Normalizacja tła w fluorescencyjnej optycznej tomografii projekcyjnej do obrazowania całego serca

Aby przeprowadzić znormalizowaną optyczną tomografię projekcyjną, próbkę najpierw utrwalono i zatopiono w cylindrze agaru. Następnie próbkę obracano wokół osi pionowej i równomiernie oświetlano falą o długości wzbudzenia, a transmisję mierzono przy użyciu odpowiedniej optyki C, CD. Sygnał fluorescencyjny o danej długości fali mierzono w trybie transiluminacji.

Pozyskane obrazy fluorescencyjne i absorpcyjne są wykorzystywane do wyznaczenia znormalizowanego stosunku Borna oraz rekonstrukcji rozkładu fluoroforów wewnątrz próbki. Cześć, nazywam się Claudia Naone i pracuję w Centers for Systems Biology w Mass General Hospital, Harvard Medical School. Jestem Danielle Raki z Institute for Biological and Medical Imaging na Uniwersytecie Technicznym w Monachium oraz AI Center Munich.

Nazywam się Giselle Fido. Jestem dyrektorem jednostki Experimental su Co w C-M-I-C-S-B w Massachusetts General Hospital przy Harvard Med School. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę obrazowania całych organów ex vivo w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem podejścia z normalizacją Borna w tomografii projekcyjnej optycznej.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania rozkładu fluorescencyjnych sond molekularnych w organach pustych. Zatem zacznijmy. Ten film wyjaśni procedurę wykorzystania tomografii projekcyjnej optycznej do obrazowania przygotowanych tkanek lub organów oraz towarzyszący mu film instruktażowy.

Wyjaśniamy, jak wykorzystać ten system do obrazowania time-lapse rozwijających się muchowców drosophila. Trójwymiarowa technika obrazowania, jaką jest optyczna tomografia projekcyjna, wymaga unikalnej kombinacji optyki oraz obrotowego stolika. W tym fragmencie filmu zostanie szczegółowo omówiona procedura obrazowania.

Na początek główne źródło światła służy zarówno do pomiarów natężenia oświetlenia, jak i absorpcji, a w celu zapewnienia wzbudzenia fluorescencyjnego do pomiarów fluorescencji, światło z głównego źródła jest najpierw filtrowane za pomocą wąskopasmowego filtra interferencyjnego. Następnie światło przechodzi przez zestaw stałych i zmiennych filtrów neutralnych. Są one połączone z automatyczną migawką, aby kontrolować ilość światła padającego na próbkę i utrzymywać ją na poziomie wystarczająco niskim, by zapobiec fotoblakaniu.

Jednorodne oświetlenie próbki uzyskuje się dzięki zastosowaniu rozszerzacza wiązki oraz zestawu składającego się z soczewki teleskopu Glana i soczewki dyfuzyjnej. Na koniec stosuje się optyczne filtry interferencyjne wąskopasmowe w celu oczyszczenia optycznie światła źródła wzbudzenia. Próbka zostaje zanurzona w roztworze klarującym i unieruchomiona do obrazowania w szklanej rurce.

Próbka jest obracana wokół swojej osi pionowej za pomocą wysokoprzędkościowego stołu obrotowego z dokładnością absolutną 0,05 stopnia. Trzy oddzielne kontrolery manualne umożliwiają pochylenie osi pionowej próbki oraz jej regulację w płaszczyźnie ortogonalnej. Sygnał absorbancji jest pozyskiwany w oświetleniu przechodzącym i wykrywany bezpośrednio przez kamerę CCD.

Sygnał fluorescencyjny jest filtrowany przez wąskopasmowy filtr interferencyjny, połączony z filtrem długoprzepustowym, a następnie zbierany za pomocą obiektywu telecentrycznego. Obiektywy telecentryczne oferują unikalne właściwości, które sprawiają, że są one idealne do optycznej tomografii projekcyjnej.

Kluczowe jest zastosowanie przysłony apertury umieszczonej wewnątrz zespołu soczewek w punkcie ogniskowym obiektywu. Zapewnia to przebieg obrazu równolegle do osi optycznej. Eliminuje to dystorsję perspektywiczną i zapewnia jednakowe powiększenie w wielu płaszczyznach ogniskowych w obrębie głębokości telecentryczności.

Następny segment wideo opisuje technikę przygotowywania próbek. Po nim nastąpi opis metodologii wykorzystywanej do obrazowania. Przygotowanie tkanki lub organu do obrazowania tomograficznego opiera się na odwadnianiu próbki w etanolu, co pozwala uniknąć asymetrycznego skurczu.

Proces ten trwa wiele dni. W niniejszym filmie przygotowano serce myszy, jednak protokół ten można zastosować do dowolnej tkanki lub narządu. Zaprezentujemy naszą metodę obrazowania fluorescencyjnego z wykorzystaniem serca zwierzęcia, u którego wywołano kontrolowany zawał.

Innymi słowy, utrata dopływu krwi prowadząca do wyraźnej martwicy tkanek w stadium zaawansowanym. Myszy wstrzyknięto sensor fluorescencyjny pro since six 80 inact, informujący o aktywności katepsyny w gojącym się mięśniu sercowym. Znieczul mysz w celu perfuzji i wyjęcia serca, stosując dożylne wstrzyknięcie ketaminy i ksylazyny. Następnie wstrzyknij 50 jednostek heparyny dożylnie, aby zapobiec krzepnięciu krwi.

Pięć minut później, u w pełni znieczulonego zwierzęcia, wykonaj podłużną laparotomię w celu usunięcia krwi. Najpierw otwórz lewą żyłę nerkową. Następnie powoli wstrzyknij 20 mililitrów roztworu soli fizjologicznej do żyły głównej dolnej.

Sól fizjologiczna wypiera krew po wypłukaniu całej krwi pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie, stosując standardowe procedury operacyjne, otwórz klatkę piersiową i wyjmij serce. Teraz utrwal serce przez osiem godzin w 4% PFA w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Od tego momentu etapy przygotowania tkanki muszą być wykonywane w ciemności, aby uniknąć blaknięcia zastosowanych w tkance fluorescencyjnych środków kontrastowych lub białek. Po zakończeniu fiksacji należy wypłukać PFA, płukząc przez 15 minut w PBS, a następnie oczyszczone serce zostaje zatopione w bloku 0,8% agarose. Po wyschnięciu agarozy, należy wyciąć ją wokół tkanki, aby uzyskać kształt bloku.

Następnie odwodnij zaszyfrowane serce aros w pięciu etapach, zaczynając od namaczania w 20%Ethanol, następnie w stopniowo wyższych stężeniach etanolu, a na koniec w czystym etanolu. Ta procedura odwadniania pomaga uniknąć asymetrycznego skurczenia się próbki. Pierwsze cztery kąpiele w rozcieńczonym etanolu muszą trwać godzinę, a ostatnia kąpiel w 100%Ethanol musi trwać co najmniej 10 godzin.

Po zakończeniu traktowania etanolem, umieść próbkę w klarownym roztworze Murraya aż do momentu jej przezroczystości, co może zająć od kilku godzin do kilku dni. Roztwór ten naśladuje wodę wewnątrzkomórkową i dopasowuje współczynnik załamania światła do błon komórkowych, czyniąc tkankę przezroczystą. Pod koniec procesu klarowania mogą pozostać minimalne śladowe ilości etanolu, co może prowadzić do powstania licznych artefaktów w rekonstrukcjach na skutek ruchów termicznych alkoholu w samym roztworze klarującym.

Aby uniknąć tego problemu, zaleca się przeprowadzenie drugiego cyklu klarowania. Nie powinno ono potrwać więcej niż cztery godziny. Po jego zakończeniu próbka jest gotowa do projekcji optycznej.

Tomografia z wykorzystaniem komputera. Rekonstrukcja absorpcji optycznej w warunkach braku rozpraszania światła może zostać uzyskana przy użyciu powszechnego algorytmu filtrowanej projekcji wstecznej Radona. Proces ten jest analogiczny do dwuwymiarowej komputerowej tomografii rentgenowskiej.

Umieść blok aerozoli w przezroczystej komorze obrazującej wypełnionej roztworem klarującym. Następnie zamocuj komorę na stoliku i oświetl próbkę skupioną wiązką w celu przeprowadzenia pomiarów wzbudzenia oraz transmisji. Wybór źródła wzbudzenia zależy od wybranego białka fluorescencyjnego lub molekularnego kontrastowego środka obrazującego.

Wygodne jest ustawienie osi pionowej próbki równolegle do kolumny pikseli detektora CCD. Obróć próbkę w zakresie 360 projekcji, stosując przyrosty kątowe wynoszące jeden stopień, i wykonaj obrazy pod każdym kątem w oświetleniu przechodzącym, zarówno dla długości fal absorpcji, jak i fluorescencji. Oprogramowanie sterujące akwizycją automatycznie kontroluje migawkę głównego źródła światła, aby uniknąć ciągłego naświetlania i ograniczyć fotowyblaknięcie próbki.

Migawka jest szczególnie istotna, gdy wymagane są długie czasy całkowania w celu stworzenia rekonstrukcji 3D z danych absorpcyjnych. Do rekonstrukcji 3D z obrazów fluorescencyjnych należy po prostu zastosować algorytm filtrowanej projekcji wstecznej Radona. Należy wziąć pod uwagę inne wkłady absorpcyjne, które są opisane w następnym segmencie wideo.

Po wykonaniu kroków niezbędnych do rekonstrukcji absorpcyjnej, należy przeprowadzić kilka dodatkowych etapów w celu ukończenia rekonstrukcji fluorescencyjnej. Rekonstrukcję mapy optycznej przy braku rozpraszania światła można uzyskać przy użyciu powszechnego algorytmu filtrowanej projekcji wstecznej Radona. Proces ten jest analogiczny do dwuwymiarowej tomografii komputerowej rentgenowskiej.

Podczas rekonstrukcji rozkładu fluorescencji zmienne, zależne od położenia tłumienie sprawia, że zastosowanie odwrotnej transformaty Radona do wstecznej projekcji obrazów fluorescencji jest błędne, co poważnie wpływa na uzyskane rozkłady białek fluorescencyjnych lub fluorescencyjnych sond molekularnych oraz na możliwość ich kwantyfikacji. Każdy promień o długości fali wzbudzenia Lambda X, emitowany z dowolnej pozycji źródła Xs, ulega tłumieniu wykładniczemu podczas przechodzenia przez obrazowany obiekt.

Po wzbudzeniu fluorochromu znajdującego się w pozycji X, promieniowanie o długości fali emisji jest filtrowane i zbierane przez piksel matrycy CCD znajdujący się w pozycji XD przy użyciu systemu soczewek obrazujących Teleric. Choć emitowana fluorescencja nie biegnie tą samą drogą co promień wzbudzenia, natężenie rejestrowane w każdym pikselu przybliża projekcję wszystkich fluorochromów wzbudzonych w całej strefie ogniskowania odpowiadającej temu konkretnemu promieniowi wzbudzenia. Dzięki wysokiej telecentryczności systemu, obrazowany obiekt jest następnie obracany o 360 stopni, a za pomocą kamery CCD pozyskuje się wielokrotne pomiary źródło-detektor: UX przy długości fali wzbudzenia oraz UFL przy długości fali emisji.

Następnie zostają one połączone w ramach znormalizowanego pola UB, zdefiniowanego jako stosunek tych dwóch wartości. Rekonstrukcję rozkładu fluorochromów można ułatwić poprzez zapisanie modelu bezpośredniego dla propagacji światła wzbudzenia i emisji, gdzie funkcja Greena opisuje wzbudzenie. Propagacja promieni przebiega zgodnie z prostym prawem Beera-Lamberta, w którym moo A jest wcześniej wyznaczonym rozkładem absorpcji optycznej.

Natężenie światła UX emitowane ze źródła w położeniu excess i mierzone przez detektor w położeniu XD na C.C, D można zapisać jako iloczyn funkcji zielonej oraz stałej B zależnej od systemu. Następnie można obliczyć dokładny rozkład natężenia światła wzbudzenia GX wzdłuż każdej ścieżki promienia. Natężenie fluorescencji UFL rejestrowane przez detektor XD, wywołane światłem emitowanym ze źródła Xs, uwzględnia wkład wszystkich theros, które zostały wzbudzone wzdłuż ścieżki promienia od X do xd.

Model przód naszego problemu obrazowania można zapisać jako ub ub, gdzie alpha obejmuje nieznane stałe zależne od systemu. Model przód jest następnie dyskretyzowany na przyjętej siatce, a następnie przeprowadza się inwersję w celu wyodrębnienia rozkładu fluorochromu, pozyskania sygnału transmisyjnego oraz fluorescencyjnego i wykorzystania konwencjonalnego algorytmu wstecznej projekcji do rekonstrukcji próbki. Tutaj przedstawiono rekonstrukcje z transmisyjnej i konwencjonalnej fluorescencyjnej optycznej tomografii projekcyjnej.

Przedstawiono rekonstrukcję pojedynczej płaszczyzny serca w obrazowaniu absorpcyjnym oraz fluorescencyjnym. Prezentowana jest znormalizowana rekonstrukcja Borna, która ukazuje różnice w rozkładzie barwnika w obrębie serca. Po normalizacji zaprezentowano sposób konfiguracji układu do optycznej tomografii projekcyjnej oraz metodę usuwania artefaktów wynikających z absorpcji optycznej w rekonstrukcjach dla tomografii fluorescencyjnej.

W rzeczywistości bardzo ważne jest pamiętanie o konieczności przejrzyszczania próbki w celu usunięcia wpływu światła rozproszonego, ale jednocześnie istotne jest zbalansowanie procesu przejrzyszczania, aby zachować jak największy wkład fluorescencji. Inną bardzo ważną kwestią przy stosowaniu tego podejścia jest obliczenie znormalizowanego stosunku dla kości, który uzyskuje się poprzez podzielenie obrazów fluorescencyjnych przez obrazy absorpcyjne. To wszystko.

Dziękujemy za zapoznanie się z naszą wizualizacją eksperymentu i życzymy powodzenia w prowadzeniu własnych badań.