Normalizacja Borna dla fluorescencyjnej optycznej tomografii projekcyjnej do obrazowania całego serca

W celu wykonania znormalizowanej optycznej tomografii projekcyjnej próbka jest najpierw utrwalana i osadzana w cylindrze ślimaka. Próbka jest następnie obracana wzdłuż osi pionowej, a następnie równomiernie oświetlana długością fali wzbudzenia, a transmisja jest mierzona za pomocą optyki odpowiedniej C, CD. Sygnał fluorescencyjny na długości fali jest mierzony w trybie transoświetlenia.

Uzyskane obrazy fluorescencyjne i absorpcyjne są wykorzystywane do określenia znormalizowanego stosunku urodzeń i zrekonstruowania rozkładu czwórek fluorowych w próbce. Cześć, nazywam się Claudia Naone i pracuję w Centrach Biologii Systemów w Mass General Hospital, Harvard Medical School. Nazywam się Danielle Raki i pracuję w Instytucie Obrazowania Biologicznego i Medycznego na Uniwersytecie Technicznym w Monachium oraz w Al Center w Monachium.

Nazywam się Giselle Fido. Jestem dyrektorem Experimental su Co w C-M-I-C-S-B, Massachusetts General Hospital, Harvard Med School. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę obrazowania całych narządów ex vivo w czasie rzeczywistym przy użyciu znormalizowanego podejścia Borna do optycznej tomografii projekcyjnej.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania rozkładu fluorescencyjnej sondy molekularnej w pustych narządach. Więc zacznijmy. Ten film wyjaśni procedurę korzystania z optycznej tomografii projekcyjnej do obrazowania przygotowanych tkanek lub narządów oraz towarzyszący mu film.

Wyjaśniamy, jak używać tego systemu do wykonywania obrazowania poklatkowego u rozwijających się drosophila. Trójwymiarowa technika obrazowania optycznej tomografii projekcyjnej wymaga unikalnego połączenia optyki i obrotowego stolika. W tej części filmu zostanie wyjaśniona procedura obrazowania.

Na początek główne źródło światła służy jako źródło zarówno do pomiarów oświetlenia, jak i absorpcji, a aby zapewnić wzbudzenie fluorescencyjne do pomiarów fluorescencji, główne źródło światła jest najpierw filtrowane za pomocą wąskopasmowego filtra interferencyjnego. Następnie światło przechodzi przez zestaw stałych i zmiennych filtrów o neutralnej gęstości. Są one połączone z obecnością automatycznej migawki, która kontroluje ilość światła na próbce i utrzymuje ją na tyle nisko, aby zapobiec wybielaniu zdjęć.

Równomierne oświetlenie próbki uzyskuje się dzięki zastosowaniu ekspandera wiązki i połączonej soczewki teleskopu glan z soczewką dyfuzora. Wreszcie, optyczne filtry interferencyjne wąskopasmowe służą do optycznego oczyszczania źródła światła wzbudzenia. Próbkę zanurza się w roztworze klarującym i utrzymuje na miejscu w celu obrazowania w szklanej probówce.

Próbka jest obracana wzdłuż osi pionowej za pomocą stolika o dużej prędkości obrotowej z absolutną dokładnością 0,05 stopnia. Trzy odrębne sterowniki ręczne pozwalają na pochylanie i regulację osi pionowej próbki w jej płaszczyźnie ortogonalnej. Sygnał absorpcyjny jest odbierany w oświetleniu trans i jest bezpośrednio wykrywany przez kamerę CCD.

Sygnał fluorescencyjny jest filtrowany przez wąskopasmowy filtr interferencyjny sprzężony z filtrem długoprzepustowym, a następnie zbierany za pomocą soczewki telecentrycznej. Teleobiektywy mają tę zaletę, że zapewniają unikalne funkcje, które czynią je idealnymi. Do optycznej tomografii projekcyjnej.

Kluczowa jest obecność ogranicznika przysłony umieszczonego w zespole obiektywu w punkcie ogniskowym obiektywu. Zapewnia to, że obraz będzie poruszał się równolegle do osi optycznej. Eliminuje to zniekształcenia perspektywy i zapewnia równe powiększenie w wielu płaszczyznach ogniskowych w głębi telecentrycznej.

W następnym segmencie filmu opisano technikę przygotowywania próbek. Następnie zostanie opracowana metodologia stosowana do obrazowania. Przygotowanie próbki, tkanki lub narządu do obrazowania tomograficznego opiera się na odwodnieniu próbki na bazie etanolu, co pozwala uniknąć asymetrycznego kurczenia się.

Ten proces trwa wiele dni. W tym filmie przygotowywane jest serce myszy, ale protokół można zastosować do dowolnej tkanki lub narządu. Zademonstrujemy naszą metodę obrazowania fluorescencyjnego na sercu zwierzęcia, które przeszło kontrolowany zawał.

Innymi słowy, utrata dopływu krwi prowadząca z góry do oczywistej martwicy tkanek. Mysz została wstrzyknięta pro od sześciu 80-aktowych czujników fluorescencyjnych informujących o aktywności katepsyny podczas gojenia. Mięsień sercowy znieczulić mysz do perfuzji i ekstruzji serca za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia ketaminy i ksylazyny, a następnie wstrzyknąć 50 jednostek heparyny dootrzewnowej, aby zapobiec krzepnięciu.

Pięć minut później wykonaj laparotomię podłużną na w pełni znieczulonym zwierzęciu, aby usunąć krew. Najpierw otwórz lewą żyłę nerkową. Teraz powoli wstrzyknij 20 mililitrów roztworu soli fizjologicznej do żyły głównej dolnej.

Sól fizjologiczna wypiera krew po wypłukaniu całej krwi pod mikroskopem preparacyjnym. Kontynuuj stosowanie standardowych metod operacyjnych, aby otworzyć klatkę piersiową i usunąć serce. Teraz napraw serce na osiem godzin w 4% PFA w czterech stopniach Celsjusza.

Od tego momentu etapy przygotowania tkanek muszą być wykonywane w ciemności, aby uniknąć wybielania jakichkolwiek fluorescencyjnych środków kontrastowych lub białek nałożonych na tkankę. Po zakończeniu utrwalania zmyj PFA 15-minutowym płukaniem w PBS, oczyszczone serce jest następnie osadzane w puli 0,8% aros. Po wyschnięciu aros agaroza jest odcinana wokół tkanki, aby uzyskać kształt bloku.

Następnie odwodnić zaszyfrowane serce w arosie przez pięcioetapową serię najpierw moczenia w 20% etanolu, następnie stopniowo wyższych stężeniach etanolu, a na końcu czystego etanolu. Ta procedura odwadniania pomaga uniknąć asymetrycznego skurczu próbki. Pierwsze cztery kąpiele w rozcieńczonym etanolu muszą być wykonywane przez godzinę, a końcowa kąpiel w 100% etanolu musi być wykonywana przez co najmniej 10 godzin.

Po zakończeniu obróbki etanolem umieść próbkę w klarownym roztworze Murraya, aż próbka się oczyści, co waha się od kilku godzin do kilku dni. To rozwiązanie oczyszczające naśladuje wodę komórkową, a indeks dopasowuje się do błon komórkowych, dzięki czemu tkanka jest przezroczysta. Etanol w minimalnych śladach może być obecny na końcu procesu oczyszczania, powodując powstanie kilku artefaktów w rekonstrukcjach spowodowanych ruchem termicznym alkoholu w samym roztworze oczyszczającym.

Aby uniknąć tego problemu, zalecany jest drugi cykl oczyszczania. Nie powinno to zająć więcej niż cztery godziny. Po zakończeniu próbka jest gotowa do projekcji optycznej.

Tomografia z pomocą komputera. Rekonstrukcję absorpcji optycznej przy braku rozpraszania światła można uzyskać za pomocą wspólnego algorytmu odwrotnej projekcji radonu z filtrem. Proces ten jest analogiczny do dwuwymiarowej rentgenowskiej tomografii komputerowej.

Umieść blok aeros w przezroczystej komorze obrazowania wypełnionej roztworem klarującym. Teraz zamontuj komorę na stoliku, oświetl próbkę skumulowaną wiązką zarówno do pomiarów wzbudzenia, jak i transmisji. Wybór źródła wzbudzenia opiera się na wybranym białku fluorescencyjnym lub środku kontrastowym do obrazowania molekularnego.

Wygodne jest wyrównanie osi pionowej próbki równolegle do kolumny pikseli CCD. Obracaj próbkę w rzutach 360 za pomocą przyrostów kątowych o jeden stopień, uzyskuj obrazy pod każdym kątem w oświetleniu trans zarówno na długości fali absorpcyjnej, jak i fluorescencyjnej. Oprogramowanie uruchamiające akwizycję automatycznie steruje migawką na głównym źródle światła, aby uniknąć ciągłego oświetlenia i zmniejszyć blaknięcie próbki zdjęć.

Migawka jest szczególnie ważna, gdy wymagany jest długi czas integracji, aby stworzyć rekonstrukcję 3D na podstawie danych absorpcyjnych. Wystarczy użyć algorytmu projekcji wstecznej radonu z filtrem do rekonstrukcji 3D na podstawie obrazów fluorescencyjnych. Należy wziąć pod uwagę inne wkłady absorpcyjne, które są opisane w następnym segmencie filmu.

Po wykonaniu kroków wymaganych do rekonstrukcji absorpcyjnej, pozostaje jeszcze kilka kroków do wykonania rekonstrukcji fluorescencyjnej. Rekonstrukcję mapy optycznej przy braku rozpraszania światła można uzyskać przy użyciu wspólnego algorytmu odwrotnej projekcji radonu z filtrem. Proces ten jest analogiczny do dwuwymiarowej rentgenowskiej tomografii komputerowej.

Podczas rekonstrukcji rozkładu fluorescencji. Zmienna absorpcja zależna przestrzennie sprawia, że użycie odwróconego radonu do powrotu jest nieprawidłowe, co powoduje projekcję obrazów fluorescencyjnych, co poważnie wpływa na uzyskane rozkłady białek fluorescencyjnych lub fluorescencyjnej sondy molekularnej i jej zdolność do kwantyfikacji. Każdy promień o długości fali wzbudzenia Lambda X, który jest emitowany z dowolnej pozycji źródła Xs, jest tłumiony wykładniczo, gdy przechodzi przez obrazowany obiekt.

Po wzbudzeniu, fluorochrom znajdujący się w pozycji X, promieniowanie o długości fali emisyjnej jest filtrowane i zbierane przez piksel CCD znajdujący się w pozycji XD za pomocą systemu soczewkowania obrazowania Teleric. Chociaż emitowana fluorescencja nie podąża tą samą ścieżką co promień wzbudzenia, intensywność rejestrowana w każdym pikselu przybliża projekcję wszystkich fluorochromów wzbudzonych wzdłuż całej strefy ogniskowej odpowiadającej temu konkretnemu promieniowi wzbudzenia. Ze względu na wysoką telecentryczność systemu, obrazowany obiekt jest następnie obracany o 360 stopni, a pomiary detektora wielu źródeł, UX na długości fali wzbudzenia i UFL na długości fali emisji są rejestrowane za pomocą kamery CCD.

Są one następnie łączone w znormalizowanym polu urodzonym UB zdefiniowanym jako stosunek tych dwóch. Rekonstrukcję rozkładu fluorochromu można ułatwić, pisząc model do przodu zarówno dla wzbudzenia, jak i propagacji światła emisyjnego, przy czym funkcja zieleni opisuje wzbudzenie. Rozchodzenie się promieni jest zgodne z prostym prawem Lamberta, gdzie moo A jest wcześniej określonym rozkładem absorpcji optycznej.

Natężenie światła UX emitowane ze źródła w nadmiarze pozycji i mierzone przez detektor w pozycji XD na CC, D można zapisać jako iloczyn funkcji koloru zielonego ze stałą B, która jest zależna od systemu. Następnie można obliczyć dokładny rozkład natężenia światła wzbudzenia GX wzdłuż każdej ścieżki promienia. Intensywność fluorescencji UFL wykryta w detektorze XD, która jest stymulowana przez światło emitowane ze źródła Xs, uwzględnia wkład wszystkich theros, które zostały wzbudzone wzdłuż ścieżki promienia od X do xd.

Przyszłościowy model naszego problemu z obrazowaniem można następnie zapisać jako ub ub, gdzie alfa zawiera nieznane stałe, które są zależne od systemu. Model do przodu jest następnie dyskretyzowany na założonej siatce i przeprowadzana jest inwersja w celu wyodrębnienia rozkładu fluorochromu, uzyskania zarówno sygnału transmisyjnego, jak i fluorescencyjnego oraz wykorzystania konwencjonalnego algorytmu projekcji wstecznej do rekonstrukcji próbki. Pokazane są tu rekonstrukcje transmisyjne i konwencjonalnej fluorescencyjnej optycznej tomografii projekcyjnej.

Rekonstrukcja pojedynczej płaszczyzny serca jest widoczna zarówno w absorpcji, jak i fluorescencji. Przedstawiono znormalizowaną rekonstrukcję urodzenia, która pokazuje różnicę w rozmieszczeniu barwnika w sercu. Po normalizacji właśnie pokazaliśmy, jak być ustawieniem do optycznej tomografii projekcyjnej i jak usunąć artefakty spowodowane absorpcją optyczną w rekonstrukcjach do tomografii fluorescencyjnej.

W rzeczywistości bardzo ważne jest, aby pamiętać o oczyszczeniu próbki w celu usunięcia wkładu rozproszonego światła, ale jednocześnie ważne jest również, aby zrównoważyć proces oczyszczania, aby zachować jak najwięcej wkładu fluorescencji. Kolejną rzeczą, o której bardzo ważne jest zapamiętanie przy stosowaniu tego podejścia, jest obliczenie stosunku znormalizowanego kości, który uzyskuje się przez podzielenie obrazów fluorescencyjnych przez obrazy absorpcyjne. Więc to wszystko.

Dziękujemy za dołączenie do naszego zwizualizowanego eksperymentu i życzymy powodzenia we własnych eksperymentach.