Name: Normalizacja Borna dla fluorescencyjnej optycznej tomografii projekcyjnej do obrazowania całego serca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 44 s
Description: Poznaj metodę BnOPT do dokładnej rekonstrukcji fluorescencji w małych organach zwierzęcych, uwzględniającą właściwości absorpcyjne próbek. Technika ta poprawia jakość obrazowania tomograficznego serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C. Vinegoni potwierdza otrzymanie wsparcia z grantu National Institutes of Health (NIH) nr 1-RO1-EB006432.

Procedura obrazowania
Układ doświadczalny przedstawiono szczegółowo na Rysunku 1. Źródło światła LS służy zarówno do oświetlenia w pomiarach absorbancji, jak i jako źródło wzbudzenia w pomiarach fluorescencji; jest ono filtrowane za pomocą wąskopasmowego filtra interferencyjnego BPF. Zestaw stałych i zmiennych filtrów neutralnych ND w połączeniu z automatyczną migawką S pozwala na kontrolę ilości światła padającego na próbkę i utrzymanie go na poziomie wystarczająco niskim, aby zapobiec fotoblaknięciu. Jednorodne oświetlenie próbki uzyskuje się za pomocą ekspandera wiązki BE z dwusoczewkowym teleskopem Galileusza oraz dyfuzora. Próbka S jest zanurzona w roztworze do przejaśniania, zamocowana na uchwycie i obracana wokół swojej osi pionowej za pomocą wysokoobrotowego stołu obrotowego (Newport, PR50) z dokładnością bezwzględną 0,05 stopnia. Trzy oddzielne kontrolery manualne umożliwiają pochylenie osi pionowej próbki oraz jej regulację w płaszczyźnie ortogonalnej. Sygnał transiluminacji jest wykrywany bezpośrednio przez kamerę CCD; sygnał fluorescencji jest filtrowany przez wąskopasmowy filtr interferencyjny połączony z filtrem długoprzepustowym (Omega Optical, Brattleboro, VT), a następnie zbierany za pomocą soczewki telecentrycznej TL. Soczewki telecentryczne oferują unikalne właściwości, które czynią je idealnymi do optycznej tomografii projekcyjnej. W rzeczywistości obecność przysłony otworu znajdującej się wewnątrz zestawu soczewek w punkcie ogniskowym zapewnia, że promienie tworzące obraz przysłony będą biegnąć równolegle do osi optycznej, co praktycznie eliminuje jakiekolwiek zniekształcenia perspektywiczne i zapewnia takie samo powiększenie dla wielu płaszczyzn w obrębie głębokości telecentrycznej.
Przygotowanie próbek
W celu utrwalenia tkanek/organów stosuje się następującą procedurę
<ol>
<li>Próbki utrwala się w PFA przez 8 godzin w temperaturze 4C.</li>
<li>Następnie próbkę przemywa się w PBS przez 15 minut.</li>
<li>Próbkę zatapia się w bloku 0,8% agarozy.</li>
<li>Blok agarozy odwadnia się za pomocą serii roztworów etanolu o stężeniu od 20% do 100%. Ta procedura odwadniania w serii etanolu pomaga uniknąć asymetrycznego kurczenia się próbki.</li>
<li>Na koniec próbkę inkubuje się przez 10 godzin w 100% etanolu w celu całkowitego usunięcia wody z próbki.</li>
<li>Próbkę umieszcza się w roztworze alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu w stosunku 1:2 na czas niezbędny do przejaśnienia próbki. Należy pamiętać, że czas ten może się znacznie różnić w zależności od próbki — od kilku godzin do kilku dni.</li>
<li>Pod koniec procesu przejaśniania mogą pozostać minimalne ślady etanolu, co prowadzi do powstania poważnych artefaktów w rekonstrukcjach z powodu ruchów termicznych alkoholu w samym roztworze przejaśniającym. Aby uniknąć tego problemu, zaleca się przeprowadzenie drugiego cyklu przejaśniania.</li>
<li>Kroki 4 i 5 należy wykonywać w ciemności, aby uniknąć wybielania fluorescencyjnych środków kontrastowych lub białek.</li>
</ol>
Przygotowanie próbek serca
W celu uniknięcia artefaktów wysokiego pochłaniania w rekonstrukcjach, przed obrazowaniem ważne jest usunięcie krwi z każdej tkanki. Można zastosować następującą procedurę.
<ol>
<li>Zanurz mysz w narkozie poprzez domięśniowy (IP) wtrysk mieszaniny ketaminy (90 mg/kg) i ksylazyny (10mg/kg). Uwaga: „Od tego momentu należy chronić próbkę przed światłem”.</li>
<li>Wstrzyknij 50 U heparyny (IP), a po pięciu minutach wykonaj podłużną laparotomię.</li>
<li>Otwórz lewą żyłę nerkową (LRV) i wprowadź 20ml roztworu soli fizjologicznej do żyły głównej dolnej (IVC). </li>
<li>Blok agarozowy należy odwadniać w czterech, jednogodzinnych inkubacjach w etanolu o stężeniach 20%, 40%, 60% i 80%, a następnie inkubować próbki w 100% etanolu przez 10 godzin (przez noc).</li>
<li>Następnie utrwal serce zgodnie z ogólną procedurą przygotowania próbek Uwaga: „Od tego momentu należy chronić próbkę przed światłem”.</li>
</ol>
Rekonstrukcje absorpcyjne
Rekonstrukcja absorpcji optycznej w przypadku braku rozpraszania jest zazwyczaj analogiczna do X-CT i może zostać przeprowadzona przy użyciu powszechnego algorytmu filtrowanej projekcji wstecznej Radona. Obrazy absorpcyjne są następnie rejestrowane kamerą CCD w trybie transiluminacji, wykonując 360 projekcji w odstępach 1 stopnia wzdłuż osi pionowej. Wskazane jest, aby ustawić oś pionową próbki równolegle do kolumny pikseli kamery CCD.
<ol>
<li>Umieść blok agarozy w komorze wypełnionej roztworem do przejaśniania</li>
<li>Oświetl próbkę skolonimowanym wiązką światła w celu przeprowadzenia pomiarów wzbudzenia oraz transmisji</li>
<li>Obróć próbkę, wykonując 360 projekcji w odstępach 1 stopnia</li>
<li>Nabyj obrazy w transiluminacji, zarówno dla długości fal absorpcji (wewnętrznej), jak i fluorescencji</li>
<li>Zastosuj migawkę, aby uniknąć ciągłego oświetlania i ograniczyć fotowyblakanie</li>
<li>Użyj algorytmu filtrowanej wstecznej projekcji Radona do tomograficznej rekonstrukcji próbki</li>
</ol>
Rekonstrukcje fluorescencyjne
Algorytm stosowany do rekonstrukcji absorpcji nie jest odpowiedni do rekonstrukcji rozkładu fluorescencji i, jeśli nie zostanie wzięty pod uwagę, wkład absorpcji doprowadzi do powstania poważnych artefaktów.
<ol>
<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w sekcji „Absoprtion Reconstructions”. </li>
<li>Wykonaj jednocześnie pomiary absorpcji i fluorescencji.</li>
<li>Połącz dane w znormalizowane obrazy pola Borna.</li>
<li>Zapisz równania modelu bezpośredniego propagacji światła dla długości fal wewnętrznych i fluorescencyjnych.</li>
<li>Oblicz macierz wag na dyskretyzowanej siatce dla funkcji Greena modelu bezpośredniego.</li>
<li>Odwróć macierz wag i pomnóż ją przez wykryte znormalizowane obrazy pola Borna, aby uzyskać rekonstrukcję rozkładu fluorescencji w obiekcie.</li>
</ol>

<ol><li>Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sorensen, J., Baldock, R., Davidson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-544 (2002).</li>
<li>Lee, K., Avondo, J., Morrison, H., Blot, L., Stark, M., Sharpe, J., Bangham, A., Coen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+plant+development+and+gene++in+three+dimensions+using+optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing plant development and gene in three dimensions using optical projection tomography.</a> Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).</li>
<li>Oldham, M., Sakhalkar, H., Wang, Y. M., Guo, P. Y., Oliver, T., Bentley, R., Vujaskovic, Z., Dewhirst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+whole+rodent+organs+using+optical+computed+and+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of whole rodent organs using optical computed and emission tomography.</a> J. Biomed. Opt. 12, 1-10 (2007).</li>
<li>Ntziachristos, V., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+three-dimensional+fluorescence+reconstruction+of+diffuse+media+by+use+of+a+normalized+Born+approximation%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Experimental three-dimensional fluorescence reconstruction of diffuse media by use of a normalized Born approximation.</a> Opt. Lett. 26, 893-895 (2001).</li>
</ol>

normalizacja tła w fluorescencyjnej optycznej tomografii projekcyjnej do obrazowania całego serca

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optyczna tomografia projekcyjna jest techniką obrazowania trójwymiarowego, która została niedawno wprowadzona jako narzędzie obrazowania stosowane głównie w badaniach nad biologią rozwoju i ekspresją genów. Technika ta czyni próbkę biologiczną optycznie przezroczystą poprzez uprzednią dehydratację, a następnie umieszczenie jej w mieszaninie alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu w stosunku 2:1 (BABB lub roztwór Murray’s Clear). Technika ta czyni próbki biologiczne optycznie przezroczystymi poprzez ich uprzednią dehydratację w roztworach etanolu o rosnącym stężeniu, a następnie umieszczenie ich w mieszaninie alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu w stosunku 2:1 (BABB lub roztwór Murray’s Clear) w celu przejrzystości. Po procesie przejrzystości udział rozpraszania w próbce może zostać znacznie zredukowany i stać się niemal pomijalny, podczas gdy udział absorpcji nie może zostać całkowicie wyeliminowany. Podczas próby rekonstrukcji rozkładu fluorescencji w badanej próbce wpływ ten oddziałuje na rekonstrukcje i nieuchronnie prowadzi do artefaktów obrazowania oraz błędów w kwantyfikacji. Chociaż absorpcję można by zredukować w jeszcze większym stopniu poprzez pozostawienie próbki w mediach do przejrzystości na wiele tygodni lub miesięcy, prowadziłoby to do postępującej utraty fluorescencji oraz nierealistycznie długiego czasu przetwarzania próbki. Dotyczy to rekonstrukcji zarówno egzogennych środków kontrastowych (molekularnych środków kontrastowych), jak i kontrastu endogennego (np. rekonstrukcji genetycznie eksprymowanych białek fluorescencyjnych).

Proponujemy podejście oparte na normalizacji Borna w optycznej tomografii projekcyjnej (BnOPT), które uwzględnia właściwości absorpcyjne obrazowanych próbek w celu uzyskania dokładnych i ilościowych rekonstrukcji tomograficznych fluorescencji. Przedstawiony algorytm wykorzystujemy do rekonstrukcji rozkładu fluorescencyjnej sondy molekularnej w narządach małych zwierząt.

Normalizacja tła w fluorescencyjnej optycznej tomografii projekcyjnej do obrazowania całego serca

Optyczna tomografia projekcyjna jest techniką obrazowania trójwymiarowego, która została niedawno wprowadzona jako narzędzie obrazujące głównie w biologii rozwoju ...

Aby przeprowadzić znormalizowaną optyczną tomografię projekcyjną, próbkę najpierw utrwalono i zatopiono w cylindrze agaru. Następnie próbkę obracano wokół osi pionowej i równomiernie oświetlano falą o długości wzbudzenia, a transmisję mierzono przy użyciu odpowiedniej optyki C, CD. Sygnał fluorescencyjny o danej długości fali mierzono w trybie transiluminacji.Pozyskane obrazy fluorescencyjne i absorpcyjne są wykorzystywane do wyznaczenia znormalizowanego stosunku Borna oraz rekonstrukcji rozkładu fluoroforów wewnątrz próbki. Cześć, nazywam się Claudia Naone i pracuję w Centers for Systems Biology w Mass General Hospital, Harvard Medical School. Jestem Danielle Raki z Institute for Biological and Medical Imaging na Uniwersytecie Technicznym w Monachium oraz AI Center Munich.Nazywam się Giselle Fido. Jestem dyrektorem jednostki Experimental su Co w C-M-I-C-S-B w Massachusetts General Hospital przy Harvard Med School. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę obrazowania całych organów ex vivo w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem podejścia z normalizacją Borna w tomografii projekcyjnej optycznej.Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania rozkładu fluorescencyjnych sond molekularnych w organach pustych. Zatem zacznijmy. Ten film wyjaśni procedurę wykorzystania tomografii projekcyjnej optycznej do obrazowania przygotowanych tkanek lub organów oraz towarzyszący mu film instruktażowy.Wyjaśniamy, jak wykorzystać ten system do obrazowania time-lapse rozwijających się muchowców drosophila. Trójwymiarowa technika obrazowania, jaką jest optyczna tomografia projekcyjna, wymaga unikalnej kombinacji optyki oraz obrotowego stolika. W tym fragmencie filmu zostanie szczegółowo omówiona procedura obrazowania.Na początek główne źródło światła służy zarówno do pomiarów natężenia oświetlenia, jak i absorpcji, a w celu zapewnienia wzbudzenia fluorescencyjnego do pomiarów fluorescencji, światło z głównego źródła jest najpierw filtrowane za pomocą wąskopasmowego filtra interferencyjnego. Następnie światło przechodzi przez zestaw stałych i zmiennych filtrów neutralnych. Są one połączone z automatyczną migawką, aby kontrolować ilość światła padającego na próbkę i utrzymywać ją na poziomie wystarczająco niskim, by zapobiec fotoblakaniu.Jednorodne oświetlenie próbki uzyskuje się dzięki zastosowaniu rozszerzacza wiązki oraz zestawu składającego się z soczewki teleskopu Glana i soczewki dyfuzyjnej. Na koniec stosuje się optyczne filtry interferencyjne wąskopasmowe w celu oczyszczenia optycznie światła źródła wzbudzenia. Próbka zostaje zanurzona w roztworze klarującym i unieruchomiona do obrazowania w szklanej rurce.Próbka jest obracana wokół swojej osi pionowej za pomocą wysokoprzędkościowego stołu obrotowego z dokładnością absolutną 0,05 stopnia. Trzy oddzielne kontrolery manualne umożliwiają pochylenie osi pionowej próbki oraz jej regulację w płaszczyźnie ortogonalnej. Sygnał absorbancji jest pozyskiwany w oświetleniu przechodzącym i wykrywany bezpośrednio przez kamerę CCD.Sygnał fluorescencyjny jest filtrowany przez wąskopasmowy filtr interferencyjny, połączony z filtrem długoprzepustowym, a następnie zbierany za pomocą obiektywu telecentrycznego. Obiektywy telecentryczne oferują unikalne właściwości, które sprawiają, że są one idealne do optycznej tomografii projekcyjnej.Kluczowe jest zastosowanie przysłony apertury umieszczonej wewnątrz zespołu soczewek w punkcie ogniskowym obiektywu. Zapewnia to przebieg obrazu równolegle do osi optycznej. Eliminuje to dystorsję perspektywiczną i zapewnia jednakowe powiększenie w wielu płaszczyznach ogniskowych w obrębie głębokości telecentryczności.Następny segment wideo opisuje technikę przygotowywania próbek. Po nim nastąpi opis metodologii wykorzystywanej do obrazowania. Przygotowanie tkanki lub organu do obrazowania tomograficznego opiera się na odwadnianiu próbki w etanolu, co pozwala uniknąć asymetrycznego skurczu.Proces ten trwa wiele dni. W niniejszym filmie przygotowano serce myszy, jednak protokół ten można zastosować do dowolnej tkanki lub narządu. Zaprezentujemy naszą metodę obrazowania fluorescencyjnego z wykorzystaniem serca zwierzęcia, u którego wywołano kontrolowany zawał.Innymi słowy, utrata dopływu krwi prowadząca do wyraźnej martwicy tkanek w stadium zaawansowanym. Myszy wstrzyknięto sensor fluorescencyjny pro since six 80 inact, informujący o aktywności katepsyny w gojącym się mięśniu sercowym. Znieczul mysz w celu perfuzji i wyjęcia serca, stosując dożylne wstrzyknięcie ketaminy i ksylazyny. Następnie wstrzyknij 50 jednostek heparyny dożylnie, aby zapobiec krzepnięciu krwi.Pięć minut później, u w pełni znieczulonego zwierzęcia, wykonaj podłużną laparotomię w celu usunięcia krwi. Najpierw otwórz lewą żyłę nerkową. Następnie powoli wstrzyknij 20 mililitrów roztworu soli fizjologicznej do żyły głównej dolnej.Sól fizjologiczna wypiera krew po wypłukaniu całej krwi pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie, stosując standardowe procedury operacyjne, otwórz klatkę piersiową i wyjmij serce. Teraz utrwal serce przez osiem godzin w 4% PFA w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Od tego momentu etapy przygotowania tkanki muszą być wykonywane w ciemności, aby uniknąć blaknięcia zastosowanych w tkance fluorescencyjnych środków kontrastowych lub białek. Po zakończeniu fiksacji należy wypłukać PFA, płukząc przez 15 minut w PBS, a następnie oczyszczone serce zostaje zatopione w bloku 0,8% agarose. Po wyschnięciu agarozy, należy wyciąć ją wokół tkanki, aby uzyskać kształt bloku.Następnie odwodnij zaszyfrowane serce aros w pięciu etapach, zaczynając od namaczania w 20%Ethanol, następnie w stopniowo wyższych stężeniach etanolu, a na koniec w czystym etanolu. Ta procedura odwadniania pomaga uniknąć asymetrycznego skurczenia się próbki. Pierwsze cztery kąpiele w rozcieńczonym etanolu muszą trwać godzinę, a ostatnia kąpiel w 100%Ethanol musi trwać co najmniej 10 godzin.Po zakończeniu traktowania etanolem, umieść próbkę w klarownym roztworze Murraya aż do momentu jej przezroczystości, co może zająć od kilku godzin do kilku dni. Roztwór ten naśladuje wodę wewnątrzkomórkową i dopasowuje współczynnik załamania światła do błon komórkowych, czyniąc tkankę przezroczystą. Pod koniec procesu klarowania mogą pozostać minimalne śladowe ilości etanolu, co może prowadzić do powstania licznych artefaktów w rekonstrukcjach na skutek ruchów termicznych alkoholu w samym roztworze klarującym.Aby uniknąć tego problemu, zaleca się przeprowadzenie drugiego cyklu klarowania. Nie powinno ono potrwać więcej niż cztery godziny. Po jego zakończeniu próbka jest gotowa do projekcji optycznej.Tomografia z wykorzystaniem komputera. Rekonstrukcja absorpcji optycznej w warunkach braku rozpraszania światła może zostać uzyskana przy użyciu powszechnego algorytmu filtrowanej projekcji wstecznej Radona. Proces ten jest analogiczny do dwuwymiarowej komputerowej tomografii rentgenowskiej.Umieść blok aerozoli w przezroczystej komorze obrazującej wypełnionej roztworem klarującym. Następnie zamocuj komorę na stoliku i oświetl próbkę skupioną wiązką w celu przeprowadzenia pomiarów wzbudzenia oraz transmisji. Wybór źródła wzbudzenia zależy od wybranego białka fluorescencyjnego lub molekularnego kontrastowego środka obrazującego.Wygodne jest ustawienie osi pionowej próbki równolegle do kolumny pikseli detektora CCD. Obróć próbkę w zakresie 360 projekcji, stosując przyrosty kątowe wynoszące jeden stopień, i wykonaj obrazy pod każdym kątem w oświetleniu przechodzącym, zarówno dla długości fal absorpcji, jak i fluorescencji. Oprogramowanie sterujące akwizycją automatycznie kontroluje migawkę głównego źródła światła, aby uniknąć ciągłego naświetlania i ograniczyć fotowyblaknięcie próbki.Migawka jest szczególnie istotna, gdy wymagane są długie czasy całkowania w celu stworzenia rekonstrukcji 3D z danych absorpcyjnych. Do rekonstrukcji 3D z obrazów fluorescencyjnych należy po prostu zastosować algorytm filtrowanej projekcji wstecznej Radona. Należy wziąć pod uwagę inne wkłady absorpcyjne, które są opisane w następnym segmencie wideo.Po wykonaniu kroków niezbędnych do rekonstrukcji absorpcyjnej, należy przeprowadzić kilka dodatkowych etapów w celu ukończenia rekonstrukcji fluorescencyjnej. Rekonstrukcję mapy optycznej przy braku rozpraszania światła można uzyskać przy użyciu powszechnego algorytmu filtrowanej projekcji wstecznej Radona. Proces ten jest analogiczny do dwuwymiarowej tomografii komputerowej rentgenowskiej.Podczas rekonstrukcji rozkładu fluorescencji zmienne, zależne od położenia tłumienie sprawia, że zastosowanie odwrotnej transformaty Radona do wstecznej projekcji obrazów fluorescencji jest błędne, co poważnie wpływa na uzyskane rozkłady białek fluorescencyjnych lub fluorescencyjnych sond molekularnych oraz na możliwość ich kwantyfikacji. Każdy promień o długości fali wzbudzenia Lambda X, emitowany z dowolnej pozycji źródła Xs, ulega tłumieniu wykładniczemu podczas przechodzenia przez obrazowany obiekt.Po wzbudzeniu fluorochromu znajdującego się w pozycji X, promieniowanie o długości fali emisji jest filtrowane i zbierane przez piksel matrycy CCD znajdujący się w pozycji XD przy użyciu systemu soczewek obrazujących Teleric. Choć emitowana fluorescencja nie biegnie tą samą drogą co promień wzbudzenia, natężenie rejestrowane w każdym pikselu przybliża projekcję wszystkich fluorochromów wzbudzonych w całej strefie ogniskowania odpowiadającej temu konkretnemu promieniowi wzbudzenia. Dzięki wysokiej telecentryczności systemu, obrazowany obiekt jest następnie obracany o 360 stopni, a za pomocą kamery CCD pozyskuje się wielokrotne pomiary źródło-detektor: UX przy długości fali wzbudzenia oraz UFL przy długości fali emisji.Następnie zostają one połączone w ramach znormalizowanego pola UB, zdefiniowanego jako stosunek tych dwóch wartości. Rekonstrukcję rozkładu fluorochromów można ułatwić poprzez zapisanie modelu bezpośredniego dla propagacji światła wzbudzenia i emisji, gdzie funkcja Greena opisuje wzbudzenie. Propagacja promieni przebiega zgodnie z prostym prawem Beera-Lamberta, w którym moo A jest wcześniej wyznaczonym rozkładem absorpcji optycznej.Natężenie światła UX emitowane ze źródła w położeniu excess i mierzone przez detektor w położeniu XD na C.C, D można zapisać jako iloczyn funkcji zielonej oraz stałej B zależnej od systemu. Następnie można obliczyć dokładny rozkład natężenia światła wzbudzenia GX wzdłuż każdej ścieżki promienia. Natężenie fluorescencji UFL rejestrowane przez detektor XD, wywołane światłem emitowanym ze źródła Xs, uwzględnia wkład wszystkich theros, które zostały wzbudzone wzdłuż ścieżki promienia od X do xd.Model przód naszego problemu obrazowania można zapisać jako ub ub, gdzie alpha obejmuje nieznane stałe zależne od systemu. Model przód jest następnie dyskretyzowany na przyjętej siatce, a następnie przeprowadza się inwersję w celu wyodrębnienia rozkładu fluorochromu, pozyskania sygnału transmisyjnego oraz fluorescencyjnego i wykorzystania konwencjonalnego algorytmu wstecznej projekcji do rekonstrukcji próbki. Tutaj przedstawiono rekonstrukcje z transmisyjnej i konwencjonalnej fluorescencyjnej optycznej tomografii projekcyjnej.Przedstawiono rekonstrukcję pojedynczej płaszczyzny serca w obrazowaniu absorpcyjnym oraz fluorescencyjnym. Prezentowana jest znormalizowana rekonstrukcja Borna, która ukazuje różnice w rozkładzie barwnika w obrębie serca. Po normalizacji zaprezentowano sposób konfiguracji układu do optycznej tomografii projekcyjnej oraz metodę usuwania artefaktów wynikających z absorpcji optycznej w rekonstrukcjach dla tomografii fluorescencyjnej.W rzeczywistości bardzo ważne jest pamiętanie o konieczności przejrzyszczania próbki w celu usunięcia wpływu światła rozproszonego, ale jednocześnie istotne jest zbalansowanie procesu przejrzyszczania, aby zachować jak największy wkład fluorescencji. Inną bardzo ważną kwestią przy stosowaniu tego podejścia jest obliczenie znormalizowanego stosunku dla kości, który uzyskuje się poprzez podzielenie obrazów fluorescencyjnych przez obrazy absorpcyjne. To wszystko.Dziękujemy za zapoznanie się z naszą wizualizacją eksperymentu i życzymy powodzenia w prowadzeniu własnych badań.

born-normalization-for-fluorescence-optical-projection-tomography-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Normalizacja urodzenia dla tomografii projekcyjnej fluorescencyjnej dla pełnego obrazu serca

Niniejszy artykuł opisuje podstawowe procedury przeprowadzania eksperymentów mapowania optycznego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa z wykorzystaniem panoramicznego systemu obrazowania oraz podwójnej modalności obrazowania (napięciowego i wapniowego).

Multiparametryczne mapowanie optyczne serca królika perfundowanego metodą Langendorffa

Opisujemy adaptację optycznej tomografii projekcyjnej (OPT)1 do obrazowania w bliskiej podczerwieni oraz implementację szeregu narzędzi obliczeniowych. Protokoły te umożliwiają ocenę masy β komórek trzustki (BCM) w większych próbkach, zwiększają wielokanałowość techniki i poprawiają jakość danych OPT.

Tomografia optyczna w bliskiej podczerwieni do oceny rozkładu masy komórek β w badaniach nad cukrzycą

Analiza ex vivo zmian w tętnicach z modeli zwierzęcych chorób sercowo-naczyniowych klasycznie opiera się na technikach histologicznych i immunohistochemicznych. Zapewniają one 2-wymiarowe pomiary w 3-wymiarowych zmianach. W artykule opisano generowanie zmian tętniczych do analizy ilościowej w 3 wymiarach z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej.

Generowanie i 3-wymiarowa ocena ilościowa zmian w tętnicach u myszy za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Opisujemy protokół obrazowania hybrydowego, łączący tomografię za pośrednictwem fluorescencji (FMT) z mikrotomografią komputerową (μCT). Po fuzji i rekonstrukcji przeprowadzamy interaktywną segmentację narządów w celu wyodrębnienia ilościowych pomiarów rozkładu fluorescencji.

Hybrydowe obrazowanie μCT-FMT i analiza obrazu

Ten protokół opisuje nowatorską metodę 3D porównywania tkanki mięśnia sercowego całego serca z MRI. Ma to na celu dokładną ocenę iniekcji domięśniowych w strefie granicznej zawału przewlekłego świńskiego modelu zawału mięśnia sercowego.

Analiza 3D tkanki mięśnia sercowego całego serca

Przedstawiamy metodę mezoskopowej rekonstrukcji całego serca myszy poprzez połączenie nowych osiągnięć w transformacji tkanek i barwieniu z rozwojem osiowo skanowanego mikroskopu świetlnego.

Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

Ten protokół przedstawia zbiór sarkomerów, wapnia i makroskopowych danych geometrycznych z aktywnie kurczącego się trabecula serca ex vivo. Te równoczesne pomiary są możliwe dzięki integracji trzech modalności obrazowania.

Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu, fluorescencji i optycznej koherentnej tomografii kurczących się beleczków serca ex vivo

Tutaj prezentujemy eksperymentalny protokół obrazowania do ilościowego oznaczania funkcji i morfologii serca za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości dla małych zwierząt. Pod uwagę brane są zarówno myszy, jak i szczury, omawiając różne wymagania dotyczące środków kontrastowych w tomografii komputerowej dla tych dwóch gatunków.

Pozytonowa tomografia emisyjna serca o wysokiej rozdzielczości/tomografia komputerowa dla małych zwierząt

Ten protokół przedstawia kompleksowy potok do analizy próbek pobranych z ludzkich serc, które obejmują mikroskopijne i makroskopowe skale.

Rurociąg do wieloskalowych trójwymiarowych badań anatomicznych ludzkiego serca

Dostarczamy wyczerpujący opis wewnętrznej metody retrospektywnego bramkowania serca CrumpCAT, prototypu tomografu komputerowego (CT) dla małych zwierząt, zaprojektowanego i zbudowanego w naszej instytucji badawczej.

Retrospektywne bramkowanie serca z prototypem rentgenowskiego tomografu komputerowego małych zwierząt

Poznaj metodę BnOPT do dokładnej rekonstrukcji fluorescencji w małych organach zwierzęcych, uwzględniającą właściwości absorpcyjne próbek. Technika ta poprawia jakość obrazowania tomograficznego serca.

Normalizacja tła w fluorescencyjnej optycznej tomografii projekcyjnej do obrazowania całego serca

Przeglądaj więcej filmów