Name: Wieloprzedziałowa platforma mikroprzepływowa do wspólnego hodowania neuronów i gleju w OUN (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-10T16:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania wieloprzedziałowego mikroprzepływowego urządzenia do wspólnego hodowania neuronów i gleju w OUN. Platforma umożliwia prowadzenie sześciu niezależnych eksperymentów równolegle przy użyciu innowacyjnej techniki hybrydowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant #1R21MH085267 z National Institutes of Health / National Institute of Mental Health (NIH/NIMH).

Część 1: Przygotowanie formy matki do wytworzenia wielokomorowego urządzenia do kokultury neuronów
<ol>
<li>Pierwszym krokiem wytwarzania matrycy PMMA jest wykonanie komór o głębokości 3,5 mm. Jedna komora ciała neuronu (soma) oraz sześć komór aksonowo-glejowych zostają zdefiniowane na bloku PMMA przy użyciu mikrofrezarki (MDX-40, Roland lub jakiejkolwiek innej frezarki CNC). Następnie matryca PMMA jest poddawana sonikacji w alkoholu izopropylowym przez 10 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń.</li>
<li>Układy struktur grzbietowych o wysokości 2,5 μm są formowane na szkiełku przedmiotowym o wymiarach 50,8 mm x 50,8 mm za pomocą standardowego procesu fotolitografii, a następnie poddawane trawieniu mokremu szkła. Najpierw układ struktur grzbietowych jest formowany na oczyszczonym podłożu szklanym z dodatnim fotorezystem S1818 za pomocą fotolitografii. S1818 jest nanoszony na podłoże metodą spin-coatingu (4000 rpm), poddawany wstępnemu wygrzewaniu (soft bake) w temperaturze 110°C przez 5 min, a następnie naświetlany światłem UV (84 mJ/cm2) przy użyciu wyrównywacza masek, po czym następuje wywoływanie fotorezystu w MF319 przez 40 sekund. Następnie podłoże szklane z naniesionym wzorem fotorezystu jest zanurzane w buforowanym trawaczu tlenków (BOE) w temperaturze pokojowej przez 6-7 minut, aby uzyskać struktury grzbietowe o wysokości 2,5 μm. Na koniec warstwa fotorezystu jest usuwana za pomocą acetonu i alkoholu izopropylowego, a następnie dokładnie płukana w wodzie dejonizowanej (DI).</li>
<li>Podłoże szklane z mikrostrukturami grzbietowymi jest poddawane tłoczeniu na gorąco przeciwko matrycy PMMA w celu przeniesienia wzorów. Najpierw matryca PMMA i podłoża szklane są ręcznie wyrównywane i umieszczane w prasie termicznej. Następnie temperatura jest podnoszona do 115 °C. Po osiągnięciu pożądanej temperatury przykłada się nacisk 0,5 tony przez 5 minut. Po 5 minutach temperatura jest obniżana do 40 °C, a ciśnienie zwalniane. Matryca PMMA jest następnie wycinana w blok o rozmiarze 50,8 mm x 50,8 mm.</li>
<li>Prepolimer PDMS (Sylgard 184) jest mieszany z utwardzaczem w stosunku masowym 10:1.</li>
<li>Matryca PMMA jest umieszczana w kasecie, a mieszanina PDMS jest wlewana na wierzch matrycy PMMA w celu wykonania matrycy PDMS. Jest ona następnie umieszczana w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej. Wlany na matrycę PMMA PDMS jest odgazowywany przez 15 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza powstałych podczas procesu mieszania PDMS.</li>
<li>Po usunięciu wszystkich pęcherzyków PDMS jest umieszczany w wypoziomowanym piekarniku w temperaturze 85 °C na jedną godzinę w celu polimeryzacji.</li>
<li>Po całkowitym utwardzeniu PDMS, matryca PDMS jest oddzielana od matrycy PMMA i umieszczana w eksykatorze z 2-3 kroplami trichlorosilanu, a następnie poddawana próżni przez 15 minut w celu naniesienia powłoki parowej na powierzchnię matrycy PDMS. Powłoka z trichlorosilanu ułatwia oddzielenie końcowych urządzeń PDMS do kokultury neuronów od matrycy PDMS. Po nałożeniu powłoki matryca PDMS jest krótko płukana alkoholem izopropylowym w celu usunięcia nadmiaru trichlorosilanu, a następnie suszona gazem N2.</li>
</ol>
Część 2: Replikacja urządzenia do hodowli neuronów
<ol>
<li>Prepolimer PDMS (Sylgard 184) miesza się z czynnikiem sieciującym w stosunku masowym 10:1.</li>
<li>Mieszaninę PDMS wlewa się na matrycę PDMS, a następnie odgazowuje w deskryptorze podłączonym do pompy próżniowej przez 15 minut. Ważne jest, aby nie wlewać zbyt dużej ilości PDMS, tak aby struktura PDMS o wysokości 3,5 mm na matrycy nie została całkowicie zanurzona.</li>
<li>Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza PDMS umieszcza się w wypoziomowanym piekarniku o temperaturze 85 °C na jedną godzinę w celu polimeryzacji.</li>
<li>Po godzinie PDMS wyjmuje się z piekarnika i pozostawia do ostygnięcia w temperaturze pokojowej. Następnie urządzenia do hodowli neuronów z PDMS delikatnie odkleja się od matrycy PDMS. Odklejone urządzenia PDMS owija się parafilmem, aby chronić je przed kurzem lub zanieczyszczeniami.</li>
<li>Urządzenia PDMS owinięte parafilmem tnie się na pojedyncze elementy za pomocą wiertarki stołowej wyposażonej w ostrze.</li>
</ol>
Część 3: Montaż urządzenia
<ol>
<li>Urządzenie PDMS do hodowli neuronów umieszcza się w oczyszczaczu plazmowym i poddaje działaniu plazmy powietrznej przez 90 sekund, aby uczynić powierzchnię urządzenia PDMS hydrofilową. Obróbka plazmą ułatwi wypełnienie mikrokanałów pożywką hodowlaną po montażu na podłożu pokrytym poli-d-lizyną.</li>
<li>Urządzenia poddane działaniu plazmy zanurza się następnie w 70 % etanolu na 30 minut w celu sterylizacji, a następnie przenosi do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza.</li>
<li>Zsterylizowane urządzenia wyjmuje się z 70 % etanolu i osusza gazem N2 filtrowanym przez filtr Millipore. Osuszone urządzenia kładzie się na polistyrenowej płytce hodowlanej z 6 dołkami pokrytej poli-d-lizyną i delikatnie dociska, aby zapewnić szczelne połączenie między podłożem a urządzeniem.</li>
<li>Następnie do komory somy wlewa się pożywkę hodowlaną, a po niej do sześciu komór akson/gleby. Po dodaniu pożywki do komory somy zaleca się odczekać 1-2 minuty przed wypełnieniem komór akson/gleby, aby upewnić się, że w mikrokanałach nie pozostały pęcherzyki powietrza.</li>
<li>Urządzenia wypełnione pożywką hodowlaną inkubuje się w temperaturze 37 °C przez noc, aby wypłukać ewentualne zanieczyszczenia lub toksyczne pozostałości.</li>
</ol>
Część 4: Ładowanie komórek i kokultura neuronów z oligodendrocytami
<ol>
<li>Pierwszego dnia hodowli komórkowej pierwotne neurony przedmózgowia szczurów z 16-18 dnia embrionalnego są wprowadzane do komory somy z gęstością powierzchniową 500 cells/mm2. Przed załadunkiem komórek należy odessać pipetą podłoża hodowlane z komory somy oraz z komór aksonów/gleju. Następnie do komory somy, w okolice wlotów mikrokanałów, wprowadza się 38500 komórek rozcieńczonych w 40 μl pożywki hodowlanej. Ważne jest, aby nie dotykać urządzenia PDMS podczas załadunku komórek, ponieważ może to naruszyć uszczelnienie między urządzeniem a podłożem.</li>
<li>Urządzenia z załadowanymi komórkami inkubuje się przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aby zwiększyć adhezję komórek do podłoża. Po inkubacji wszystkie komory wypełnia się pożywką hodowlaną.</li>
<li>Komórki hoduje się w temperaturze 37 °C w humidyfikowanym inkubatorze z 5 % CO2, wymieniając jedynie połowę pożywki hodowlanej co 3-4 dni.</li>
<li>Po 14 dniach hodowli neuronów in vitro, do komór aksonów/gleju dodaje się oligodendrocyty w celu stworzenia kokultury. Oligodendrocyty, wyizolowane z półkul mózgowych szczurów Sprague-Dawley w 1-2 dobie po urodzeniu, dodaje się do każdej komory aksonów/gleju z gęstością powierzchniową 1000 cells/mm2. Przed załadunkiem komórek odsysa się pipetą około 60 % pożywki hodowlanej z komór. Należy zachować ostrożność, aby nie dotknąć dolnego podłoża, ponieważ może to uszkodzić uformowaną na nim sieć aksonalną. Następnie do komór aksonów/gleju dodaje się 6700 komórek oligodendrocytów rozcieńczonych w 5 μl pożywki hodowlanej. Komórki inkubuje się przez 1 godzinę, a następnie komory wypełnia się pożywką hodowlaną.</li>
<li>Komórki hoduje się w temperaturze 37 °C w humidyfikowanym inkubatorze z 5 % CO2, wymieniając jedynie połowę pożywki hodowlanej co 3-4 dni przez kolejne dwa tygodnie.</li>
</ol>
Część 5: Reprezentatywne wyniki:
Przy prawidłowym przeprowadzeniu eksperymentów komórki neuronów umieszczone w przedziale soma lokalizują się blisko wlotów mikrokanałów, a warstwa aksonalna zaczyna formować się w przedziałach akson/glia po 1 tygodniu hodowli. Agregacja komórek neuronów w przedziale soma może wskazywać na brak zdrowotności komórek. Podczas wprowadzania oligodendrocytów po dwóch tygodniach hodowli neuronów, przedziały akson/glia powinny być pokryte gęstą warstwą aksonów, a oligodendrocyty powinny zostać załadowane na wierzch warstwy aksonalnej.
<img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig1tmb.jpg" border="0" alt="Schemat hodowli neuronów; płytka powleczona PDL, przedziały akson/soma, badanie interakcji akson-glej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 1"> Rycina 1. Schematyczne ilustracje wysokoprzepustowej mikrofluidycznej wieloprzedziałowej platformy do kokultury neuronów OUN. Widok w przekroju pokazujący izolację aksonów od ciał neuronów (soma) i dendrytów, a także izolację fluidyczną między przedziałami przy minimalnej różnicy poziomów cieczy. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig1.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.
<img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig2tmb.jpg" border="0" alt="Wytwarzanie mikrokanałów; schemat; proces tworzenia urządzenia z PDMS; frezowanie, powlekanie; badania nad mikrofluidyką." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 2"> Rycina 2. Kroki wytwarzania i montażu wielokomorowego mikrofluidycznego urządzenia do kokultury z PDMS. Każde urządzenie pasuje do jednego dołka konwencjonalnej polistyrenowej płytki hodowlanej z 6 dołkami. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig2.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2.

<ol><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. 37, 550-575 (1998).</li>
<li>Taylor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
<li>Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxynitrite+generated+by+inducible+nitric+oxide+synthase+and+NADPH+oxidase+mediates+microglial+toxicity+to+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Opracowaliśmy wielokomorową platformę do kokultury w celu badania oddziaływań akson-glej w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) ssaków. Aksony OUN zostały pomyślnie odizolowane od ciał komórek neuronalnych i dendrytów, a oligodendrocyty pomyślnie poddano kokulturze wewnątrz urządzenia. Gęstość neuronów może być dostosowana do zastosowania, jednak zbyt niskie lub zbyt wysokie stężenie może prowadzić do obumarcia komórek. Ważne jest również, aby wymieniać tylko połowę pożywki hodowlanej, aby nie uszkodzić komórek lub warstwy...

wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury neuronów i gleju ośrodkowego układu nerwowego

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

Prezentujemy nowatorską platformę w postaci wielokomorowego mikrosystemu do kokultury neuronów, przeznaczoną do badań interakcji aksonalno-glejowych w OUN in vitro, umożliwiającą prowadzenie do sześciu niezależnych eksperymentów równolegle w celu zwiększenia przepustowości. Opracowaliśmy nową metodę wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych posiadających struktury w skali mikro i makro w obrębie jednego urządzenia za pomocą pojedynczego procesu soft-litografii, co umożliwia masową produkcję przy zachowaniu dobrej powtarzalności.
Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury składa się z jednej komory somy dla neuronów oraz sześciu komór akson/glej dla oligodendrocytów (OLs). Komora somy i komory akson/glej są połączone macierzami mikrokanałów prowadzących aksony, które pełnią funkcję barier fizycznych ograniczających somy neuronów do komory somy, jednocześnie umożliwiając wzrost aksonów do komór akson/glej. Oligodendrocy wprowadzone do komór akson/glej mogą oddziaływać wyłącznie z aksonami, a nie z somami czy dendrytami neuronów, co umożliwia prowadzenie zlokalizowanych badań nad interakcjami akson-glej. Mikrokanały zapewniają również izolację fluidyczną między komorami, co pozwala na przeprowadzenie sześciu niezależnych eksperymentów na jednym urządzeniu w celu zwiększenia przepustowości.
Miękka litografia z wykorzystaniem poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) jest powszechnie stosowaną techniką w produkcji biomedycznych mikro urządzeń. Zbiorniki w tych urządzeniach są zazwyczaj definiowane poprzez ręczne wycinanie otworów. Mimo prostoty, słabe dopasowanie oraz czasochłonność sprawiają, że proces ten nie jest odpowiedni w przypadku konieczności wielokrotnego tworzenia dużej liczby zbiorników. Nowo opracowana metoda nie wymaga ręcznego wycinania zbiorników, co pozwala pokonać te ograniczenia. Najpierw w bloku z poli(metakrylanu metylu) (PMMA) wykonano siedem zbiorników (głębokość: 3.5 mm) przy użyciu mikrofrezarki. Następnie macierze mikrostruktur w formie grzbietów, wykonane na podłożu szklanym, zostały wytłoczone na gorąco w bloku PMMA w celu zdefiniowania mikrokanałów łączących przedziały somy i aksonu/gleby. Proces ten pozwolił na uzyskanie w ramach jednej matrycy PMMA zbiorników w skali makro (3.5 mm) oraz kanałów w skali mikro (2.5 μm). Replika z PDMS, która służyła jako matryca formy, została uzyskana metodą miękkiej litografii, a finalne urządzenie z PDMS zostało odtworzone z tej matrycy.
Pierwotne neurony od szczurów w dniach embrionalnych E16-18 wprowadzono do przedziału somy i hodowano przez dwa tygodnie. Po jednym tygodniu hodowli komórkowej aksony przeszły przez mikrokanały i utworzyły warstwę sieci składającą się wyłącznie z aksonów wewnątrz przedziałów akson/glia. Aksony rosły równomiernie przez sześć przedziałów akson/glia, a w 14. dniu in vitro do przedziałów akson/glia dodano oligodendrocy (OLs) od szczurów w dniach postnatalnych P1-2 w celu stworzenia kokultury.

Opracowaliśmy nowatorską wielokomorową platformę mikrosystemową do kokultury neuronów, przeznaczoną do badań nad oddziaływaniami aksonów i gleju w OUN in vitro. Platforma ta umożliwia prowadzenie do sześciu niezależnych eksperymentów równolegle i została wykonana przy użyciu nowo opracowanej hybrydowej metody fabrykacji makro/mikro.

Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury neuronów i gleju ośrodkowego układu nerwowego

Przedstawiamy nowatorską platformę w postaci wielokomorowego mikrosystemu do kokultury neuronów, przeznaczoną do badań in vitro nad oddziaływaniami aksonowo-glejowymi w ośrodkowym układzie nerwowym, zdolną do prowadzenia do ...

Wytwarzanie wielokomorowego mikrofluidycznego urządzenia do kokultury neuronów rozpoczyna się od wydefiniowania zbiorników w bloku PMMA za pomocą frezarki, a następnie poprzez tłoczenie na gorąco macierzy mikrokanałów łączących poszczególne komory. Po przygotowaniu formy z PMMA, z tej formy powielana jest matryca z PDMS, którą następnie powleka się trichloroetylenem. Końcowe urządzenie jest powielane z matrycy z PDMS i montowane na płytce hodowlanej powlekanej PDL.Pierwotne neurony szczurze z E 16 do 18 są następnie wprowadzane do komory somy i hodowane przez dwa tygodnie przed dodaniem szczurzych komórek oligodendrocytów P 1 do 2 na wierzch warstw aksonalnych wewnątrz komory akson ggl w celu ko-kultury. Cześć, jestem J Par z Laboratorium Nano Bio Systems w Departamencie Inżynierii Elektrycznej i Komputerowej na Texas A&amp;M University. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wytwarzania wielokomorowej mikrofluidycznej platformy do ko-kultury neuronów.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania interakcji między neuronami a glejem ośrodkowego układu nerwowego in vitro. Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, należy użyć mikrofrezarki do wykonania komór o głębokości 3.5 millimeter.W bloku A-P-M-M-A zdefiniuj jeden przedział soma oraz sześć przedziałów ggl aksonu. Po przygotowaniu przedziałów poddaj je sonikacji w izopropanolu przez 10 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń, wykonaj struktury mikrowypustek na szkiełku przedmiotowym za pomocą konwencjonalnej fotolitografii i procesu trawienia mokrego, a następnie wykonaj gorące tłoczenie wzorów mikrowypustek z przeszklenia. Przesuń na matrycę PMMA, a następnie ręcznie wyrównaj matrycę formy PMMA i podłoże szklane.Następnie zwiększ temperaturę do 115 °C w prasie termicznej. Po osiągnięciu tej temperatury przyłóż obciążenie wynoszące 0,5 t na pięć minut. Po pięciu minutach schłodź próbkę do 40 °C i zwolnij nacisk.Następnie należy przystąpić do przygotowania formy matrycy z PDMS. Wymieszać prepolimer PDMS z utwardzaczem w stosunku masowym 10:1, a matrycę z PMMA pociąć na bloki o wymiarach 50 mm na 50 mm. Przy użyciu piły taśmowej umieścić blok w kasecie i wylać mieszaninę PDMS na matrycę z PMMA, a następnie umieścić kasetę w eksyكاته połączonym z pompą próżniową i DGAs na 15 minut.W celu usunięcia pęcherzyków powietrza powstałych podczas procesu mieszania PDMS. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków, umieść formę w wypoziomowanej piecowni w temperaturze 85 stopni Celsiusiusza na jedną godzinę w celu polimeryzacji. Po całkowitym utwardzeniu PDMS, odklej matrycę PDMS od matrycy PMMA, a następnie poddaj matrycę PDMS naparowaniu, umieszczając ją w eksykatorku z dwiema do trzech kropli trichloroetylenu i stosując próżnię przez 15 minut.Powlekanie matrycy PDMS ułatwia oddzielenie gotowego urządzenia do kokultury neuronów PDMS od formy matrycy PDMS. Po powleczeniu matrycę PDMS krótko płucze się alkoholem izopropylowym w celu usunięcia nadmiaru trichloroetylenu, a następnie suszy strumieniem azotu. Fabrykacja urządzenia do kokultury neuronów z polimeru PDMS przebiega analogicznie do przygotowania formy matrycy PDMS opisanego w poprzedniej sekcji. Należy rozpocząć od zmieszania prepolimeru PDMS z utwardzaczem w stosunku masowym 10:1, a następnie wylać mieszaninę PDMS na matrycę PDMS. Ważne jest, aby nie wlewać zbyt dużej ilości PDMS, tak aby struktura PDMS o wysokości 3,5 mm na matrycy nie została całkowicie zanurzona.DGAs wewnątrz eksykatora podłączonego do pompy próżniowej przez 15 minut. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza, umieść PDMS w wypoziomowanej piecu ustawionym na 85 stopni Celsiusia na jedną godzinę w celu polimeryzacji. Po upływie godziny wyjmij PDMS z pieca i pozostaw w temperaturze pokojowej do ostygnięcia. Następnie delikatnie odklej urządzenia do hodowli neuronów z PDMS od matrycy PDMS.Owiń urządzenia z PDMS parafomą, aby chronić je przed kurzem i zanieczyszczeniami. Na koniec potnij owinięte w parafomę bloki PDMS na pojedyncze elementy za pomocą wiertarki stołowej wyposażonej w ostrze; w ten sposób urządzenia PDMS do kokultury neuronów są prawie gotowe do użycia w płytkach hodowlanych. Przed umieszczeniem urządzenia PDMS do kokultury neuronów w płytce hodowlanej, włóż je do oczyszczacza plazmowego i poddaj działaniu plazmy powietrznej przez 90 sekund, aby powierzchnia stała się hydrofilowa.Obróbka ta ułatwi wypełnienie mikrokanałów pożywką hodowlaną po montażu na płytkach powlekanych poli-L-lizyną. W celu sterylizacji urządzenia poddanego działaniu plazmy, należy zanurzyć je w 70% etanolu na 30 minut, a następnie przenieść pojemnik do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza. Po 30 minutach należy wyjąć urządzenie i osuszyć je azotem przefiltrowanym przez filtr Millipore o rozmiarze porów 0,2 mikrona.Następnie umieść wysuszone urządzenia na powierzchni polistyrenowej płytki hodowlanej z sześcioma dołkami pokrytej poli-D-lizyną i delikatnie dociśnij, aby zapewnić szczelne połączenie między powierzchnią płytki hodowlanej a lodem urządzenia. Teraz napełnij komorę somy pożywką hodowlaną. Odczekaj minutę lub dwie, aby upewnić się, że w mikrokanałach nie pozostały pęcherzyki powietrza.Następnie wypełnij sześć komór glejowych aksonów. Na koniec inkubuj urządzenia wypełnione pożywką hodowlaną w inkubatorze w temperaturze 37°C przez noc, aby usunąć wszelkie ewentualne zanieczyszczenia lub toksyczne pozostałości. Po nocnej inkubacji można rozpocząć hodowlę w celu przygotowania do załadowania komórek do urządzenia.Za pomocą pipety odessać pożywkę hodowlaną z komór Soma i Axon. Następnie nanieść 40 µL pierwotnych neuronów przedmózgowia szczurów z 16. do 18. dnia embrionalnego do komory soma w okolicy wlotów mikrokanałów, zachowując gęstość powierzchniową 500 komórek na mm². Ważne jest, aby nie dotykać urządzenia z PDMS podczas nanoszenia komórek, ponieważ może to naruszyć szczelność połączenia między urządzeniem a płytką do hodowli komórek.Te obrazy mikroskopowe przedstawiają neurony zabarwione barwnikiem wapnia. W obrębie somy komórki są rozmieszczone jednorodnie i znajdują się w bliskim sąsiedztwie kanałów mikrofluidycznych. Inkubuj urządzenia z załadowanymi komórkami przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aby zwiększyć adhezję komórek do podłoża.Po tej inkubacji należy wypełnić wszystkie komory pożywką hodowlaną. Hodowlę komórek w urządzeniu należy prowadzić w temperaturze 37°C w inkubatorze z wilgotnym powietrzem i 5% CO2, wymieniając jedynie połowę pożywki hodowlanej co trzy lub cztery dni. W komorach Axon glia powinna wytworzyć się gęsta sieć aksonalna.Po dwóch tygodniach hodowli, przed załadowaniem komórek, odsysa się około 60% pożywki z przedziałów zawierających pierwotne neurony in vitro. Oligodendrocyty wyizolowano z półkul mózgu szczurów rasy Sprague Dawley w pierwszym lub drugim dniu po urodzeniu. Do każdego przedziału z gleją aksonalną dodaje się 5 µL zawiesiny oligodendrocytów przy gęstości 1000 komórek/mm². Należy zachować ostrożność, aby podczas ładowania nie dotknąć pipetą podłoża, ponieważ może to uszkodzić sieć aksonalną utworzoną na powierzchni. Po dodaniu oligodendrocytów komórki inkubuje się przez jedną godzinę w temperaturze 37°C, a następnie dopełnia pożywkę w przedziałach.Kontynuuj hodowlę neuronów w pożywkach tak jak przed dodaniem CLIA, wymieniając jedynie połowę pożywki co trzy lub cztery dni przez kolejne dwa tygodnie, badając interakcje między aksonami a glejem w ssaczym ośrodkowym układzie nerwowym. Jeśli eksperymenty są przeprowadzone prawidłowo, komórki neuronów załadowane do komory somy lokują się blisko wlotów mikrokanałów, a wewnątrz komór axon Ggl zaczyna tworzyć się warstwa aksonalna.Po jednym tygodniu hodowli oznaki agregacji neuronów wewnątrz przedziału soma mogą wskazywać na to, że komórki nie są zdrowe podczas wprowadzania oligodendrocytów. Po dwóch tygodniach hodowli neuronów przedziały aksonalne powinny być pokryte gęstą warstwą aksonów, a oligodendrocy powinny zostać naniesione na wierzch warstwy aksonalnej. Przedstawiliśmy właśnie sposób wykonania wieloprzedziałowej platformy do kokultury neuronowej oraz sposób jej wykorzystania do badania interakcji neurogleju OUN in vitro.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby chronić urządzenia przed kurzem i nie sterylizować ich w etanolu przez zbyt długi czas, ponieważ może to pogorszyć wiązanie. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

a-multi-compartment-cns-neuron-glia-co-culture-microfluidic-platform

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma współhodowania neuronów i komórek glejowych OUN

W tym filmie prezentujemy technikę soft lithography z wykorzystaniem polidimetylosiloksanu (PDMS), której używamy do wykonania urządzenia mikroprzepływowego do hodowli neuronów.

Wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego do kompartymentacji somy i aksonów neuronów

W tym filmie demonstrujemy przygotowanie neuronów korowych szczura z 18. dnia embrionalnego (E18).

Przygotowanie neuronów korowych szczura z 18. dnia embrionalnego (E18) do kompartymentacji w urządzeniu mikroprzepływowym

Niniejszy film opisuje wytwarzanie i zastosowanie urządzenia mikroprzepływowego do hodowli neuronów ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Urządzenie to jest kompatybilne z...

BioMEMS: nawiązywanie nowych współprac pomiędzy biologami a inżynierami

Niniejsze badanie opisuje procedury tworzenia nowatorskiej platformy do kokultury aksonów neuronalnych i (astro)gleju. W tym systemie kokultury możliwa staje się manipulacja bezpośrednią interakcją między pojedynczym aksonem (i pojedynczą komórką glejową), co pozwala na analizę mechanistyczną wzajemnego sygnalizowania między neuronem a glejem.

Analiza obrazowa oddziaływań neuronów z glejem w systemie kokultury aksonów neuronowych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej (MCP)

Ten film demonstruje wykorzystanie wstępnie zmontowanego plastikowego chipa mikroprzepływowego do podzielonej na przedziały hodowli pierwotnych neuronów hipokampa szczura. Neurony są umieszczane w jednym z przedziałów mikroprzepływowych, gdzie przyczepiają się i rosną, przedłużając swoje aksony przez mikrorowki chipa do sąsiedniego przedziału. Wąskie mikrorowki zapobiegają przedostawaniu się ciał komórek neuronalnych, umożliwiając w ten sposób fizyczną separację między przedziałami somatycznymi...

Podzielona na przedziały pierwotna hodowla neuronów mysich przy użyciu plastikowych chipów mikroprzepływowych

Ten film demonstruje ocenę aktywności elektrycznej neuronów w kokulturze pochodzących z hiPSC korowych neuronów glutaminergicznego i komórek glejaka przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego z układami wieloelektrodowymi.

Ocena interakcji neuronów glutaminergicznego i komórek glejaka w kokulturze

Opisane są protokoły dla układu mikroprzepływowego pojedynczego neuronu i maskowania wody dla wbudowanego w układ plazmowy wzór powłok biomateriałowych. Wysoce powiązane ze sobą kokultury można przygotować przy użyciu minimalnego wkładu komórek.

Przygotowanie kokultur neuronalnych z precyzją pojedynczej komórki

Ten protokół opisuje użycie plastikowych chipów do hodowli i podziału pierwotnych neuronów mysich. Chipy te są wstępnie zmontowane, przyjazne dla użytkownika i kompatybilne z obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości, na żywo i fluorescencyjnym. Protokół ten opisuje, w jaki sposób umieścić neurony hipokampa szczura w tych chipach i przeprowadzić izolację płynów, aksotomię i barwienie immunologiczne.

Wykorzystanie wstępnie zmontowanych plastikowych chipów mikroprzepływowych do podziału pierwotnych neuronów mysich

Ten protokół demonstruje użycie podzielonych na przedziały mikroprzepływowych chipów, formowanych wtryskowo w cyklicznym kopolimerze olefin, do hodowanych neuronów zróżnicowanych od ludzkich komórek macierzystych. Chipy te są wstępnie zmontowane i łatwiejsze w użyciu niż tradycyjne urządzenia z poli(dimetylosiloksanu) z przedziałami. Opisano tutaj wiele powszechnych paradygmatów eksperymentalnych, w tym znakowanie wirusów, izolację płynów, aksotomię i barwienie immunologiczne.

Podział neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych na wstępnie zmontowane plastikowe chipy mikroprzepływowe

Ten protokół opisuje kokulturę mikrogleju i neuronów utworzoną z pierwotnych komórek nerwowych wyizolowanych z embrionalnych zarodków myszy w 15-16 dniach embrionalnych oraz pierwotnego mikrogleju generowanego z mózgów nowonarodzonych myszy w 1-2 dniach po urodzeniu.

Generowanie i kokultura mysich pierwotnych mikrogleju i neuronów korowych

Protokół ten opisuje system mikroprzepływowy modelujący dynamikę metaboliczną neuronów po uszkodzeniu aksonalnym, umożliwiając obrazowanie, analizę multiomiczną i mechanistyczne badania wewnętrznej przebudowy metabolicznej.

Chip mikroprzepływowy do budowy modeli uszkodzeń aksonalnych i umożliwiający analizę multiomiczną

Poznaj metodę wytwarzania wieloprzedziałowego mikroprzepływowego urządzenia do wspólnego hodowania neuronów i gleju w OUN. Platforma umożliwia prowadzenie sześciu niezależnych eksperymentów równolegle przy użyciu innowacyjnej techniki hybrydowej.

Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury neuronów i gleju ośrodkowego układu nerwowego

Przeglądaj więcej filmów