Wielokomorowa mikrofluidyczna platforma do kokultury neuronów i gleju ośrodkowego układu nerwowego

Wytwarzanie wielokomorowego mikrofluidycznego urządzenia do kokultury neuronów rozpoczyna się od wydefiniowania zbiorników w bloku PMMA za pomocą frezarki, a następnie poprzez tłoczenie na gorąco macierzy mikrokanałów łączących poszczególne komory. Po przygotowaniu formy z PMMA, z tej formy powielana jest matryca z PDMS, którą następnie powleka się trichloroetylenem. Końcowe urządzenie jest powielane z matrycy z PDMS i montowane na płytce hodowlanej powlekanej PDL.

Pierwotne neurony szczurze z E 16 do 18 są następnie wprowadzane do komory somy i hodowane przez dwa tygodnie przed dodaniem szczurzych komórek oligodendrocytów P 1 do 2 na wierzch warstw aksonalnych wewnątrz komory akson ggl w celu ko-kultury. Cześć, jestem J Par z Laboratorium Nano Bio Systems w Departamencie Inżynierii Elektrycznej i Komputerowej na Texas A&M University. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wytwarzania wielokomorowej mikrofluidycznej platformy do ko-kultury neuronów.

W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania interakcji między neuronami a glejem ośrodkowego układu nerwowego in vitro. Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, należy użyć mikrofrezarki do wykonania komór o głębokości 3.5 millimeter.

W bloku A-P-M-M-A zdefiniuj jeden przedział soma oraz sześć przedziałów ggl aksonu. Po przygotowaniu przedziałów poddaj je sonikacji w izopropanolu przez 10 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń, wykonaj struktury mikrowypustek na szkiełku przedmiotowym za pomocą konwencjonalnej fotolitografii i procesu trawienia mokrego, a następnie wykonaj gorące tłoczenie wzorów mikrowypustek z przeszklenia. Przesuń na matrycę PMMA, a następnie ręcznie wyrównaj matrycę formy PMMA i podłoże szklane.

Następnie zwiększ temperaturę do 115 °C w prasie termicznej. Po osiągnięciu tej temperatury przyłóż obciążenie wynoszące 0,5 t na pięć minut. Po pięciu minutach schłodź próbkę do 40 °C i zwolnij nacisk.

Następnie należy przystąpić do przygotowania formy matrycy z PDMS. Wymieszać prepolimer PDMS z utwardzaczem w stosunku masowym 10:1, a matrycę z PMMA pociąć na bloki o wymiarach 50 mm na 50 mm. Przy użyciu piły taśmowej umieścić blok w kasecie i wylać mieszaninę PDMS na matrycę z PMMA, a następnie umieścić kasetę w eksyكاته połączonym z pompą próżniową i DGAs na 15 minut.

W celu usunięcia pęcherzyków powietrza powstałych podczas procesu mieszania PDMS. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków, umieść formę w wypoziomowanej piecowni w temperaturze 85 stopni Celsiusiusza na jedną godzinę w celu polimeryzacji. Po całkowitym utwardzeniu PDMS, odklej matrycę PDMS od matrycy PMMA, a następnie poddaj matrycę PDMS naparowaniu, umieszczając ją w eksykatorku z dwiema do trzech kropli trichloroetylenu i stosując próżnię przez 15 minut.

Powlekanie matrycy PDMS ułatwia oddzielenie gotowego urządzenia do kokultury neuronów PDMS od formy matrycy PDMS. Po powleczeniu matrycę PDMS krótko płucze się alkoholem izopropylowym w celu usunięcia nadmiaru trichloroetylenu, a następnie suszy strumieniem azotu. Fabrykacja urządzenia do kokultury neuronów z polimeru PDMS przebiega analogicznie do przygotowania formy matrycy PDMS opisanego w poprzedniej sekcji. Należy rozpocząć od zmieszania prepolimeru PDMS z utwardzaczem w stosunku masowym 10:1, a następnie wylać mieszaninę PDMS na matrycę PDMS. Ważne jest, aby nie wlewać zbyt dużej ilości PDMS, tak aby struktura PDMS o wysokości 3,5 mm na matrycy nie została całkowicie zanurzona.

DGAs wewnątrz eksykatora podłączonego do pompy próżniowej przez 15 minut. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza, umieść PDMS w wypoziomowanej piecu ustawionym na 85 stopni Celsiusia na jedną godzinę w celu polimeryzacji. Po upływie godziny wyjmij PDMS z pieca i pozostaw w temperaturze pokojowej do ostygnięcia. Następnie delikatnie odklej urządzenia do hodowli neuronów z PDMS od matrycy PDMS.

Owiń urządzenia z PDMS parafomą, aby chronić je przed kurzem i zanieczyszczeniami. Na koniec potnij owinięte w parafomę bloki PDMS na pojedyncze elementy za pomocą wiertarki stołowej wyposażonej w ostrze; w ten sposób urządzenia PDMS do kokultury neuronów są prawie gotowe do użycia w płytkach hodowlanych. Przed umieszczeniem urządzenia PDMS do kokultury neuronów w płytce hodowlanej, włóż je do oczyszczacza plazmowego i poddaj działaniu plazmy powietrznej przez 90 sekund, aby powierzchnia stała się hydrofilowa.

Obróbka ta ułatwi wypełnienie mikrokanałów pożywką hodowlaną po montażu na płytkach powlekanych poli-L-lizyną. W celu sterylizacji urządzenia poddanego działaniu plazmy, należy zanurzyć je w 70% etanolu na 30 minut, a następnie przenieść pojemnik do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza. Po 30 minutach należy wyjąć urządzenie i osuszyć je azotem przefiltrowanym przez filtr Millipore o rozmiarze porów 0,2 mikrona.

Następnie umieść wysuszone urządzenia na powierzchni polistyrenowej płytki hodowlanej z sześcioma dołkami pokrytej poli-D-lizyną i delikatnie dociśnij, aby zapewnić szczelne połączenie między powierzchnią płytki hodowlanej a lodem urządzenia. Teraz napełnij komorę somy pożywką hodowlaną. Odczekaj minutę lub dwie, aby upewnić się, że w mikrokanałach nie pozostały pęcherzyki powietrza.

Następnie wypełnij sześć komór glejowych aksonów. Na koniec inkubuj urządzenia wypełnione pożywką hodowlaną w inkubatorze w temperaturze 37°C przez noc, aby usunąć wszelkie ewentualne zanieczyszczenia lub toksyczne pozostałości. Po nocnej inkubacji można rozpocząć hodowlę w celu przygotowania do załadowania komórek do urządzenia.

Za pomocą pipety odessać pożywkę hodowlaną z komór Soma i Axon. Następnie nanieść 40 µL pierwotnych neuronów przedmózgowia szczurów z 16. do 18. dnia embrionalnego do komory soma w okolicy wlotów mikrokanałów, zachowując gęstość powierzchniową 500 komórek na mm². Ważne jest, aby nie dotykać urządzenia z PDMS podczas nanoszenia komórek, ponieważ może to naruszyć szczelność połączenia między urządzeniem a płytką do hodowli komórek.

Te obrazy mikroskopowe przedstawiają neurony zabarwione barwnikiem wapnia. W obrębie somy komórki są rozmieszczone jednorodnie i znajdują się w bliskim sąsiedztwie kanałów mikrofluidycznych. Inkubuj urządzenia z załadowanymi komórkami przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aby zwiększyć adhezję komórek do podłoża.

Po tej inkubacji należy wypełnić wszystkie komory pożywką hodowlaną. Hodowlę komórek w urządzeniu należy prowadzić w temperaturze 37°C w inkubatorze z wilgotnym powietrzem i 5% CO2, wymieniając jedynie połowę pożywki hodowlanej co trzy lub cztery dni. W komorach Axon glia powinna wytworzyć się gęsta sieć aksonalna.

Po dwóch tygodniach hodowli, przed załadowaniem komórek, odsysa się około 60% pożywki z przedziałów zawierających pierwotne neurony in vitro. Oligodendrocyty wyizolowano z półkul mózgu szczurów rasy Sprague Dawley w pierwszym lub drugim dniu po urodzeniu. Do każdego przedziału z gleją aksonalną dodaje się 5 µL zawiesiny oligodendrocytów przy gęstości 1000 komórek/mm². Należy zachować ostrożność, aby podczas ładowania nie dotknąć pipetą podłoża, ponieważ może to uszkodzić sieć aksonalną utworzoną na powierzchni. Po dodaniu oligodendrocytów komórki inkubuje się przez jedną godzinę w temperaturze 37°C, a następnie dopełnia pożywkę w przedziałach.

Kontynuuj hodowlę neuronów w pożywkach tak jak przed dodaniem CLIA, wymieniając jedynie połowę pożywki co trzy lub cztery dni przez kolejne dwa tygodnie, badając interakcje między aksonami a glejem w ssaczym ośrodkowym układzie nerwowym. Jeśli eksperymenty są przeprowadzone prawidłowo, komórki neuronów załadowane do komory somy lokują się blisko wlotów mikrokanałów, a wewnątrz komór axon Ggl zaczyna tworzyć się warstwa aksonalna.

Po jednym tygodniu hodowli oznaki agregacji neuronów wewnątrz przedziału soma mogą wskazywać na to, że komórki nie są zdrowe podczas wprowadzania oligodendrocytów. Po dwóch tygodniach hodowli neuronów przedziały aksonalne powinny być pokryte gęstą warstwą aksonów, a oligodendrocy powinny zostać naniesione na wierzch warstwy aksonalnej. Przedstawiliśmy właśnie sposób wykonania wieloprzedziałowej platformy do kokultury neuronowej oraz sposób jej wykorzystania do badania interakcji neurogleju OUN in vitro.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby chronić urządzenia przed kurzem i nie sterylizować ich w etanolu przez zbyt długi czas, ponieważ może to pogorszyć wiązanie. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.