Name: Sekcja dysków imaginalnych z larw Drosophila w 3. stadium rozwojowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Naucz się techniki sekcji dysków imaginalnych z larw Drosophila w 3. stadium rozwojowym. Metoda umożliwia izolację tkanek skrzydeł, nóg i oczu do badań nad biologią rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych informacji do ujawnienia.

wypreparowanie tarczek imaginalnych z larw drosophila w trzecim stadium rozwojowym

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

Niniejszy protokół przedstawia technikę sekcji stosowaną do izolacji tarcz imaginalnych z larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym. Metody utrwalania tkanki po wycięciu i usunięciu tarcz skrzydłowych, odnóży oraz oka są zaprezentowane bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym w celu ich późniejszej wizualizacji.

Wypreparowanie tarczek imaginalnych z larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym

Dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzić dysekcję tarczek imaginalnych z larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym. Tarczki larwalne w trzecim stadium mogą być wykorzystywane do badania wielu procesów rozwojowych. W naszym laboratorium analizujemy je w celu obserwacji procesu apoptozy, jednak można w nich ekspresować różne białka i w ten sposób badać różnorodne procesy rozwojowe zachodzące w tarczkach w odpowiedniej kolejności.W tym celu będę używać kilku bardzo ważnych narzędzi. Pierwszym z nich jest patyczek do przenoszenia, za pomocą którego wyjmiemy larwy z szalek. Następnie, co jest niezwykle istotne, posłużą nam pęsety sekcyjne, które muszą być bardzo ostre, aby możliwe było przeprowadzenie sekcji.Następnie użyjemy skalpela z ostrzem nr 11, aby usunąć krążki z głowy. Potem umieścimy krążki na szkiełku przedmiotowym, wykorzystując Vector Shield jako medium montażowe. Pierwszym krokiem będzie zatem zebranie larw trzeciego stopnia *Sturnus vulgaris*.Używam teraz mojego patyczka do zbierania, aby w pewien sposób odseparować je od ścianki fiolki. Czasami pomaga, gdy patyczek jest lekko wilgotny, a następnie umieszczamy je w kropli PBS. Dobrze, mamy teraz naszą trzecią larwę gwiazdy.Ponieważ jestem praworęczny, obrócę jego głowę w prawą stronę i wykorzystamy kilka punktów orientacyjnych, aby określić miejsce chwytu. Pierwszym z nich jest główna część tchawicy tutaj i tutaj. Następnie, w górę w stronę głowy, znajduje się niewielki przekrój poprzeczny.Najpierw delikatnie chwycę larwę w około dwóch trzecich długości ciała, licząc od głowy. Następnie prawą ręką chwycę ją kilka milimetrów za element poprzeczny, starając się objąć około połowy szerokości larwy. To jest odpowiedni chwyt.Jak widać, jestem w połowie procesu. Teraz delikatnie pociągnę prawą ręką do przodu i widzimy, jak wysuwają się wszystkie jelita. Dobrze. Główna część ciała może zostać teraz odrzucona.A tutaj mamy głowę, która obejmuje prążki imaginalne przytwierdzone do części gębowych. Chwycę go zatem za części gębowe, aby nie zmiażdżyć żadnego z prążków, i przeniosę go na świeżą kroplę PBS. W ten sposób otrzymaliśmy utrwaloną głowę larwy.Usuniemy teraz całą nadmiarową tkankę, a następnie chwycimy larwę za aparaty gębowe, tak jak wcześniej, lub przyciśniemy ją pęsetą do płytki sekcyjnej. Aparaty gębowe znajdują się teraz po lewej stronie. Dobrze, tutaj mamy jelito, którego nie potrzebujemy, a obok znajduje się gruczoł ślinowy.Widoczna jest tkanka tłuszczowa lub ciała tłuszczowe. Należy je sukcesywnie usuwać, szczególnie tłuszcz, który może zakłócać niektóre testy i barwienia oraz wszelkie niepożądane elementy. W ten sposób otrzymujemy oczyszczoną głowę larwy.W tym momencie mamy głowy larw, które zostały odseparowane od ciała podczas sekcji, utrwalone i wypłukane, a zbędne tkanki usunięte; zostały one również poddane niezbędnym zabiegom, takim jak barwienie przeciwciałami w C2 tunnel lub inne barwienie funkcjonalne. Następnie umieściliśmy je na szkiełku i jesteśmy gotowi do odseparowania właściwych tarcz od głowy, czyli usunięcia części gębowych.Zatem tym razem części gębowe znajdują się tutaj, po lewej stronie. Użyję pęsety, aby docisnąć je do szkiełka podstawowego. W prawej ręce trzymam ostrze skalpela nr 11, które jest nieco precyzyjniejszym narzędziem do przeprowadzania sekcji.Najpierw usunę OUN oraz płaty optyczne. Widzą Państwo OUN, dwa płaty optyczne oraz przymocowane do nich tarczki oka i anteny. Usuwam OUN, wsuwając ostrze między płaty optyczne a tarczki oka i powoli ciągnąc, tak że tarczki oka lekko się rozciągają.Zatem mamy tutaj OUN oraz płaty optyczne. Obecnie dysponujemy dwoma tarczkami ocznymi, które zostały oddzielone od OUN. Teraz oddzielę je od części gębowych, delikatnie przecinając i pociągając u nasady.Dobrze, zatem mamy jeden tarczek oka-anteny, a tutaj drugi tarczek oka-anteny. Dobrze. A teraz widzimy wystający tutaj tarczek skrzydła. Ponownie delikatnie zlokalizuję podstawę, przetnę ją i pociągnę.Zatem mamy tutaj tarczkę skrzydłową i przymocowaną do niej tarczkę odnóża, wraz z niewielkim fragmentem tchawki. Dobrze, mamy więc tarczkę skrzydłową z przyłączoną tarczką odnóża, a jak widać, tarczek odnóży jest kilka. Możemy zatem przeszukać ten obszar i odnaleźć więcej tarczek, delikatnie sondując go ostrzem.To wszystkie krążki, jakie znajdziemy w tym osobniku. Jest jeszcze kilka krążków odnóży.

dissection-of-imaginal-discs-from-3rd-instar-drosophila-larvae

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przekroj tkanek imaginacyjnych z larw Drosophila w 3. stadium

W niniejszej pracy opisujemy protokół badania migracji komórek glejowych do rozwijającego się oka Drosophila za pomocą analizy mikroskopowej żywych tkanek z wykorzystaniem komórek glejowych znakowanych GFP.

Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

Opisujemy nowy reporter w postaci czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP), który jest specyficznie ekspresowany w oku Drosophila. Szczegółowo przedstawiamy metodologię preparowania tarczki wyobraźnej oka oraz sposób, w jaki reporter ten może pomóc w preparacji i identyfikacji konkretnych typów komórek w rozwijającym się oku.

Nowy reporter RFP wspomagający wizualizację tarczki wyobraźnej oka u Drosophila

Drosophila melanogaster larwy stanowią idealny model badawczy do analizy mechanizmów transportu aksonalnego w nerwach segmentowych larw. Stosując tę procedurę, 3Badania i rozwój larwy w stadium poczwarki niosące różne mutacje można porównać z larwami typu dzikiego.

Wizualizacja nerwów segmentowych larw w preparatach larw Drosophila w 3rd stadium zasiedlenia

Siatkówka Drosophila stanowi krystaliczną sieć złożoną z niewielkiej liczby typów komórek, które są generowane w sposób stereotypowy 1. Jej podatność na zaawansowane analizy genetyczne umożliwia badanie złożonych programów rozwojowych. Niniejszy protokół opisuje preparowanie oraz immunohistochemię siatkówek na trzech odrębnych etapach rozwoju, ze szczególnym uwzględnieniem różnicowania fotoreceptorów.

Disekcja i immunohistochemia siatkówek larwalnych, poczwarkowych i dorosłych Drosophila

Podczas barwienia wyimaginowanych krążków Drosophila, często przeprowadza się zgrubną sekcję, podczas której dyski są odsłonięte, ale pozostają przyczepione do ciała. Po zabarwieniu interesujące dyski są izolowane i montowane. Przykładowy protokół demonstruje procedurę wyimaginowanego rozwarstwienia i montażu dysku skrzydłowego.

Drosophila Wyimaginowana sekcja dysku larwy: metoda obserwacji rozwijającego się nabłonka

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Celem tej techniki jest umożliwienie naukowcom przeprowadzenia sekcji, barwienia immunologicznego i montażu krążków z oczami poczwarek Drosophila melanogaster w każdym wieku.

Wypreparowanie i montaż krążków ocznych poczwarki Drosophila

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Opisujemy protokół pomiaru kontaktów między komórkami w sąsiednich warstwach nabłonka w żywych dyskach imaginalnych skrzydeł Drosophila przy użyciu podejścia opartego na rekonstytucji GFP.

System podwójnej ekspresji oparty na komplementacji GFP do oceny kontaktu komórka-komórka, w którym pośredniczą cytonemy w żywych krążkach imaginalnych skrzydeł Drosophila

Artykuł opisuje efektywny protokół rozwarstwiania dysku wyobrażalnego i barwienia przeciwciał, który jest ekonomiczny pod względem odczynników i ułatwia obsługę dysków wyobrażających w małych ilościach.

Małoskalowe rozwarstwienie i barwienie przeciwciał na dyskach wyimaginowanych oczno-czułowych i skrzydłowych Drosophila melanogaster

Naucz się techniki sekcji dysków imaginalnych z larw Drosophila w 3. stadium rozwojowym. Metoda umożliwia izolację tkanek skrzydeł, nóg i oczu do badań nad biologią rozwoju.

Wypreparowanie tarczek imaginalnych z larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym

Przeglądaj więcej filmów