Sekcja dysków imaginalnych z larw Drosophila w 3. stadium rozwojowym
February 17th, 2007
Ten protokół demonstruje technikę preparacji używaną do izolowania wyimaginowanych dysków od larw Drosophila w trzecim stadium rozwoju. Metody mocowania tkanki po wyjęciu i usunięciu krążków skrzydła, nogi i oka są demonstrowane bezpośrednio na szkiełku mikroskopowym w celu późniejszej wizualizacji.
Dzisiaj pokażę Ci, jak wypreparować wyimaginowane dyski z larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym. Krążki larwalne w trzecim stadium rozwojowym mogą być wykorzystywane do wielu procesów rozwojowych. Przyglądamy się im w naszym laboratorium, aby zobaczyć proces apoptozy, ale można w nich eksprymować różne białka i badać je w ten sposób, obserwując w kolejności wszelkiego rodzaju procesy rozwojowe zachodzące w dyskach.
W tym celu zamierzam skorzystać z kilku bardzo ważnych narzędzi. Pierwszym z nich jest patyczek do wybierania, za pomocą którego wyjmujemy larwy z ich naczyń. Następnie, bardzo ważne, są kleszcze preparacyjne, które muszą być niezwykle ostre, aby sekcja mogła się posunąć.
Następnie użyjemy ostrza chirurgicznego, ostrza chirurgicznego numer 11, aby usunąć dyski z głowy. A potem umieścimy dyski na slajdzie z tarczą wektorową jako naszym nośnikiem montażowym. Pierwszą rzeczą, którą zamierzamy zrobić, to zebrać larwy trzeciej i wędrującej gwiazdy, trzeciej i gwiaździstej.
Po prostu używam tutaj mojego patyczka do wybierania, aby podważyć je z boku fiolki. Czasami pomaga to, że kij jest trochę mokry, a następnie włóż go do kropli PBS. Okej, więc mamy nasze trzecie larwy gwiazdy.
Ponieważ jestem praworęczny, zamierzam obrócić jego głowę w moją prawą stronę i użyjemy kilku punktów orientacyjnych, które wskażą nam, gdzie go chwycić. Pierwsza to główna część tchawicy tutaj i tutaj. A potem jest mały przekrój poprzeczny tutaj, w kierunku głowy.
Więc najpierw delikatnie chwycę larwy około dwóch trzecich długości ciała od głowy. A potem zamierzam chwycić prawą ręką kilka milimetrów za poprzeczką, próbując dostać się mniej więcej do połowy szerokości larw. To całkiem niezłe ujęcie.
Widzisz, że jestem mniej więcej w połowie drogi. Więc wtedy delikatnie pociągnę prawą ręką do przodu, zobaczę, jak wszystkie jelita tam wychodzą. Porządku. Główną część ciała można teraz odrzucić.
A tutaj mamy głowę, która zawiera wyimaginowane dyski przymocowane do części ustnych. Zamierzam więc złapać go za usta, żeby nie zmiażdżyć żadnego z krążków i przenieść go do świeżej kropki PBS. Więc teraz mamy naszą stałą głowę larwy.
Usuniemy cały nadmiar tkanki i albo chwycimy larwę za ustniki, jak poprzednio, albo możemy przycisnąć ją do płytki preparacyjnej za pomocą kleszczy. Ustniki znajdują się teraz po lewej stronie. W porządku, więc mamy jelita, których nie chcemy, i gruczoł ślinowy.
Jest jakieś grube ciało lub grube ciało. Po prostu odciągaj się, zwłaszcza tłuszcz, który może zakłócać niektóre testy i plamić wszystko, czego nie chcesz. Więc teraz mamy oczyszczoną głowę larwy.
Więc teraz mamy nasze głowy larw, które zostały wycięte z ciała, naprawione i umyte, obce tkanki usunięte, i zostały potraktowane tym, czym powinny być leczone, co może być wybarwieniem przeciwciał w tunelu C dwa lub innym funkcjonalnym zabarwieniem. A teraz umieściliśmy je na szkiełku i jesteśmy gotowi do przecięcia właściwych krążków z dala od głowy. Usta rozchylają się.
Okej, więc tym razem nasze części ust są po lewej stronie. Wezmę kleszcze i po prostu przyciśnię je do zjeżdżalni. Po prawej ręce trzymam ostrze skalpela numer 11, które jest również nieco drobniejszym narzędziem, za pomocą którego można dokonać sekcji.
Więc najpierw zamierzam usunąć OUN i płaty wzrokowe. Widzicie, to jest OUN, to są dwa płaty optyczne, a tutaj są tarcze anteny oka przymocowane do nich. Więc jeśli usunę OUN, wkładając ostrze między płaty wzrokowe a dyski oka i pociągając powoli, tak że krążki oczne będą się tam rozciągać.
Okej, więc mamy OUN i płaty nerwu wzrokowego. Tak więc teraz mamy dwie tarcze oko-oko, które zostały odłączone od OUN. Teraz zamierzam zabrać je z części ustnych, delikatnie przecinając i ciągnąc za podstawę.
Okej, więc jest jeden dysk anteny oka, drugi dysk z anteną oka. Porządku. A teraz możemy zobaczyć wystający tutaj dysk skrzydła. Zamierzam ponownie delikatnie znaleźć podstawę ciętą i pociągnąć.
Mamy więc dysk ze skrzydłem i przymocowany do niego dysk na nogach, wraz z odrobiną tchawicy. Okej, więc jest twój dysk skrzydłowy z dołączonym dyskiem na nogi i oczywiście jest kilka dysków na nogach. Więc możemy, możemy trochę poszukać tutaj i znaleźć więcej dysków, po prostu delikatnie sondując za pomocą ostrza.
To wszystkie płyty, które znajdziemy w tym. Jest jeszcze kilka krążków na nogi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół demonstruje technikę sekcji stosowaną do izolowywania dysków wyobraźni z larw drosofil w 3. stadium larwalnym. Metody utrwalania tkanki po usunięciu dysków skrzydeł, nóg i oczu są demonstrowane bezpośrednio na szklanym slajdzie mikroskopicznym w celu późniejszej wizualizacji.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia rozwoju
- Genetyka
Tło
- Dyski wyobraźni są niezbędne do badania procesów rozwojowych u Drosophila.
- Larwy w 3. stadium zapewniają model do badania apoptozy i ekspresji białek.
- Techniki sekcji są niezbędne do izolowywania określonych tkanek do analizy.
- Właściwe narzędzia i metody poprawiają dokładność sekcji.
Cel badania
- Izolowanie dysków wyobraźni do badań rozwojowych.
- Wizualizacja i analiza procesów komórkowych w obrębie dysków.
- Dostarczenie szczegółowego protokołu dla badaczy w tej dziedzinie.
Stosowane metody
- Użycie patyczka do ekstrakcji larw z pojemników.
- Wykorzystanie ostrych kleszczy sekccyjnych dla precyzji.
- Utrwalanie tkanki na szklanych slajdów mikroskopicznych w celu wizualizacji.
- Demonstracja technik sekcji dla dysków skrzydeł, nóg i oczu.
Główne wyniki
- Udane izolowanie dysków wyobraźni z larw.
- Skuteczna wizualizacja procesów rozwojowych po sekcji.
- Demonstracja znaczenia ostrza narzędzia w sekcjach.
- Protokół stanowi podstawę dla dalszych badań w biologii rozwoju.
Wnioski
- Technika sekcji jest skuteczna w izolacji dysków wyobraźni.
- Właściwe metody poprawiają badania procesów rozwojowych u Drosophila.
- Ten protokół służy jako cenne źródło dla badaczy.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol provides a foundational method for isolating Drosophila imaginal discs, enabling mechanistic studies of developmental pathways and apoptosis. The technique supports target validation by allowing precise interrogation of gene function in a genetically tractable model system. It enhances predictive confidence in early discovery by facilitating phenotypic screening and pathway analysis relevant to conserved human disease mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of genes and pathways in a living tissue context to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible method for isolating specific tissues to reduce variability in downstream assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates isolated disc preparations suitable for protein expression studies and functional staining to assess compound effects.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation for consistent readouts in apoptosis and developmental process screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to observable developmental phenotypes in a disease-relevant system.
- Operational Value: Facilitates continuity from gene discovery to functional validation in a genetically manipulable model.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where genetic and phenotypic screening inform target selection and lead identification efforts.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing through tissue-specific protein expression and phenotypic analysis in imaginal discs.
- Screening: Delivers standardized tissue samples for quantitative assessment of developmental processes and compound-induced phenotypes.
- Analytics: Produces isolatable tissues compatible with staining, imaging, and molecular readouts for pathway analysis.
- Translational Research: Connects genetic findings to phenotypic outcomes in a conserved developmental system relevant to human biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue preparation platform for iterative screening and mechanistic studies across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct observation of developmental phenotypes in intact tissues.
- Operational Value: Improves assay reproducibility via standardized dissection and tissue mounting procedures.
- Strategic Value: Reduces false positives in target selection by providing functional validation in a physiological context.
- Portfolio Impact: Supports early go/no-go decisions by clarifying mechanism-of-action and phenotypic relevance.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in microsurgical techniques and tissue handling to maintain sample integrity.
- Dependent on sharp dissection tools and clean PBS-based workflows to prevent tissue damage or contamination.
- Necessitates standardization across operators to ensure consistent disc isolation and mounting quality.
- Adaptable to various staining and fixation protocols depending on downstream assay requirements.
- Limited by the small tissue size, which may constrain multiplexed analytical approaches.
