Chimery embrionalne ukierunkowane na tkanki: przeszczep komórek gastruli danio pręgowanego

Procedura ta rozpoczyna się od umieszczenia jednokomórkowych zarodków danio pręgowanego na płytce do mikroiniekcji. Mikro wstrzyknąć fluorescencyjny roztwór dekstryny do żółtka. Tuż pod zarodkami, do których wstrzyknięto komórki, znajdują się dawcy przeszczepów.

Pokryj zarodki dawcy i gospodarza i wyhoduj do tarczy Etap Załaduj dwa zarodki z dekstryną pokrytą DEC obok siebie do jednego dołka płytki do przeszczepu. Powtórz te czynności poniżej każdej pary dawców. Dodaj jeden zarodek gospodarza na studzienkę, aby celować w przeszczepione komórki do przyszłego di cefalonu komórek przeszczepu przodomózgowia od i do linii środkowej.

W połowie drogi między słupem dla zwierząt a tarczą. Przeszczep komórki z dawcy gasa do gospodarza Gasa. Umień do 30 godzin.

W razie potrzeby wykonaj immunochemię, zamontuj i zobrazuj. Alternatywnie zamontuj hosta na żywo i przeprowadź obrazowanie poklatkowe. Cześć, nazywam się Elizabeth De Shane i pracuję w laboratorium dr Michaela ESI na Wydziale Nauk Biologicznych w Smith College w Northampton w stanie Massachusetts.

A ja jestem głównym badaczem laboratorium, dr Michael Besi. Dziś pokażemy Ci, jak tworzyć chimeryczne zarodki, przeprowadzając przeszczepy komórek w stadium żołądkowym przy użyciu systemu modelowego danio pręgowanego. Używamy tej procedury w moim laboratorium do badania funkcji określonych genów w rozwoju spoidła przodomózgowia, a także procesu interakcji glejowych aksonów podczas tworzenia spoidła.

Więc zacznijmy. Aby rozpocząć, przygotuj formy korytowe na płytki do mikroiniekcji, ostrożnie rozbijając na pół trzy jednomilimetrowe, czterocalowe kapilary bez włókien. Za pomocą super kleju przyklej dwie połówki kapilar obok siebie na kleju do płaskiej powierzchni.

Trzecia kapilara na tych dwóch zagnieździła się w rowku, tworząc kształt piramidy. Za pomocą trzech naczyń włosowatych pozostaw formę do wyschnięcia. Powinieneś wykonać około trzech do pięciu form na każdą płytę wtryskową.

Następnie należy przygotować płytki iniekcyjne, wlewając od 20 do 25 mililitrów stopionego 1,5% aros do pożywki zarodkowej na 100-milimetrową szalkę Petriego. Natychmiast umieść trzy do pięciu przygotowanych foremek korytowych na dnie talerza, upewniając się, że płaska strona formy dotyka dna szalki Petriego i jest całkowicie pokryta aros. Gdy aros stwardnieje, usuń formy korytowe, wycinając duży kwadrat aros, który je zawiera.

Delikatnie usuń agar na obrzeżach wyciętego kwadratu i wyrzuć go. Odwróć kwadratowy kawałek agaru i za pomocą drobnych kleszczyków całkowicie usuń foremki do koryta. Wlej stopiony aros do szalki Petriego wokół kwadratu, aby utrzymać nowo uformowane studzienki na miejscu.

Niech zastygnie. Płytki mogą być zgrzewane i przechowywane przez tygodnie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Należy je wyrzucić, jeśli w agarze są jakiekolwiek oznaki wzrostu.

Na koniec, aby przygotować igły do wstrzykiwań, użyj ściągacza kapilarnego z mikropipetami, aby wykonać igły z jednomilimetrowych czterocalowych szklanych kapilar z wewnętrznymi włóknami z przygotowaną płytką do mikroiniekcji i igłami. Przyjrzyjmy się pobieraniu zarodków i ustawianiu aparatu do mikroiniekcji. Zapłodnione jaja zbiera się natychmiast po ich złożeniu i utrzymuje na szalce Petriego wypełnionej pożywką zarodkową

Za pomocą szklanej pipety z szeroką końcówką wyrzuć zarodki do studzienek w pomieszczeniu. Płytka iniekcyjna do pomiaru temperatury wypełniona pożywką zarodkową. Użyj zaciśniętych, kleszczy, aby delikatnie zaklinować zarodki na dnie koryt: zarodki, których korian lub żółtko zostały naruszone, należy wyrzucić.

Następnie załaduj igłę do wstrzykiwań jednym lub dwoma mikrolitrami rozcieńczonego roztworu dekstryny fluorescencyjnej Alexa 5 9 4. Pozwolić dekstrynie przemieścić się do końcówki igły iniekcyjnej poprzez działanie kapilarne. Przymocuj igłę do iniekcji do uchwytu kapilarnego stereotaktycznego mikromanipulatora i na początek wyreguluj ciśnienie na aparacie do mikroiniekcji.

40 do 50 PSI i czas trwania impulsu 500 milisekund. Za pomocą kleszczy delikatnie ocierać się lub odcinać końcówkę igły do wstrzykiwań, aby zerwać uszczelkę. Idealnie, średnica powinna wynosić od 0,05 do 0,15 milimetra.

Aby skalibrować igłę, użyj mikroskopu stereoskopowego i wyrzuć dekstrynę na mikrometr z olejem mineralnym na wierzchu. Zmodyfikuj rozmiar bolusa, dostosowując czas trwania impulsu pod ciśnieniem powietrza i rozmiar igły. Napiwek. Przez cały czas wstrzykiwania należy utrzymywać wielkość bolusa odpowiadającą objętości od 0,8 do jednego nanolitra.

Możemy teraz rozpocząć mikroiniekcję dekstryny przy użyciu około 3,2-krotnego powiększenia pod mikroskopem stereoskopowym. Rozpocznij wstrzykiwanie zarodków od jednego końca koryta, płynnie przebijając korion i błonę komórkową zarodków, aby weszły do żółtka. Wstrzyknąć roztwór dekstryny tuż pod komórkę.

Należy upewnić się, że igła do wstrzykiwań jest usuwana tym samym płynnym ruchem, który jest używany do wnikania do zarodka. Przesunąć szalkę Petriego, aby ustawić następny zarodek w jednej linii i kontynuować wstrzykiwanie wzdłuż koryta. Okresowo sprawdzaj ciśnienie i wielkość bolusa.

Teraz użyj kleszczy, aby delikatnie wypchnąć zarodki z koryt. Przenieś je na szalkę Petriego wypełnioną zarodkiem z antybiotykiem. Średni. Wysiaduj zarodki w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza i monitoruj je pod kątem niezapłodnionych jaj lub śmierci.

Zarodki są teraz gotowe do przyszłych przeszczepów. Przed zakończeniem poli podczas racji gazu, części żółtka pozostają odsłonięte. Żółtko jest niezwykle delikatne i łatwo przylega i rozrywa się na plastiku szalki Petriego.

W związku z tym zarodki muszą być pokryte powlekaną płytką na dzień przed przeszczepem. Zrób te talerze dekoracyjne, wlewając od pięciu do 10 mililitrów stopionego aros do 100-milimetrowej szalki Petriego. Potrzebna jest tylko cienka warstwa aros o długości około dwóch do trzech milimetrów, aby zamortyzować zarodki podczas dekoracji.

Niech talerze ostygną. Następnie wykonaj oddzielne płytki do przeszczepu, wlewając 30 mililitrów 1,5% roztworu aros do 100-milimetrowej szalki Petriego i włóż formę do przeszczepu. Forma powinna zawierać 104 trójkątne wgłębienia, z których każdy składa się z trzech boków pod kątem 90 stopni i 1 boku pod kątem 45 stopni.

Studzienki są przeznaczone do przechowywania dwóch zarodków obok siebie. Uważaj, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza pod formą i pozwól agros stwardnieć. Usunięcie formy odsłania zapadnięty obszar zawierający kwadratowe studzienki o nachylonej krawędzi.

Aby przygotować zarodki gospodarza i dawcy do przeszczepu, należy monitorować ich rozwój, aby utrzymać pary zbliżone do wieku. Aby to zrobić, zarodki można hodować w różnych temperaturach od 23 do 31 stopni Celsjusza, aby spowolnić lub przyspieszyć rozwój. Zarówno zarodki gospodarza, jak i dawcy powinny być ręcznie pokryte powlekaną płytką na godzinę przed osiągnięciem pożądanego wieku.

W przypadku przeszczepów w fazie żołądkowej należy to zrobić do pięciu godzin po zapłodnieniu lub HPF przed etapem tarczy przy 5,5 HPF. Za pomocą szklanej pipety załadować zarodki gospodarza i dawcy do płytki transplantacyjnej wypełnionej pożywką z antybiotykiem. Tutaj pierwszy rząd jest wypełniony zarodkami dawcy z dwoma zarodkami na studzienkę, a kolejne dwa rzędy są wypełnione pojedynczym zarodkiem gospodarza na studzienkę.

Do przeszczepów używamy mikroskopu stereoskopowego Luer Zeiss, który ma w pełni zautomatyzowany zoom sterowany joystickiem i manipulację ostrością. Chociaż ten zautomatyzowany mikroskop nie jest konieczny, znacznie zwiększa łatwość i wydajność tych precyzyjnych przeszczepów chirurgicznych, zwłaszcza gdy pożądana jest duża liczba przeszczepów. Aby skonfigurować aparat do przeszczepu, ustaw tramwaj powietrzny einor w środkowym miejscu jego skali, podłącz rurkę kanału powietrznego do uchwytu kapilary i przymocuj uchwyt do automatycznego mikromanipulatora einor Po przygotowaniu zarodków i aparatury transplantacyjnej możemy teraz przejść do przeszczepów komórek w fazie żołądkowej.

Najważniejszą umiejętnością w wykonywaniu przeszczepów komórek w fazie żołądkowej jest zdolność do rozpoznawania anatomii komórkowej wargi APO z blastami grzbietowymi, znanej również jako tarcza u danio pręgowanego. Tutaj prezentujemy film sekwencyjny gastruli z różnych punktów widokowych i podkreślamy, gdzie znajduje się tarcza w tym widoku bocznym. Tarcza lub strona grzbietowa znajduje się po prawej stronie w czerwonym konturze, aby kierować komórki do przeszczepu komórek przodomózgowia od i do linii środkowej.

Dokładnie w połowie drogi między słupem zwierzęcym a tarczą, zaczniemy najpierw obracać zarodek w Twoją stronę, aby wyświetlić słup zwierzęcia, podkreślając po drodze tarczę i miejsce przeszczepu. Następnie zarodek obraca się wokół własnej osi, aby ustawić tarczę na dole. Gastro obraca się teraz z powrotem do góry, prezentując widok prosto na grzbiet

Zarodek jest teraz obracany z powrotem w sekwencji do widoku bocznego przy sześciu HPF. Za pomocą mikromanipulatora delikatnie ocieraj zarodek końcówką naczynia włosowatego, aby obrócić go do pozycji do ekstrakcji komórek tak, aby jego linia środkowa i tarcza były widoczne i przeciwstawiały się końcówce naczynia włosowatego dawcy, zarodki można łatwo zweryfikować, przełączając się z jasnego pola na oświetlenie fluorescencyjne. W tym przypadku komórki żołądka fluoryzują na czerwono, odsysają niewielką ilość pożywki zarodkowej do naczynia włosowatego, aby wyeliminować wszelkie szanse na kontakt komórek z interfejsem powietrze-woda, który mógłby je uszkodzić.

Delikatnie przebij ektodermę zarodka dawcy na linii środkowej, dokładnie między biegunem zwierzęcia a tarczą. Między powierzchnią ektodermy a leżącym pod nią żółtkiem w gazie znajdowało się tylko około 20 mikrometrów komórek. Uważaj więc, aby nie przebić żółtka, ponieważ często prowadzi to do śmierci w ciągu kilku godzin.

Za pomocą tramwaju powietrznego powoli zasysaj komórki do kapilary. Zawsze utrzymuj widoczność linii wodnej, lekko poruszając końcówką. Będąc wewnątrz dawcy pomoże rozluźnić kontakty komórka-komórka.

Z zarodka dawcy należy pobrać od 10 do 50 komórek. Następnie usuń kapilatę od dawcy. Podobnie zorientuj gospodarza i przebij i wydal komórki dokładnie w to samo miejsce W zarodku gospodarza przejście z oświetlenia jasnego pola na fluorescencyjne ujawnia ruch komórek znakowanych dekstryną w igle kapilarnej do zarodka gospodarza.

Na koniec, po przeszczepie, usuń zarodki dawcy i gospodarza z dołków. Oddziel je i delikatnie umieść na pokrytej A szalce Petriego wypełnionej zarodkiem antybiotyku. Pożywkę inkubować zarodki w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza z kompletnymi przeszczepami.

Zacznijmy wizualizować i obrazować. Zarodki rozpoczynają się od utrwalenia zarodków na odpowiednim etapie do obrazowania w konserwatorze zweryfikowanym pod kątem immunochemicznym. W naszym przypadku byłoby to w 4% formaldehydzie przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie przepłucz utrwalone zarodki dwa razy, a następnie myj je przez trzy do pięciu minut. W 0,1 mola pb. W razie potrzeby wykonaj prawidłowe znakowanie immunologiczne.

Umieść zarodki w 75% glicerolu, zanurz je w temperaturze pokojowej i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotuj szkiełko do zamontowania dwóch zarodków, tworząc na szkiełku dwa kwadratowe kontury wazeliny, które pasują do wewnętrznej średnicy kwadratu. Szkiełko nakrywkowe obok zarodka de yoan i wykonaj wszelkie niezbędne sekcje, aby uzyskać widok z przodu przodomózgowia.

Wypreparuj przodomózgowie, przecinając prostopadle w poprzek śródmózgowia. Umieść tę tkankę z minimalną ilością glicerolu w ropie naftowej. Dobrze ustaw tkankę w odpowiedniej pozycji i umieść szkiełko nakrywkowe na próbce.

Alternatywnie, w przypadku żywych zarodków, zamontuj je w 0,75% roztworze agro na szkle. Naczynia z kultur dolnych przed zestaleniem się agro użyj igły wolframowej, aby manipulować zarodkiem w odpowiedniej orientacji do obrazowania. Obrazowane są zarówno hosty stałe, jak i na żywo.

Za pomocą pięciolaserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Leica SP pobierane są stosy ZS i przeprowadzane jest trzy- lub czterowymiarowe przetwarzanie obrazu za pomocą oprogramowania do pomiaru prędkości w celu wygenerowania chimerycznych zarodków, w których pewna część populacji astroglejowej w zarodku różni się genotypem lub fenotypem. Zastosowaliśmy wieloaspektowe podejście, które łączy wykorzystanie transgenicznych embrionów GFP, które oznaczają astroglej z wykorzystaniem przeszczepu komórek w stadium gastrologicznym, aby skierować nasze klony do głowowu. Wykorzystaliśmy mapę losu pokarmowego danio pręgowanego, aby selektywnie wyodrębnić komórki w linii środkowej w równej odległości od bieguna zwierzęcia i tarczy.

Te wyekstrahowane komórki zostały następnie przeszczepione w to samo miejsce w gazie gospodarza typu dzikiego, który następnie podniesiono do 30 HPF i znakowano immunologicznie dla wszystkich aksonów jako punkty odniesienia anatomii mózgu. W przedstawionym przykładzie obrazowanie konfokalne jednego zarodka gospodarza ujawnia izolowane komórki GFP dodatnie w całym głowu i głowowie. Pełną morfologię tych komórek GFP dodatnich można zaobserwować w tym teście klonalnym, ujawniając, że większość z tych komórek przyjmuje charakterystyczną radialną morfologię glejową, w której soma znajduje się w sąsiedztwie strefy komorowej, a duża stopa końcowa kończy proces promieniowy na powierzchni skórki.

Trójwymiarowe odwzorowanie Zacka tych zebranych wycinków optycznych wyraźnie pokazuje położenie tych komórek w stosunku do oznaczonych aksonów. Innym podejściem powszechnie stosowanym do wizualizacji przeszczepionych komórek jest wstępne mikrowstrzyknięcie fluorescencyjnego barwnika linii komórkowej do żółtka jednokomórkowego zarodka transgenicznego typu dzikiego lub GFP. W tym przykładzie wstrzyknęliśmy dekstrynę Alexa 5 94 do zarodków typu dzikiego.

Na etapie jednej komórki pozwoliliśmy im rozwinąć się w celu osłony gazu, a następnie przeprowadziliśmy cztery przeszczepy ukierunkowane na mózg, jak wspomniano powyżej. Ale zamiast tego przeszczepiliśmy do transgenicznego gospodarza obrazowanie gastruli grzbietowej głowy za pomocą skaningu laserowego. Mikroskopia konfokalna ujawniła fluorescencyjne czerwone skupiska komórek dawcy wśród jąder GFP dodatnich w przodomózgowiu.

Dalej analizowaliśmy tego hosta, zbierając Zacksa co trzy minuty w ciągu dwóch godzin za pomocą konfokalnego skanowania laserowego. Czterowymiarowe renderowanie tego upływu czasu przy użyciu oprogramowania do pomiaru prędkości przez IMP pokazuje dynamiczne ruchy komórkowe błon komórkowych pręcików dominujących i jąder dodatnich GFP. Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować całą niezbędną aparaturę i odczynniki do przeszczepu komórek w zarodkach danio pręgowanego.

W szczególności zademonstrowaliśmy tę technikę na etapie gazu. Ma jednak również zastosowanie do przeszczepów w stadium blastuli. Podczas korzystania z tej procedury ważne jest, aby precyzyjnie skorelować ostateczną pożądaną lokalizację przeszczepionych komórek z wcześniejszą lokalizacją tych komórek na mapie losu w konsultacji gazowej, szczegółowym badaniu map losu danio pręgowanego dr Scotta Fraziera z 1995 roku zatytułowanym Fate Maps of the Zebrafish Embryo w celu uzyskania dalszych wskazówek.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.