Chimery embrionalne z ukierunkowaniem tkankowym: transplantacja komórek gastruli rybki danio-pręgawki

Procedura rozpoczyna się od ułożenia embrionów ryby zebrafish w stadium jednego komórki w płytce do mikroiniekcji. Wstrzyknij za pomocą mikroiniekcji roztwór fluorescencyjnej dekstryny do żółtka. Bezpośrednio pod wstrzykniętymi embrionami znajdują się donory do transplantacji.

Powlecz embriony donora i gospodarza i hoduj je do stadium tarczy (shield stage). Umieść dwa embriony powleczone DEC i wstrzyknięte dekstryną obok siebie w jednej studni płytki do transplantacji. Powtórz powyższą czynność dla każdej pary donorów. Dodaj jeden embrion gospodarza do każdej studni, aby skierować transplantowane komórki do przyszłego diencephalon przedmózgowia; transplantuj komórki z i do linii pośrodkowej.

W połowie drogi między biegunem zwierzęcym a tarczą (shield). Przeszczepić komórki z gastruli dawcy do gastruli biorcy. Hodować do 30 godziny, następnie utrwalić.

W razie potrzeby przeprowadzić badanie immunochemiczne, zamontować preparat i wykonać obrazowanie. Alternatywnie można zamontować żywego organizma gospodarza i przeprowadzić obrazowanie poklatkowe. Witajcie, nazywam się Elizabeth De Shane i reprezentuję laboratorium dr. Michaela ESI z Katedry Nauk Biologicznych na Smith College w Northampton w Massachusetts.

Jestem kierownikiem laboratorium, dr Michael Besi. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak tworzyć embriony chimeryczne poprzez przeprowadzanie transplantacji komórek w stadium gastruli z wykorzystaniem modelu rybki danio (zebrafish). W moim laboratorium stosujemy tę procedurę w celu zbadania wpływu specyficznych genów na rozwój spoiwa przedmózgowia, a także procesów interakcji aksonalno-glejowych podczas formowania się spoiwa.

Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć, przygotuj formy rynienek do płytek do mikroiniekcji, ostrożnie przełamując na pół trzy kapilary niefilamentowe o średnicy 1 mm i długości 4 cali. Używając superkleju, przyklej dwie połówki kapilar obok siebie do płaskiej powierzchni klejącej.

Trzecią kapilarę umieść na szczycie tych dwóch, osadzając ją w zagłębieniu, aby utworzyć kształt piramidy. Pozostaw formę z trzema kapilarami do wyschnięcia. Należy przygotować od trzech do pięciu form dla każdej płyty do wtryskiwania.

Następnie przygotuj płytki do iniekcji, wlewając 20 do 25 mililitrów roztopionego 1,5% medium aros in embryo do 100-milimetrowej szalki Petriego. Bezzwłocznie umieść od trzech do pięciu przygotowanych form do rynienek na dnie płytki, upewniając się, że płaska strona formy dotyka dna szalki Petriego i jest całkowicie przykryta medium aros. Po zestaleniu się medium aros usuń formy do rynienek, wycinając z nimi duży kwadrat z aros.

Delikatnie oddziel agar znajdujący się na obwodzie wyciętego kwadratu i go usuń. Odwróć kwadratowy kawałek agaru i za pomocą precyzyjnej pęsety całkowicie usuń formy do rowków. Wlej roztopiony agar do szalki Petriego wokół kwadratu, aby ustabilizować nowo uformowane studzienki.

Pozostaw do zastygnięcia. Płytki można uszczelnić parafilmem i przechowywać przez wiele tygodni w temperaturze czterech stopni Celsius. Należy je utylizować, jeśli na agarze pojawią się jakiekolwiek oznaki wzrostu.

Na koniec, aby przygotować igły do iniekcji, należy użyć wyciągacza kapilar mikropipetowych do wytworzenia igieł z czterocalowych kapilar szklanych o średnicy jednego milimetra z wewnętrznymi włóknami, mając przygotowaną płytkę do mikroiniekcji oraz igły. Przejdźmy do zbierania embrionów i przygotowania aparatury do mikroiniekcji. Zapłodnione jaja są zbierane natychmiast po złożeniu i przechowywane w szalce Petri wypełnionej podłożem dla embrionów.

Za pomocą szklanej pipety o szerokim zakończeniu przenieść embriony do otworów w płytce inkubacyjnej w temperaturze pokojowej, wypełnionej pożywką dla embrionów. Używając pęsety stępionej, ostrożnie wcisnąć embriony na dno zagłębień; embriony, których chorion lub żółtko zostały uszkodzone, należy odrzucić.

Następnie należy pobrać do igły wtryskowej od jednego do dwóch mikrolitrów rozcieńczonego fluorescencyjnego roztworu dekstryny Alexa 5 9 4. Pozostawić dekstrynę, aby dotarła do końcówki igły wtryskowej dzięki działaniu kapilarnemu. Przymocować igłę wtryskową do uchwytu kapilarnego mikromanipulatora stereotaktycznego i wstępnie ustawić ciśnienie w aparacie mikroinjektora.

od 40 do 50 PSI i czas trwania impulsu 500 milisekund. Za pomocą pęsety delikatnie przetrzyj lub odetnij końcówkę igły wtryskowej, aby przełamać uszczelnienie. Optymalnie średnica powinna wynosić od 0,05 do 0,15 milimetra.

Aby skalibrować igłę, należy użyć stereomikroskopu i wypchnąć dekstrynę na mikrometr pokryty olejem mineralnym. Wielkość bolusa można modyfikować, regulując czas trwania impulsu ciśnienia powietrza oraz rozmiar igły. Wskazówka: podczas wstrzyknięć należy utrzymywać wielkość bolusa odpowiadającą objętości od 0,8 do 1 nanolitra.

Można teraz rozpocząć mikroiniekcję dekstryny, używając przybliżenia około 3.2x na mikroskopie stereoskopowym. Iniekcje zarodków należy przeprowadzać od jednego końca koryta, płynnie przebijając chorion i błonę komórkową zarodków w celu wprowadzenia igły do żółtka. Roztwór dekstryny należy wstrzyknąć tuż pod komórkę.

Należy upewnić się, że igła do wstrzykiwania jest wyjmowana tym samym płynnym ruchem, którym wprowadzano ją do zarodka. Przesuwać szalkę Petriego tak, aby kolejny zarodek w rzędzie znalazł się w odpowiedniej pozycji, a następnie kontynuować wstrzykiwanie wzdłuż całego rowka. Okresowo kontrolować ciśnienie oraz wielkość bolusa.

Następnie za pomocą pęsety delikatnie wypchnij embriony z rynienek. Przenieś je do szalki Petriego wypełnionej pożywką dla embrionów z antybiotykiem. Inkubuj embriony w temperaturze 28,5 °C i monitoruj je pod kątem niezapłodnionych jaj lub obumarć.

Zarodki są teraz gotowe do przyszłych transplantacji. Przed zakończeniem procesu polipolizacji części żółtka pozostają odsłonięte. Żółtko jest niezwykle delikatne i może przywrzeć do plastiku szalki Petriego, co łatwo doprowadzi do jego przerwania.

W związku z tym zarodki muszą zostać naniesione na powlekone płytki na dzień przed przeprowadzeniem przeszczepów. Przygotuj te płytki dekoracyjne, wlewając od 5 do 10 ml roztopionego agarosu do 100 mm szalki Petriego. Do amortyzacji zarodków podczas dekorowania wystarczy cienka warstwa agarosu o grubości około 2-3 mm.

Pozostaw płytki do ostygnięcia. Następnie przygotuj oddzielne płytki do transplantacji, wlewając 30 mililitrów 1,5% roztworu agarose do 100-milimetrowej płytki Petriego i wkładając formę do studzienek transplantacyjnych. Forma powinna zawierać 104 trójkątne wgłębienia, z których każde składa się z trzech boków pod kątem 90 stopni oraz jednego boku pod kątem 45 stopni.

Dołki są zaprojektowane tak, aby pomieścić dwa embriony obok siebie. Należy uważać, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza pod formą, i pozwolić agarowi stężeć. Usunięcie formy odsłania zagłębienie zawierające kwadratowe dołki ze ściętą krawędzią.

Aby przygotować zarodki biorcy i dawcy do transplantacji, należy monitorować ich rozwój, aby zachować pary o zbliżonym wieku. W tym celu zarodki można hodować w temperaturach od 23 do 31 stopni Celsjusza, aby spowolnić lub przyspieszyć ich rozwój. Zarówno zarodki biorcy, jak i dawcy powinny zostać ręcznie naniesione na płytkę powlekaną na godzinę przed osiągnięciem pożądanego wieku.

W przypadku przeszczepów na etapie gastrulacji procedura ta musi zostać zakończona do pięciu godzin po zapłodnieniu (HPF), przed etapem tarczy (shield stage) w 5,5 HPF. Użyj szklanej pipety, aby przenieść zarodki gospodarza i dawcy do płytki do przeszczepów wypełnionej antybiotykowym podłożem dla zarodków. W tym układzie pierwszy rząd jest wypełniony zarodkami dawcy (po dwa zarodki na studzienkę), a dwa kolejne rzędy zawierają po jednym zarodku gospodarza na studzienkę.

Do transplantacji wykorzystujemy fluorescencyjny stereomikroskop Zeiss luer z w pełni zautomatyzowaną regulacją zoomu i ostrości sterowaną joystickiem. Choć ten zautomatyzowany mikroskop nie jest niezbędny, znacząco zwiększa on łatwość i efektywność tych precyzyjnych transplantacji chirurgicznych, zwłaszcza gdy planowana jest ich duża liczba. Aby przygotować aparat do transplantacji, ustawimy einor air tram w połowie jego skali, podłączymy rurki air tram do uchwytu kapilarnego i przymocujemy uchwyt do zautomatyzowanego mikromanipulatora einor. Po przygotowaniu embrionów i aparatu do transplantacji możemy przejść do transplantacji komórek na etapie gastruli.

Najbardziej krytyczną umiejętnością przy przeprowadzaniu transplantacji komórek na etapie gastrulacji jest zdolność do rozpoznania anatomii komórkowej grzbietowych blastomerów (APO lip), znanych u danio przewodnikowego jako tarcza (shield). Przedstawiamy tutaj film sekwencyjny gastruli z różnych perspektyw i wskazujemy położenie tarczy w tym widoku bocznym. Tarcza, czyli strona grzbietowa, znajduje się po prawej stronie w czerwonej obramowaniu, aby wskazać komórki docelowe dla transplantacji komórek do przedmózgowia oraz do linii środkowej.

Dokładnie w połowie drogi między biegunem zwierzęcym a tarczą zaczniemy obracać zarodek najpierw w stronę widza, aby ukazać biegun zwierzęcy, eksponując przy tym tarczę oraz miejsce przeszczepu. Następnie zarodek obraca się wokół własnej osi, tak aby tarcza znalazła się na dole. Gastrula obraca się teraz z powrotem w górę, prezentując widok grzbietowy od przodu.

Zarodek zostaje teraz ponownie obrócony sekwencyjnie do widoku bocznego w 6 HPF. Używając mikromanipulatora, należy delikatnie dotknąć zarodka końcówką kapilary, aby obrócić go do pozycji umożliwiającej ekstrakcję komórek w taki sposób, aby jego linia środkowa i tarcza były widoczne i znajdowały się naprzeciwko końcówki kapilary; zarodki dawcy można łatwo zweryfikować, przełączając oświetlenie z jasnego pola na fluorescencyjne. W tym przypadku komórki gastruli fluorescują na czerwono. Należy zassać niewielką ilość medium dla zarodków do kapilary, aby wyeliminować możliwość kontaktu komórek z powierzchnią fazy powietrze-woda, co mogłoby doprowadzić do ich uszkodzenia.

Delikatnie przebij ektodermę zarodka dawcy w linii środkowej, dokładnie pomiędzy biegunem zwierzęcym a tarczką. W obszarze gasa między ektodermą powierzchniową a leżącym pod nią żółtkiem znajdowała się warstwa komórek o grubości zaledwie około 20 micrometers. Należy zatem uważać, aby nie przebić żółtka, ponieważ często prowadzi to do śmierci zarodka w ciągu kilku godzin.

Używając mikromanipulatora powietrznego, powoli aspiruj komórki do kapilary. Przez cały czas utrzymuj widoczność linii wody, lekko poruszając końcówką. Podczas przebywania wewnątrz dawcy pomoże to rozluźnić kontakty międzykomórkowe.

Z zarodka dawcy należy wyekstrahować około 10 do 50 komórek. Następnie należy wyciągnąć kapilarę z dawcy. W analogiczny sposób należy ustawić zarodek biorcy, a następnie przebić go i wprowadzić komórki dokładnie w to samo miejsce w zarodku biorcy; zmiana oświetlenia z jasnego pola na fluorescencyjne pozwala zaobserwować przemieszczanie się znakowanych dekstryną komórek z igły kapilarnej do zarodka biorcy.

Na koniec, po transplantacji, wyjmij embriony dawcy i biorcy z dołków. Rozdziel je i delikatnie umieść na powleczonej agarosem szalce Petriego wypełnionej pożywką dla embrionów z antybiotykiem. Inkubuj embriony w temperaturze 28.5 °C; tym samym proces transplantacji został zakończony.

Przejdźmy do wizualizacji i obrazowania. Proces rozpoczyna się od utrwalenia embrionów na odpowiednim etapie rozwoju za pomocą konserwantu zweryfikowanego pod kątem immunochemii. W naszym przypadku utrwalanie odbywa się w 4% formaldehydzie przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C w warunkach rotacji.

Następnie przepłucz utrwalone embriony dwukrotnie, a potem płucz je przez trzy do pięciu minut w 0.1 molar pb. W razie potrzeby przeprowadź odpowiednie znakowanie immunologiczne.

Zanurz zarodki w 75% glicerolu w temperaturze pokojowej, a następnie przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotuj preparat do zamontowania dwóch zarodków, tworząc na szkiełku dwa kwadratowe obrysy z wazeliny, odpowiadające średnicy wewnętrznej kwadratu. Połóż szkiełko nakrywkę obok zarodka i przeprowadź wszelkie niezbędne sekcje, aby uzyskać widok frontalny przedmózgowia.

Odseparuj przedmózgowie, wykonując cięcie prostopadle przez śródmózgowie. Umieść tę tkankę wraz z minimalną ilością glicerolu w wazelinie. Odpowiednio zorientuj tkankę i przykryj preparat szkiełkiem podstawowym.

Alternatywnie, w przypadku żywych zarodków, należy zamocować je na szkle w 0,75% roztworze agro. W naczyniach hodowlanych o płaskim dnie, zanim agro zestaleje, należy użyć igły wolframowej, aby ustawić zarodek w odpowiedniej orientacji do obrazowania. Obrazowane są zarówno utrwalone, jak i żywe organizmy gospodarza.

Przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego z pięcioma laserami Leica SP nabywano stosy ZS, a następnie przeprowadzano trój- lub czterowymiarowe przetwarzanie obrazów za pomocą oprogramowania Velocity w celu wygenerowania embrionów chimerycznych, w których część populacji astroglii wewnątrz zarodka różni się genotypem lub fenotypem. Zastosowaliśmy wieloaspektowe podejście, łączące wykorzystanie transgeniczych embrionów GFP, które znakują astroglia, z transplantacją komórek w określonym stadium gastrulacji, aby precyzyjnie skierować nasze klony do cefalonu. Wykorzystaliśmy mapę losów gastrulacji danio pręgowanego, aby selektywnie pobrać komórki z linii środkowej w odległości równoodległej od bieguna zwierzęcego i tarczy.

Wyizolowane komórki przeszczepiono następnie w to samo miejsce u gospodarza z linii dzikiej, którego następnie hodowano do 30 HPF i poddano immunoznakowaniu wszystkich aksonów, aby służyły one jako punkty orientacyjne dla anatomii przedmózgowia. W przedstawionym tutaj przykładzie obrazowanie konfokalne jednego embrionu gospodarza ujawnia odizolowane komórki GFP-dodatnie w obrębie cefalonu i cefalonu. Pełną morfologię tych komórek GFP-dodatnich można zaobserwować w tym badaniu klonalnym, które wykazuje, że większość tych komórek przyjmuje charakterystyczną morfologię gleju radialnego, w której soma znajduje się sąsiadująco ze strefą komorową, a duża stopka końcowa zamyka wypustkę radialną na powierzchni płaszcza.

Trójwymiarowa wizualizacja stosu tych zebranych przekrojów optycznych wyraźnie pokazuje położenie tych komórek w stosunku do znakowanych aksonów. Innym powszechnie stosowanym podejściem do wizualizacji przeszczepionych komórek jest wstępne mikro wstrzyknięcie fluorescencyjnego barwnika linii komórkowych do żółtka zarodka typu dzikiego lub transgenicznego GFP w stadium jednej komórki. W tym przykładzie wstrzyknęliśmy dekstrynę Alexa 594 do zarodków typu dzikiego.

Na etapie jednej komórki pozwoliliśmy im rozwijać się do stadium gastruli, a następnie przeprowadziliśmy czterokrotne przeszczepy celowane w mózg, zgodnie z powyższym opisem. Jednak zamiast tego, dokonaliśmy przeszczepu do transgenicznego gospodarza w stadium gastruli, wykonując obrazowanie grzbietowej części głowy za pomocą skanującego laserowo mikroskopu konfokalnego. Mikroskopia konfokalna ujawniła czerwone fluorescencyjne skupiska komórek dawcy pośród jąder dodatnich dla GFP w obrębie przedmózgowia.

Dalszą analizę tego gospodarza przeprowadziliśmy, zbierając obrazy z-stacki co trzy minuty przez dwie godziny za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego. Renderowanie czterowymiarowe tego zapisu czasowego przy użyciu oprogramowania Velocity udostępnionego przez IMP pokazuje dynamiczne ruchy komórkowe błon komórkowych dominujących pręcików oraz jąder dodatnich dla GFP. Przedstawiliśmy właśnie sposób przygotowania całej niezbędnej aparatury i odczynników do transplantacji komórek w embrionach zebrafish.

W szczególności zademonstrowaliśmy tę technikę na etapie gastruli. Jest ona jednak stosowalna również w przypadku przeszczepów na etapie blastuli. Podczas stosowania tej procedury ważne jest precyzyjne powiązanie końcowej pożądanej lokalizacji przeszczepionych komórek z ich wcześniejszą pozycją na mapie losów komórek w trakcie gastrulacji; w celu uzyskania dalszych wytycznych należy zapoznać się ze szczegółowym badaniem map losów zarodków Danio pręgowanego z 1995 roku autorstwa dr. Scotta Fraziera pt. Fate Maps of the Zebrafish Embryo.

To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.