Chimery embrionalne z ukierunkowaniem tkankowym: transplantacja komórek gastruli rybki danio-pręgawki

Procedura rozpoczyna się od ułożenia zarodków danio pręgowanego w stadium jednej komórki w płytce do mikroiniekcji. Należy wstrzyknąć za pomocą mikroiniekcji roztwór fluorescencyjnej dekstryny do żółtka. Zarodki poddane iniekcji znajdujące się bezpośrednio poniżej komórki stanowią dawców do transplantacji.

Powlecz zarodki dawcy i gospodarza i hoduj je do stadium tarczy (shield stage). Umieść dwa zarodki z wstrzykniętą dekstryną powleczoną DEC obok siebie w jednej studzience płytki do transplantacji. Powtórz to dla każdej pary dawców poniżej. Dodaj jeden zarodek gospodarza do każdej studzienki, aby skierować transplantowane komórki do przyszłego przedmózgowia (diencephalon) w przedniej części mózgu; transplantuj komórki z linii środkowej i do niej.

W połowie drogi między biegunem zwierzęcym a tarczą. Przeszczep komórki z gastruli dawcy do gastruli biorcy. Hodować do 30 godziny, a następnie utrwalić.

W razie potrzeby przeprowadź immunochemię, zamontuj preparat i wykonaj obrazowanie. Alternatywnie zamontuj żywego gospodarza i przeprowadź obrazowanie z odstępem czasu (time-lapse). Cześć, nazywam się Elizabeth De Shane i pochodzę z laboratorium dr. Michaela ESI z Katedry Nauk Biologicznych w Smith College w Northampton w Massachusetts.

Jestem kierownikiem laboratorium, dr Michael Besi. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak tworzyć embriony chimeryczne poprzez przeprowadzanie transplantacji komórek w stadium gastruli z wykorzystaniem modelu rybki danio (zebrafish). W moim laboratorium stosujemy tę procedurę do badania funkcji specyficznych genów w rozwoju spoiwa przedmózgowia, a także procesu oddziaływań aksonalno-glejowych podczas formowania się spoiwa.

Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć, należy przygotować formy rynienek do płytek do mikroiniekcji, ostrożnie łamiąc na pół trzy kapilary niefilamentowe o średnicy 1 mm i długości 4 cali. Za pomocą superkleju przyklej dwie połówki kapilar obok siebie do płaskiej powierzchni klejącej.

Trzecią kapilarę ułożono na wierzchu tych dwóch, osadzając ją w zagłębieniu tak, aby utworzyć kształt piramidy. Pozostawić formę do wyschnięcia wraz z trzema kapilarami. Należy przygotować od trzech do pięciu form dla każdej płyty wtryskowej.

Następnie przygotuj płytki do iniekcji, wlewając od 20 do 25 mililitrów roztopionego 1,5% agarosu w podłożu do embrionów do 100 milimetrowej szalki Petriego. Natychmiast umieść od trzech do pięciu przygotowanych form do rynienek na dnie płytki, upewniając się, że płaska strona formy dotyka dna szalki Petriego i jest całkowicie przykryta agarozą. Po zestaleniu się agarozy wyjmij formy do rynienek, wycinając duży kwadrat z agarozy, w którym się znajdują.

Delikatnie oddziel agar na obrzeżach wyciętego kwadratu i go usuń. Odwróć kwadratowy kawałek agaru i za pomocą precyzyjnej pęsety całkowicie usuń formy do rowków. Wlej stopiony agar do czerpni Petriego wokół kwadratu, aby ustabilizować nowo uformowane dołki.

Pozostawić do zastygnięcia. Płytki można uszczelnić parafilmem i przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze 4 °C. Należy je wyrzucić, jeśli w agarze pojawią się jakiekolwiek oznaki wzrostu.

Na koniec, aby przygotować igły do mikroiniekcji, należy użyć wyciągacza kapilar mikropipet, aby wykonać igły z jednofilamentowych szklanych kapilar o średnicy 1 mm i długości 4 cali, z wykorzystaniem płytki do mikroiniekcji i przygotowanych igieł. Przejdźmy do zbierania embrionów i konfiguracji aparatury do mikroiniekcji. Zapłodnione jaja są zbierane natychmiast po ich złożeniu i utrzymywane w szalce Petri wypełnionej pożywką dla embrionów.

Za pomocą szklanej pipety o szerokim wylocie przenieś zarodki do otworów płytki iniekcyjnej w temperaturze pokojowej, wypełnionej pożywką dla zarodków. Używając zapinanych pęsety tępich, delikatnie dociśnij zarodki do dna zagłębień; zarodki, których chorion lub żółtko zostały uszkodzone, należy odrzucić.

Następnie należy pobrać od 1 do 2 µL rozcieńczonego fluorescencyjnego roztworu dekstryny Alexa 5 9 4 do igły iniekcyjnej. Pozostawić dekstrynę, aby przedostała się do końcówki igły iniekcyjnej dzięki działaniu kapilarnemu. Przymocować igłę iniekcyjną do uchwytu kapilary stereotaktycznego mikromanipulatora, a następnie odpowiednio ustawić ciśnienie w urządzeniu mikroiniekcyjnym przed rozpoczęciem procedury.

Od 40 do 50 PSI oraz czas trwania impulsu wynoszący 500 milisekund. Za pomocą pęsety delikatnie potrzeć lub odciąć końcówkę igły wtryskowej, aby przerwać uszczelnienie. Idealnie średnica powinna wynosić od 0,05 do 0,15 milimetra.

Aby skalibrować igłę, należy użyć stereomikroskopu i wypuścić dekstrynę na mikrometr z nałożonym na wierzch olejem mineralnym. Wielkość bolusa modyfikuje się poprzez regulację czasu trwania impulsu ciśnienia powietrza oraz rozmiaru igły. Wskazówka: podczas wstrzykiwań należy utrzymywać wielkość bolusa odpowiadającą objętości od 0,8 do 1 nanolitrów.

Można teraz rozpocząć mikroiniekcję dekstryny, stosując powiększenie około 3,2x w mikroskopie stereoskopowym. Iniekcje zarodków należy przeprowadzać od jednego końca korytka, gładko przebijając chorion i błonę komórkową zarodków, aby dostać się do żółtka. Należy wstrzyknąć roztwór dekstryny bezpośrednio pod komórkę.

Należy upewnić się, że igła do wstrzykiwania została usunięta tym samym płynnym ruchem, który zastosowano podczas wnikania do zarodka. Przesuń szalkę Petriego, aby ustawić kolejnego zarodka w linii, a następnie kontynuuj wstrzykiwanie wzdłuż rynienki. Okresowo sprawdzaj ciśnienie oraz wielkość bolusa.

Następnie za pomocą pęsety delikatnie wypchnij zarodki z rowków. Przenieś je do szalki Petriego wypełnionej pożywką do zarodków z antybiotykiem. Inkubuj zarodki w temperaturze 28,5 °C i monitoruj je pod kątem obecności niezapłodnionych jaj lub martwych osobników.

Zarodki są teraz gotowe do przyszłych transplantacji. Przed zakończeniem procesu polaryzacji część żółtka pozostaje odsłonięta. Żółtko jest niezwykle kruche, może przylegać do plastiku szalki Petriego i łatwo ulec rozerwaniu.

W związku z tym zarodki muszą zostać naniesione na powlekone płytki na dzień przed przeprowadzeniem transplantacji. Przygotuj te płytki dekoracyjne, wlewając od 5 do 10 ml roztopionego agarosu do 100 mm szalki Petriego. Do amortyzacji zarodków podczas dekoracji wystarczy cienka warstwa agarosy o grubości około 2-3 mm.

Pozostaw płytki do ostygnięcia. Następnie przygotuj osobne płytki do transplantacji, wlewając 30 mililitrów 1,5% roztworu agarose do 100 milimetrowej szalki Petriego i wkładając formę do studni transplantacyjnych. Forma powinna zawierać 104 trójkątne wgłębienia, z których każde składa się z trzech boków pod kątem 90 stopni i jednego boku pod kątem 45 stopni.

Dołki są zaprojektowane tak, aby pomieścić dwa embriony obok siebie. Należy uważać, aby pod formą nie uwięźli pęcherzyki powietrza, i pozostawić agar do stwardnienia. Po usunięciu formy odsłonięty zostanie zagłębiony obszar zawierający kwadratowe dołki ze skośną krawędzią.

Aby przygotować embriony biorcy i dawcy do transplantacji, należy monitorować ich rozwój w celu utrzymania par o zbliżonym wieku. W tym celu embriony można hodować w różnych temperaturach, od 23 do 31 stopni Celsius, aby spowolnić lub przyspieszyć ich rozwój. Zarówno embriony biorcy, jak i dawcy powinny zostać naniesione ręcznie na płytkę powlekaną na godzinę przed osiągnięciem pożądanego wieku.

W przypadku transplantacji na etapie gastrulacji proces ten musi zostać ukończony do piątej godziny po zapłodnieniu (HPF), czyli przed etapem tarczy (shield stage) w 5,5 HPF. Należy użyć szklanej pipety, aby przenieść zarodki gospodarza i dawcy do płytki transplantacyjnej wypełnionej antybiotykowym medium do embrionów. W tym układzie pierwszy rząd wypełnia się zarodkami dawcy (po dwa zarodki na dołek), a dwa kolejne rzędy pojedynczymi zarodkami gospodarza w każdym dołku.

Do transplantacji wykorzystujemy fluorescencyjny stereomikroskop Zeiss luer, który posiada w pełni zautomatyzowaną manipulację zoomem i ostrością sterowaną za pomocą dżojstika. Chociaż ten zautomatyzowany mikroskop nie jest niezbędny, znacznie zwiększa on łatwość i wydajność tych precyzyjnych transplantacji chirurgicznych, szczególnie gdy wymagana jest ich duża liczba. Aby przygotować aparat do transplantacji, ustaw einor air tram w pozycji środkowej na skali, podłącz rurkę air tram do uchwytu kapilarnego i zamocuj uchwyt do zautomatyzowanego mikromanipulatora einor. Po przygotowaniu embrionów i aparatu do transplantacji możemy przejść do transplantacji komórek w stadium gastruli.

Najważniejszą umiejętnością podczas przeprowadzania transplantacji komórek na etapie gastruli jest zdolność do rozpoznania anatomii komórkowej grzbietowych blastomerów APO lip, znanych również jako tarcza (shield) u danio pręgowanego. Przedstawiamy tutaj sekwencję filmową gastruli z różnych perspektyw i wskazujemy położenie tarczy w tym widoku bocznym. Tarcza, czyli strona grzbietowa, znajduje się po prawej stronie w czerwonym obrysie, aby wyznaczyć komórki docelowe do transplantacji w kierunku przedmózgowia oraz do linii środkowej.

Dokładnie w połowie drogi między biegunem zwierzęcym a tarczą zaczniemy obracać embrion najpierw w Twoją stronę, aby ukazać biegun zwierzęcy, uwydatniając po drodze tarczę oraz miejsce przeszczepu. Następnie embrion obraca się wokół własnej osi, tak aby tarcza znalazła się na dole. Gastrula obraca się teraz z powrotem w górę, prezentując bezpośredni widok grzbietowy.

Zarodek zostaje teraz obrócony z powrotem w sekwencji do widoku bocznego w szóstej godzinie po zapłodnieniu (HPF). Za pomocą mikromanipulatora należy delikatnie dotknąć zarodka końcówką kapilary, aby obrócić go do pozycji umożliwiającej ekstrakcję komórek, tak aby jego linia środkowa i tarcza były widoczne i znajdowały się naprzeciwko końcówki kapilary; zarodki dawcy są łatwo weryfikowalne poprzez przełączenie oświetlenia z jasnego pola na fluorescencyjne. W tym przypadku komórki gastruli fluorescują na czerwono; należy zassać niewielką ilość medium dla zarodków do kapilary, aby wyeliminować możliwość kontaktu komórek z powierzchnią styku powietrza i wody, co mogłoby im zaszkodzić.

Delikatnie przebij ektodermę zarodka dawcy w linii środkowej, dokładnie pomiędzy biegunem zwierzęcym a tarczką. W obszarze gasa między ektodermą powierzchniową a leżącym pod nią żółtkiem znajdowała się warstwa komórek o grubości zaledwie około 20 µm. Należy zatem uważać, aby nie przebić żółtka, ponieważ często prowadzi to do śmierci zarodka w ciągu kilku godzin.

Używając trampka powietrznego, powoli aspiruj komórki do kapilary. Zawsze utrzymuj widoczność linii wody, lekko potrząsając końcówką. Podczas przebywania wewnątrz, donor pomoże poluzować kontakty międzykomórkowe.

Z zarodka dawcy należy pobrać około 10 do 50 komórek. Następnie należy wyciągnąć kapilarę z dawcy. Odpowiednio ustawiając zarodek biorcy, należy go przebić i wprowadzić komórki dokładnie w to samo miejsce. Przełączenie z oświetlenia w polu jasnym na fluorescencyjne pozwala zaobserwować przemieszczanie się znakowanych dekstryną komórek z igły kapilarnej do zarodka biorcy.

Na koniec, po transplantacji, należy usunąć embriony donora i gospodarza z dołków. Rozdzielić je i ostrożnie umieścić na pokrytej agarem szalce Petriego wypełnionej pożywką do embrionów z antybiotykiem. Inkubować embriony w temperaturze 28,5 °C; tym samym proces transplantacji zostaje zakończony.

Rozpocznijmy proces wizualizacji i obrazowania. W pierwszej kolejności należy utrwalić zarodki na odpowiednim etapie rozwoju do obrazowania, używając konserwantu zweryfikowanego pod kątem immunochemii. W naszym przypadku będzie to 4% formaldehyd przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C w warunkach rotacji.

Następnie przepłucz utrwalone embriony dwukrotnie, a potem myj je przez od trzech do pięciu minut w 0,1 M pb. W razie potrzeby przeprowadź odpowiednie znakowanie immunologiczne.

Umieść embriony w 75% glicerolu, zanurz je w temperaturze pokojowej, a następnie przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotuj preparat do zamontowania dwóch embrionów, tworząc na szkiełku dwa kwadratowe obrysy z wazeliny, których wymiary odpowiadają średnicy wewnętrznej kwadratu. Połóż szkiełko nakrywkę obok embrionu i przeprowadź wszelkie niezbędne sekcje, aby uzyskać widok czołowy przedmózgowia.

Oddziel przedmózowie, wykonując cięcie prostopadłe w obrębie śródmózwia. Umieść tę tkankę wraz z minimalną ilością glicerolu w wazelinie. Odpowiednio zorientuj tkankę i przykryj preparat szkiełkiem nakrywką.

Alternatywnie, w przypadku żywych zarodków, należy zamocować je na szkle w 0,75% roztworze agro. Do naczyń hodowlanych z dnem, zanim agro zestali się, należy użyć igły wolframowej, aby ustawić zarodek w odpowiedniej orientacji do obrazowania. Obrazowane są zarówno utrwalone, jak i żywe organizmy gospodarzy.

Przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego Leica SP z pięcioma laserami pozyskano stosy Z-stack, a następnie przeprowadzono trój- lub czterowymiarową analizę obrazu za pomocą oprogramowania Velocity w celu wygenerowania embrionów chimerycznych, w których część populacji astroglii wewnątrz embrionu różni się pod względem genotypu lub fenotypu. Zastosowano wieloaspektowe podejście łączące użycie embrionów transgenicznych GFP, które znakują astroglię, z transplantacją komórek na etapie gastruli, aby precyzyjnie skierować klony do głowy (cephalon). Wykorzystano mapę losów gastrulacji danio-przeżerca, aby selektywnie wyizolować komórki z linii środkowej, w równej odległości od bieguna zwierzęcego i tarczy (shield).

Wyizolowane komórki przeszczepiono następnie w to samo miejsce u gospodarza gaza typu dzikiego, który został następnie doprowadzony do 30 HPF i poddany immunoznakowaniu wszystkich aksonów jako punktów odniesienia dla anatomii przedmózgu. W przedstawionym tutaj przykładzie obrazowanie konfokalne jednego zarodka gospodarza wykazuje odizolowane komórki GFP-dodatnie w obrębie cefalonu i cefalonu. Pełna morfologia tych komórek GFP-dodatnich może być zaobserwowana w tym badaniu klonalnym, wykazując, że większość z tych komórek przyjmuje charakterystyczną morfologię glejową radialną, w której soma znajduje się sąsiadująco ze strefą komorową, a duża stopka końcowa zamyka wypustkę radialną na powierzchni płaszcza.

Trójwymiarowa rekonstrukcja stosu tych zebranych przekrojów optycznych wyraźnie pokazuje położenie tych komórek względem znakowanych aksonów. Innym powszechnie stosowanym podejściem do wizualizacji przeszczepionych komórek jest początkowe mikroiniekcja fluorescencyjnego barwnika linii komórkowej do żółtka zarodka typu dzikiego lub transgenicznego GFP w stadium jednego komórki. W tym przykładzie do zarodków typu dzikiego wstrzyknęliśmy dekstrynę Alexa 594.

Na etapie jednej komórki pozwolono im rozwijać się do stadium gastruli, a następnie przeprowadzono czterech transplantacji celowanych w mózg, zgodnie z opisaną powyżej procedurą. Jednak w tym przypadku transplantacji dokonano do transgenicznych gospodarzy w stadium gastruli, a następnie wykonano obrazowanie grzbietowej części głowy za pomocą skanującego mikroskopu konfokalnego. Mikroskopia konfokalna ujawniła fluorescencyjne czerwone skupiska komórek dawcy pomiędzy jądrami dodatnimi dla GFP w obrębie przedmózgu.

Dalszą analizę tego gospodarza przeprowadziliśmy, wykonując obrazy typu z-stack co trzy minuty przez dwie godziny za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego. Czterowymiarowa wizualizacja tego przebiegu czasowego, opracowana przy użyciu oprogramowania Velocity dostarczonego przez IMP, pokazuje dynamiczne ruchy komórkowe błon komórkowych komórek pręcikowych oraz jąder GFP-dodatnich. Przedstawiliśmy właśnie sposób przygotowania całej niezbędnej aparatury i odczynników do transplantacji komórek w zarodkach ryb zebrafish.

W szczególności zaprezentowaliśmy tę technikę na etapie gastruly. Jest ona jednak możliwa do zastosowania również w przypadku przeszczepów na etapie blastuli. Podczas stosowania tej procedury ważne jest, aby precyzyjnie powiązać docelową pożądaną lokalizację przeszczepionych komórek z ich wcześniejszą lokalizacją na mapie losów tych komórek w gastruli; w celu uzyskania dalszych wytycznych należy zapoznać się ze szczegółowym badaniem map losów zarodka danio pręgowanego z 1995 roku autorstwa dr. Scotta Fraziera pt. Fate Maps of the Zebrafish Embryo.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.