Name: Szybkie i czułe koloidalne barwienie Coomassie G-250 białek w żelach poliakrylamidowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-03T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Poznaj zmodyfikowany protokół barwienia Coomassie G-250 do szybkiej detekcji nanogramowych ilości białek w żelach poliakrylamidowych. Ta metoda zapewnia wysoką czułość w analizie proteomicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Nicola Wiethölter za przygotowanie i barwienie żeli 1-D.
Praca ta została sfinansowana z grantu przyznanego przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/projekt 5 dla ND i SM) oraz wsparta stypendium badawczym z Jürgen Manchot Stiftung dla ND.

Część 1: Dwuwymiarowa (2-D) elektroforeza żelowa z wykorzystaniem nakładania do zagłębień (cup-loading)
<ol>
<li>Rehydratacja pasków IPG i ogniskowanie izoelektryczne (IEF) 
<ul>
<li>Rehydratować żele Immobiline DryStrip, pH 6-11 (7 cm) w 125 μl roztworu rehydratacyjnego [7 M mocznika, 2 M tiomocznika, 4% CHAPS, 50 mM hydroksyetylodisiarczku i 2% buforu IPG pH 6-11], używając kuwety do rehydratacji Immobiline DryStrip Reswelling Tray przez co najmniej 10 godzin.</li>
<li>Rozpuścić wytrąconą próbkę białka w buforze do próbek IEF [7 M mocznika, 2 M tiomocznika, 2% CHAPS, 2% ASB-14, 50 mM hydroksyetylodisiarczku i 2% buforu IPG pH 6-11] w stężeniu odpowiadającym 60-100 μg białka na 100 μl.</li>
<li>Po solubilizacji (co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej), nanieść próbkę białka poprzez ładowanie do wgłębień anodowych za pomocą uchwytów na próbki. Objętość wgłębienia wynosi 100 μl (uchwyty typu Manifold pozwalają na naniesienie do 150 μl). Uwaga: można nanieść większe ilości próbki, jeśli na początku protokołu ogniskowania wprowadzi się etap niskiego napięcia i uzupełni zawartość wgłębień, gdy wciąż znajduje się w nich warstwa cieczy!</li>
<li>Przeprowadzić ogniskowanie izoelektryczne przez 11,1 kVh w trybie gradientowym w urządzeniu do elektroforezy Multiphor II.</li>
</ul>
</li>
<li>Równoważenie i SDS-PAGE 
<ul>
<li>Po IEF paski IPG poddano redukcji i alkilacji, po 15 minut na wytrząsarce w każdym etapie, stosując odpowiednio 1% ditiotreitol i 2,5% jodoacetamid w roztworze równoważącym [50 mM Tris-HCl/pH 8,8, 6 M mocznika, 30% glicerolu i 2% SDS]. </li>
<li>Przepłukać zrównoważone paski wodą H2O i osuszyć je na papierze Whatman, aby usunąć nadmiar buforu równoważącego. Następnie zanurzyć paski w buforze do elektroforezy SDS (1X). </li>
<li>Drugi wymiar wykonuje się za pomocą SDS-PAGE w pionowym systemie elektroforetycznym przy całkowitym stężeniu akryloamidu 12 %. Zrównoważone paski IPG umieszczono na górze żeli rozdzielających i utrwalono gorącym roztworem agarozy [0,5% agarozy w buforze do elektroforezy zawierającym błękit bromofenolowy].</li>
<li>Białka rozdzielano przez 2,5 h, rozpoczynając od 80 V przez 15 minut, a następnie 120 V aż do momentu dotarcia frontu barwnika do dna kasety z żelem.</li>
</ul>
</li>
</ol>
Część 2: Koloidalne barwienie Coomassie z użyciem CBB G-250
1. Roztwory barwiące Uwaga: do przygotowania roztworów barwiących należy używać odczynników o wysokiej czystości, np. klasy czystości analitycznej (p.a.), oraz wody wysokiej czystości uzyskiwanej z systemów Millipore (woda Milli-Q).
<table border="0">
<tbody>
<tr>
<td colspan="2">Roztwór Coomassie:</td>
<td>do 2000 ml H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>0,02 % (w/v)</td>
<td>CBB G-250</td>
<td>0,4 g</td>
</tr>
<tr>
<td>5 % (w/v)</td>
<td>siarczan glinu-(14-18)-wodny</td>
<td>100 g</td>
</tr>
<tr>
<td>10 % (v/v)</td>
<td>etanol (96%)</td>
<td>200 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>2 % (v/v)</td>
<td>kwas ortofosforowy (85 %)</td>
<td>47 ml</td>
</tr>
</tbody>
</table>
Uwaga: podczas przygotowywania roztworu barwiącego należy zachować sekwencyjną kolejność dodawania składników w następujący sposób:
<ol>
<li>najpierw rozpuścić siarczan glinu w wodzie Milli-Q</li>
<li>następnie dodać etanol, zhomogenizować i dodać do roztworu CBB G-250</li>
<li>gdy roztwór zostanie całkowicie rozpuszczony, dodać kwas fosforowy (dodanie kwasu do środowiska alkoholowego powoduje agregację cząsteczek Coomassie do stanu koloidalnego)</li>
<li>na koniec dopełnić wodą Milli-Q</li>
</ol>
Uwaga: końcowy roztwór barwiący ma ciemnozielono-niebieski kolor i zawiera liczne pływające w nim cząsteczki:
<ul>
<li>Nie filtruj tego roztworu!</li>
<li>Jeśli zmieniono kolejność przygotowania, otrzymany roztwór będzie miał bardziej fioletowo-niebieski kolor i będzie mniej czuły.</li>
</ul>
<table border="0">
<tbody>
<tr>
<td colspan="2">Roztwór do odbarwiania:</td>
<td>do 2000 ml H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>10 % (v/v)</td>
<td>etanol (96 %)</td>
<td>200 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>2 % (v/v)</td>
<td>kwas ortofosforowy (85 %)</td>
<td>47 ml</td>
</tr>
</tbody>
</table>
2. Procedura barwienia
<ul>
<li>Po rozdzieleniu w drugim wymiarze ostrożnie wyjmij żele z szklanych płytek i przenieś je do kuwety do barwienia wypełnionej wodą Milli-Q.</li>
<li>Przemyj żele trzykrotnie wodą Milli-Q przez 10 minut na wytrząsarce poziomej (niewystarczające przemywanie powoduje niską czułość, ponieważ pozostały na żelach SDS zakłóca wiązanie barwnika z białkiem).</li>
<li>Przed użyciem wstrząśnij roztworem Coomassie, aby równomiernie rozproszyć cząsteczki koloidalne.</li>
<li>Inkubuj żele całkowicie przykryte roztworem Coomassie przy jednoczesnym mieszaniu na wytrząsarce przez 2–12 godzin. Barwienie to generuje minimalne tło, dzięki czemu można obserwować postęp procesu. Uwaga: po 10 minutach można zauważyć pierwsze plamki białek; w ciągu 2 godzin inkubacji około 80% barwienia do poziomu maksymalnego zostaje zakończone. W celu uzyskania prawie 100% barwienia zaleca się inkubację przez noc. W niektórych przypadkach, gdy ilość białka do zabarwienia jest bardzo duża i roztwór zmienia barwę na jaskrawoniebieską, konieczna jest wymiana roztworu barwiącego.</li>
<li>Po zakończeniu procedury barwienia usuń roztwór Coomassie i przepłucz żele dwukrotnie wodą Milli-Q. Uwaga: roztwór barwiący można wykorzystać ponownie, dopóki wciąż obecne są w nim cząsteczki; w przeciwnym razie należy go zutylizować (należy pamiętać, że w laboratorium mogą obowiązywać specjalne przepisy dotyczące utylizacji odpadów).</li>
<li>Usuń przyklejone cząsteczki barwnika z kuwety do barwienia za pomocą ręcznika papierowego niepozostawiającego kłaczków i odbarwiaj przez 10–60 minut. Uwaga: żele można przemywać również samą wodą Milli-Q, jednak zaleca się to wyłącznie w przypadku żeli preparatywnych, ponieważ na żelach pozostanie nieregularna, słaba warstwa Coomassie, która ujawni się podczas skanowania.</li>
<li>Na koniec przepłucz żele dwukrotnie wodą Milli-Q: żele odzyskają swoją pierwotną grubość (środowisko alkoholowo-kwasowe powoduje kurczenie się żeli), a neutralizacja w wodzie dodatkowo wzmocni intensywność koloru Coomassie.</li>
</ul>
Część 3: Reprezentatywne wyniki
Stosując opisany powyżej protokół, uzyskają Państwo na żelu 2-D wyraźnie rozdzielone i dobrze zabarwione na ciemnoniebiesko plamki białkowe. Nawet w porównaniu z żelem 2-D barwionym srebrem zgodnie z metodą Shevchenko et al.5, która charakteryzuje się wysoką czułością i kompatybilnością ze spektrometrią mas, osiągamy porównywalne efekty barwienia.
<img src="/files/ftp_upload/1431/fig1.jpg" alt="Rycina 1" /> Rycina 1: Końcowy wynik opisanego powyżej eksperymentu. Protokół Coomassie według Kanga (A) wykazuje wysoką skuteczność, porównywalną z barwieniem srebrem według Shevchenko et al. (B), w wykrywaniu białek po elektroforezie żelowej 2-D.
Część 4: Wskazówki i triki
<ul>
<li>Przed przystąpieniem do analizy własnych próbek należy wykonać kilka barwień testowych. Z niewyjaśnionych przyczyn zdarzało nam się odnotować przypadki, w których białko docelowe nie zostało pomyślnie wykryte mimo naniesienia ilości rzędu miligramów. W takim przypadku zalecamy przygotowanie serii rozcieńczeń w celu przetestowania czułości metody.</li>
<li>Jeśli w ogóle obserwuje się słabą detekcję białek w żelu, przyczyną może być nieudawany transfer z żelu koncentrującego do żelu rozdzielczego podczas SDS-PAGE. Można sprawdzić obecność takich „lepkich” białek, barwiąc cały żel, w tym obszar koncentrujący.</li>
<li>W celu szybkiej weryfikacji wyników ogniskowania izoelektrycznego można bezpośrednio zabarwić paski IPG bez przeprowadzania dalszej separacji w drugim wymiarze.</li>
<li>Podczas procedury barwienia należy sporadycznie obracać żele, aby były one równomiernie barwione z obu stron (pozostawienie żeli w bezruchu powoduje wiązanie barwnika tylko do jednej strony żelu).</li>
<li>Zaobserwowaliśmy, że przechowywanie roztworu barwiącego w ciemnej butelce przedłuża jego trwałość (w butelkach przezroczystych wynosi ona do 4 miesięcy).</li>
<li>Po zabarwieniu i dokumentacji żele można przechowywać w lodówce przez kilka lat (dodanie roztworu kwasowego pozwala uniknąć zanieczyszczeń grzybami).</li>
<li>Odbarwianie wycinków żelu do trawienia trypsyną można przyspieszyć poprzez ogrzewanie w bloku grzejnym.</li>
</ul>

<ol><li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li>
<li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+Silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li>
<li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Korean+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li>
<li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li>
</ol>

Nie mam nic do ujawnienia.

Innowacyjny czy tylko kolejny protokół barwienia Coomassie?
Obecnie istnieje wiele protokołów procedur barwienia za pomocą Coomassie Brilliant Blue. Większość z nich wynika z niewielkich lub znaczących modyfikacji jednego z najczęściej stosowanych protokołów opracowanych przez Neuhoffa i współpracowników2. Protokół Kanga również opiera się na formule Neuhoffa. Czy jest to jednak rzeczywiście alternatywna metoda barwienia Coomassie w badaniach proteomicznych? Przeanalizujemy dwie głó...

<table><tbody><tr><td>żele Immobiline DryStrip</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6001-94</td><td>Mogą być używane nawet 2 lata po dacie ważności.</td></tr><tr><td>kuweta do rehydratacji Immobiline DryStrip</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6371-84</td><td>Nie czyścić rozpuszczalnikami organicznymi. Przeznaczona dla pasków IPG o długości 7-18 cm.</td></tr><tr><td>zestaw Immobiline DryStrip</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1004-30</td><td>Zawiera kuwetę, uchwyt elektrod, elektrody anodowe i katodowe, wyrównywacz, listwę na kubeczki do próbek oraz kubeczki do próbek.</td></tr><tr><td>zasilacz EPS 3501 XL</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1130-05</td><td>Zapewnia napięcie do 3500 V.</td></tr><tr><td>układ elektroforetyczny Multiphor II</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1018-06</td><td>Ruchome elektrody umożliwiają IEF w paskach IPG o dowolnej długości (paski IPG 7-24 cm)</td></tr><tr><td>system żelowy PerfectBlue Twin S</td><td>Peqlab</td><td>45-1010-C</td><td>SDS-PAGE w formacie mini-żelu 10x10 cm. Komora żelowa zawiera system chłodzenia.</td></tr><tr><td>kuwety do barwienia z pokrywkami</td><td>VWR international</td><td>216-3412</td><td>Pasują do mini-żeli. Możliwość układania w stosy na wytrząsarce.</td></tr><tr><td>siarczan glinu 18-wodny</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1.01102.5000</td><td>Najlepsze doświadczenia uzyskaliśmy z produktami firmy Merck. Dostępny wyłącznie w opakowaniach 5 kg.</td></tr><tr><td>kwas ortofosforowy</td><td>Prolabo</td><td>20 624.295</td><td>Sprzedawany w butelkach szklanych.</td></tr></tbody></table>

szybkie i czułe barwienie białek w żelach poliakrylamidowych koloidalnym barwnikiem coomassie g-250

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) to barwnik powszechnie stosowany do wizualizacji białek rozdzielonych metodą SDS-PAGE, oferujący prostą procedurę barwienia i wysoką możliwość kwantyfikacji. Ponadto jest on w pełni kompatybilny z identyfikacją białek za pomocą spektrometrii mas. Jednak mimo tych zalet, CBB jest uważany za mniej czuły niż barwienia srebrem lub fluorescencyjne, przez co rzadko stosuje się go do wykrywania białek w analitycznych podejściach proteomicznych opartych na żelach.
Wprowadzono kilka ulepszeń oryginalnego protokołu barwienia Coomassie1, aby zwiększyć czułość CBB. Wprowadzono dwie główne modyfikacje w celu usprawnienia detekcji białek o niskiej obfitości poprzez przekształcenie cząsteczek barwnika w cząsteczki koloidalne: w 1988 roku Neuhoff i współpracownicy zastosowali 20% metanol oraz wyższe stężenia siarczanu amonu w roztworze barwiącym opartym na CBB G-2502, a w 2004 roku Candiano et al. opracowali metodę Blue Silver, wykorzystując CBB G-250 z kwasem fosforowym w obecności siarczanu amonu i metanolu3. Niemniej jednak wszystkie te modyfikacje pozwalają na detekcję jedynie około 10 ng białka. Powszechnie znany protokół koloidalnego barwienia Coomassie został opublikowany przez Kang et al. w 2002 roku, w którym zmodyfikowano protokół koloidalnego barwienia CBB Neuhoffa w zakresie substancji kompleksujących. Zamiast siarczanu amonu zastosowano siarczan glinu, a metanol zastąpiono mniej toksycznym etanolem4. Nowa metoda barwienia oparta na glinie w badaniu Kang wykazała wyższą czułość, pozwalającą na detekcję ilości tak niskich jak 1 ng/prążek (fosforylaza b), przy niewielkich różnicach w czułości zależnie od rodzaju białek.
W niniejszym materiale demonstrujemy zastosowanie protokołu Kanga do szybkiego i czułego barwienia białek metodą koloidalnego Coomassie w celach analitycznych. Przedstawimy ten szybki i łatwy protokół na przykładzie żeli dwuwymiarowych, rutynowo stosowanych w naszej grupie badawczej.

Niniejszy film ma na celu spopularyzowanie protokołu barwienia koloidalnego Coomassie G-250 według Kanga et al., służącego do wykrywania średnio 4 ng białka w żelach. Barwienie zostaje zakończone w ciągu 2 godzin i nie wymaga dużego nakładu pracy. Rutynowo stosujemy protokół Kanga do celów analitycznych w proteomice opartej na żelach.

Szybkie i czułe barwienie białek w żelach poliakrylamidowych koloidalnym barwnikiem Coomassie G-250

Coomassie Brilliant Blue (CBB) to barwnik powszechnie stosowany do wizualizacji białek rozdzielonych metodą SDS-PAGE, oferujący prostą procedurę barwienia oraz ...

W tym filmie zaprezentujemy skuteczność zmodyfikowanego protokołu barwienia kumaszem w celu wykrycia kilku nanogramów białka w żelach poliakrylamidowych. Jako przykład wykorzystamy dwuwymiarową elektroforezę żelową, zaczynając od separacji w pierwszym wymiarze. Paski z unieruchomionym gradientem pH są rehydratowane w warunkach buforu denaturującego.Po całonocnym ponownym pęcznieniu pasków, próbki białek nanosi się poprzez ładowanie do kubeczków anodowych. Podczas procesu ogniskowania białka są rozdzielane zgodnie z ich punktami izoelektrycznymi. Rozdzielanie w drugim wymiarze jest przeprowadzane za pomocą SDS-PAGE.Następnie żel przenosi się do kuwety do barwienia, a białka wykrywa się poprzez barwienie koloidalnym kumasim. Dzień dobry, nazywam się Nadine de Bala i pochodzę z laboratorium Sabiny Meki w centrum badań biologiczno-medycznych na Uniwersytecie w Olor. Dzisiaj zwrócę Państwa uwagę na procedurę, która według kolegów z Kangan nie jest szeroko znana; Cy Brilliant Blue jest barwnikiem powszechnie stosowanym do wizualizacji białek po rozdziałach elektroforetycznych, jednak często zakłada się, że jest on mniej przydatny w proteomice porównawczej.Jednakże barwienie koloidalne Co

fast-sensitive-colloidal-coomassie-g-250-staining-for-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szybkie i wrażliwe barwienie kolloidalnym Coomassie G-250 dla białek w żelach poliakrylamideowych

Po rozdzieleniu metodami elektroforetycznymi białka w żelu można wykryć za pomocą kilku metod barwienia. W niniejszym filmie zaprezentowano barwienie białek błękitem Coomassie, barwienie srebrem, SYPRO Orange oraz SYPRO Ruby.

Barwienie białek w żelach

Opisano krótki protokół barwienia białek Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 w żelach poliakrylamidowych, który nie wymaga użycia rozpuszczalników organicznych ani kwasu octowego, stosowanych w klasycznych procedurach barwienia CBB.

Barwienie białek w żelach Coomassie G-250 bez użycia rozpuszczalników organicznych i kwasu octowego

W niniejszym filmie opisujemy charakterystykę kompleksów wielobiałkowych (MPCs) za pomocą nieodbarwiającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE). W pierwszym wymiarze dializowane lizaty komórkowe są rozdzielane metodą BN-PAGE w celu identyfikacji poszczególnych MPCs. W drugim wymiarze, SDS-PAGE, wybrane MPCs są dalej rozdzielane w celu analizy ich składników za pomocą immunoblottingu.

Błękitna natywna elektroforeza w żelach poliakrylamidowych (BN-PAGE) do analizy kompleksów wielobiałkowych z lizatów komórkowych

W tym filmie demonstrujemy metodę barwienia srebrem żeli poliakrylamidowych do wizualizacji całkowitego białka za pomocą sond fluorogenicznych.

Barwienie srebrem fluorescencyjnym: technika wizualizacji białka całkowitego w żelach poliakrylamidowych

Ten film demonstruje technikę denaturacji białek na bazie poliakrylamidu. Technika ta pomaga we wstępnej identyfikacji białek na podstawie ich mas cząsteczkowych.

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu do analizy białek: technika oddzielania i wizualizacji białek na podstawie masy cząsteczkowej

W tym filmie demonstrujemy dwuwymiarową metodę elektroforezy żelowej, która oddziela pojedyncze białka od złożonej mieszaniny białek uzyskanej z tkanek nowotworowych ludzkiego niefunkcjonalnego gruczolaka przysadki (NFPA). Białka są rozdzielane na podstawie ich ładunku elektrycznego w pierwszym wymiarze i dalej rozdzielane na podstawie mas cząsteczkowych w drugim wymiarze.

Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika rozdzielania do analizy białek w złożonej mieszaninie białek na podstawie ładunku i masy cząsteczkowej

Tutaj prezentujemy dwuwymiarową elektroforezę żelową (2DE) w połączeniu ze spektrometrią mas (MS) w celu oddzielenia i identyfikacji proteomu tkankowego ludzkiego gruczolaka przysadki, który przedstawia dobry i powtarzalny wzór 2DE. Wiele białek obserwuje się w każdym miejscu 2DE podczas analizy złożonego proteomu nowotworu przy użyciu MS o wysokiej czułości.

Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa w połączeniu z metodami spektrometrii mas do analizy proteomu tkanki gruczolaka przysadki mózgowej

Tutaj przedstawiamy prosty i tani protokół barwienia srebrem, który wymaga tylko trzech odczynników i 7 minut przetwarzania, i jest odpowiedni do szybkiego generowania wysokiej jakości danych SSR w analizie genetycznej.

Szybki protokół barwienia srebrem umożliwiający proste i skuteczne wykrywanie markerów SSR przy użyciu niedenaturującego żelu poliakrylamidowego

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół opisujący nową technikę barwienia fluorescencyjnego do całkowitego wykrywania białek w żelach poliakrylamidowych. Protokół wykorzystuje specyficzną dla jonów srebra sondę fluorescencyjną, która wykrywa kompleksy białkowe Ag + i eliminuje pewne ograniczenia tradycyjnych chromogennych barwników srebra.

Fluorescencyjne barwienie srebrem białek w żelach poliakryloamidowych

Aby przezwyciężyć ograniczenia klasycznej mutagenezy ukierunkowanej, analogi proliny ze specyficznymi modyfikacjami zostały włączone do kilku białek fluorescencyjnych. Pokazujemy, jak zastąpienie wodoru przez fluor lub pojedynczego przez wiązania podwójne w resztach proliny ("chirurgia molekularna") wpływa na podstawowe właściwości białek, w tym ich fałdowanie i interakcję ze światłem.

Specyficzna dla reszty wymiana proliny przez analogi proliny w białkach fluorescencyjnych: jak "chirurgia molekularna" kręgosłupa wpływa na fałdowanie i stabilność

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Poznaj zmodyfikowany protokół barwienia Coomassie G-250 do szybkiej detekcji nanogramowych ilości białek w żelach poliakrylamidowych. Ta metoda zapewnia wysoką czułość w analizie proteomicznej.

Szybkie i czułe barwienie białek w żelach poliakrylamidowych koloidalnym barwnikiem Coomassie G-250

Przeglądaj więcej filmów