Szybkie i czułe barwienie białek w żelach poliakrylamidowych koloidalnym barwnikiem Coomassie G-250

W tym filmie zaprezentujemy skuteczność zmodyfikowanego protokołu barwienia kumaszem w celu wykrycia kilku nanogramów białka w żelach poliakrylamidowych. Jako przykład wykorzystamy dwuwymiarową elektroforezę żelową, zaczynając od separacji w pierwszym wymiarze. Paski z unieruchomionym gradientem pH są rehydratowane w warunkach buforu denaturującego.

Po całonocnym ponownym pęcznieniu pasków, próbki białek nanosi się poprzez ładowanie do kubeczków anodowych. Podczas procesu ogniskowania białka są rozdzielane zgodnie z ich punktami izoelektrycznymi. Rozdzielanie w drugim wymiarze jest przeprowadzane za pomocą SDS-PAGE.

Następnie żel przenosi się do kuwety do barwienia, a białka wykrywa się poprzez barwienie koloidalnym kumasim. Dzień dobry, nazywam się Nadine de Bala i pochodzę z laboratorium Sabiny Meki w centrum badań biologiczno-medycznych na Uniwersytecie w Olor. Dzisiaj zwrócę Państwa uwagę na procedurę, która według kolegów z Kangan nie jest szeroko znana; Cy Brilliant Blue jest barwnikiem powszechnie stosowanym do wizualizacji białek po rozdziałach elektroforetycznych, jednak często zakłada się, że jest on mniej przydatny w proteomice porównawczej.

Jednakże barwienie koloidalne Coomassie oferuje lepsze właściwości pod względem czułości, kosztów i praktyczności. W naszym laboratorium stosujemy protokół barwienia K w niemal każdej aplikacji opartej na żelach, a w szczególności w proteomice analitycznej do określania zmian w ekspresji białek mięśnia sercowego. Zaprezentuję zastosowanie tej metody do wykrywania białek mięśnia sercowego w zakresie pH zasadowym w żelach do elektroforezy dwuwymiarowej.

Zacznijmy zatem. Pierwszym wymiarem dwuwymiarowej elektroforezy żelowej jest ogniskowanie izoelektryczne (IEF), a do tej analizy wykorzystuje się paski z unieruchomionym gradientem pH (paski IPG).

Przed IEF cztery paski IPG są rehydratowane indywidualnie w 125 µL roztworu rehydratującego przy użyciu tacy do pęcznienia suchych pasków IM Mobilly przez co najmniej 10 godzin, aż paski IPG zostaną rehydratowane i będą gotowe do nałożenia próbek białek. Próbki białek wytrącone za pomocą TCA z czterech różnych preparatów serca są rozpuszczane w buforze do próbek IEF do stężenia 100 µg białka na 100 µL. Solubilizacja próbek białek trwa co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej na wstrząsarze typu vortex.

W międzyczasie należy przygotować dodatkowe elementy zestawu do suchych pasków IM Molene, aby przeprowadzić IEF w urządzeniu do elektroforezy multi four. Najpierw ustaw temperaturę jednostki chłodzącej na 20 °C, nanieś pipetą od 3 do 4 mL płynu pokrywowego na płytkę chłodzącą i ustaw na niej tackę do suchych pasków Immobilien, kierując czerwone złącze elektrody w stronę anody. Wlej około 10 mL oleju pokrywowego do tacki do suchych pasków Immobilien, a następnie umieść na niej wyrównywacz do suchych pasków Immobilien stroną z rowkiem do góry.

Następnie wyjmij rehydratyzowany pasek z kuwety do pęcznienia i przenieś go stroną żelową do góry do rowków wyrównywacza. Kwasowy koniec paska powinien być skierowany w stronę anody. Na koniec wszystkie paski powinny być wyrównane krawędziami anodowymi.

Umieść paski elektrod nasycone wodą destylowaną poprzecznie na końcach pasków żelu, upewniając się, że paski elektrod przynajmniej częściowo stykają się z powierzchnią żelu. Na koniec ustaw elektrody na paskach elektrod tak, aby kolorowy znacznik był skierowany w stronę odpowiadającego mu kontaktu elektronicznego. Umieść listwę z naczyniami na próbki w pobliżu anody w tacy na suche paski immobilien i umieść naczynie na próbkę nad każdym paskiem IPG.

Delikatnie dociśnij kubeczki z próbkami, aby zapewnić dobry kontakt z paskiem IPG. Wlej od 70 do 80 ml oleju maskującego do kuwety, aby zakryć paski IPG. Olej nie może przedostać się do wnętrza kubeczków z próbkami.

Jeśli olej wycieknie do kubka, należy go usunąć za pomocą pipety i ponownie ustawić kubki. Na koniec należy dodać około 150 ml oleju maskującego, aby całkowicie przykryć kubki z próbkami. Następnie nanosi się próbki białek do kubków, pipetując je pod powierzchnię cieczy maskującej.

Objętość dołka wynosi 100 µL. Po naniesieniu wszystkich próbek białek podłącz wszystkie przewody. Podłącz urządzenie multi four do zasilacza i przeprowadź ogniskowanie izoelektryczne przez 11,1 kVh w trybie gradientowym; po IEF paski IPG umieszcza się w kuwecie stroną z żelem do góry i poddaje redukcji oraz alkilacji podczas etapu równoważenia.

W celu redukcji należy zużyć 2,5 milliliters roztworu równoważącego 1% DTT na każdy pasek. Następnie należy mieszać przez 15 minut, po czym całkowicie wymienić roztwór DTT i przeprowadzić alkilację pasków w 2,5% roztworze równoważącym acetamidu, mieszając przez kolejne 15 minut. Paski po równoważeniu należy jednokrotnie wypłukać w zlewce z wodą, a następnie osuszyć na papierze filtracyjnym, aby usunąć nadmiar buforu równoważącego.

Następnie przenieś paski do jednego buforu do elektroforezy XSDS. Białka w paskach są teraz gotowe do drugiego wymiaru dwuwymiarowej elektroforezy żelowej. Drugi wymiar przeprowadza się za pomocą elektroforezy SDS-PAGE w pionowym systemie elektroforetycznym.

Odpowiednią liczbę żeli z 12% akryloamidu o grubości jednego milimetra odlewa się dzień przed użyciem i przechowuje pod przykryciem z mokrej papierowej chusteczki. W temperaturze pokojowej zrównoważone paski IPG umieszcza się na górnej powierzchni żeli rozdzielczych i mocuje za pomocą gorącego roztworu agarozy; następnie białka rozdziela się przez 2,5 godziny, rozpoczynając od 80 V przez 15 minut, a następnie 120 V aż do momentu, gdy czoło barwnika dotrze do dołu kasety żelowej.

Podczas rozdzielania białek metodą SDS-PAGE należy przygotować roztwory do barwienia żelu koloidalnym Coomassie. Przy sporządzaniu roztworu barwiącego bardzo ważne jest zachowanie sekwencji dodawania składników w następującej kolejności. Najpierw w zlewce należy rozpuścić 100 g siarczanu glinu w około 1,5 l wody Milli-Q, mieszając do całkowitego rozpuszczenia. Po rozpuszczeniu siarczanu glinu należy wymieszać 200 ml etanolu i dodać do roztworu 0,4 g CBG 250.

Gdy tylko CBB G two 50 zostanie całkowicie rozpuszczony, należy dodać 47 ml kwasu ortofosforowego. Ten etap pozwala cząsteczkom kamasi na zagregowanie się w stan koloidalny. Na koniec należy dodać wodę milli Q do uzyskania końcowej objętości dwóch litrów.

Końcowy roztwór po odstaniu będzie zawierał pływające cząsteczki. Nie należy filtrować tego roztworu. Roztwór barwiący można również przygotować wcześniej i przechowywać w ciemności do momentu użycia.

Po zakończeniu elektroforezy w żelu SDS, ostrożnie wyjmij żel z szkiełek i przenieś go do kuwety do barwienia wypełnionej wodą Milli Q. Umieść kuwetę z żelem na wytrząsarce poziomej i wytrząsaj przez 10 minut.

Powtórz płukanie jeszcze dwa razy przez około 5 do 10 minut. Należy dokładnie wypłukać żel świeżą wodą z systemu Milli-Q, ponieważ pozostały na żelu SDS może zaburzyć wiązanie barwnika z białkiem i spowodować niską czułość. Po zakończeniu trzeciego płukania wylej wodę z naczynia.

Żel jest teraz gotowy do barwienia. Najpierw wstrząśnij roztworem Kumasi, aby równomiernie rozproszyć cząsteczki koloidalne. Następnie dodaj ilość roztworu wystarczającą do całkowitego zakrycia żelu.

Umieść przykrytą szalkę z roztworem Kumasi z żelem na wytrząsarce i inkubuj przez od 2 do 12 godzin. Po 10 minutach pojawią się pierwsze plamki białek.

Od 80 do stu procent barwienia można osiągnąć w ciągu dwóch godzin inkubacji. Zalecamy jednak inkubację przez noc, aby uzyskać barwienie bliskie 100%. Po zakończeniu barwienia należy usunąć roztwór Coomassie i dwukrotnie wypłukać żel wodą Milli Q.

Po wypłukaniu żelu należy usunąć przyklejone cząsteczki barwnika z kuwety do barwienia za pomocą bezpyłowego ręcznika papierowego. Do żelu należy dodać roztwór odbarwiający i odbarwiać go od 10 do 60 minut na wytrząsarce. Na koniec żel należy dwukrotnie wypłukać wodą Milli Q.

Żel powróci do swojej pierwotnej grubości, a intensywność zabarwienia kumasi zostanie zwiększona. Po zastosowaniu tego protokołu żel 2D powinien wykazać wyraźną rozdzielczość i być dobrze zabarwiony ciemnoniebieskimi plamkami białek. Wynik naszego barwienia żeli 2D metodą kumasi jest porównywalny z wynikami barwienia srebrem.

Zgodnie z protokołem opracowanym przez Chenko i współpracowników, który charakteryzuje się wysoką czułością i kompatybilnością ze spektrometrią mas. Na przykładzie dwuwymiarowej elektroforezy żelowej pokazaliśmy, jak szybkie, proste i czułe jest barwienie kangs cooma. Wykrywanie białek w żelach poliakryloamidowych za pomocą tej metody barwienia może zostać zakończone w ciągu dwóch godzin.

Sama procedura wymaga niewielkiego nakładu pracy. I ostatnim, lecz nie mniej ważnym aspektem jest to, że możliwe może być wykrycie ilości białka rzędu jednego nanograma. Zatem niniejszy protokół stanowi zdecydowanie dobrą alternatywę dla metod bezznakowania w proteomice opartej na żelach.

Podczas stosowania procedury barwienia ważne jest, aby pamiętać o użyciu odczynników klasy analitycznej oraz wody o najwyższej czystości. Ponadto krytycznym etapem przygotowania jest sekwencyjne dodawanie składników do roztworu barwiącego. Na koniec należy pamiętać o dokładnym wypłukaniu pozostałości SDS z żeli po rozdziału elektroforetycznym.

W przeciwnym razie na żelach nic nie będzie widać. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.