Uzyskiwanie wysokiej jakości RNA z pojedynczych populacji komórek w ludzkiej pośmiertnej tkance mózgowej

Opisujemy proces wykorzystujący mikrodysekcję laserową do izolowania i ekstrakcji RNA z jednorodnej populacji komórek, neuronów piramidowych, w warstwie III górnego zakrętu skroniowego w pośmiertnych mózgach ludzkich. Następnie liniowo amplifikujemy (oparte na T7) mRNA i hybrydyzujemy próbkę z ludzką mikromacierzą X3P Affymetrix.

Procedura ta rozpoczyna się od przekrojenia ośmiu mikrometrowych bloków tkanek zamrożonych w ciekłym azocie azotu na kriostacie ustawionym na minus 17 stopni Celsjusza na zwykłych, nienaładowanych szkiełkach podstawowych. Następnie skrawki są barwione za pomocą zestawu do barwienia genu histo. Po zidentyfikowaniu neuronów piramidowych, komórki około 500 są laserowo przechwytywane na czapeczkę wychwytującą HS.

Nakrętkę z komórkami umieszcza się w mikroprobówce wirówkowej zawierającej 50 mikrolitrów odwróconego do góry nogami buforu ekstrakcyjnego i umieszcza w probówce Falcon umieszczonej wcześniej w Iraku, osadzonej w łaźni wodnej ustawionej na 42 stopnie Celsjusza. Po krótkim etapie wirowania nasadka jest usuwana. Pozostały roztwór jest następnie gotowy do izolacji RNA.

Cześć, nazywam się Charmaine Peterson i pracuję w laboratorium Wilsona Wu na Wydziale Neurologii Strukturalnej i Molekularnej w McLean Hospital. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę laserowego wychwytywania neuronów parametalicznych z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania zróżnicowanej ekspresji genów w górnym i słabym zakręcie u osób ze schizofrenią przy użyciu technologii mikromacierzy.

Więc zacznijmy. Tkanki mózgowe uzyskano z Harvard Brain Tissue Resource Center w postaci bloków zamrożonych w postaci ciekłego azotu przed sekcją tkanek. Ważne jest, aby zmniejszyć zanieczyszczenie RNA Wszystkie powierzchnie, w tym obszar roboczy, ostrze do cięcia i prowadnice, są traktowane roztworem do odkażania RNA, takim jak RNA SAP i przecierane 100% etanolem.

Procedura ta rozpoczyna się od przekroju bloków tkanek zamrożonych w ciekłym azocie na kriostacie ustawionym na minus 17 stopni Celsjusza na zwykłych, nienaładowanych szkiełkach podstawowych. Wycinki tkanek są teraz gotowe do identyfikacji neuronów piramidowych za pomocą zestawu do szybkiego barwienia genu histo. Przygotować serię odwadniania etanolu podwielokrotność 25 mililitrów o odpowiednich stężeniach etanolu i wodę wolną od RNA do słoików do barwienia dostarczonych z zestawem genów histo.

Umieść wszystkie słoiki w wiaderku z lodem z wyjątkiem jednego słoika z 75% etanolem. Umieść ten 75% etanol w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj roztwór barwiący, dodając jeden mikrolitr inhibitora RNA na 100 mikrolitrów roztworu barwiącego.

Ponieważ będziemy barwić cztery skrawki tkanek na dwóch szkiełkach, cztery mikrolitry inhibitora RNA dodaje się do 400 mikrolitrów roztworu barwiącego w mikroprobówce wirówkowej. Roztwór barwiący należy przechowywać na lodzie. Pod wyciągiem.

Dodaj sita molekularne do słoika z ksylenem, aby usunąć nadmiar wody, który może zagrozić liftingowi tkanek. Włącz łaźnię wodną o temperaturze ustawionej na 42 stopnie Celsjusza i umieść w łaźni wodnej 50-mililitrową rurkę Falcon wspartą na stojaku. Wyjmij dwa szkiełka z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i rozmroź je na chusteczce Kim.

Przez około 30 sekund lub tylko do momentu, gdy rogi szkiełek zaczną się rozmrażać, na krótko utrwal chusteczkę w 75% etanolu na 30 sekund w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie za pomocą kleszczyków wolnych od RNA przenieś szkiełka do wody wolnej od nukleaz na 32. płukanie Po umyciu szkiełek obrysuj skrawki pisakiem barierowym PAP, aby skoncentrować roztwór barwiący na sekcji, zabarwić cztery sekcje roztworem do barwienia genu histo przez 20 sekund. Za pomocą 97 mikrolitrów inhibitora RNA na sekcję odwadniaj skrawki we wcześniej przygotowanym etanolu na lodzie przez 30 sekund na krok.

Ostatni etap 100% etanolu należy przedłużyć do trzech minut, aby osiągnąć wystarczające odwodnienie dla odpowiedniego liftingu tkanek. Na koniec zanurz szkiełka w ksylenie na pięć minut, pozwalając szkiełkom całkowicie wyschnąć na powietrzu przed przystąpieniem do mikrodysekcji laserowej, neurony piramidowe należy natychmiast usunąć po zabarwieniu procedury wychwytywania laserowego pojedynczych komórek. MIKRODYSEKCJA lub LCM wymaga kąpieli wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza zawierającej 50-mililitrową rurkę Falcon wspartą na a, która została założona wcześniej.

Pojedynczy cell LCM jest realizowany za pomocą systemu i oprogramowania do przechwytywania laserowego ARCTURUS XT. Aby rozpocząć tę procedurę, załaduj szkiełka i nasadki na aparat Arcturus XT. Użyj nasadek HS do przechwytywania, ale pozostaw ustawienie programu na makro.

Kliknij pole ładowania z przeglądem, aby uzyskać zdjęcie przeglądowe każdego slajdu. Dostosuj ostrość jasności przy powiększeniu dwukrotnym, aby określić optymalny przekrój do przechwytywania laserowego. Unikaj skrawków tkanek z nadmiernym fałdowaniem, ale wybieraj sekcje, które są nienaruszone, gładkie i poplamione.

Cóż, umieść czapkę nad ogólnym obszarem, w którym będziesz przechwytywać, upewniając się, że zawiera obszar, który ma zostać przechwycony w naszym przypadku. Warstwa trzecia kory mózgowej. Upewnij się, że szyny nasadki nie spoczywają na żadnych fałdach, ponieważ spowoduje to przechylenie nasadki, co spowoduje zmienne rozmiary plamek.

Następnie ręcznie potwierdź położenie plamki lasera IR przy powiększeniu 40 razy. Niebieski krzyż powinien być wyśrodkowany w plamce lasera IR. Jeśli nie, dostosuj jego lokalizację, klikając prawym przyciskiem myszy na miejsce i wybierając zlokalizowany punkt IR.

Przy powiększeniu 40 x zidentyfikuj neurony piramidalne zgodnie z następującymi kryteriami, po pierwsze, komórki mają kształt piramidy, a po drugie, można zidentyfikować bliższą część dendrytów wierzchołkowych i/lub podstawnych. Zapisz pozycję czapki, klikając znak plus w funkcji pozycji. W ten sposób, jeśli nasadka zostanie przesunięta, zawsze powróci dokładnie do tego samego miejsca, dla którego dostosowałeś rozmiar plamki.

Wprowadź te wartości do skrzynki sterowniczej: 70 oznacza moc i 16 czas trwania. Ponieważ parametry te są specyficzne dla naszej tkanki, zalecamy, aby przed rozpoczęciem przetestować i dostosować się do tych zmiennych zgodnie z konkretną próbką tkanki. W przypadku laserowego przechwytywania pojedynczych komórek usuń zaznaczenie opcji automatycznego przesuwania sceny i upewnij się, że symbol odpowiedniego rozmiaru jest skorelowany z symbolem na panelu po prawej stronie.

Wybierz opcję koła w prawym dolnym rogu, aby wybrać neuron, który chcesz przetestować przechwytywanie. A po wyrównaniu niebieskiego krzyżyka z okręgiem, aktywuj laser, klikając testuj punkt IR. Plamka utworzona przez laser powinna najpierw mieć wyraźny ciemny pierścień wokół uchwyconego obiektu.

Upewnij się, że pierścień jest wystarczająco duży, aby objąć komórkę, ale na tyle mały, aby nie zawierał niechcianej tkanki ani innych komórek. Jeśli ten pierścień jest zbyt jasny, komórka nie została przechwycona. Jeśli w środku ciemnego pierścienia znajduje się ciemna plama, oznacza to, że czas trwania cięcia siły lasera jest zbyt duży.

Powtórz ten proces na różnych częściach tkanki w warstwie, którą chcesz uchwycić. Aby sprawdzić, czy rozmiar plamki nie różni się w zależności od lokalizacji, dostosuj odpowiednio. Zidentyfikuj neurony piramidowe, aby uchwycić około 500 komórek.

Naciśnij przycisk przechwytywania laserowego, aby przechwycić komórki. Przesuń nasadkę do stacji kontroli jakości. Upewnij się, że co najmniej 90% neuronów zostało usuniętych.

Jeśli nie, przechwyć więcej komórek w obszarze, w którym większość komórek została przechwycona. Umieść nakrętkę w 0,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej zawierającej 50 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego. Nasadka została zaprojektowana tak, aby idealnie pasowała, aby zapobiec wyciekaniu bufora.

Odwróć zespół do góry nogami, upewniając się, że bufor ekstrakcyjny zakrywa całą nasadkę i umieść go na dnie 50-mililitrowej rurki Falcon w łaźni wodnej ustawionej na 42 stopnie Celsjusza. Inkubować neurony przez 30 minut, aby usunąć tkankę z czapeczki po inkubacji, odwirowywać zespół probówki i nasadki przez dwie minuty w temperaturze 800 g. Po odwirowaniu zdejmij nakrętkę.

Jeśli izolacja RNA zostanie przeprowadzona dopiero w późniejszym czasie. Pozostały ekstrakt komórkowy przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W przeciwnym razie kontynuuj izolowanie RNA z ekstraktu komórkowego, jak pokazano w następnej sekcji, izolację RNA przeprowadza się przy użyciu zestawu do czystej izolacji PICO, który jest przeznaczony do izolowania niewielkiej liczby komórek z próbek LCM i zachowania mRNA o niskiej obfitości.

Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 70% etanol dostarczony z zestawem do ekstraktu komórkowego i odwiruj na wstępnie przygotowanej kolumnie oczyszczającej. Aby związać RNA z filtrem kolumnowym po umyciu, należy potraktować RNA D N, aby wyeliminować ryzyko interferencji DNA. Ten krok jest szczególnie ważny w dalszych zastosowaniach, takich jak R-T-P-C-R w czasie rzeczywistym.

Po roztrawieniu DNA dodać 40 mikrolitrów pierwszego buforu do płukania i odwirować kolumnę oczyszczającą przez 15 sekund przy 8 000 Gs. Następnie należy przystąpić do płukania zgodnie z protokołem dostarczonym z zestawem, ale przedłużyć końcowy etap płukania buforem do płukania o dwie minuty z dwóch do dwóch i pół minuty, aby upewnić się, że w kolumnie nie pozostał bufor do płukania, co może zmniejszyć wydajność RNA. Przenieść kolumnę do innej probówki do mikrowirówki. Dodać bufor objaśniający i inkubować na filtrze w kolumnie przez jedną minutę, odwirować kolumnę w celu wymycia RNA.

Na koniec sprawdź jakość wyekstrahowanego RNA, uruchamiając chip laboratoryjny Experian High Sense, który zapewnia wirtualną pipetę żelową i elektroferogramową 1,3 mikrolitra próbki do probówki o pojemności 0,5 mililitra. W celu przeprowadzenia testu kontroli jakości należy zamrozić resztę próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po zweryfikowaniu jakości RNA można je amplifikować, znakować i hybrydyzować.

W przypadku analizy profilowania ekspresji genów zostaną przeprowadzone dwie rundy amplifikacji liniowej za pomocą zestawu ribo amp HS plus, co powinno skutkować około 50 mikrogramami amplifikowanego RNA wystarczającym do przeprowadzenia eksperymentów zarówno z mikromacierzą, jak i Q-R-T-P-C-R. Zestaw do znakowania turbo biotyny i znakowania z urządzeń molekularnych służy do znakowania amplifikowanego RNA. Na koniec zostanie przeprowadzone profilowanie ekspresji genów przy użyciu ludzkiego chipa z genem X three P pro beret firmy atrix.

Cięcie tkanek powinno skutkować dwoma szkiełkami po dwie sekcje na szkiełko, w sumie cztery sekcje na przypadek. Każda sekcja powinna być gładka, z minimalnym rozdarciem, pękaniem lub zagięciem. Neurony piramidalne powinny być ciemno zabarwione o wielkości około 20 do 25 mikrometrów z piramidalnym kształtem i widocznymi dendrytami wierzchołkowymi.

Podczas LCM, po tym, jak laser przejdzie impulsowo przez folię termoplastyczną, komórki przylegają do nasadki i dlatego nie znajdują się już na szkiełku, pozostawiając otaczającą tkankę. Za około 85 do 100% neuronów powinno przylegać do nasadki z czapeczkami HS wychwytywającymi przy ustawieniach makro i prawidłowym dostosowaniu mocy i siły lasera. Dla każdej sekcji należy uzyskać około 500 do 700 komórek na sekcję, co daje co najmniej 500 pikogramów całkowitego RNA na przypadek.

Po całkowitej izolacji RNA, jakość RNA jest oceniana za pomocą elektroferogramu i wirtualnego żelu za pomocą BioRad Experian. Na elektroferogramie powinny być widoczne dwa wyraźne piki odpowiadające 18 s i 20 as rybosomalnym jednostkom RNA z tkanką pośmiertną. Jednak nie zawsze tak jest, ponieważ tkanka może ulec degradacji z powodu czynników poprzedzających sekcję.

Zwykle zobaczysz duży guzek wskazujący na degradację z dużym szczytem około 18 s i mniejszym szczytem 28 s, jak wskazują czerwone strzałki. Natomiast złej jakości RNA ze zbyt dużą degradacją będzie wskazywane przez elektroferogram z dużą powierzchnią pod jego krzywą. Oprócz przesunięcia w dół miejsca rozsiewu w celu zbadania jakości mRNA po dwóch rundach amplifikacji liniowej, używamy zarówno standardowego chipa laboratoryjnego BioRad Experian Sense, jak i spektrofotometru NanoDrop.

Tradycyjna technologia mikromacierzy Atrics wymaga, aby rozprzestrzenianie się transkryptu mRNA miało długość co najmniej 600 nukleotydów, aby można je było wykryć za pomocą tego protokołu. Rozprzestrzenianie się mRNA osiągnęło zakres 1000 nukleotydów, na co wskazuje elektroferogram, z dużymi pikami powoli opadającymi w funkcji czasu. Wynik ten potwierdza również wirtualny żel.

Jeśli długość transkryptu jest krótsza niż 600 nukleotydów, próbka nie powinna być uwzględniana W przypadku hybrydyzacji odczyty NanoDrop wskazywały średnio dwa 60 w stosunku dwóch 80 lub czystość 2,5 w próbkach. Średnie stężenie wynosiło 1,7 mikrograma na mikrolitr, co daje około 50 mikrogramów mRNA na próbkę, co jest wystarczające zarówno do analizy mikromacierzy, jak i późniejszej walidacji, która wymaga od 15 do 20 mikrogramów mRNA, a następnie walidacji wyników za pomocą QR TPCR. Nasze wyniki wskazują, że dzięki temu protokołowi zarówno ilość, jak i jakość uzyskanego RNA jest wystarczająco dobra, aby zbadać różnice w ekspresji genów za pomocą ludzkiego chipa atrix x three P.

Po hybrydyzacji z chipem Atrics Human X three P osiągnęliśmy procentowy wskaźnik połączeń wynoszący średnio 26,6%, co wskazuje na odpowiednią hybrydyzację i intensywność sondy. Właśnie pokazaliśmy, jak laserowo wychwytywać neurony parametaliczne z pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej w celu wykorzystania RNA uzyskanego z tych komórek. W przypadku badań profilowania G mikromacierzy podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wykonać wszystkie kroki w środowisku wolnym od RNA i zakończyć je w odpowiednim czasie, aby zachować integralność RNA.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.