Uzyskiwanie wysokiej jakości RNA z populacji pojedynczych komórek w pośmiertnej tkance mózgu człowieka

Procedura ta rozpoczyna się od pobierania przekrojów o grubości ośmiu mikrometrów z bloków tkankowych mrożonych w oparach ciekłego azotu za pomocą kriostatu ustawionego na minus 17 stopni Celsjusza, na zwykłe, nieładowane szkiełka przedmiotowe. Następnie przekroje są barwione za pomocą zestawu do barwienia histogennego. Po zidentyfikowaniu neuronów piramidowych, około 500 komórek zostaje wyciętych laserowo na nakrętkę do przechwytywania HS.

Kapturek z komórkami umieszcza się w probówce do mikrocentryfugi zawierającej 50 µL buforu do ekstrakcji, odwraca do góry dno i umieszcza w probówce Falcon wcześniej umieszczonej w statywie, a następnie w kąpieli wodnej ustawionej na 42 °C. Po krótkim etapie wirowania kapturek zostaje usunięty. Pozostały roztwór jest następnie gotowy do izolacji RNA.

Cześć, jestem Charmaine Peterson z laboratorium Wilsona Wu w Departamencie Strukturalnej i Molekularnej Neuronauki w McLean Hospital. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę laserowego mikrosekcjonowania neuronów parametalnych z ludzkiej tkanki mózgowej pobranej po śmierci. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania różnic w ekspresji genów w zakręcie górnym i zakręcie kątowym u pacjentów z schizofrenią przy użyciu technologii mikromacierzy.

Zacznijmy zatem. Tkanki mózgowe zostały pozyskane z Harvard Brain Tissue Resource Center w formie bloków mrożonych w oparach ciekłego azotu przed przystąpieniem do sekcjonowania tkanek. Aby zminimalizować ryzyko kontaminacji RNA, wszystkie powierzchnie, w tym obszar roboczy, ostrze do sekcjonowania oraz szkiełka przedmiotowe, należy potraktować roztworem do dekontaminacji RNA, takim jak RNA SAP, a następnie przetrzeć 100% etanolem.

Procedurę rozpoczyna się od krojenia mrożonych w oparach ciekłego azotu bloków tkankowych przy użyciu kriotomu ustawionego na -17 °C na zwykłe, nieładowane szkiełka przedmiotowe. Przygotowane skrawki tkanek są teraz gotowe do identyfikacji neuronów piramidowych z wykorzystaniem zestawu do szybkiego barwienia histo gene. W celu przygotowania serii do odwodnienia w etanolu, należy odmierzyć 25 ml odpowiednich stężeń etanolu oraz wody wolnej od RNA do słoików do barwienia dołączonych do zestawu histo gene.

Umieścić wszystkie słoiki w wiadrze z lodem, z wyjątkiem jednego słoika z 75% ethanol. Ten słoik z 75% ethanol należy umieścić w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Następnie przygotować roztwór barwiący, dodając 1 µL inhibitora RNA na każde 100 µL roztworu barwiącego.

Ponieważ będziemy barwić cztery przekroje tkankowe na dwóch szkiełkach, do 400 µL roztworu barwiącego w probówce do mikrocentryfugi dodaje się 4 µL inhibitora RNA. Roztwór barwiący należy przechowywać w lodzie. Pracować pod wyciągiem.

Do słoika z ksylenem należy dodać sita molekularne, aby usunąć nadmiar wody, która mogłaby upośledzić odrywanie tkanek. Włączyć kąpiel wodną z temperaturą ustawioną na 42 °C i umieścić w niej probówkę Falcon o pojemności 50 ml, wspartą na statywie. Wyjąć dwa preparaty z zamrażarki o temperaturze -80 °C i rozmrozić je na chusteczce Kimwipe.

Przez około 30 sekund lub do momentu, aż narożniki szkiełek zaczną odmarzać, krótko utrwal tkankę w 75% etanolu przez 30 sekund w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Następnie, używając pęsety wolnej od RNA, przenieś szkiełka do wody wolnej od nukleaz w celu przeprowadzenia 30-sekundowego płukania. Po wypłukaniu szkiełek obrysuj przekroje pisakiem do bariery PAP, aby skoncentrować roztwór barwiący na przekroju, a następnie barw cztery przekroje roztworem barwiącym histo gene przez 20 sekund. Przy zastosowaniu 97 µL barwnika/inhibitora RNA na przekrój, odwodnij przekroje w wcześniej przygotowanym etanolu na lodzie przez 30 sekund w każdym kroku.

Ostatni etap w 100% etanolu należy przedłużyć do trzech minut, aby uzyskać wystarczające odwodnienie zapewniające odpowiednie uniesienie tkanki. Na koniec zanurz slajdy w ksylenie na pięć minut, pozwalając im całkowicie wyschnąć na powietrzu przed przystąpieniem do laserowej mikrodysekcji przechwytującej; neurony piramidowe muszą zostać niezwłocznie usunięte po zabarwieniu w procedurze laserowego przechwytywania pojedynczych komórek. MIKRODYSEKCJA lub LCM wymaga łaźni wodnej o temperaturze 42°C zawierającej probówkę Falcon o pojemności 50 ml wspartą przez uchwyt, który został przygotowany wcześniej.

LCM pojedynczych komórek wykonuje się przy użyciu systemu i oprogramowania do mikrodysekcji laserowej ARCTURUS XT. Aby rozpocząć tę procedurę, należy umieścić preparaty i nakładki w urządzeniu Arcturus XT. Należy używać nakładek capture HS, zachowując jednocześnie ustawienie programu na macro.

Kliknij pole „load with overview”, aby uzyskać zdjęcie ogólne każdego preparatu. Dostosuj jasność i ostrość przy powiększeniu 2x, aby wyznaczyć optymalny obszar do przechwytywania laserowego. Unikaj przekrojów tkanki z nadmiernymi pofałdowaniami; wybieraj przekroje nienaruszone, gładkie i zabarwione.

Następnie nałóż zaślepkę na obszar, który będzie rejestrowany, upewniając się, że obejmuje ona interesującą nas strefę – w naszym przypadku trzecią warstwę kory. Upewnij się, że prowadnice zaślepki nie opierają się na żadnych fałdach, ponieważ spowoduje to przechylenie zaślepki, co doprowadzi do powstania plam o różnej wielkości.

Następnie należy ręcznie potwierdzić położenie plamki lasera IR przy powiększeniu 40 x. Niebieski krzyżyk powinien znajdować się w centrum plamki lasera IR. Jeśli tak nie jest, należy skorygować jego położenie, klikając prawym przyciskiem myszy na plamkę i wybierając opcję located IR spot.

Przy powiększeniu 40x zidentyfikuj neurony piramidalne według następujących kryteriów: po pierwsze, komórki o kształcie piramidalnym oraz po drugie, zidentyfikowana proksymalna część dendrytów apikalnych i/lub bazalnych. Zapisz pozycję kapilary, klikając znak plus w funkcji pozycji. W ten sposób, jeśli kapilara zostanie przesunięta, zawsze powróci dokładnie w to samo miejsce, dla którego dostosowano rozmiar punktu.

Wprowadź te wartości do pola sterowania: 70 w polu mocy oraz 16 w polu czasu trwania. Ponieważ parametry te są specyficzne dla naszej tkanki, zalecamy przetestowanie i dostosowanie tych zmiennych do konkretnej próbki tkanki przed rozpoczęciem pracy. W przypadku przechwytywania pojedynczych komórek laserem odznacz opcję automatycznego przesuwania stolika (auto move stage) i upewnij się, że symbol odpowiedniego rozmiaru odpowiada symbolowi na panelu po prawej stronie.

Wybierz opcję z kółkiem w prawym dolnym rogu, aby wskazać neuron, którego przechwycenie chcesz przetestować. Po wyrównaniu niebieskiego krzyżyka z kółkiem aktywuj laser, klikając test IR spot. Plamka wytworzona przez laser powinna początkowo mieć wyraźny ciemny pierścień wokół przechwyconego obiektu.

Upewnij się, że pierścień jest wystarczająco duży, aby objąć komórkę, ale na tyle mały, by nie obejmował niepożądanej tkanki ani innych komórek. Jeśli pierścień jest zbyt jasny, oznacza to, że komórka nie została przechwycona. Jeśli w środku ciemnego pierścienia znajduje się ciemna plama, oznacza to, że moc lub czas trwania impulsu lasera jest zbyt duża.

Powtórz ten proces w różnych obszarach tkanki w obrębie warstwy, którą chcesz pobrać. Aby upewnić się, że rozmiar plamki nie różni się w zależności od lokalizacji, wprowadź odpowiednie korekty. Zidentyfikuj neurony piramidowe do pobrania, około 500 komórek.

Naciśnij przycisk przechwytywania laserowego, aby pobrać komórki. Przenieś nakrętkę do stacji kontroli jakości (QC). Upewnij się, że usunięto co najmniej 90% neuronów.

Jeśli nie, należy pobrać więcej komórek z obszaru, w którym uchwycono ich najwięcej. Umieść nakrętkę w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mililitra zawierającej 50 µL buforu ekstrakcyjnego. Nakrętka została zaprojektowana tak, aby idealnie pasowała i zapobiegała wyciekowi buforu.

Odwróć zestaw do góry dnem, upewniając się, że bufor do ekstrakcji całkowicie pokrywa nakrętkę, a następnie umieść go na dnie probówki Falcon o pojemności 50 ml w kąpieli wodnej ustawionej na 42 °C. Inkubuj neurony przez 30 minut, aby usunąć tkankę z nakrętki; po inkubacji wiruj zestaw z probówką i nakrętką przez dwie minuty przy 800 g. Po wirowaniu zdejmij nakrętkę.

Jeśli izolacja RNA ma zostać przeprowadzona w późniejszym terminie, pozostały ekstrakt komórkowy należy przechowywać w temperaturze -80 °C. W przeciwnym razie należy przystąpić do izolacji RNA z ekstraktu komórkowego zgodnie z opisem w następnej sekcji; izolację RNA przeprowadza się przy użyciu zestawu PICO pure isolation kit, który został zaprojektowany do izolacji niewielkiej liczby komórek z próbek LCM oraz do odzyskiwania mRNA o niskiej zawartości.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać do ekstraktu komórkowego 70% etanol dołączony do zestawu, a następnie odwirować go na wcześniej przygotowanej kolumnie oczyszczającej. W celu związania RNA z filtrem kolumny po przemyciu, należy potraktować RNA DNazą, aby wyeliminować ryzyko interferencji z DNA. Ten krok jest szczególnie istotny w późniejszych zastosowaniach, takich jak real-time RT-PCR.

Po trawieniu DNA należy dodać 40 µL buforu płuczącego jeden i wirować kolumnę oczyszczającą przez 15 sekund przy 8 000 ×g. Następnie należy przeprowadzić etapy płukania zgodnie z protokołem dołączonym do zestawu, jednak wydłużyć końcowy etap płukania buforem płuczącym dwa z dwóch do dwóch i pół minut, aby upewnić się, że w kolumnie nie pozostał bufor płuczący, co mogłoby zmniejszyć wydajność RNA. Przenieść kolumnę do innej probówki do mikrocentryfugi. Dodać bufor eluujący i inkubować na filtrze w kolumnie przez jedną minutę, a następnie wirować kolumnę w celu elucji RNA.

Na koniec sprawdź jakość wyekstrahowanego RNA, przeprowadzając analizę za pomocą chipa Agilent High Sensitivity, który dostarcza wirtualny żel i elektroferogram; pipetuj 1,3 µL próbki do probówki o pojemności 0,5 mL. W celu kontroli jakości zamroź resztę próbki w temperaturze -80 °C. Po zweryfikowaniu jakości RNA można poddać je amplifikacji, znakowaniu oraz hybrydyzacji.

W celu przeprowadzenia analizy profilowania ekspresji genów wykonane zostaną dwie rundy amplifikacji liniowej przy użyciu zestawu ribo amp HS plus, co powinno pozwolić na uzyskanie około 50 µg amplifikowanego RNA, wystarczającego do przeprowadzenia eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy oraz Q-R-T-P-C-R. Do znakowania amplifikowanego RNA wykorzystywany jest zestaw turbo biotin labeling kit i labeling od molecular devices. Na koniec przeprowadzone zostanie profilowanie ekspresji genów z wykorzystaniem human X three P gene chip pro beret firmy atrix.

Przygotowanie skrawków tkankowych powinno skutkować uzyskaniem dwóch szkiełek z dwoma skrawkami na każdym, co daje łącznie cztery skrawki na przypadek. Każdy skrawek powinien być gładki, z minimalną liczbą rozdarć, pęknięć lub zagięć. Neurony piramidowe powinny być intensywnie barwione, mieć rozmiar około 20 do 25 µm, kształt piramidalny oraz widoczne dendryty apikalne.

Podczas LCM, po przejściu impulsu lasera przez film termoplastyczny, komórki przylegają do nakładki i tym samym nie znajdują się już na szkiełku, pozostawiając otaczającą tkankę. Przy zastosowaniu nakładek przechwytujących HS w ustawieniach makro oraz prawidłowej regulacji mocy i siły lasera, do nakładki powinno przywrzeć od około 85 do 100% neuronów. Dla każdego przekroju należy uzyskać około 500 do 700 komórek, co daje co najmniej 500 picogramów całkowitego RNA na przypadek.

Po izolacji całkowitego RNA jakość RNA jest oceniana za pomocą elektroferogramu i wirtualnego żelu przy użyciu systemu BioRad Experian. Na elektroferogramie powinny być widoczne dwa wyraźne piki odpowiadające jednostkom rybosomalnego RNA 18 s i 20 a s w przypadku tkanek pobranych po śmierci. Nie zawsze jednak tak jest, ponieważ tkanka może ulec degradacji z przyczyn występujących przed etapem sekcjonowania.

Zazwyczaj widoczny będzie wyraźny wybrzuszenie wskazujące na degradację, z dużym pikiem w okolicach 18 s i mniejszym pikiem 28 s, co zaznaczono czerwonymi strzałkami. Z kolei RNA złej jakości z nadmierną degradacją będzie widoczne na elektroferogramie jako duży obszar pod krzywą. Aby sprawdzić jakość mRNA po dwóch rundach amplifikacji liniowej, oprócz przesunięcia w dół lokalizacji rozkładu, wykorzystujemy zarówno chip BioRad Experian standard Sense lab, jak i spektrofotometr NanoDrop.

Tradycyjna technologia mikromacierzy Atrics wymaga, aby rozprzestrzeniony transkrypt mRNA miał długość co najmniej 600 nukleotydów, aby mógł zostać wykryty zgodnie z tym protokołem. Rozprzestrzenione mRNA osiągnęło zakres 1000 nukleotydów, co wskazuje elektroferogram z dużymi piki powoli opadającymi w funkcji czasu. Wynik ten jest również potwierdzony przez wirtualny żel.

Jeśli długość transkrypcyjnych kopii jest krótsza niż 600 nukleotydów, próbka nie powinna być włączona do hybrydyzacji. Pomiary NanoDrop wykazały średni stosunek 260/280 lub czystość na poziomie 2,5 w obrębie próbek. Średnie stężenie wynosiło 1,7 µg/µL, co daje około 50 µg mRNA na próbkę, co jest wystarczającą ilością zarówno do analizy mikromacierzy, jak i późniejszej walidacji wyników metodą qRT-PCR, która wymaga od 15 do 20 µg mRNA. Nasze wyniki wskazują, że przy zastosowaniu tego protokołu zarówno ilość, jak i jakość uzyskanego RNA są wystarczające do badania różnic w ekspresji genów za pomocą macierzy Atrix Human X3P chip.

Po hybrydyzacji z chipem Atrics Human X three P osiągnęliśmy średni procent wywołań sygnału na poziomie 26,6%, co wskazuje na odpowiednią hybrydyzację i intensywność sond. Przedstawiliśmy właśnie sposób laserowej mikrodysekcji neuronów parametanych z pośmiertnej tkanki ludzkiego mózgu w celu wykorzystania RNA otrzymanego z tych komórek. Podczas przeprowadzania tej procedury w badaniach profilowania mikrotablic RNA kluczowe jest wykonanie wszystkich etapów w środowisku wolnym od RNaz oraz sprawne ukończenie poszczególnych kroków w celu zachowania integralności RNA.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.