Name: Uzyskiwanie wysokiej jakości RNA z pojedynczych populacji komórek w ludzkiej pośmiertnej tkance mózgowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-06T19:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: Poznaj izolację wysokiej jakości RNA z pojedynczych neuronów piramidowych w ludzkiej pośmiertnej tkance mózgowej przy użyciu mikrodissekcji laserowej. Ta metoda umożliwia badanie ekspresji genów w schizofrenii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy wdzięczność firmie Molecular Devices Analytical technologies/Arcturus za hojne przekazanie odczynników wykorzystanych w badaniu. Dziękujemy również Harvard Tissue Resource Center za udostępnienie pośmiertnej tkanki ludzkiego mózgu. Finansowanie: RO1MH76060 oraz P50MH080272.

<ol><li>Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Res. 33, e56-e56 (2005).</li>
</ol>

Produkcja tego artykułu wideo była sponsorowana przez Life Technologies.

W niniejszej pracy podejmujemy próbę dostosowania protokołu ekstrakcji jednorodnych populacji komórek z heterogenicznej pośmiertnej tkanki mózgowej przy użyciu systemu Arcturus XT oraz powiązanych zestawów do ekstrakcji RNA. Zgodnie z powyższym, wprowadziliśmy pewne modyfikacje do oryginalnych protokołów dostarczonych przez producenta, aby zmaksymalizować integralność RNA. Skuteczne wychwytywanie pojedynczych komórek zależy wyłącznie od optymalizacji etapów poprzedzających sam proces wychwytywania, w celu uzyskania maksymalnej liczby komórek z wysoką jakością RNA. Etapy te obejmują różne parametry związane z sekcjonowaniem i barwieniem tkanek. W skrócie, w odniesieniu do przygotowania tkanki, obejmują one: 1) zmniejszenie gradientu temperatury podczas sekcjonowania, 2) umieszczanie tylko 2 skrawków na jednym szkiełku, 3) przeprowadzanie wszystkich etapów odwodnienia w lodzie, 4) dodanie inhibitora RNazy do barwnika, 5) wydłużenie czasu odwodnienia w końcowym 100% etanolu do 3 minut.
W odniesieniu do procesu wychwytywania uważamy, że zastosowanie nakładek CapSure HS wraz z oprogramowaniem ustawionym w trybie Macro powinno zapewnić optymalne wyniki. Środowisko z kontrolowaną wilgotnością jest kluczowe dla wychwytywania pojedynczych komórek, ponieważ wysoka wilgotność drastycznie zmniejsza „odrywanie” tkanki. Wysokie temperatury mogą również negatywnie wpływać na jakość RNA.
Podczas protokołu izolacji RNA z zestawem PicoPure występują dwa etapy płukania. Ważne jest upewnienie się, że cały bufor do płukania został usunięty przed przeniesieniem próbki do kolejnej probówki do mikrocentryfugi w celu elucji RNA, ponieważ obecność buforu w końcowej próbce spowoduje zmniejszenie ilości RNA wyjściowego do amplifikacji. Aby to zapewnić, końcowy etap płukania wirujemy przez 2,5 minuty zamiast 2 minut sugerowanych w dołączonym protokole.
W przeważającej mierze protokół amplifikacji liniowej był zgodny z instrukcjami producenta. Należy jednak wziąć pod uwagę dwa kluczowe punkty podczas stosowania tego protokołu: 1) należy starać się ograniczyć straty RNA wynikające z nadmiernego przenoszenia próbek między probówkami, używając wyłącznie dostarczonych probówek 0,5 ml w połączeniu z blokiem 0,5 ml w termocyklerze; oraz 2) podczas przenoszenia próbki do kolumny oczyszczającej w celu puryfikacji cDNA, należy upewnić się, że probówki z próbką zostały odwirowane po pierwszym przeniesieniu. Pozwoli to na dodanie do kolumny oczyszczającej dodatkowych 1-2 µl próbki, co może zwiększyć odzysk cDNA.
Podczas korzystania z zestawu do znakowania końców TURBO w celu znakowania biotyną ograniczonych próbek aRNA, sugerujemy dodanie kilku dodatkowych μl wody przed etapem wirowania, aby zwiększyć wydajność ekstrahowanego z kolumny znakowanego RNA. Dodatkowa minuta wirowania również pomoże w tym zakresie, zwłaszcza w przypadku pracy z tkaniami zdegradowanymi, takimi jak tkanki FFPE.
Jesteśmy przekonani, że niniejszy protokół umożliwi użytkownikowi izolację małych, jednorodnych struktur, takich jak populacje pojedynczych komórek, z heterogennej tkanki mózgu pobranej po śmierci. Pozwala to na ograniczenie efektów rozcieńczenia przez otaczające struktury i inne typy komórek zlokalizowane w różnych warstwach mózgu, co prowadzi do uzyskania wyników ukierunkowanych na konkretne badane typy komórek. Ponieważ jakość uzyskanego RNA jest wystarczająco wysoka do badań z wykorzystaniem mikromacierzy, możemy rozpocząć precyzyjne określanie specyficznych sygnatur molekularnych konkretnych populacji komórek dotkniętych stanami chorobowymi.

<table><tbody><tr><td>Pinceta 4,5&amp;#8221;</td><td>VWR international</td><td>82027-392</td><td></td></tr><tr><td>System mikrodysekcji laserowej (LCM) Arcturus XT&amp;#8482;</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>13821-00</td><td></td></tr><tr><td>Nakrętki LCM CapSure&amp;#8482; HS</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>LCM 0214</td><td></td></tr><tr><td>Nakrętki LCM CapSure&amp;#174; Macro</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>LCM 0211</td><td></td></tr><tr><td>Zautomatyzowana stacja elektroforezy Experion&amp;#8482;</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7001</td><td></td></tr><tr><td>Chipsy Experion&amp;#8482; RNA HighSens</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7155</td><td>10 chipsów</td></tr><tr><td>Odczynniki Experion&amp;#8482; RNA HighSens</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7156</td><td>10 chipsów</td></tr><tr><td>Chipsy Experion&amp;#8482; RNA StdSens</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7153</td><td>10 chipsów</td></tr><tr><td>Odczynniki Experion&amp;#8482; RNA StdSens</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7154</td><td>10 chipsów</td></tr><tr><td>Stożkowa probówka polipropylenowa Falcon&amp;#174;</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenna probówka reakcyjna z wypukłym korkiem GeneAmp&amp;#174;</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010611</td><td></td></tr><tr><td>Macierz GeneChip&amp;#174; Human X3P</td><td>Affymetrix</td><td>900516</td><td>6 chipsów</td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia mrożonych skrawków LCM Histogene&amp;#174;</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>KIT0401</td><td>Zawiera roztwór barwiący, słoiki, etanole i ksylen</td></tr><tr><td>Szkiełka LCM Histogene&amp;#8482;</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>12231-00</td><td></td></tr><tr><td>Pudełko na mikro-szkiełka</td><td>VWR international</td><td>48444-004</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat Microm HM 505E</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22-050-350</td><td>Numer katalogowy podobnego produktu, ponieważ obecny produkt nie jest już dostępny</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna serii 280 sterowana mikroprocesorem</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>51221048</td><td>Model 282</td></tr><tr><td>Sito molekularne</td><td>EMD Millipore</td><td>MX1583L-1</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop 1000</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>n/a</td><td>NanoDrop 1000 nie jest już dostępny, ale NanoDrop 2000 jest porównywalny.</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka z membraną PEN</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>LCM 0522</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA PicoPure&amp;#174;</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>RiboAmp&amp;#174;HS&lt;sup&gt;PLUS&lt;/sup&gt; z znakowaniem biotyną</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>KIT0511B</td><td>12 reakcji, zawiera zestaw do znakowania TURBO biotin labeling&amp;#8482;</td></tr><tr><td>RNase Zap&amp;#174;</td><td>Ambion</td><td>AM9780/2</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNaza wolna od RNaz</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNasin&amp;#174; Plus</td><td>Promega Corp.</td><td>N261B</td><td></td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza SuperScript&amp;#8482; III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr></tbody></table>

uzyskiwanie wysokiej jakości rna z populacji pojedynczych komórek w pośmiertnej tkance mózgu człowieka

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Zaproponowaliśmy zbadanie redukcji istoty szarej w górnym zakręcie skroniowym u pacjentów z schizofrenią poprzez analizę profili ekspresji genów neuronów piramidalnych w warstwie III. Powszechnie wiadomo, że kora mózgowa jest strukturą wyjątkowo heterogenną, składającą się z różnorodnych obszarów, warstw i typów komórek, z których każdy charakteryzuje się odmiennym składem komórkowym i molekularnym, a tym samym różnicującymi się profilami ekspresji genów. Aby uniknąć wpływu heterogeniczności tkanki, zastosowaliśmy mikrodysekcję wspomaganą laserem (LCM) w celu izolacji konkretnego typu komórek, mianowicie neuronów piramidalnych.
Za pomocą systemu Arcturus XT LCM pobrano około 500 neuronów piramidowych zabarwionych roztworem barwiącym Histogene. Następnie z pobranych komórek wyizolowano RNA, które poddano dwóm cyklom liniowej amplifikacji opartej na T7 z wykorzystaniem zestawów Arcturus/Molecular Devices. Analiza żelu i elektroferogram z systemu Experion LabChip (Bio-Rad) wykazały dobrą jakość a(m)RNA, z długością transkryptu przekraczającą 600nt, co jest wymagane dla mikromacierzy. Średnia ilość uzyskanego mRNA wyniosła 51μg, a średnia czystość próbek, określona przez stosunek A260/280, była na akceptowalnym poziomie 2,5. Profil ekspresji genów opracowano z wykorzystaniem macierzy sond Human X3P GeneChip firmy Affymetrix.

Opisujemy proces wykorzystujący laserową mikrodysekcję do izolacji i ekstrakcji RNA z homogenicznej populacji komórek — neuronów piramidowych — w warstwie III zakrętu skroniowego górnego w pośmiertnych ludzkich mózgach. Następnie przeprowadzamy linearną amplifikację (opartą na T7) mRNA i hybrydyzujemy próbkę z macierzą Affymetrix human X3P.

Uzyskiwanie wysokiej jakości RNA z populacji pojedynczych komórek w pośmiertnej tkance mózgu człowieka

Zaproponowaliśmy zbadanie redukcji istoty szarej w zakręcie skroniowym górnym obserwowanej u pacjentów ze schizofrenią poprzez analizę ekspresji genów...

Procedura ta rozpoczyna się od pobierania przekrojów o grubości ośmiu mikrometrów z bloków tkankowych mrożonych w oparach ciekłego azotu za pomocą kriostatu ustawionego na minus 17 stopni Celsjusza, na zwykłe, nieładowane szkiełka przedmiotowe. Następnie przekroje są barwione za pomocą zestawu do barwienia histogennego. Po zidentyfikowaniu neuronów piramidowych, około 500 komórek zostaje wyciętych laserowo na nakrętkę do przechwytywania HS.Kapturek z komórkami umieszcza się w probówce do mikrocentryfugi zawierającej 50 µL buforu do ekstrakcji, odwraca do góry dno i umieszcza w probówce Falcon wcześniej umieszczonej w statywie, a następnie w kąpieli wodnej ustawionej na 42 °C. Po krótkim etapie wirowania kapturek zostaje usunięty. Pozostały roztwór jest następnie gotowy do izolacji RNA.Cześć, jestem Charmaine Peterson z laboratorium Wilsona Wu w Departamencie Strukturalnej i Molekularnej Neuronauki w McLean Hospital. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę laserowego mikrosekcjonowania neuronów parametalnych z ludzkiej tkanki mózgowej pobranej po śmierci. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania różnic w ekspresji genów w zakręcie górnym i zakręcie kątowym u pacjentów z schizofrenią przy użyciu technologii mikromacierzy.Zacznijmy zatem. Tkanki mózgowe zostały pozyskane z Harvard Brain Tissue Resource Center w formie bloków mrożonych w oparach ciekłego azotu przed przystąpieniem do sekcjonowania tkanek. Aby zminimalizować ryzyko kontaminacji RNA, wszystkie powierzchnie, w tym obszar roboczy, ostrze do sekcjonowania oraz szkiełka przedmiotowe, należy potraktować roztworem do dekontaminacji RNA, takim jak RNA SAP, a następnie przetrzeć 100% etanolem.Procedurę rozpoczyna się od krojenia mrożonych w oparach ciekłego azotu bloków tkankowych przy użyciu kriotomu ustawionego na -17 °C na zwykłe, nieładowane szkiełka przedmiotowe. Przygotowane skrawki tkanek są teraz gotowe do identyfikacji neuronów piramidowych z wykorzystaniem zestawu do szybkiego barwienia histo gene. W celu przygotowania serii do odwodnienia w etanolu, należy odmierzyć 25 ml odpowiednich stężeń etanolu oraz wody wolnej od RNA do słoików do barwienia dołączonych do zestawu histo gene.Umieścić wszystkie słoiki w wiadrze z lodem, z wyjątkiem jednego słoika z 75% ethanol. Ten słoik z 75% ethanol należy umieścić w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Następnie przygotować roztwór barwiący, dodając 1 µL inhibitora RNA na każde 100 µL roztworu barwiącego.Ponieważ będziemy barwić cztery przekroje tkankowe na dwóch szkiełkach, do 400 µL roztworu barwiącego w probówce do mikrocentryfugi dodaje się 4 µL inhibitora RNA. Roztwór barwiący należy przechowywać w lodzie. Pracować pod wyciągiem.Do słoika z ksylenem należy dodać sita molekularne, aby usunąć nadmiar wody, która mogłaby upośledzić odrywanie tkanek. Włączyć kąpiel wodną z temperaturą ustawioną na 42 °C i umieścić w niej probówkę Falcon o pojemności 50 ml, wspartą na statywie. Wyjąć dwa preparaty z zamrażarki o temperaturze -80 °C i rozmrozić je na chusteczce Kimwipe.Przez około 30 sekund lub do momentu, aż narożniki szkiełek zaczną odmarzać, krótko utrwal tkankę w 75% etanolu przez 30 sekund w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Następnie, używając pęsety wolnej od RNA, przenieś szkiełka do wody wolnej od nukleaz w celu przeprowadzenia 30-sekundowego płukania. Po wypłukaniu szkiełek obrysuj przekroje pisakiem do bariery PAP, aby skoncentrować roztwór barwiący na przekroju, a następnie barw cztery przekroje roztworem barwiącym histo gene przez 20 sekund. Przy zastosowaniu 97 µL barwnika/inhibitora RNA na przekrój, odwodnij przekroje w wcześniej przygotowanym etanolu na lodzie przez 30 sekund w każdym kroku.Ostatni etap w 100% etanolu należy przedłużyć do trzech minut, aby uzyskać wystarczające odwodnienie zapewniające odpowiednie uniesienie tkanki. Na koniec zanurz slajdy w ksylenie na pięć minut, pozwalając im całkowicie wyschnąć na powietrzu przed przystąpieniem do laserowej mikrodysekcji przechwytującej; neurony piramidowe muszą zostać niezwłocznie usunięte po zabarwieniu w procedurze laserowego przechwytywania pojedynczych komórek. MIKRODYSEKCJA lub LCM wymaga łaźni wodnej o temperaturze 42°C zawierającej probówkę Falcon o pojemności 50 ml wspartą przez uchwyt, który został przygotowany wcześniej.LCM pojedynczych komórek wykonuje się przy użyciu systemu i oprogramowania do mikrodysekcji laserowej ARCTURUS XT. Aby rozpocząć tę procedurę, należy umieścić preparaty i nakładki w urządzeniu Arcturus XT. Należy używać nakładek capture HS, zachowując jednocześnie ustawienie programu na macro.Kliknij pole „load with overview”, aby uzyskać zdjęcie ogólne każdego preparatu. Dostosuj jasność i ostrość przy powiększeniu 2x, aby wyznaczyć optymalny obszar do przechwytywania laserowego. Unikaj przekrojów tkanki z nadmiernymi pofałdowaniami; wybieraj przekroje nienaruszone, gładkie i zabarwione.Następnie nałóż zaślepkę na obszar, który będzie rejestrowany, upewniając się, że obejmuje ona interesującą nas strefę – w naszym przypadku trzecią warstwę kory. Upewnij się, że prowadnice zaślepki nie opierają się na żadnych fałdach, ponieważ spowoduje to przechylenie zaślepki, co doprowadzi do powstania plam o różnej wielkości.Następnie należy ręcznie potwierdzić położenie plamki lasera IR przy powiększeniu 40 x. Niebieski krzyżyk powinien znajdować się w centrum plamki lasera IR. Jeśli tak nie jest, należy skorygować jego położenie, klikając prawym przyciskiem myszy na plamkę i wybierając opcję located IR spot.Przy powiększeniu 40x zidentyfikuj neurony piramidalne według następujących kryteriów: po pierwsze, komórki o kształcie piramidalnym oraz po drugie, zidentyfikowana proksymalna część dendrytów apikalnych i/lub bazalnych. Zapisz pozycję kapilary, klikając znak plus w funkcji pozycji. W ten sposób, jeśli kapilara zostanie przesunięta, zawsze powróci dokładnie w to samo miejsce, dla którego dostosowano rozmiar punktu.Wprowadź te wartości do pola sterowania: 70 w polu mocy oraz 16 w polu czasu trwania. Ponieważ parametry te są specyficzne dla naszej tkanki, zalecamy przetestowanie i dostosowanie tych zmiennych do konkretnej próbki tkanki przed rozpoczęciem pracy. W przypadku przechwytywania pojedynczych komórek laserem odznacz opcję automatycznego przesuwania stolika (auto move stage) i upewnij się, że symbol odpowiedniego rozmiaru odpowiada symbolowi na panelu po prawej stronie.Wybierz opcję z kółkiem w prawym dolnym rogu, aby wskazać neuron, którego przechwycenie chcesz przetestować. Po wyrównaniu niebieskiego krzyżyka z kółkiem aktywuj laser, klikając test IR spot. Plamka wytworzona przez laser powinna początkowo mieć wyraźny ciemny pierścień wokół przechwyconego obiektu.Upewnij się, że pierścień jest wystarczająco duży, aby objąć komórkę, ale na tyle mały, by nie obejmował niepożądanej tkanki ani innych komórek. Jeśli pierścień jest zbyt jasny, oznacza to, że komórka nie została przechwycona. Jeśli w środku ciemnego pierścienia znajduje się ciemna plama, oznacza to, że moc lub czas trwania impulsu lasera jest zbyt duża.Powtórz ten proces w różnych obszarach tkanki w obrębie warstwy, którą chcesz pobrać. Aby upewnić się, że rozmiar plamki nie różni się w zależności od lokalizacji, wprowadź odpowiednie korekty. Zidentyfikuj neurony piramidowe do pobrania, około 500 komórek.Naciśnij przycisk przechwytywania laserowego, aby pobrać komórki. Przenieś nakrętkę do stacji kontroli jakości (QC). Upewnij się, że usunięto co najmniej 90% neuronów.Jeśli nie, należy pobrać więcej komórek z obszaru, w którym uchwycono ich najwięcej. Umieść nakrętkę w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mililitra zawierającej 50 µL buforu ekstrakcyjnego. Nakrętka została zaprojektowana tak, aby idealnie pasowała i zapobiegała wyciekowi buforu.Odwróć zestaw do góry dnem, upewniając się, że bufor do ekstrakcji całkowicie pokrywa nakrętkę, a następnie umieść go na dnie probówki Falcon o pojemności 50 ml w kąpieli wodnej ustawionej na 42 °C. Inkubuj neurony przez 30 minut, aby usunąć tkankę z nakrętki; po inkubacji wiruj zestaw z probówką i nakrętką przez dwie minuty przy 800 g. Po wirowaniu zdejmij nakrętkę.Jeśli izolacja RNA ma zostać przeprowadzona w późniejszym terminie, pozostały ekstrakt komórkowy należy przechowywać w temperaturze -80 °C. W przeciwnym razie należy przystąpić do izolacji RNA z ekstraktu komórkowego zgodnie z opisem w następnej sekcji; izolację RNA przeprowadza się przy użyciu zestawu PICO pure isolation kit, który został zaprojektowany do izolacji niewielkiej liczby komórek z próbek LCM oraz do odzyskiwania mRNA o niskiej zawartości.Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać do ekstraktu komórkowego 70% etanol dołączony do zestawu, a następnie odwirować go na wcześniej przygotowanej kolumnie oczyszczającej. W celu związania RNA z filtrem kolumny po przemyciu, należy potraktować RNA DNazą, aby wyeliminować ryzyko interferencji z DNA. Ten krok jest szczególnie istotny w późniejszych zastosowaniach, takich jak real-time RT-PCR.Po trawieniu DNA należy dodać 40 µL buforu płuczącego jeden i wirować kolumnę oczyszczającą przez 15 sekund przy 8 000 ×g. Następnie należy przeprowadzić etapy płukania zgodnie z protokołem dołączonym do zestawu, jednak wydłużyć końcowy etap płukania buforem płuczącym dwa z dwóch do dwóch i pół minut, aby upewnić się, że w kolumnie nie pozostał bufor płuczący, co mogłoby zmniejszyć wydajność RNA. Przenieść kolumnę do innej probówki do mikrocentryfugi. Dodać bufor eluujący i inkubować na filtrze w kolumnie przez jedną minutę, a następnie wirować kolumnę w celu elucji RNA.Na koniec sprawdź jakość wyekstrahowanego RNA, przeprowadzając analizę za pomocą chipa Agilent High Sensitivity, który dostarcza wirtualny żel i elektroferogram; pipetuj 1,3 µL próbki do probówki o pojemności 0,5 mL. W celu kontroli jakości zamroź resztę próbki w temperaturze -80 °C. Po zweryfikowaniu jakości RNA można poddać je amplifikacji, znakowaniu oraz hybrydyzacji.W celu przeprowadzenia analizy profilowania ekspresji genów wykonane zostaną dwie rundy amplifikacji liniowej przy użyciu zestawu ribo amp HS plus, co powinno pozwolić na uzyskanie około 50 µg amplifikowanego RNA, wystarczającego do przeprowadzenia eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy oraz Q-R-T-P-C-R. Do znakowania amplifikowanego RNA wykorzystywany jest zestaw turbo biotin labeling kit i labeling od molecular devices. Na koniec przeprowadzone zostanie profilowanie ekspresji genów z wykorzystaniem human X three P gene chip pro beret firmy atrix.Przygotowanie skrawków tkankowych powinno skutkować uzyskaniem dwóch szkiełek z dwoma skrawkami na każdym, co daje łącznie cztery skrawki na przypadek. Każdy skrawek powinien być gładki, z minimalną liczbą rozdarć, pęknięć lub zagięć. Neurony piramidowe powinny być intensywnie barwione, mieć rozmiar około 20 do 25 µm, kształt piramidalny oraz widoczne dendryty apikalne.Podczas LCM, po przejściu impulsu lasera przez film termoplastyczny, komórki przylegają do nakładki i tym samym nie znajdują się już na szkiełku, pozostawiając otaczającą tkankę. Przy zastosowaniu nakładek przechwytujących HS w ustawieniach makro oraz prawidłowej regulacji mocy i siły lasera, do nakładki powinno przywrzeć od około 85 do 100% neuronów. Dla każdego przekroju należy uzyskać około 500 do 700 komórek, co daje co najmniej 500 picogramów całkowitego RNA na przypadek.Po izolacji całkowitego RNA jakość RNA jest oceniana za pomocą elektroferogramu i wirtualnego żelu przy użyciu systemu BioRad Experian. Na elektroferogramie powinny być widoczne dwa wyraźne piki odpowiadające jednostkom rybosomalnego RNA 18 s i 20 a s w przypadku tkanek pobranych po śmierci. Nie zawsze jednak tak jest, ponieważ tkanka może ulec degradacji z przyczyn występujących przed etapem sekcjonowania.Zazwyczaj widoczny będzie wyraźny wybrzuszenie wskazujące na degradację, z dużym pikiem w okolicach 18 s i mniejszym pikiem 28 s, co zaznaczono czerwonymi strzałkami. Z kolei RNA złej jakości z nadmierną degradacją będzie widoczne na elektroferogramie jako duży obszar pod krzywą. Aby sprawdzić jakość mRNA po dwóch rundach amplifikacji liniowej, oprócz przesunięcia w dół lokalizacji rozkładu, wykorzystujemy zarówno chip BioRad Experian standard Sense lab, jak i spektrofotometr NanoDrop.Tradycyjna technologia mikromacierzy Atrics wymaga, aby rozprzestrzeniony transkrypt mRNA miał długość co najmniej 600 nukleotydów, aby mógł zostać wykryty zgodnie z tym protokołem. Rozprzestrzenione mRNA osiągnęło zakres 1000 nukleotydów, co wskazuje elektroferogram z dużymi piki powoli opadającymi w funkcji czasu. Wynik ten jest również potwierdzony przez wirtualny żel.Jeśli długość transkrypcyjnych kopii jest krótsza niż 600 nukleotydów, próbka nie powinna być włączona do hybrydyzacji. Pomiary NanoDrop wykazały średni stosunek 260/280 lub czystość na poziomie 2,5 w obrębie próbek. Średnie stężenie wynosiło 1,7 µg/µL, co daje około 50 µg mRNA na próbkę, co jest wystarczającą ilością zarówno do analizy mikromacierzy, jak i późniejszej walidacji wyników metodą qRT-PCR, która wymaga od 15 do 20 µg mRNA. Nasze wyniki wskazują, że przy zastosowaniu tego protokołu zarówno ilość, jak i jakość uzyskanego RNA są wystarczające do badania różnic w ekspresji genów za pomocą macierzy Atrix Human X3P chip.Po hybrydyzacji z chipem Atrics Human X three P osiągnęliśmy średni procent wywołań sygnału na poziomie 26,6%, co wskazuje na odpowiednią hybrydyzację i intensywność sond. Przedstawiliśmy właśnie sposób laserowej mikrodysekcji neuronów parametanych z pośmiertnej tkanki ludzkiego mózgu w celu wykorzystania RNA otrzymanego z tych komórek. Podczas przeprowadzania tej procedury w badaniach profilowania mikrotablic RNA kluczowe jest wykonanie wszystkich etapów w środowisku wolnym od RNaz oraz sprawne ukończenie poszczególnych kroków w celu zachowania integralności RNA.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

obtaining-high-quality-rna-from-single-cell-populations-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uzyskiwanie wysokiej jakości RNA z pojedynczych populacji komórek w ludzkim tkance mózgu po śmierci

Heterogeniczność komórkowa tkanki mózgowej stanowi istotne ograniczenie w badaniach nad oznaczeniami epigenetycznymi w chromatynie, ponieważ większość analiz nie zapewnia rozdzielczości na poziomie pojedynczej komórki. Neurony są zazwyczaj przemieszane z glejem i innymi komórkami nieneuronalnymi. Przedstawiamy protokół izolacji i gromadzenia jąder neuronalnych z ludzkiego mózgu.

Izolacja jąder neuronalnych z tkanki mózgowej ludzi pobranej po śmierci

W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę izolacji pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronalnych szczura oraz późniejszą analizę transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Metoda ta może zostać zastosowana do każdego typu komórek.

Analiza transkryptomu pojedynczych komórek

Profilowanie ekspresji RNA w oddzielnych regionach mózgu myszy wymaga precyzyjnej i powtarzalnej strategii pobierania tkanek. W niniejszym opracowaniu opisano protokół wykorzystujący zarówno sekcjonowanie mózgu w płaszczyźnie czołowej, jak i mikrodysekcję wspomaganą wycinakiem do tkanek. Wydajność i jakość całkowitego RNA uzyskanego z otrzymanych próbek potwierdzają użyteczność przedstawionej metody.

Metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego RNA oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów

Analiza ekspresji genów w podzbiorze komórek w określonej tkance stanowi duże wyzwanie. W tym artykule opisano, jak wyizolować wysokiej jakości całkowite RNA z określonej populacji komórek, łącząc metodę szybkiego znakowania immunologicznego z mikrodysekcją wychwytu laserowego.

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego izolowania wysokiej jakości jąder ze świeżej lub zamrożonej tkanki do dalszego masowo równoległego sekwencjonowania RNA. Uwzględniamy opcje detergencyjno-mechanicznego i hipotoniczno-mechanicznego rozbijania tkanek oraz lizy komórek, które można wykorzystać do izolacji jąder.

Izolacja dorosłych jąder rdzenia kręgowego do masowo równoległego sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Ten protokół opisuje ogólne procesy i kontrole jakości niezbędne do przygotowania zdrowych pojedynczych komórek dorosłych ssaków do wysokoprzepustowych preparatów RNA-Seq opartych na kropelkach. Dostępne są również parametry sekwencjonowania, wyrównanie odczytu i dalsza analiza bioinformatyczna pojedynczych komórek.

Transkryptomika pojedynczych komórek oparta na kropelkowym kodowaniu kreskowym tkanek dorosłych ssaków

Ten protokół wykorzystuje metodę bez plam do wizualizacji i izolowania komórek Purkinjego w świeżo zamrożonej tkance z ludzkiego móżdżku pośmiertnego za pomocą mikrodysekcji laserowej. Celem tego protokołu jest wygenerowanie wystarczających ilości wysokiej jakości RNA do sekwencjonowania RNA.

Nierdzewny protokół wysokiej jakości izolacji RNA z mikrowypreparowanych komórek Purkiniego w ludzkim pośmiertnym móżdżku

Niejednorodność wewnątrznowotworowa jest nieodłączną cechą nowotworów, w tym glejaków. Opracowaliśmy prosty i wydajny protokół, który wykorzystuje kombinację i wirowania gradientowego do izolowania pojedynczych jąder ze świeżo mrożonych tkanek glejaka do badań sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i ATAC.

Izolacja jąder ze świeżo zamrożonych guzów mózgu dla sekwencji RNA pojedynczego jądra i sekwencji ATAC

Opracowaliśmy metodę, która wzbogaca i izoluje ludzkie populacje astrocytów ze świeżo zamrożonej tkanki do wykorzystania w dalszych analizach molekularnych.

Izolacja populacji astrocytów dorosłych ludzi ze świeżo zamrożonej kory mózgowej przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Sukces transkryptomiki i multiomiki pojedynczej komórki/pojedynczego jądra w dużej mierze zależy od jakości komórek/jąder. Dlatego izolowanie komórek/jąder od tkanek i ich oczyszczanie musi być wysoce ustandaryzowane. Protokół ten opisuje przygotowanie jąder z mózgu i szpiku kostnego do dalszego testu multiomu pojedynczego jądra.

Wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder

Tutaj wprowadzamy kompleksowy protokół do generowania i dalszej analizy organoidów ludzkiego mózgu za pomocą sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i pojedynczego jądra.

Generowanie i dalsza analiza transkryptomów pojedynczych komórek i jąder w organoidach mózgowych

Poznaj izolację wysokiej jakości RNA z pojedynczych neuronów piramidowych w ludzkiej pośmiertnej tkance mózgowej przy użyciu mikrodissekcji laserowej. Ta metoda umożliwia badanie ekspresji genów w schizofrenii.

Uzyskiwanie wysokiej jakości RNA z populacji pojedynczych komórek w pośmiertnej tkance mózgu człowieka

Przeglądaj więcej filmów