Izolacja RNA z zarodków danio pręgowanego i synteza cDNA do analizy ekspresji genów

Aby rozpocząć izolację RNA i uzyskać wystarczającą wydajność, 50 embrionów zebrafish przenosi się do mikroprobówki z moździerzem. Po dokładnej homogenizacji RNA jest najpierw ekstrahowane przy użyciu odczynnika triol i chloroformu. Następnie RNA jest oczyszczane przy użyciu zestawu Qiagen RNEZ minikit, aby uzyskać wysokiej jakości, niedegradowane całkowite RNA do dalszych zastosowań i długoterminowego przechowywania.

RNA jest syntetyzowane w bardziej stabilny produkt cDNA. cDNA jest oczyszczane w celu usunięcia oryginalnej matrycy RNA. Witam, nazywam się Sam Peterson, reprezentuję laboratorium dr Jennifer Freeman z Wydziału Nauk o Zdrowiu na Uniwersytecie Purdue.

Dzisiaj pokażemy Państwu, jak wyizolować wysokiej jakości RNA z całych embrionów rybki danio oraz jak przekształcić je w produkt cDNA. Zazwyczaj stosujemy tę procedurę do badania profili ekspresji genów. Przejdźmy zatem do szczegółów.

Podczas pracy z RNA bardzo ważne jest zachowanie środowiska wolnego od RNaz. Należy stosować proste środki ostrożności, takie jak używanie wyznaczonych pipet wyłącznie do procedur z RNA oraz spryskiwanie obszaru roboczego preparatem RNase Away przed rozpoczęciem ekstrakcji całkowitego RNA. Aby rozpocząć ekstrakcję, pracując w dygestorium, należy przenieść 50 embrionów zebrafish do probówki do wirówki o pojemności 1,5 ml. Należy usunąć jak największą ilość wody i natychmiast dodać 250 µL odczynnika TRIzol, który zawiera fenol.

Użyj tłuczka do probówek, aby rozetrzeć i zhomogenizować zarodki, wykonując około 20 ruchów, aż tkanka zostanie dostatecznie rozbita. Następnie dodaj 750 µL odczynnika triazolowego i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić całkowitą dysocjację kompleksów białek jądrowych. Po upływie pięciu minut dodaj 0,2 ml chloroformu, wymieszaj, kołysząc probówką przez 15 sekund i inkubuj próbkę przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie odwiruj przy 12 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Mieszanina rozdzieli się na dolną czerwoną fazę fenolowo-chloroformową, interfazę oraz bezbarwną górną fazę wodną. Górna warstwa ma grubość około 0,6 mm i zawiera RNA; przenieś całą górną warstwę wodną, około 0,6 mm, do nowej probówki mikrocentryfugi. Uważaj, aby nie przenieść żadnej części warstwy interfazy. Następnie, aby wytrącić RNA, dodaj 0,5 ml izopropanolu i wymieszaj.

Następnie pozostawiamy próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a potem wirujemy ją z prędkością 12 000 G przez 10 minut w temperaturze 4 °C. RNA powinno utworzyć żelowaty osad. Odsuwamy nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu, i przemywamy go, dodając 1 mL 75% etanolu, mieszając przez delikatne odwracanie probówki, a następnie wirujemy z prędkością 7 500 G przez 5 minut w temperaturze 4 °C.

Po wirowaniu usunąć etanol i odwrócić probówkę, aby wysuszyć osad przez 10 minut. Resuspender osad, dodając 100 µL wody wolnej od RNaz i inkubując w temperaturze 55 °C przez 10 minut. Często mieszać próbkę w vortexerze (metodą „finger vortex”), aby wspomóc rehydratację RNA.

Po wyekstrahowaniu RNA z embrionów należy przejść do oczyszczania RNA i traktowania D a. Aby oczyścić RNA, należy użyć zestawu Rogen RN easy mini kit. Przy pierwszym użyciu, pracując pod wyciągiem, należy dodać cztery objętości 100% etanolu do jednej objętości buforu RPE.

Dodaj 10 µL beta-merkaptoetanolu na każdy 1 mL buforu RLT. Następnie do próbki dodaj 350 µL buforu RLT oraz 250 µL 100% etanolu, wymieszaj poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieś całą próbkę na kolumnę RNeasy umieszczoną w probówce do zbierania o pojemności 2 mL. Wiruj przy 8 000 ×g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej; po wirowaniu odlej filtrat i dodaj 700 µL buforu RW1 do kolumny wirowej.

Ponownie odwiruj próbkę przy 8,000 G przez jedną minutę i odlej nadsącz, aby usunąć DA z próbki. Następnie przeprowadź oczyszczanie DNA przy użyciu zestawu do usuwania RNA z DNA. Po otrzymaniu zestawu dodaj 550 µL wody wolnej od nukleaz do DNA i delikatnie wymieszaj poprzez odwracanie probówki, a następnie podziel roztwór zapasowy na aliquoty po 10 µL i zamroź w temperaturze -20 °C.

Do 10 µL roztworu stokowego DNA dodać 70 µL buforu RDD, wymieszać poprzez delikatne odwrócenie probówki, krótko odwirować, a następnie przenieść mieszaninę bezpośrednio na kolumnę wiążącą R and easy spin column A. Próbkę DNA inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie do kolumny wirowej dodać 350 µL buforu RW one, odwirować przy 8 000 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, odrzucić filtrat i dodać 500 µL buforu RPE do kolumny wirowej. Próbkę inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Ponownie odwiruj próbkę przy 8, 000 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, odlej filtrację i dodaj 500 µL 75% etanolu do kolumny wirówki. Powtórz wirowanie przy 8, 000 G, lecz tym razem przez dwie minuty w temperaturze pokojowej; po wirowaniu odlej filtrację i pozostaw kolumnę do wyschnięcia na pięć minut. Odwiruj próbkę przy 8, 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie pozostałości etanolu.

Następnie przenieś kolumnę wirową do nowej probówki do zbierania o pojemności 1,5 ml i dodaj 10 µl wody wolnej od nukleaz; inkubuj przez jedną minutę w celu elucji RNA, a następnie wiruj przy 10 000 G przez jedną minutę. W temperaturze pokojowej RNA znajdzie się w frakcji przepływowej. Powtórz elucję, dodając kolejne 10 µl wody.

Sprawdzić ilość i jakość RNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND 1000 zgodnie z instrukcjami producenta. Dodatkowo przeprowadzić elektroforezę w żelu denaturującym lub użyć bioanalizatora Agilent 2100, aby ocenić integralność RNA. Jeśli jakość i ilość RNA są zadowalające, przejść do syntezy cDNA.

Na koniec przechowywać RNA w temperaturze -80°C do momentu przeprowadzenia syntezy cDNA. Rozpocząć syntezę cDNA, mieszając i krótko wirując każdy składnik primera RNA. Wymieszać RNA, dNTPs oraz oligo dT.

Do sterylnej probówki typu microfuge o pojemności 0,5 mililitra dodać każdy z komponentów tak, aby uzyskać łączną objętość 10 µL. Szczegółowe objętości znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym. Następnie inkubować próbkę w temperaturze 65 °C przez pięć minut.

Natychmiast przenieś próbkę do zawiesiny lodowej na 10 minut. W czasie chłodzenia próbki przygotuj master miks buforu o całkowitej objętości 9 µL, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym. Po schłodzeniu połącz master miks buforu z mieszaniną starterów RNA, delikatnie wymieszaj i zbierz poprzez krótkie wirowanie. Następnie inkubuj połączoną próbkę w termocyklerze w temperaturze 42 °C przez dwie minuty.

Aby rozpocząć transkrypcję odwrotną, dodać 1 µL superscript two RT do probówki i wymieszać. Kontynuować inkubację w temperaturze 42 °C przez jedną godzinę. Zakończyć reakcję w temperaturze 70 °C przez 15 minut.

Następnie schłodzić próbkę do 4 °C i przenieść do łaźni lodowej. Do próbki dodać 1 µL RNazy H i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C; RNaza H degraduje matrycę RNA, pozostawiając jedynie jednoniciowy produkt cDNA. Synteza cDNA jest teraz zakończona i wymaga jedynie dodatkowego etapu oczyszczania i zagęszczania. Aby wyizolować produkt cDNA, przygotować probówkę z żelem Phase Lock o pojemności 1,5 ml poprzez wirowanie przy 12 000 ×g przez dwie minuty.

Wszystkie żele powinny znajdować się na dnie probówki. Do probówki z żelem Phase Lock należy dodać 81,5 µL nasyconego fenolu Tris o pH 8,0, 81,5 µL mieszaniny chloroformu z izoamylalkoholem w stosunku 24:1 oraz próbkę, a następnie wymieszać całość kilkukrotnie poprzez delikatne odwracanie. Próbkę wirować przy 12 000 ×g przez pięć minut. W temperaturze pokojowej cDNA powinno znajdować się w górnej fazie wodnej.

Przenieś górną fazę, której objętość powinna wynosić około 20 µL, do czystej probówki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 mL. Aby wytrącić cDNA, dodaj 2 µL 3 M octanu sodu o pH 5.2 i delikatnie wymieszaj. Dodaj 7 µL glikogenu w stężeniu 5 mg/mL i delikatnie wymieszaj.

Następnie należy dodać 30 µL izopropanolu, delikatnie wymieszać i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie odwiruj próbkę z prędkością 12 000 G przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu na dnie probówki pojawi się mały osad cDNA.

Ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pipety. Przemyj osad, dodając 500 µL 70% etanolu i mieszając przez odwracanie, a następnie odwiruj próbkę przy 12 000 G przez pięć minut. Po wirowaniu usuń nadsącz za pomocą pipety.

Powtórz przemywanie, dodaj etanol, odwiruj w wirówce i usuń nadsącz. Po drugim przemywaniu krótko odwiruj probówkę, aby zebrać pozostałą ciecz. Usuń nadmiar płynu i pozostaw osad do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie dodaj 20 µL wody wolnej od nukleaz, aby rehydratować osad. Przechowuj próbkę w temperaturze 55 °C przez pięć minut. Po rehydratacji CD NA można przechowywać w temperaturze -20 °C.

Na koniec, zgodnie z instrukcjami producenta, należy sprawdzić ilość i jakość produktu cDNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND 1000. Ekstrakcja i oczyszczanie RNA z 50 embrionów zebrafish rutynowo daje około 15 µg wysokiej jakości całkowitego RNA, co zostało ocenione przy użyciu spektrofotometru NanoDrop ND 1000, przy czym stosunek absorbancji A260/A280 wynosi około 1,9 do 2,0. Integralność wyekstrahowanego RNA ocenia się za pomocą denaturującego żelu do RNA. RNA widoczne jest jako rozmycie z dwoma jasnymi prążkami odpowiadającymi rybosomalnemu RNA 18 S i 28 S.

Prążek 28 S powinien być około dwukrotnie intensywniejszy niż prążek 18 S. Alternatywnie, integralność RNA ocenia się za pomocą bioanalizatora Agilent 2100. Widoczne są dwa wyraźne piki odpowiadające rybosomalnemu RNA 18 S i 28 S.

Prążek 28 s powinien być większy od prążka 18 s. Odwrotna transkrypcja pięciu mikrogramów całkowitego RNA rutynowo daje od jednego do dwóch mikrogramów cDNA w ocenie za pomocą NanoDrop ND 1000. Stosunek absorbancji 260 do 280 dla cDNA wynosi około 1,8.

Właśnie pokazaliśmy, jak wyizolować całkowity RNA z całych zarodków danio pruzełkowatego i przekształcić ten RNA w produkt cDNA. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o zachowaniu środowiska wolnego od RNaz. To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie materiału i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.