Name: Izolacja RNA od embrionalnego danio pręgowanego i synteza cDNA do analizy ekspresji genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-07T16:40:00.000+00:00
Duration: 15 min 21 s
Description: Naucz się izolować wysokiej jakości RNA z embrionów Danio rerio i syntetyzować cDNA do analizy ekspresji genów metodami biologii molekularnej. Protokół umożliwia długoterminowe przechowywanie materiału genetycznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Część 1: Izolacja całkowitego RNA przy użyciu odczynnika TRIzol
Podczas pracy z RNA bardzo ważne jest zachowanie środowiska wolnego od RNaz. Bardzo pomocne są proste środki ostrożności, takie jak przeznaczenie osobnych pipet wyłącznie do procedur z RNA oraz spryskanie obszaru roboczego odczynnikiem dekontaminującym (np. RNAse Away) przed rozpoczęciem procedury.
<ol>
<li>Aby uzyskać odpowiednią ilość RNA, umieść 50 embrionów zebrafish w probówce mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i usuń jak najwięcej wody za pomocą pipety.</li>
<li>Natychmiast dodaj 250 μl odczynnika TRIzol1 do probówki z embrionami. Odczynnik TRIzol zawiera fenol i powinien być używany wyłącznie pod wyciągiem.</li>
<li>Zlizuj i zhomogenizuj embriony za pomocą tłuczka do probówek (około 20 ruchów), aż tkanka zostanie w wystarczającym stopniu rozbita.</li>
<li>Gdy komórki zostaną odpowiednio zhomogenizowane, dodaj 750 μl odczynnika TRIzol, aby uzyskać całkowitą objętość 1 ml.</li>
<li>Aby umożliwić całkowitą dysocjację kompleksów nukleoproteinowych, inkubuj zhomogenizowane próbki przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Na tym etapie próbkę można zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w -80°C lub kontynuować protokół.</li>
<li>Aby kontynuować, dodaj 0,2 ml chloroformu i kołysz probówką przez 15 sekund w celu wymieszania.</li>
<li>Inkubuj próbkę przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie wiruj przy 12,000 x g przez 15 minut w temperaturze 4°C.</li>
<li>Mieszanina rozdzieli się na dolną czerwoną fazę fenolowo-chloroformową, interfazę oraz bezbarwną górną fazę wodną. Górna faza wodna zawiera RNA. Górna warstwa powinna stanowić około 60% początkowej objętości TRIzol (około 0,6 ml). Przenieś górną warstwę wodną do nowej probówki mikrocentryfugi za pomocą pipety 1 ml, uważając, aby nie przenieść żadnej części warstwy interfazy.</li>
<li>Aby wytrącić RNA, dodaj 0,5 ml izopropanolu.</li>
<li>Pozostaw próbkę w temperaturze pokojowej na 10 minut, a następnie wiruj próbkę przy 12,000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C. RNA utworzy żelowaty osad na dnie probówki.</li>
<li>Nie naruszając osadu, usuń nadsącz za pomocą pipety i przemyj osad w 1 ml 75% etanolu. Wymieszaj próbkę poprzez delikatne odwracanie i wiruj przy 7,500 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C.</li>
<li>Po wirowaniu usuń etanol pipetą i pozostaw próbkę do wyschnięcia w pozycji odwróconej przez 10 minut.</li>
<li>Resuspenduj osad, dodając 100 μl wody wolnej od RNazy, i inkubuj próbkę w 55°C przez 10 minut. Zaleca się częste mieszanie na vortexie podczas inkubacji, aby wspomóc rehydratację RNA. Opcjonalnie można sprawdzić jakość i ilość próbki za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND-1000 lub przejść bezpośrednio do następnego kroku.</li>
</ol>
Część 2: Oczyszczanie RNA przy użyciu zestawu Qiagen RNEasy Mini Kit
Zestaw Qiagen RNEasy Mini Kit2 jest przydatny do usuwania zanieczyszczeń i domieszek z próbki RNA wyizolowanej innymi metodami. Do przeprowadzenia tej procedury, poza komponentami zawartymi w zestawie, potrzebne są: β-merkaptoetanol, etanol oraz woda wolna od nukleaz. Podczas tej procedury zaleca się opcjonalną obróbkę DNazą.
<ol>
<li>Przy pierwszym użyciu zestawu należy przygotować bufor RPE, dodając 4 objętości 100% etanolu do 1 objętości buforu RPE.</li>
<li>W dniu przeprowadzenia procedury należy przygotować świeży bufor RLT. Należy obliczyć całkowitą ilość potrzebnego buforu RLT. Na jedną próbkę wymagana jest objętość 350 μl. Aby przygotować bufor RLT, należy dodać 10 μl β-merkaptoetanolu na każdy 1 ml buforu. Czynność tę należy wykonać pod wyciągiem.</li>
<li>Do każdej próbki należy dodać 350 μl buforu RLT i 250 μl 100% etanolu. Należy dokładnie wymieszać roztwór, kilkakrotnie pipetując go w górę i w dół.</li>
<li>Próbkę, której objętość powinna wynosić około 700 μl, należy przenieść do kolumny RNEasy umieszczonej w probówce do zbierania o pojemności 2 ml i wirować przy 8,000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Po wirowaniu należy odrzucić filtrat i dodać 700 μl buforu RW1 do kolumny wirówki RNEasy.</li>
<li>Próbkę należy wirować przy 8,000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie odrzucić filtrat.</li>
<li>Obróbka nukleazą DNA za pomocą zestawu Qiagen RNAse-Free DNAse Kit: Obróbka nukleazą DNA jest opcjonalna, ale wysoce zalecana w celu uzyskania próbek najwyższej jakości.
<ol style="list-style-type:upper-alpha;">
<li>Po otrzymaniu zestawu do obróbki nukleazą DNA należy przygotować roztwór zapasowy DNAse I, dodając 550 μl wody wolnej od nukleaz do DNAse. Należy wymieszać delikatnie poprzez odwracanie probówki; nie wolno mieszać w wirówce typu vortex. Należy rozdzielić roztwór na aliquoty do probówek jednorazowych, zawierających po 10 μl roztworu zapasowego. Roztwór zapasowy można przechowywać w temperaturze -20°C do 9 miesięcy. Rozmrożone aliquoty można przechowywać w temperaturze 4°C przez 6 tygodni, jeśli jest to konieczne, jednak nie wolno ponownie zamrażać aliquotów po rozmrożeniu.</li>
<li>Aby przygotować mieszaninę inkubacyjną DNAse I, należy dodać 70 μl buforu RDD do 10 μl roztworu zapasowego DNAse I na każdą próbkę. Należy wymieszać poprzez delikatne odwracanie i krótko wirować probówkę, aby zebrać pozostałą ciecz ze ścianek. Należy dodać 80 μl mieszaniny inkubacyjnej DNAse I bezpośrednio do kolumny wirówki RNEasy. Obróbkę nukleazą DNA należy inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol></li>
<li>Po obróbce nukleazą DNA należy dodać 350 μl buforu RW1 do kolumny wirówki i wirować przy 8,000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Po wirowaniu należy odrzucić filtrat i dodać 500 μl buforu RPE do kolumny wirówki. Próbkę należy inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Próbkę należy wirować przy 8,000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i odrzucić filtrat.</li>
<li>Po wirowaniu należy dodać 500 μl 75% etanolu do kolumny wirówki.</li>
<li>Należy powtórzyć wirowanie przy 8,000 x g, tym razem przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Po wirowaniu należy odrzucić filtrat i pozostawić kolumnę do wyschnięcia na 5 minut.</li>
<li>Należy natychmiast wirować przy 8,000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie pozostałe ślady etanolu.</li>
<li>Po zakończeniu wirowania należy przenieść kolumnę wirówki do nowej probówki do zbierania o pojemności 1,5 ml i dodać 10 μl wody wolnej od nukleaz. Należy inkubować przez 1 minutę, a następnie wirować przy 10,000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. RNA znajdzie się w filtracie.</li>
<li>Do kolumny wirówki należy dodać kolejne 10 μl wody wolnej od nukleaz i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Próbkę należy wirować przy 10,000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Po wirowaniu należy wyjąć i odrzucić kolumnę wirówki. RNA znajdzie się w filtracie.</li>
<li>Ilość i jakość RNA należy sprawdzić za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND-1000 zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
<li>Dodatkowo należy wykonać elektroforezę w żelu denaturującym lub użyć bioanalizatora Agilent 2100, aby sprawdzić integralność RNA.</li>
<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia syntezy cDNA.</li>
</ol>
Część 3: Synteza cDNA przy użyciu systemu Invitrogen SuperScript First-Strand System
RNA jest podatne na rozszczepianie przez RNazy, co prowadzi do jego degradacji. W związku z tym opracowano wiele protokołów ekspresji genów wykorzystujących bardziej stabilny produkt cDNA, który został zsyntetyzowany bezpośrednio z RNA. W niniejszym materiale szczegółowo opisujemy syntezę pierwszej nici cDNA z wykorzystaniem systemu Invitrogen SuperScript First-Strand Synthesis System3. Każda reakcja syntezy cDNA może pomieścić do 5 μg RNA.
<ol>
<li>Przed rozpoczęciem procedury wymieszać i krótko odwirować każdy z komponentów.</li>
<li>Przygotować mieszaninę RNA/starter w sterylnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0.5 ml zgodnie z Tabelą 1.</li>
<li>Inkubować próbkę w temperaturze 65°C przez 5 minut.</li>
<li>Bezzwłocznie przenieść próbkę do zawiesiny lodowej na 10 minut.</li>
<li>Podczas chłodzenia próbki przygotować master mix z komponentami wymienionymi w Tabeli 2. Objętości podano na 1 reakcję. Dostosować objętości do całkowitej liczby reakcji.</li>
<li>Po schłodzeniu dodać 9 μl przygotowanego w kroku 5 master mixu do każdej mieszaniny RNA/starter. Delikatnie wymieszać i zebrać zawartość poprzez krótkie wirowanie. Całkowita objętość każdej próbki powinna wynosić 19 μl.</li>
<li>Inkubować próbkę w temperaturze 42°C przez 2 minuty w termocyklerze.</li>
<li>Dodać 1 μl (50 jednostek) SuperScript II RT do każdej probówki, wymieszać i inkubować w temperaturze 42°C przez 60 minut w termocyklerze.</li>
<li>Zatrzymać reakcję w temperaturze 70°C przez 15 minut, a następnie schłodzić próbkę do 4°C. Termocykler można zaprogramować dla kroków 8 i 9.</li>
<li>Po osiągnięciu przez próbkę temperatury 4°C przenieść reakcję do łaźni lodowej.</li>
<li>W warunkach chłodzenia na lodzie dodać 1 μl RNAse H do każdej probówki i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37°C. Całkowita objętość wynosi teraz 21 μl. Dodanie RNAse H do próbki spowoduje degradację matrycy RNA i pozostawi jedynie jednoniciowy produkt cDNA.</li>
</ol>
Część 4: Izolacja i precypitacja cDNA
<ol>
<li>Do izolacji produktu cDNA należy użyć probówki z żelem do rozdziału faz (phase lock gel) o pojemności 1,5 ml. Przygotuj probówkę z żelem do rozdziału faz o pojemności 1,5 ml poprzez wirowanie przy 12 000 x g przez 2 minuty. Żel powinien całkowicie osiąść na dnie probówki.</li>
<li>Do probówki z żelem do rozdziału faz dodaj 81,5 μl fenolu (nasyconego Trisem, buforowanego do pH 8,0), 81,5 μl chloroformu z alkoholem izoamylowym w stosunku 24:1 oraz próbkę (21 μl). Wymieszaj kilka razy, delikatnie odwracając probówkę.</li>
<li>Wirować próbkę przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>cDNA powinno znajdować się w górnej fazie wodnej. Przenieś górną fazę do czystej probówki do mikrowirowania o pojemności 1,5 ml. Objętość całkowita powinna wynosić około 20 μl.</li>
<li>Dodaj 1/10 objętości 3 M NaOAc, pH 5,2 i delikatnie wymieszaj. Na przykład, jeśli objętość górnej fazy wodnej wynosiła 20 μl, należy dodać 2 μl 3 M NaOAc, pH 5,2.</li>
<li>Dodaj 7 μl glikogenu w stężeniu 5 mg/ml i delikatnie wymieszaj.</li>
<li>Dodaj 1,5-krotną objętość izopropanolu i delikatnie wymieszaj. Zazwyczaj jest to około 30 μl izopropanolu.</li>
<li>Inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie wirować przy 12 000 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Na dnie probówki powinien utworzyć się niewielki osad cDNA. Ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pipety.</li>
<li>Dodaj 500 μl 70% etanolu i wymieszaj poprzez odwracanie probówki.</li>
<li>Wirować próbkę przy 12 000 x g przez 5 minut.</li>
<li>Po wirowaniu usuń nadsącz pipetą i powtórz przemywanie 70% etanolem oraz wirowanie (kroki 10 i 11).</li>
<li>Po wirowaniu usuń nadsącz pipetą. Jeśli na ściankach probówki pozostał płyn, można go zebrać poprzez krótkie wirowanie. Usuń nadmiar płynu i pozostaw osad do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
<li>Dodaj 20 μl wody wolnej od nukleaz, aby rehydratować osad. Przechowuj próbkę w temperaturze 55°C przez 5 minut w celu rehydratacji osadu.</li>
<li>Ilość i jakość produktu cDNA sprawdza się następnie za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND-1000 zgodnie z instrukcjami producenta. cDNA można przechowywać w temperaturze -20°C.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
Po oczyszczaniu RNA z 50 embrionów danio pręgowanego można uzyskać około 15 μg wysokiej jakości całkowitego RNA. Do oceny jakości całkowitego RNA można wykorzystać spektrofotometr, elektroforezę w żelu oraz analizator Agilent 2100 Bioanalyzer. Spektrofotometr NanoDrop ND-1000 może służyć do oceny absorbancji przy 260 nm w porównaniu do absorbancji przy 280 nm (Rycina 1). Stosunek A260/A280 pozwala wykryć obecność zanieczyszczeń oraz dostarcza dowodów na możliwą degradację. Stosunek A260/A280 w zakresie 1,9-2,0 uznaje się za akceptowalny. Ponadto wysoce zaleca się przeprowadzenie elektroforezy w żelu denaturującym do RNA w celu oceny jego integralności. Nitki RNA rozdzielą się na podstawie wielkości, przy czym krótsze fragmenty będą migrować dalej w głąb żelu. Próbka niedegradowana pojawi się jako rozmycie z dwoma wyraźnymi prążkami. Rozmycie wynika z obecności populacji nici mRNA o różnych rozmiarach, a prążki odpowiadają rRNA 28S i 18S. Prążek 28S powinien być około dwukrotnie bardziej intensywny niż prążek 18S (Rycina 2). Alternatywnie, integralność całkowitego RNA można ocenić za pomocą analizatora Agilent 2100 bioanalyzer. Oczekuje się dwóch wyraźnych pików reprezentujących rRNA 28S i 18S (Rycina 3). Pik 28S powinien być większy od piku 18S, a pole powierzchni pod pikami powinno wynosić w przybliżeniu 2:1. W próbkach zdegradowanych dwa wyraźne piki nie będą widoczne. Próbki RNA wykazujące degradację nie powinny być wykorzystywane w kolejnych procedurach eksperymentalnych.
Do oceny jakości produktu cDNA można wykorzystać analizę spektrofotometryczną (Rysunek 4). Stosunek A260/A280 powinien wynosić około 1,8. W naszym laboratorium reakcje cDNA z użyciem 5 μg całkowitego RNA rutynowo dają 1-2 μg produktu cDNA.
<img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="Widmo absorpcji UV kwasów nukleinowych, wykres, analiza stężenia DNA, wyniki spektrofotometrii." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Widmo NanoDrop próbki RNA. Po oczyszczaniu RNA ilość i jakość RNA można ocenić za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND-1000. Z 50 embrionów danio pręgowanego rutynowo uzyskuje się około 15 μg wysokiej jakości całkowitego RNA z stosunkiem A260/A280 w granicach 1,9-2,0.
<img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="Elektroforeza żelu agarozowego RNA; prążki 18S/28S; analiza czystości RNA, drabinka molekularna." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Denaturujący żel do RNA. W celu oceny integralności izolowanego całkowitego RNA można przeprowadzić elektroforezę na żelu denaturującym. Oczekiwanym wynikiem jest rozmaz z dwoma jasnymi prążkami odpowiadającymi rRNA 28S i 18S. Prążek 28S powinien być około dwukrotnie bardziej intensywny niż prążek 18S.
<img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="Wykres fluorescencji pokazujący piki RNA, 18S i 28S, dla analizy ilościowej kwasów nukleinowych." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Profil próbki RNA z bioanalizatora. W celu oceny integralności wyizolowanego całkowitego RNA próbki można przeanalizować za pomocą bioanalizatora Agilent 2100. Powinny być widoczne dwa wyraźne piki odpowiadające rRNA 28S i 18S. Pik 28S powinien być większy od piku 18S, a stosunek pól pod pikami powinien wynosić w przybliżeniu 2:1.
<img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="Wykres absorpcji kwasów nukleinowych, dane spektroskopii UV-Vis, wykazujące szczyt widmowy przy 260 nm." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4. Widmo NanoDrop próbki cDNA. Analiza spektrofotometryczna z użyciem NanoDrop ND-1000 może służyć do oceny ilości i jakości produktu cDNA. Stosunek A260/A280 powinien wynosić około 1,8. Reakcje cDNA z użyciem 5 ug całkowitego RNA rutynowo dają w naszym laboratorium 1-2 ug cDNA.
Tabela 1. Składniki dodawane do mieszanin RNA/starterów w kroku 2 syntezy cDNA.
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody >
 <tr >
 <td >Składnik</td>
 <td >Objętość</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >Całkowite RNA (do 5 μg)</td>
 <td >10 μl</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >10 mM mieszanina dNTP</td>
 <td >1 μl</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >Oligo(dT)12-18 (0.5 μg/ μl)</td>
 <td >1 μl</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >Woda traktowana DEPC</td>
 <td >n μl</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >Objętość całkowita</td>
 <td >10 μl</td>
 </tr >
</tbody >
</table >
Tabela 2. Mieszanina reakcyjna dla etapu 5 syntezy cDNA. Podane objętości dotyczą jednej reakcji. Należy zwiększyć objętości każdego składnika zgodnie z całkowitą liczbą reakcji.
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>Składnik</td>
 <td>Objętość</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X RT Buffer</td>
 <td>2 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 mM MgCl2</td>
 <td>4 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.1 mM DTT</td>
 <td>2 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAseOUT</td>
 <td>1 μl</td>
 </tr>
</tbody>
</table>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22TRIzol+Reagent+Manual%22">TRIzol Reagent Manual</a>. , (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNEasy+Mini+Handbook%22">RNEasy Mini Handbook</a>. , 4th ed, (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SuperScript+First-Strand+Synthesis+System+for+RT-PCR%22">SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR</a>. , Version E. (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Kruchość cząsteczki RNA jest najważniejszym aspektem, o którym należy pamiętać przez cały czas trwania niniejszego protokołu. Należy zawsze używać sterylnego sprzętu wolnego od RNaz w strefie laboratorium wolnej od RNaz. Pomocne jest wyznaczenie części laboratorium przeznaczonej wyłącznie do procedur z udziałem RNA. Obszar ten powinien być często spryskiwany produktem usuwającym RNazy, takim jak RNAse Away. Próbki RNA należy zawsze obsługiwać w rękawiczkach i przechowywać w lodzie, aby zapobiec ich degradacji.
<p cla...

<table><tbody><tr><td>Glikogen (5 mg/ml)</td><td>Ambion</td><td>9510</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Moździerzyki do probówek do mikrowirówek</td><td>VWR international</td><td>KT749520-0090</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Light, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>2302800</td><td></td></tr><tr><td>Fenol, nasycony Trisem</td><td>Roche Group</td><td>3117944001</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>VWR international</td><td>17810-491</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNazy wolnej od RNaz</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RNEasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&amp;#174; First-Strand Synthesis System for RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja rna z zarodków danio pręgowanego i synteza cdna do analizy ekspresji genów

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Wiele istotnych i złożonych procedur laboratoryjnych wymaga wysokiej jakości, nienaruszonego RNA. Degradacja próbki lub obecność zanieczyszczeń mogą prowadzić do katastrofalnych wyników w późniejszych zastosowaniach eksperymentalnych. Dlatego też niezwykle ważne jest stosowanie sprawdzonych technik z licznymi zabezpieczeniami i kontrolami jakości, aby zapewnić najwyższą jakość próbki. W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisujemy protokół izolacji całkowitego RNA z całych embrionów ryby danio pręgowanego z wykorzystaniem dostępnego komercyjnie denaturanta chemicznego, a następnie oczyszczania w celu usunięcia śladów DNA i zanieczyszczeń przy użyciu komercyjnego zestawu do izolacji RNA. Ponieważ RNA jest stosunkowo niestabilne i podatne na rozkład przez RNazy, większość protokołów oceniających ekspresję genów wykorzystuje produkt cDNA syntetyzowany bezpośrednio z matrycy RNA. Opisujemy procedurę konwersji RNA w bardziej stabilny produkt cDNA przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu. W trakcie tych procedur przeprowadzanych jest szereg kontroli jakości, aby upewnić się, że próbka nie uległa degradacji ani zanieczyszczeniu. Produktem końcowym tych protokołów jest cDNA odpowiedni do analizy mikromacierzy, RT-PCR lub długoterminowego przechowywania.

Izolacja wysokiej jakości, nienaruszonego RNA jest kluczowym krokiem w wielu protokołach laboratoryjnych. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę ekstrakcji RNA z całych embrionów zebrafish oraz syntezę cDNA do późniejszego zastosowania w różnych procedurach eksperymentalnych, w tym w analizie ekspresji genów za pomocą mikromacierzy.

Izolacja RNA z zarodków danio pręgowanego i synteza cDNA do analizy ekspresji genów

Wiele istotnych i złożonych procedur laboratoryjnych wymaga dostarczenia wysokiej jakości, nienaruszonego RNA. Próbka zdegradowana lub obecność zanieczyszczeń mogą prowadzić...

Aby rozpocząć izolację RNA i uzyskać wystarczającą wydajność, 50 embrionów zebrafish przenosi się do mikroprobówki z moździerzem. Po dokładnej homogenizacji RNA jest najpierw ekstrahowane przy użyciu odczynnika triol i chloroformu. Następnie RNA jest oczyszczane przy użyciu zestawu Qiagen RNEZ minikit, aby uzyskać wysokiej jakości, niedegradowane całkowite RNA do dalszych zastosowań i długoterminowego przechowywania.RNA jest syntetyzowane w bardziej stabilny produkt cDNA. cDNA jest oczyszczane w celu usunięcia oryginalnej matrycy RNA. Witam, nazywam się Sam Peterson, reprezentuję laboratorium dr Jennifer Freeman z Wydziału Nauk o Zdrowiu na Uniwersytecie Purdue.Dzisiaj pokażemy Państwu, jak wyizolować wysokiej jakości RNA z całych embrionów rybki danio oraz jak przekształcić je w produkt cDNA. Zazwyczaj stosujemy tę procedurę do badania profili ekspresji genów. Przejdźmy zatem do szczegółów.Podczas pracy z RNA bardzo ważne jest zachowanie środowiska wolnego od RNaz. Należy stosować proste środki ostrożności, takie jak używanie wyznaczonych pipet wyłącznie do procedur z RNA oraz spryskiwanie obszaru roboczego preparatem RNase Away przed rozpoczęciem ekstrakcji całkowitego RNA. Aby rozpocząć ekstrakcję, pracując w dygestorium, należy przenieść 50 embrionów zebrafish do probówki do wirówki o pojemności 1,5 ml. Należy usunąć jak największą ilość wody i natychmiast dodać 250 µL odczynnika TRIzol, który zawiera fenol.Użyj tłuczka do probówek, aby rozetrzeć i zhomogenizować zarodki, wykonując około 20 ruchów, aż tkanka zostanie dostatecznie rozbita. Następnie dodaj 750 µL odczynnika triazolowego i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić całkowitą dysocjację kompleksów białek jądrowych. Po upływie pięciu minut dodaj 0,2 ml chloroformu, wymieszaj, kołysząc probówką przez 15 sekund i inkubuj próbkę przez dwie minuty w temperaturze pokojowej, a następnie odwiruj przy 12 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Mieszanina rozdzieli się na dolną czerwoną fazę fenolowo-chloroformową, interfazę oraz bezbarwną górną fazę wodną. Górna warstwa ma grubość około 0,6 mm i zawiera RNA; przenieś całą górną warstwę wodną, około 0,6 mm, do nowej probówki mikrocentryfugi. Uważaj, aby nie przenieść żadnej części warstwy interfazy. Następnie, aby wytrącić RNA, dodaj 0,5 ml izopropanolu i wymieszaj.Następnie pozostawiamy próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a potem wirujemy ją z prędkością 12 000 G przez 10 minut w temperaturze 4 °C. RNA powinno utworzyć żelowaty osad. Odsuwamy nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu, i przemywamy go, dodając 1 mL 75% etanolu, mieszając przez delikatne odwracanie probówki, a następnie wirujemy z prędkością 7 500 G przez 5 minut w temperaturze 4 °C.Po wirowaniu usunąć etanol i odwrócić probówkę, aby wysuszyć osad przez 10 minut. Resuspender osad, dodając 100 µL wody wolnej od RNaz i inkubując w temperaturze 55 °C przez 10 minut. Często mieszać próbkę w vortexerze (metodą „finger vortex”), aby wspomóc rehydratację RNA.Po wyekstrahowaniu RNA z embrionów należy przejść do oczyszczania RNA i traktowania D a. Aby oczyścić RNA, należy użyć zestawu Rogen RN easy mini kit. Przy pierwszym użyciu, pracując pod wyciągiem, należy dodać cztery objętości 100% etanolu do jednej objętości buforu RPE.Dodaj 10 µL beta-merkaptoetanolu na każdy 1 mL buforu RLT. Następnie do próbki dodaj 350 µL buforu RLT oraz 250 µL 100% etanolu, wymieszaj poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieś całą próbkę na kolumnę RNeasy umieszczoną w probówce do zbierania o pojemności 2 mL. Wiruj przy 8 000 ×g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej; po wirowaniu odlej filtrat i dodaj 700 µL buforu RW1 do kolumny wirowej.Ponownie odwiruj próbkę przy 8,000 G przez jedną minutę i odlej nadsącz, aby usunąć DA z próbki. Następnie przeprowadź oczyszczanie DNA przy użyciu zestawu do usuwania RNA z DNA. Po otrzymaniu zestawu dodaj 550 µL wody wolnej od nukleaz do DNA i delikatnie wymieszaj poprzez odwracanie probówki, a następnie podziel roztwór zapasowy na aliquoty po 10 µL i zamroź w temperaturze -20 °C.Do 10 µL roztworu stokowego DNA dodać 70 µL buforu RDD, wymieszać poprzez delikatne odwrócenie probówki, krótko odwirować, a następnie przenieść mieszaninę bezpośrednio na kolumnę wiążącą R and easy spin column A. Próbkę DNA inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie do kolumny wirowej dodać 350 µL buforu RW one, odwirować przy 8 000 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, odrzucić filtrat i dodać 500 µL buforu RPE do kolumny wirowej. Próbkę inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Ponownie odwiruj próbkę przy 8, 000 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, odlej filtrację i dodaj 500 µL 75% etanolu do kolumny wirówki. Powtórz wirowanie przy 8, 000 G, lecz tym razem przez dwie minuty w temperaturze pokojowej; po wirowaniu odlej filtrację i pozostaw kolumnę do wyschnięcia na pięć minut. Odwiruj próbkę przy 8, 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie pozostałości etanolu.Następnie przenieś kolumnę wirową do nowej probówki do zbierania o pojemności 1,5 ml i dodaj 10 µl wody wolnej od nukleaz; inkubuj przez jedną minutę w celu elucji RNA, a następnie wiruj przy 10 000 G przez jedną minutę. W temperaturze pokojowej RNA znajdzie się w frakcji przepływowej. Powtórz elucję, dodając kolejne 10 µl wody.Sprawdzić ilość i jakość RNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND 1000 zgodnie z instrukcjami producenta. Dodatkowo przeprowadzić elektroforezę w żelu denaturującym lub użyć bioanalizatora Agilent 2100, aby ocenić integralność RNA. Jeśli jakość i ilość RNA są zadowalające, przejść do syntezy cDNA.Na koniec przechowywać RNA w temperaturze -80°C do momentu przeprowadzenia syntezy cDNA. Rozpocząć syntezę cDNA, mieszając i krótko wirując każdy składnik primera RNA. Wymieszać RNA, dNTPs oraz oligo dT.Do sterylnej probówki typu microfuge o pojemności 0,5 mililitra dodać każdy z komponentów tak, aby uzyskać łączną objętość 10 µL. Szczegółowe objętości znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym. Następnie inkubować próbkę w temperaturze 65 °C przez pięć minut.Natychmiast przenieś próbkę do zawiesiny lodowej na 10 minut. W czasie chłodzenia próbki przygotuj master miks buforu o całkowitej objętości 9 µL, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym. Po schłodzeniu połącz master miks buforu z mieszaniną starterów RNA, delikatnie wymieszaj i zbierz poprzez krótkie wirowanie. Następnie inkubuj połączoną próbkę w termocyklerze w temperaturze 42 °C przez dwie minuty.Aby rozpocząć transkrypcję odwrotną, dodać 1 µL superscript two RT do probówki i wymieszać. Kontynuować inkubację w temperaturze 42 °C przez jedną godzinę. Zakończyć reakcję w temperaturze 70 °C przez 15 minut.Następnie schłodzić próbkę do 4 °C i przenieść do łaźni lodowej. Do próbki dodać 1 µL RNazy H i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C; RNaza H degraduje matrycę RNA, pozostawiając jedynie jednoniciowy produkt cDNA. Synteza cDNA jest teraz zakończona i wymaga jedynie dodatkowego etapu oczyszczania i zagęszczania. Aby wyizolować produkt cDNA, przygotować probówkę z żelem Phase Lock o pojemności 1,5 ml poprzez wirowanie przy 12 000 ×g przez dwie minuty.Wszystkie żele powinny znajdować się na dnie probówki. Do probówki z żelem Phase Lock należy dodać 81,5 µL nasyconego fenolu Tris o pH 8,0, 81,5 µL mieszaniny chloroformu z izoamylalkoholem w stosunku 24:1 oraz próbkę, a następnie wymieszać całość kilkukrotnie poprzez delikatne odwracanie. Próbkę wirować przy 12 000 ×g przez pięć minut. W temperaturze pokojowej cDNA powinno znajdować się w górnej fazie wodnej.Przenieś górną fazę, której objętość powinna wynosić około 20 µL, do czystej probówki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 mL. Aby wytrącić cDNA, dodaj 2 µL 3 M octanu sodu o pH 5.2 i delikatnie wymieszaj. Dodaj 7 µL glikogenu w stężeniu 5 mg/mL i delikatnie wymieszaj.Następnie należy dodać 30 µL izopropanolu, delikatnie wymieszać i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie odwiruj próbkę z prędkością 12 000 G przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu na dnie probówki pojawi się mały osad cDNA.Ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pipety. Przemyj osad, dodając 500 µL 70% etanolu i mieszając przez odwracanie, a następnie odwiruj próbkę przy 12 000 G przez pięć minut. Po wirowaniu usuń nadsącz za pomocą pipety.Powtórz przemywanie, dodaj etanol, odwiruj w wirówce i usuń nadsącz. Po drugim przemywaniu krótko odwiruj probówkę, aby zebrać pozostałą ciecz. Usuń nadmiar płynu i pozostaw osad do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie dodaj 20 µL wody wolnej od nukleaz, aby rehydratować osad. Przechowuj próbkę w temperaturze 55 °C przez pięć minut. Po rehydratacji CD NA można przechowywać w temperaturze -20 °C.Na koniec, zgodnie z instrukcjami producenta, należy sprawdzić ilość i jakość produktu cDNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND 1000. Ekstrakcja i oczyszczanie RNA z 50 embrionów zebrafish rutynowo daje około 15 µg wysokiej jakości całkowitego RNA, co zostało ocenione przy użyciu spektrofotometru NanoDrop ND 1000, przy czym stosunek absorbancji A260/A280 wynosi około 1,9 do 2,0. Integralność wyekstrahowanego RNA ocenia się za pomocą denaturującego żelu do RNA. RNA widoczne jest jako rozmycie z dwoma jasnymi prążkami odpowiadającymi rybosomalnemu RNA 18 S i 28 S.Prążek 28 S powinien być około dwukrotnie intensywniejszy niż prążek 18 S. Alternatywnie, integralność RNA ocenia się za pomocą bioanalizatora Agilent 2100. Widoczne są dwa wyraźne piki odpowiadające rybosomalnemu RNA 18 S i 28 S.Prążek 28 s powinien być większy od prążka 18 s. Odwrotna transkrypcja pięciu mikrogramów całkowitego RNA rutynowo daje od jednego do dwóch mikrogramów cDNA w ocenie za pomocą NanoDrop ND 1000. Stosunek absorbancji 260 do 280 dla cDNA wynosi około 1,8.Właśnie pokazaliśmy, jak wyizolować całkowity RNA z całych zarodków danio pruzełkowatego i przekształcić ten RNA w produkt cDNA. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o zachowaniu środowiska wolnego od RNaz. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie materiału i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.

rna-isolation-from-embryonic-zebrafish-cdna-synthesis-for-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolowanie RNA z zarodkowych danios i synteza cDNA do analizy ekspresji genów

Mikromacierze genów są potężnymi narzędziami w profilowaniu ekspresji genów na poziomie całego genomu. Technologia ta znajduje zastosowanie w wielu dyscyplinach biologicznych, w tym w biologii rozwoju i toksykologii. W tym filmie szczegółowo opisujemy protokół globalnej analizy ekspresji genów z wykorzystaniem kompleksowej platformy mikromacierzy oligonukleotydowych dla danio pręgowanego.

Analiza globalnej ekspresji genów z wykorzystaniem platformy mikromacierzy oligonukleotydowych dla ryby danio-ostrobramkowej

Tutaj prezentujemy systematyczne podejście do opracowywania fizjologicznie istotnych, czułych i specyficznych testów in vivo do interpretacji zmienności w ludzkiej patologii. Przejściowa manipulacja genetyczna poprzez mikrowstrzyknięcie WT i zmutowanych ludzkich oligonukleotydów antysensownych mRNA i morfoliny (MO) wykorzystuje podatność rozwijającego się zarodka danio pręgowanego do szybkiego oznaczania mutacji patogennych, zwłaszcza, ale nie wyłącznie, w kontekście zaburzeń rozwojowych...

In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Aby przeanalizować profile ekspresji genów sercowych podczas rozwoju serca danio pręgowanego, należy wyekstrahować całkowite RNA z izolowanych serc. W tym miejscu przedstawiamy protokół pobierania funkcjonalnych/bijących serc poprzez szybką ręczną sekcję z zarodków danio pręgowanego w celu uzyskania mRNA specyficznego dla serca.

Wielkoskalowa sekcja embrionalnego serca danio pręgowanego do analizy transkrypcyjnej

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Ten protokół przedstawia podejście do analizy całego transkryptomu z zarodków danio pręgowanego, larw lub posortowanych komórek. Obejmuje izolację RNA, analizę szlaku danych RNASeq oraz walidację zmian ekspresji genów opartą na qRT-PCR.

Przygotowanie próbki i analiza danych dotyczących ekspresji genów opartych na RNASeq od danio pręgowanego

Przedstawiamy protokół izolowania neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Po wyizolowaniu RNA jest ekstrahowane z tych komórek w celu analizy ich profilu ekspresji genów. Protokół ten pozwala na zbieranie wysokiej jakości RNA do przeprowadzania dalszych analiz, takich jak qPCR i transkryptomika.

Izolacja i ekstrakcja RNA neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.

Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje, jak uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii odcinków embrionalnych danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Przydatne jest wykrycie wzorców ekspresji dwóch genów u danio pręgowanego, jeśli występuje niedobór przeciwciał.

In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania białek znacznikiem białka fluorescencyjnego u larw danio pręgowanego, nowo opracowany i zmodyfikowany system in vivo, szczególnie przydatny do wizualizacji białek o niskiej obfitości u danio pręgowanego.

Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

Naucz się izolować wysokiej jakości RNA z embrionów Danio rerio i syntetyzować cDNA do analizy ekspresji genów metodami biologii molekularnej. Protokół umożliwia długoterminowe przechowywanie materiału genetycznego.

Izolacja RNA z zarodków danio pręgowanego i synteza cDNA do analizy ekspresji genów

Przeglądaj więcej filmów