Name: Globalna analiza ekspresji genów przy użyciu platformy mikromacierzy oligonukleotydowych danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Poznaj globalną analizę ekspresji genów w Danio rerio przy użyciu mikromacierzy oligonukleotydowych. Protokół obejmuje fluorescencyjne znakowanie cDNA, hybrydyzację i skanowanie w celu profilowania transkryptomu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Część 1: Znakowanie fluorescencyjne cDNA
Barwnik Cy3 użyty w eksperymencie z mikromacierzą jest wrażliwy na fotodegradację. Procedurę należy przeprowadzać przy minimalnym oświetleniu. Protokół znakowania został opracowany na podstawie instrukcji BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual1.
<ol><li>Odczynniki do reakcji znakowania przechowuje się w temperaturze -20°C. Z zestawu BioPrime Array CGH Genomic Labeling System rozmrozić 2,5X Random Primer Buffer, 10X dCTP mix oraz wodę wolną od nukleaz. Rozmrozić również barwnik Cy3-dCTP. Po rozmrożeniu krótko odwirować wszystkie odczynniki przed użyciem.</li>
<li>Dla każdej analizowanej próbki cDNA należy przeprowadzić oddzielną reakcję znakowania. Do probówki o grubych ściankach o pojemności 0,6 ml dodać 500 ng cDNA, 40 μl 2,5X Random Primer Buffer oraz wodę wolną od nukleaz, aby uzyskać całkowitą objętość 86 μl.</li>
<li>Dokładnie wymieszać i krótko odwirować. Inkubować reakcję przez 5 minut w temperaturze 100°C w termocyklerze.</li>
<li>Bezzwłocznie przenieść reakcję do kąpieli lodowej na 10 minut.</li>
<li>Do każdej probówki dodać następnie 10 μl 10X dCTP mix, 2 μl 1 mM Cy3-dCTP oraz 2 μl polimerazy DNA Exo Klenow. Polimerazę DNA Exo Klenow należy przechowywać w zamrażarce do momentu użycia i zawsze trzymać w lodzie.</li>
<li>Dokładnie wymieszać reakcję i krótko odwirować.</li>
<li>Inkubować reakcję w temperaturze 37°C przez 16 godzin w termocyklerze.</li>
</ol>
Część 2: Wytrącanie znakowanego cDNA
<ol>
<li>Przed kontynuacją protokołu należy włączyć system hybrydyzacji NimbleGen i pozwolić systemowi ustabilizować temperaturę do 42°C.</li>
<li>Dla każdej reakcji należy umieścić kolumnę Microcon w probówce 1,5 ml. Do każdej kolumny należy dodać 300 μl 0,1X SSC, a następnie zawartość reakcji znakowania (100 μl).</li>
<li>Probówkę z kolumną należy wirować przy 16 100 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C.</li>
<li>Należy odlać filtrat, który może mieć lekko różowy kolor, i dodać do kolumny kolejne 300 μl 0,1X SSC.</li>
<li>Należy powtórzyć wirowanie przy 16 100 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C.</li>
<li>Należy odlać filtrat i dodać do kolumny dodatkowe 300 μl 0,1X SSC.</li>
<li>Należy wirować przy 16 100 x g przez 12 minut w temperaturze 4°C.</li>
<li>Należy odlać filtrat. Po tym ostatnim przemyciu filtrat powinien być przejrzysty, a na kolumnie powinno być widoczne różowe, znakowane cDNA.</li>
<li>Na kolumnę należy nanieść 100 μl wody wolnej od nukleaz. Należy wyjąć kolumnę z probówki 1,5 ml i odwrócić ją do nowej probówki 1,5 ml.</li>
<li>Należy wirować przy 2 300 x g przez 2 minuty w temperaturze 4°C. Znakowane cDNA powinno zostać rehydratowane w wodzie zbierającej się na dnie probówki.</li>
<li>Przy użyciu spektrofotometru NanoDrop ND-1000, zgodnie z instrukcją producenta, należy obliczyć stężenie DNA i ocenić wbudowanie barwnika poprzez obliczenie stosunku zasad do barwnika, gdzie stosunek nukleotydów do Cy3 jest równy stosunkowi A260/A550 pomnożonemu przez 23,15. Stosunek zasad do barwnika powinien mieścić się w przedziale od 50 do 80.</li>
<li>Jeśli cDNA zostało wystarczająco znakowane, należy odmierzyć 6 μg znakowanego cDNA do nowej probówki 1,5 ml.</li>
<li>Należy dodać 0,1X objętości 3 M NaOAc, pH 5,2 oraz 1X objętości izopropanolu. Mieszaninę należy inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Następnie próbkę należy wirować przy 16 100 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Należy ostrożnie odlać nadsącz, nie naruszając osadu DNA, który powinien mieć różowy kolor.</li>
<li>Należy przeprowadzić przemywanie etanolem, dodając 500 μl 70% EtOH i mieszając poprzez delikatne odwracanie probówki.</li>
<li>Próbkę należy wirować przy 16 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Należy usunąć nadsącz, odwrócić probówkę i pozwolić osadowi wyschnąć przez 5 minut. Na tym etapie osad można przechowywać w temperaturze -20°C, jeśli jest to pożądane, lub kontynuować protokół, przechodząc do etapu hybrydyzacji.</li>
</ol>
Część 3: Hybrydyzacja
Procedura hybrydyzacji została opracowana na podstawie podręcznika użytkownika Roche NimbleGen Arrays User's Guide for Gene Expression Analysis2.
<ol>
<li>Rozpuścić osad w 5 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
<li>Po rozpuszczeniu osadu dodać komponenty do hybrydyzacji wymienione w Tabeli 1. Komponenty do hybrydyzacji pochodzą z zestawu Roche NimbleGen Hybridization Kit. Po dodaniu wszystkich składników całkowita objętość powinna wynosić 18 μl. Dokładnie wymieszać i krótko odwirować probówkę, aby zebrać zawartość na dnie.</li>
<li>Kolejnym krokiem jest denaturacja znakowanego cDNA poprzez umieszczenie go w bloku grzewczym w temperaturze 95°C przez 5 minut.</li>
<li>Niezwłocznie przenieść probówkę do systemu hybrydyzacyjnego NimbleGen Hybridization System, podczas gdy w kolejnych krokach przygotowywane są macierze.</li>
<li>Macierze mikroarray należy zawsze obsługiwać ostrożnie i przechowywać zgodnie z instrukcjami producenta. Firma Roche NimbleGen zaleca przechowywanie macierzy ekspresyjnych w ciemności, z pochłaniaczem wilgoci, w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Włożyć macierz do narzędzia wyrównawczego Precision Mixer Alignment Tool (PMAT), dostarczonego w akcesoriach do przetwarzania macierzy NimbleGen.</li>
<li>Załadować mieszalnik X1 do PMAT i usunąć pasek klejący za pomocą pęsety. Szczelnie zamknąć PMAT. Nacisnąć mieszalnik przez otwór w PMAT i powoli otworzyć, aby macierz i mieszalnik odłączyły się od PMAT.</li>
<li>Mocno docisnąć walcem (brayerem) zewnętrzną krawędź mieszalnika, aby zapewnić całkowite uszczelnienie z macierzą i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Umieścić kompleks macierz-mieszalnik w systemie hybrydyzacyjnym w celu ogrzania.</li>
<li>Używając pipety wyporowej, powoli dodać 15 μl znakowanej próbki do otworu wlewowego. Jest to otwór znajdujący się w centrum mieszalnika. Wywierać powolny i stały nacisk na pipetę, aby próbka rozprzestrzeniła się równomiernie w mieszalniku bez pęcherzyków powietrza. Wytrzeć nadmiar próbki z otworów wlewowych i zakleić je paskami klejącymi.</li>
<li>Zamknąć zatrzask i rozpocząć mieszanie roztworu do hybrydyzacji, korzystając z programu B w systemie NimbleGen Hybridization System. Pozostawić macierze do hybrydyzacji na 16-20 godzin.</li>
</ol>
Część 4: Płukania po hybrydyzacji i skanowanie mikroarray
Procedura płukania i skanowania została dostosowana na podstawie podręcznika użytkownika Roche NimbleGen Arrays w zakresie analizy ekspresji genów2.
<ol>
<li>Gdy hybrydyzacja dobiega końca, przygotować bufory do płukania zgodnie z opisem w Tabeli 2. Podgrzać Bufor do Płukania IA do 42°C w łaźni wodnej.</li>
<li>Włączyć skaner macierzy GenePix 4000B i pozwolić mu się rozgrzać przez około 15 minut przed użyciem.</li>
<li>Nalać podgrzany Bufor do Płukania IA do naczynia.</li>
<li>Wyjąć kompleks mieszacz-macierz z systemu hybrydyzacji NimbleGen i wsunąć go do uchwytu (dołączonego do akcesoriów do przetwarzania macierzy NimbleGen). Zanurzyć zespół w podgrzanym Buforze do Płukania IA i ostrożnie usunąć mieszacz, odklejając go od płytki.</li>
<li>Wyjąć macierz z uchwytu i mieszać przez 15 sekund w Buforze do Płukania IA.</li>
<li>Szybko przenieść macierz do statywu na płytki z Buforem do Płukania IB o temperaturze pokojowej. Energicznie wstrząsać statywem przez 2 minuty.</li>
<li>Przenieść statyw do Buforu do Płukania II i mieszać przez 1 minutę.</li>
<li>Przenieść statyw do Buforu do Płukania III i mieszać przez 15 sekund.</li>
<li>Przenieść macierz do wirówki do suszenia płytek i wirować przez 2 minuty w celu usunięcia całej wilgoci. Przejść do skanowania.</li>
<li>Zaleca się natychmiastowe skanowanie macierzy, ponieważ barwnik jest wrażliwy na światło i ozon.</li>
<li>Włożyć macierz, kodem kreskowym do dołu, do skanera macierzy GenePix 4000B.</li>
<li>Otworzyć oprogramowanie GenePix Pro i przystąpić do skanowania macierzy. Macierze ekspresji genów Roche NimbleGen wykorzystują strategię hybrydyzacji jednobarwnej. W związku z tym do skanowania wymagana jest tylko jedna długość fali. Skanować sygnał fluorescencji Cy3 za pomocą lasera 532 nm. Otworzyć okno dialogowe ustawień sprzętu i ustawić wartość PMT dla lasera 532 nm na 500.</li>
<li>W oknie dialogowym ustawień sprzętu ustawić moc na 100%, rozmiar piksela na 5 mikronów, liczbę linii do uśrednienia na 1 oraz pozycję ostrzenia na 0 mikronów.</li>
<li>Wykonać skanowanie podglądowe i ustawić obszar skanowania.</li>
<li>Wykonać skanowanie.</li>
<li>Po zakończeniu skanowania sprawdzić histogram obrazu. Idealnie 1e-5 znormalizowanych zliczeń powinno znajdować się na granicy nasycenia 65 000, co oznacza, że ~1-2% cech jest nasyconych. Jeśli znormalizowane zliczenia są mniejsze niż 1e-5, zwiększyć wzmocnienie PMT i ponownie zeskanować płytkę. Jeśli znormalizowane zliczenia są większe niż 1e-5, zmniejszyć wzmocnienie PMT i ponownie zeskanować płytkę.</li>
<li>Po zakończeniu skanowania zapisać obraz. Zaleca się stosowanie standardowej konwencji nazewnictwa obrazów dla łatwiejszego odwołania. Obraz można teraz wczytać do preferowanego programu do analizy danych w celu normalizacji danych i obliczenia wartości intensywności.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
Ocena wydajności reakcji znakowania cDNA fluorescencyjnym barwnikiem Cy3 może rozpocząć się podczas pierwszych przemyć roztworem 0,1X SSC. Podczas każdego kolejnego przemycia przelew powinien stawać się mniej różowy, aż do uzyskania całkowicie bezbarwnego przelewu w ostatnim etapie. Ponadto, w trakcie tych kroków przemywania, produkt znakowany Cy3 powinien być widoczny na kolumnie. Jeśli przelew ma intensywny różowy kolor lub na kolumnie nie widać różowego produktu, jest to wyraźny sygnał, że reakcja znakowania nie przebiegła prawidłowo. Reakcję znakowania można ocenić ilościowo za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND-1000, aby określić stężenie znakowanego DNA oraz stosunek zasad do barwnika (Rysunek 1). W naszym laboratorium reakcja znakowania rutynowo pozwala uzyskać co najmniej 10 μg znakowanego DNA. Stopień wbudowania barwnika można obliczyć, stosując prosty stosunek bazy/barwnika, gdzie stosunek nukleotydów do Cy3 jest równy stosunkowi A260/A550 pomnożonemu przez 23,15. Wartości w zakresie 50-80 wskazują na wystarczające wbudowanie barwnika w reakcji znakowania. Jeśli reakcja znakowania daje niskie stężenie DNA lub słabe wbudowanie barwnika, nie zaleca się hybrydyzacji próbki z mikromacierzą i należy powtórzyć reakcję znakowania.
Ocenę jakości hybrydyzacji można przeprowadzić poprzez analizę histogramu obrazu oraz zeskanowanego obrazu mikromacierzy (Rysunek 2). W przypadku akceptowalnych hybrydyzacji 1-2% cech będzie nasyconych (tj. uzyskają 1e-5 znormalizowanych zliczeń przy granicy nasycenia 65 000) przy wartości PMT ustawionej w pobliżu 500. Jeśli wartość PMT musi zostać drastycznie skorygowana z 500, aby uzyskać 1e-5 znormalizowanych zliczeń przy granicy nasycenia 65 000, zazwyczaj wskazuje to na słabą hybrydyzację znakowanego cDNA z mikromacierzą. Dalsza analiza takich danych doprowadzi do pogorszenia jakości wyników. Jakość hybrydyzacji można również ocenić jakościowo, przeglądając obrazy zeskanowanej macierzy (Rysunek 3). Zestaw Roche NimbleGen Hybridization Kit zawiera mieszaninę oligonukleotydów do wyrównania, składającą się z 48-merów znakowanych Cy3 i Cy5, które hybrydyzują z cechami wyrównania na macierzach. Jakościowa ocena intensywności oligonukleotydów do wyrównania w stosunku do innych cech na macierzy pozwala na sprawdzenie efektywności hybrydyzacji fluorescencyjnie znakowanego cDNA na macierzy. Po przeprowadzeniu dalszej analizy można wykorzystać wykres rozrzutu analizowanych danych, aby określić względne poziomy ekspresji genów oraz zidentyfikować geny o różnej ekspresji między badanymi próbkami (Rysunek 4).
<img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure1thumb.jpg" alt="Wykres widm absorpcyjnych; spektroskopia; analiza danych; szczyt widmowy; pomiar optyczny." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Miniatura Ryciny 1"> Rycina 1. Widmo NanoDrop dla cDNA znakowanego Cy3. Wydajność znakowania cDNA oraz stopień wbudowania barwnika można ocenić za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND-1000. Proszę <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure1.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.
<img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure2thumb.jpg" alt="Wykres widm absorpcji przejściowej; zbiór danych, wynik spektroskopii, analiza danych o niskim poziomie szumu, krzywa zaniku." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Miniatura Ryciny 1"> Rycina 2. Histogram GenePix dla skanu mikromacierzy. Jakość hybrydyzacji można ocenić poprzez analizę histogramu obrazu. W przypadku akceptowalnych hybrydyzacji 1-2% cech będzie nasyconych przy 1e-5 znormalizowanych zliczeń dla granicy nasycenia 65 000, przy wartości PMT ustawionej w pobliżu 500. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure2.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2.
<img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure3.jpg" border="0" alt="Obraz mikroskopowy; fluorescencja z lokalizacji białek; badanie biologii komórki." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Skan obrazu mikromacierzy. Jakość hybrydyzacji można ocenić, analizując zeskanowany obraz mikromacierzy. Obraz należy zbadać pod kątem obecności kurzu lub innych czynników zakłócających, które uniemożliwiają wizualizację każdego punktu, a tym samym zapobiegają dokładnemu obliczeniu intensywności fluorescencji danego punktu. Intensywność oligosów wyrównawczych można porównać z innymi punktami na macierzy w celu oceny wydajności hybrydyzacji.
<img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure4.jpg" border="0" alt="Wykres rozrzutu wyników analizy statystycznej z linią regresji i korelacją." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4. Wykres rozrzutu przeanalizowanego eksperymentu z mikroarrayami.Celem tej procedury jest zidentyfikowanie genów o różnym poziomie ekspresji w próbkach. Dane z mikroarrayów można poddać dalszej analizie i przedstawić na wykresie rozrzutu w celu wizualizacji genów o różnej ekspresji.
Tabela 1. Składniki z zestawu Roche NimbleGen Hybridization Kit do dodania w kroku 2 hybrydyzacji.
<table border="1">
<tbody >
 <tr >
 <td >Składnik</td>
 <td >Objętość</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >Próbka (rozpuszczona w wodzie)</td>
 <td >5 μl</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >2X Bufor do hybrydyzacji</td>
 <td >9 μl</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >Hyb A</td>
 <td >3.6 μl</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >Oligonukleotyd do wyrównania</td>
 <td >0.4 μl</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >Objętość całkowita</td>
 <td >18 μl</td>
 </tr >
</tbody >
</table>
Tabela 2. Bufory do płukania, które należy przygotować do mycia macierzy po hybrydyzacji. 
<table border="1">
<tbody >
 <tr>
 <td>Składnik</td>
 <td>Bufor płuczący IA*</td>
 <td>Bufor płuczący IB</td>
 <td>Bufor płuczący II</td>
 <td>Bufor płuczący III</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Woda</td>
 <td>225 ml</td>
 <td>225 ml</td>
 <td>225 ml</td>
 <td>225 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X Bufor płuczący I, II lub III</td>
 <td>25 ml</td>
 <td>25 ml</td>
 <td>25 ml</td>
 <td>25 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M DTT</td>
 <td>25 μl</td>
 <td>25 μl</td>
 <td>25 μl</td>
 <td>25 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objętość całkowita</td>
 <td>250 ml</td>
 <td>250 ml</td>
 <td>250 ml</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
*Podgrzać wstępnie do 42°C

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22BioPrime+Array+CGH+Genomic+Labeling+System+Manual%22">BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual</a>. , Version C. (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Roche+NimbleGen+Arrays+User%27s+Guide+for+Gene+Expression+Analysis%22">Roche NimbleGen Arrays User's Guide for Gene Expression Analysis</a>. , Version 3 (2008).</li>
</ol>

Wiele protokołów mikromacierzy, w tym ten opisany tutaj, wykorzystuje barwniki fluorescencyjne jako sposób pomiaru i kwantyfikacji hybrydyzacji. Barwnik fluorescencyjny Cy3 jest wrażliwy na degradację pod wpływem światła i ozonu. Zaleca się przeprowadzanie procedury przy minimalnym oświetleniu. Ponadto drobne cząsteczki kurzu mogą zakłócać proces hybrydyzacji i skanowania. Należy zwrócić szczególną uwagę na to, aby obszar roboczy był czysty i wolny od kurzu.
Istnieje wiele alternatyw dla prot...

<table><tbody><tr><td>Suszarka do mikrocentryfug do macierzy</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C-1303-T</td><td></td></tr><tr><td>System znakowania genomowego BioPrime Array CGH</td><td>Invitrogen</td><td>18095-011</td><td></td></tr><tr><td>Cyanine 3-dCTP</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL576</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4000B</td><td>Molecular Devices</td><td>GENEPIX 4000B</td><td></td></tr><tr><td>Microcon YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>42411</td><td></td></tr><tr><td>Akcesoria do przetwarzania macierzy NimbleGen</td><td>Roche Group</td><td>5223539001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do hybrydyzacji NimbleGen</td><td>Roche Group</td><td>5223474001</td><td></td></tr><tr><td>System hybrydyzacji NimbleGen Hybridization System 4</td><td>Roche Group</td><td>5223652001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw buforów do płukania NimbleGen</td><td>Roche Group</td><td>5223504001</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalniki X1</td><td>Roche Group</td><td>5223725001</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza globalnej ekspresji genów z wykorzystaniem platformy mikromacierzy oligonukleotydowych dla ryby danio-ostrobramkowej

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Technologia mikromacierzy genowych umożliwia ilościowy pomiar i profilowanie ekspresji genów na poziomie poziomów transkrypcji w skali całego genomu. Technologia mikromacierzy genowych jest wykorzystywana w licznych dyscyplinach biologicznych w różnorodnych zastosowaniach, w tym w globalnej analizie ekspresji genów w odniesieniu do etapu rozwoju, stanu chorobowego oraz odpowiedzi toksycznej. W niniejszym materiale przedstawiamy demonstrację globalnej analizy ekspresji genów z wykorzystaniem kompleksowej platformy mikromacierzy oligonukleotydowych specyficznych dla danio pręgowanego. Platforma mikromacierzy ekspresyjnych dla danio pręgowanego zawiera 385 000 sond o długości 60 par zasad, badających 37 157 celów, z maksymalnie 12 sondami na jeden cel. Dla tej platformy wszystkie dostępne informacje o cDNA i genomie danio pręgowanego zostały zebrane z różnych baz danych genomowych, w tym Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu) oraz ZFIN (http://www.zfin.org). W rezultacie macierz ekspresyjna ta zapewnia pełne pokrycie aktualnego transkryptomu danio pręgowanego. Mikromacierz ekspresyjna dla danio pręgowanego została wydrukowana przez firmę Roche NimbleGen (Madison, WI). Ta demonstracja techniczna obejmuje fluorescencyjne znakowanie produktu cDNA, hybrydyzację znakowanego produktu cDNA z platformą mikromacierzy oraz skanowanie macierzy w celu pozyskania sygnału przy zastosowaniu strategii analizy jednobarwnej.

Mikromacierze genów są potężnymi narzędziami w profilowaniu ekspresji genów na poziomie całego genomu. Technologia ta znajduje zastosowanie w wielu dyscyplinach biologicznych, w tym w biologii rozwoju i toksykologii. W tym filmie szczegółowo opisujemy protokół globalnej analizy ekspresji genów z wykorzystaniem kompleksowej platformy mikromacierzy oligonukleotydowych dla danio pręgowanego.

Analiza globalnej ekspresji genów z wykorzystaniem platformy mikromacierzy oligonukleotydowych dla ryby danio-ostrobramkowej

Technologia mikromacierzy genowych umożliwia ilościowy pomiar i profilowanie ekspresji genów na poziomie transkryptów w skali całego genomu. Mikromacierze genowe ...

Niniejsza procedura rozpoczyna się od cDNA zsyntetyzowanego z wysokiej jakości matrycy RNA. cDNA jest najpierw znakowane barwnikiem fluorescencyjnym Cy3. Po zakończeniu reakcji znakowania, znakowane cDNA jest oczyszczane, izolowane, a następnie oceniana jest jakość reakcji znakowania.Oznaczone cDNA jest następnie hybrydyzowane z mikromacierzą. Po hybrydyzacji macierze są analizowane w celu określenia względnych poziomów ekspresji genów w próbkach. Witajcie, nazywam się Sam Peterson i pochodzę z laboratorium dr Jennifer Freeman z School of Health Sciences na Purdue University.Wcześniej pokazaliśmy Państwu, jak wyizolować RNA z embrionów danio pręgowanego i przekształcić to RNA w cDNA. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę znakowania i hybrydyzacji tego cDNA na platformie mikromacierzy oligonukleotydowych dla danio pręgowanego w celu badania globalnych profili ekspresji genów. Zazwyczaj stosujemy tę procedurę do badania różnicowej ekspresji genów w odpowiedzi na ekspozycję na toksynę.Zacznijmy zatem. Eksperyment z mikromacierzą wymaga środowiska o minimalnym oświetleniu, aby zapobiec fotodegradacji barwnika fluorescencyjnego Cy3 używanego do znakowania. Aby rozpocząć znakowanie cDNA za pomocą Cy3, rozmroź następujące komponenty zestawu BioPrime Array CGH Genomic Labeling System: 2,5x bufor z randomowymi starterami, 10X mieszankę dNTP oraz wodę wolną od nukleaz. Dodatkowo rozmroź zapasowy roztwór dCTP znakowanego Cy3 o stężeniu 1 mM. Po rozmrożeniu krótko odwiruj odczynniki w wirówce i połącz je w grubościennej probówce o pojemności 0,6 ml.500 ng cDNA w 40 µL, 2,5 x bufor do starterów randomowych oraz wodę wolną od nukleaz do uzyskania całkowitej objętości 86 µL. Dobrze wymieszać i krótko odwirować, następnie inkubować reakcję w termocyklerze w temperaturze 100 °C przez pięć minut. Po zakończeniu inkubacji natychmiast przenieść reakcję do kąpieli lodowej na 10 minut.Następnie wyjmij polimerazę DNA exo z zamrażarki i umieść na lodzie. Następnie do probówki z reakcją dodaj 10 µL mieszanki 10 X-D-C-T-P, 2 µL 1 mM SI 3D CTP oraz 2 µL polimerazy DNA XO cleanout, wymieszaj dokładnie i krótko odwiruj w wirówce. Na koniec inkubuj reakcję w temperaturze 37 °C przez 16 godzin w termocyklerze, aż etykietowanie zostanie zakończone.Przejdź do oczyszczania i precypitacji znakowanego cDNA. Aby rozpocząć oczyszczanie znakowanego cDNA, umieść kolumnę MicroCon w probówce 1,5 ml.Dodaj 300 µL 0,1 XSSC do kolumny, a następnie dodaj mieszaninę reakcji znakowania. Wirowarkuj kolumnę z prędkością 16 100 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zauważ, że frakcja przepływowa może mieć jasnoróżowy kolor.Odrzuć frakcję przepływową i dodaj do kolumny kolejne 300 µL 0.1 X SSC. Następnie powtórz wirowanie przy 16 100 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie odrzuć frakcję przepływową i dodaj do kolumny dodatkowe 300 µL 0.1 X SSC, a po tym ostatnim płukaniu wiruj przy 16 100 g przez 12 minut w temperaturze 4 °C.Przesącz powinien być klarowny, a różowo znakowane cDNA powinno być widoczne na kolumnie. Ponownie odrzuć przesącz z tego ostatniego przemywania, aby usunąć znakowane cDNA. Dodaj 100 µL wody wolnej od nukleaz do kolumny. Wyjmij kolumnę z probówki do mikrowirówki i odwróć ją do nowej probówki.Następnie odwiruj odwróconą kolumnę z prędkością 2,300 G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Oznakowany CDNA rozpuszcza się w wodzie znajdującej się na dnie probówki. Sprawdź uzyskany CDNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND 1000 zgodnie z instrukcjami producenta.Oblicz stężenie DNA i oceń stopień wbudowania barwnika zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym. Jeśli cDNA jest wystarczająco znakowane, przenieś 6 µg do nowej probówki, aby wyprecypitować mieszaninę znakowanego cDNA, dodając 0,1 x objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2 oraz 1 x objętości izopropanolu, a następnie inkubuj w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Należy pamiętać, że wszystkie dotychczasowe etapy były przeprowadzane w warunkach minimalnego oświetlenia. Następnie próbkę wiruje się przy 16 100 G przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu ostrożnie odrzuca się nadsącz, nie naruszając różowego osadu DNA.Na koniec przemyto próbkę, dodając 500 µL 70% etanolu, wymieszano metodą delikatnego odwracania i wirowano przy 16 100 G przez pięć minut. W temperaturze pokojowej usunięto nadsącz, odwrócono probówkę i pozostawiono osad do wyschnięcia na pięć minut. Znakowane cDNA jest gotowe do hybrydyzacji.Przed rozpoczęciem hybrydyzacji włącz system hybrydyzacji NimbleGen i poczekaj, aż osiągnie temperaturę równowagi 42 °C. Rozpocznij od rozpuszczenia pelletu znakowanego cDNA w 5 µL wody wolnej od nukleaz. Do rozpuszczonego pelletu dodaj komponenty hybrydyzacyjne z zestawu Roche NimbleGen Hybridization Kit: bufor hybrydyzacyjny Hybrid A oraz oligo wyrównujący, tak aby uzyskać całkowitą objętość 18 µL, zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym protokole pisemnym.Wymieszać dokładnie i krótko wirować probówkę, aby zebrać zawartość na dnie. Następnie zdenaturować znakowane cDNA, umieszczając probówkę w temperaturze 95 °C przez pięć minut. Natychmiast przenieść probówkę do systemu hybrydyzacji NimbleGen, aż macierze będą gotowe.Należy pamiętać, że macierze mikroarray wymagają ostrożnego obchodzenia się i przechowywania. Macierze Roche nimble gen przechowuje się w ciemności z osuszaczem w temperaturze pokojowej. Włóż macierz do narzędzia do wyrównywania mieszadła precyzyjnego.Załaduj mieszadło X do PMA T i za pomocą pęsety usuń pasek klejący. Po załadowaniu matrycy i mieszadła szczelnie zamknij PMA T. Następnie odłącz matrycę i mieszadło od PMA T, naciskając mieszadło przez otwór w PMA T.Na koniec za pomocą wałka dociskowego wywrzyć nacisk wokół zewnętrznej krawędzi miksera, aby upewnić się, że matryca jest szczelna i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Następnie umieścić kompleks miksera matrycy w systemie do hybrydyzacji w celu podgrzania i naniesienia próbki cDNA na matrycę. Tłok przesuwać powoli, wywierając stały nacisk.Dodaj 15 µL oznakowanej próbki do otworu wlewowego w centrum miksera. Wytrzyj nadmiar próbki z otworów i zamknij je za pomocą pasków samoprzylepnych. Następnie zamknij zatrzask.Następnie rozpocznij mieszanie roztworu hybrydyzacyjnego, korzystając z programu B w systemie do hybrydyzacji nimble gen. Pozostaw mikromacierz do hybrydyzacji na okres od 16 do 20 godzin. Po zakończeniu procesu mikromacierz zostanie przemyta i zeskanowana; gdy hybrydyzacja będzie dobiegać końca, przygotuj się do skanowania, włączając skaner macierzy gene picks 4, 000 B i pozostawiając go do rozgrzania przez około 15 minut.Następnie przygotuj bufory do płukania 1 A, 1 B, 2 i 3 zgodnie z opisem w załączonym protokole pisemnym. Podgrzej bufor do płukania 1 A do 42 °C, natomiast pozostałe bufory pozostaw w temperaturze pokojowej. Po ogrzaniu buforu do płukania 1 A przelej go do naczynia.Zanurz kasetę na szkiełka w buforze płuczącym one B. Następnie wyjmij kompleks miksera matrycy z systemu hybrydyzacji nimble gen i wsuń go do uchwytu. Rozpocznij płukanie, zanurzając zespół w uprzednio podgrzanym buforze płuczącym one A, a następnie ostrożnie usuń mikser, odklejając go od szkiełka. Po tym wyjmij matrycę z uchwytu i agituj przez 15 sekund w buforze płuczącym one A. Szybko przenieś matrycę do kasety na szkiełka zanurzonej w buforze płuczącym one B i energicznie agituj kasetę przez dwie minuty.Następnie przenieś kasetę z preparatami do drugiego buforu płuczącego i agituj przez jedną minutę. Na koniec przenieś kasetę z preparatami do trzeciego buforu płuczącego i agituj przez 15 sekund. Zakończ etap płukania, przenosząc matrycę do wirówki do suszenia preparatów i wirując przez dwie minuty.Niezwłocznie zeskanuj matrycę, ponieważ D jest wrażliwe na światło i ozon. Rozpocznij skanowanie, ładując matrycę kodem kreskowym skierowanym w dół do skanera matryc gene picks 4, 000 B. W oknie dialogowym ustawień sprzętu ustaw wartość PMT dla lasera 532 nanometer na 500, moc na 100%, rozmiar piksela na pięć mikronów, liczbę linii do uśrednienia na jedną oraz pozycję ogniskowania na zero mikronów. Po zakończeniu konfiguracji wykonaj podgląd matrycy.Wybierz obszar do skanowania, a następnie go zeskanuj. Po zakończeniu skanowania sprawdź histogram obrazu. Idealnie, wartość 1 E-5 znormalizowanych zliczeń powinna znajdować się na granicy nasycenia 65 000, co oznacza, że nasyconych jest około 1 do 2% cech.Jeśli znormalizowane zliczenia są mniejsze niż 1E-5, należy zwiększyć wzmocnienie PMT i ponownie zeskanować preparat. Jeśli znormalizowane zliczenia są większe niż 1E-5, należy zmniejszyć wzmocnienie PMT i ponownie zeskanować preparat, zapisać obraz, a następnie użyć programu do analizy danych w celu normalizacji danych i obliczenia wartości intensywności. Reakcja znakowania rutynowo pozwala na uzyskanie co najmniej 10 µg znakowanego cDNA.Stopień wbudowania barwnika można obliczyć, korzystając z prostego stosunku barwnika bazowego, w którym stosunek nukleotydów do SI 3 jest równy stosunkowi A 2 60 do A 5 50 pomnożonemu przez 23,15. Prawidłowa reakcja powinna dać wartość od 50 do 80. Akceptowalna hybrydyzacja będzie charakteryzować się nasyceniem od 1 do 2% cech.Wartość 1E-5 znormalizowanych zliczeń przy granicy nasycenia wynoszącej 65 000. Po ustawieniu wartości PMT w pobliżu 500, jakość hybrydyzacji można również ocenić jakościowo, przeglądając zeskanowany obraz mikromacierzy i oceniając intensywność wyrównanych oligosów w stosunku do innych elementów macierzy. Zeskanowany obraz należy również ocenić pod kątem występowania szczególnych plam lub pyłków w obszarze macierzy.W późniejszej analizie można wykorzystać wykres rozrzutu do obrazowania analizowanych danych w celu określenia względnych poziomów ekspresji genów w próbkach oraz zidentyfikowania genów wykazujących ekspresję różnicową. Geny o ekspresji różnicowej będą znacząco odbiegać od linii dopasowania. W uzupełniającej procedurze pokazaliśmy, jak wyizolować RNA z embrionów zebrafish i zsyntetyzować cDNA. Tutaj zaprezentowaliśmy sposób znakowania i hybrydyzacji cDNA na platformie mikroarray oligonukleotydowej w celu badania globalnych profili ekspresji genów.Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze pamiętać o zastosowaniu wysokiej jakości CD NA oraz unikaniu wystawiania barwnika site three na bezpośrednie działanie światła. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

global-gene-expression-analysis-using-zebrafish-oligonucleotide

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza ekspresji genów na całym świecie za pomocą platformy mikroarray oligonukleotydów z danią pręgowanym

Izolacja wysokiej jakości, nienaruszonego RNA jest kluczowym krokiem w wielu protokołach laboratoryjnych. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę ekstrakcji RNA z całych embrionów zebrafish oraz syntezę cDNA do późniejszego zastosowania w różnych procedurach eksperymentalnych, w tym w analizie ekspresji genów za pomocą mikromacierzy.

Izolacja RNA z zarodków danio pręgowanego i synteza cDNA do analizy ekspresji genów

Prezentujemy nasze podejście do wyszukiwania potencjalnych elementów enhansera w genach regulowanych rozwojowo oraz ocenę ich funkcji za pomocą mozaikowej transgenezy u rybek danio pręgowanych.

Mozaikowa transgeneza u danio pręgowanego do oceny sekwencji enhancerów

Tutaj prezentujemy systematyczne podejście do opracowywania fizjologicznie istotnych, czułych i specyficznych testów in vivo do interpretacji zmienności w ludzkiej patologii. Przejściowa manipulacja genetyczna poprzez mikrowstrzyknięcie WT i zmutowanych ludzkich oligonukleotydów antysensownych mRNA i morfoliny (MO) wykorzystuje podatność rozwijającego się zarodka danio pręgowanego do szybkiego oznaczania mutacji patogennych, zwłaszcza, ale nie wyłącznie, w kontekście zaburzeń rozwojowych...

In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

PCR w połączeniu z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA) jest pokazane jako szybka i skuteczna metoda genotypowania danio pręgowanego.

Szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości

Celem tego badania jest pokazanie, jak strategia transgenezy mozaiki może być wykorzystana u danio pręgowanego, aby szybko i skutecznie ocenić względny wkład wielu onkogenów w inicjację i progresję guza in vivo.

Mozaikowa transgeneza danio pręgowanego do funkcjonalnej analizy genomowej kandydujących genów kooperacyjnych w patogenezie nowotworu

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Ten protokół przedstawia podejście do analizy całego transkryptomu z zarodków danio pręgowanego, larw lub posortowanych komórek. Obejmuje izolację RNA, analizę szlaku danych RNASeq oraz walidację zmian ekspresji genów opartą na qRT-PCR.

Przygotowanie próbki i analiza danych dotyczących ekspresji genów opartych na RNASeq od danio pręgowanego

Danio pręgowany był używany jako wiarygodne modele genetyczne w badaniach biomedycznych, zwłaszcza wraz z pojawieniem się technologii edycji genów. Gdy spodziewane są fenotypy larw, ekstrakcja DNA i identyfikacja genotypu może być trudna. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę genotypowania larw danio pręgowanego, poprzez obcinanie ogonów, już po 72 godzinach od zapłodnienia.

Wysokoprzepustowa ekstrakcja DNA i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw

Technologie edycji genów umożliwiły badaczom generowanie mutantów danio pręgowanego w celu zbadania funkcji genów ze względną łatwością. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik do przeprowadzania równoległego genotypowania zarodków i kwantyfikacji sygnałów hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego. To bezstronne podejście zapewnia większą dokładność analiz fenotypowych opartych na hybrydyzacji in situ.

Genotypowanie i kwantyfikacja barwienia hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy metodę wyrównywania i kriosekcji wielu próbek larw danio pręgowanego (Danio rerio) i zbierania ich na jednym szkiełku do przestrzennej analizy transkryptomicznej.

Przestrzennie zwarty układ sekcji larw danio pręgowanego do przestrzennej analizy transkryptomicznej

Poznaj globalną analizę ekspresji genów w Danio rerio przy użyciu mikromacierzy oligonukleotydowych. Protokół obejmuje fluorescencyjne znakowanie cDNA, hybrydyzację i skanowanie w celu profilowania transkryptomu.

Analiza globalnej ekspresji genów z wykorzystaniem platformy mikromacierzy oligonukleotydowych dla ryby danio-ostrobramkowej

Przeglądaj więcej filmów