Analiza globalnej ekspresji genów z wykorzystaniem platformy mikromacierzy oligonukleotydowych dla ryby danio-ostrobramkowej

Procedura ta rozpoczyna się od cDNA zsyntetyzowanego z matrycy wysokiej jakości RNA. cDNA jest najpierw znakowane barwnikiem fluorescencyjnym Cy3. Po zakończeniu reakcji znakowania znakowane cDNA jest oczyszczane, izolowane, a następnie oceniana jest jakość reakcji znakowania.

Oznaczone cDNA jest następnie hybrydyzowane z macierzą mikroarray. Po hybrydyzacji macierze są analizowane w celu określenia względnych poziomów ekspresji genów w próbkach. Witam, nazywam się Sam Peterson i reprezentuję laboratorium dr Jennifer Freeman w School of Health Sciences na Uniwersytecie Purdue.

Wcześniej pokazaliśmy, jak izolować RNA z embrionów danio pręgowanego i przekształcać to RNA w cDNA. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę znakowania i hybrydyzacji tego cDNA na platformie mikromacierzy oligonukleotydowej dla danio pręgowanego w celu badania globalnych profili ekspresji genów. Zazwyczaj stosujemy tę procedurę do badania różnicowej ekspresji genów w odpowiedzi na ekspozycję na toksynę.

Zacznijmy zatem. Eksperyment z mikromacierzą wymaga minimalnego oświetlenia, aby zapobiec fotodegradacji barwnika fluorescencyjnego Cy3 używanego do znakowania. Aby rozpocząć znakowanie cDNA za pomocą Cy3, rozmroź następujące komponenty systemu BioPrime Array CGH Genomic Labeling System: 2,5x bufor do randomowych starterów, 10X mieszaninę dNTP oraz wodę wolną od nukleaz. Dodatkowo rozmroź roztwór stokowy 1 mM dCTP znakowanego Cy3. Po rozmrożeniu krótko odwiruj odczynniki w wirówce w probówkach o grubych ściankach o pojemności 0,6 ml i połącz je.

500 ng cDNA w 40 µL, 2,5 x buforu do starterów losowych oraz wodę wolną od nukleaz, aby uzyskać całkowitą objętość 86 µL. Dobrze wymieszać i krótko odwirować, a następnie inkubować reakcję w termocyklerze w temperaturze 100 °C przez pięć minut. Po zakończeniu inkubacji niezwłocznie przenieść reakcję do kąpieli lodowej na 10 minut.

Następnie wyjmij polimerazę DNA exo z zamrażarki i umieść na lodzie. Do probówki z reakcją dodaj 10 µL mieszaniny 10 X-D-C-T-P, 2 µL 1 mM SI 3D CTP oraz 2 µL polimerazy DNA XO cleanout, wymieszaj dokładnie i krótko odwiruj w wirówce. Na koniec inkubuj reakcję w temperaturze 37 °C przez 16 godzin w termocyklerze aż do zakończenia znakowania.

Przejdź do oczyszczania i wytrącania znakowanego cDNA. Aby rozpocząć oczyszczanie znakowanego cDNA, umieść kolumnę MicroCon w probówce 1,5 ml.

Dodaj 300 µL 0,1 X SSC do kolumny, a następnie dodaj mieszaninę reakcji znakowania. Wiruj kolumnę z prędkością 16 100 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zauważ, że przesącz może mieć lekko różowy kolor.

Odrzuć frakcję przepłuszczoną i dodaj do kolumny kolejne 300 µL 0.1 X SSC. Następnie powtórz wirowanie przy 16 100 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie odrzuć frakcję przepłuszczoną i dodaj do kolumny dodatkowe 300 µL 0.1 X SSC, a następnie po tym ostatnim przemyciu wiruj przy 16 100 g przez 12 minut w temperaturze 4 °C.

Przesącz powinien być klarowny, a różowo znakowane cDNA powinno być widoczne na kolumnie. Ponownie odrzuć przesącz z tego końcowego płukania, aby uniknąć zanieczyszczenia znakowanego cDNA. Dodaj 100 µL wody wolnej od nukleaz do kolumny. Wyjmij kolumnę z probówki do mikrocentryfugi i odwróć ją do nowej probówki.

Następnie odwiruj odwróconą kolumnę z prędkością 2 300 G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Znakowane cDNA rozpuszcza się w wodzie znajdującej się na dnie probówki. Sprawdź ilość otrzymanego cDNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND 1000 zgodnie z instrukcją producenta.

Oblicz stężenie DNA i oceń wbudowanie barwnika zgodnie z opisem w dołączonym protokole pisemnym. Jeśli cDNA jest wystarczająco znakowane, przenieś 6 µg do nowej probówki, aby wytrącić znakowaną mieszaninę cDNA, dodając 0,1 x objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2 oraz 1 x objętości izopropanolu, inkubując w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Pamiętając, że wszystkie dotychczasowe kroki były przeprowadzane w warunkach minimalnego oświetlenia, należy odwirować próbkę przy 16 100 G przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu ostrożnie odlać nadsącz, nie naruszając różowego osadu DNA.

Na koniec przemyto próbkę, dodając 500 µL 70% etanolu, wymieszano poprzez delikatne odwracanie i odwirowano przy 16 100 G przez pięć minut. W temperaturze pokojowej usunięto nadsącz, odwrócono probówkę i pozostawiono osad do wyschnięcia na pięć minut. Znakowane cDNA jest gotowe do hybrydyzacji.

Przed rozpoczęciem hybrydyzacji należy włączyć system do hybrydyzacji NimbleGen i pozwolić mu na ustabilizowanie temperatury do 42 °C. Następnie należy rozpuścić liofilizat znakowanego cDNA w 5 µL wody wolnej od nukleaz. Do rozpuszczonego liofilizatu należy dodać komponenty hybrydyzacyjne z zestawu Roche NimbleGen Hybridization kit: bufor do hybrydyzacji Hybrid A oraz oligo do wyrównania (alignment oligo), tak aby uzyskać całkowitą objętość 18 µL, zgodnie z opisem w dołączonym protokole pisemnym.

Wymieszać dokładnie i krótko odwiruj probówkę, aby zebrać zawartość na dnie. Następnie zdenaturować znakowane cDNA, umieszczając probówkę w temperaturze 95 °C przez pięć minut. Natychmiast przenieść probówkę do systemu hybrydyzacji NimbleGen, aż macierze będą gotowe.

Należy pamiętać, że macierze mikroarray wymagają ostrożnego obchodzenia się i przechowywania. Macierze Roche NimbleGen przechowuje się w ciemności, z osuszaczem, w temperaturze pokojowej. Włóż macierz do narzędzia wyrównawczego precyzyjnego miksera.

Załaduj mieszalnik X w PMA T, a następnie za pomocą pęsety usuń pasek zabezpieczający. Po załadowaniu matrycy i mieszalnika szczelnie zamknij PMA T. Następnie odłącz matrycę i mieszalnik z PMA T, wywierając nacisk na mieszalnik przez otwór w PMA T.

Na koniec, za pomocą wałka do nakładania farby wywrzyj nacisk wokół zewnętrznej strony mieszalnika, aby upewnić się, że matryca jest szczelna i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Następnie umieść kompleks mieszalnika matrycy w systemie hybrydyzacji w celu ogrzania i naniesienia próbki CDNA na matrycę. Użyj tłoka wypierającego powoli i z jednostajnym naciskiem.

Dodaj 15 µL oznakowanej próbki do otworu wlotowego znajdującego się na środku mieszalnika. Przetrzyj nadmiar próbki z otworów i zabezpiecz je paskami klejącymi. Następnie zamknij zatrzask.

Następnie należy rozpocząć mieszanie roztworu hybrydyzacyjnego, korzystając z programu B w systemie hybrydyzacyjnym nimble gen. Pozostawć mikromacierz do hybrydyzacji na okres od 16 do 20 godzin. Po zakończeniu hybrydyzacji mikromacierz zostanie przemyta i przeskanowana, gdy proces hybrydyzacji będzie dobiegał końca. W celu przygotowania do skanowania należy włączyć skaner mikromacierzy gene picks 4,000 B i pozwolić mu się rozgrzać przez około 15 minut.

Następnie przygotuj bufory do płukania: jeden A, jeden B dwa oraz trzy, zgodnie z opisem w załączonym protokole pisemnym. Podgrzej bufor do płukania jeden A do 42°C, natomiast pozostałe bufory pozostaw w temperaturze pokojowej. Po rozgrzaniu buforu do płukania jeden A wlej go do naczynia.

Zanurz statyw na szkiełka w buforze płuczącym jeden B. Następnie wyjmij kompleks miksera macierzy z systemu hybrydyzacji nimble gen i wsuń go do uchwytu. Rozpocznij płukanie, zanurzając cały zestaw w podgrzanym uprzednio buforze płuczącym jeden A, a następnie ostrożnie zdejmij mikser, odklejając go od szkiełka. Następnie wyjmij macierz z uchwytu i wstrząsaj przez 15 sekund w buforze płuczącym jeden A. Szybko przenieś macierz do statywu na szkiełka zanurzonego w buforze płuczącym jeden B i energicznie wstrząsaj statywem przez dwie minuty.

Następnie przenieś statyw z preparatami do buforu płukącego dwa i agituj przez jedną minutę. Na koniec przenieś statyw z preparatami do buforu płukącego trzy i agituj przez 15 sekund. Zakończ proces płukania, przenosząc macierz do wirówki do suszenia preparatów i wirując przez dwie minuty.

Niezwłocznie przeskanuj matrycę, ponieważ D jest wrażliwy na światło i ozon. Rozpocznij skanowanie, ładując matrycę kodem kreskowym skierowanym w dół do skanera matryc gene picks 4, 000 B. W dialogowym polu ustawień sprzętowych ustaw wartość PMT dla lasera o długości fali 532 nanometrów na 500, moc na 100%, rozmiar piksela na pięć mikronów, liczbę linii do uśrednienia na jedną oraz pozycję ostrości na 0 mikronów. Po zakończeniu konfiguracji wykonaj podgląd matrycy.

Wybierz obszar do skanowania, a następnie go zeskanuj. Po zakończeniu skanowania sprawdź histogram obrazu. W idealnym przypadku wartość 1E-5 znormalizowanych zliczeń powinna znajdować się przy granicy nasycenia 65 000, co oznacza, że nasycone jest około 1-2% cech obrazu.

Jeśli znormalizowane zliczenia są mniejsze niż 1E-5, należy zwiększyć wzmocnienie PMT i ponownie przeskanować preparat. Jeśli znormalizowane zliczenia są większe niż 1E-5, należy zmniejszyć wzmocnienie PMT i ponownie przeskanować preparat, zapisać obraz, a następnie użyć programu do analizy danych w celu normalizacji danych i obliczenia wartości intensywności. Reakcja znakowania rutynowo pozwala uzyskać co najmniej 10 µg znakowanego cDNA.

Włączenie barwnika można obliczyć, korzystając z prostego stosunku barwników podstawowych, gdzie stosunek nukleotydu do SI 3 równa się stosunkowi A 60 do A 50 pomnożonemu przez 23,15. Prawidłowa reakcja powinna dać wartość w zakresie od 50 do 80. Akceptowalna hybrydyzacja będzie charakteryzować się nasyceniem od 1 do 2% cech.

Wartość 1E-5 dla znormalizowanych liczników przy granicy nasycenia 65 000. Po ustawieniu wartości PMT, w okolicy 500, można również jakościowo ocenić jakość hybrydyzacji, oglądając zeskanowany obraz mikromacierzy i oceniając intensywność dopasowanych oligonukleotydów w stosunku do innych elementów macierzy. Zeskanowany obraz należy również sprawdzić pod kątem występowania konkretnych plam lub zanieczyszczeń w postaci kurzu w obrębie obszaru macierzy.

W kolejnej analizie można wykorzystać wykres rozrzutu do wizualizacji przeanalizowanych danych w celu określenia względnych poziomów ekspresji genów w próbkach oraz zidentyfikowania genów wykazujących ekspresję różnicową. Geny o ekspresji różnicowej będą znacząco odbiegać od linii dopasowania. W uzupełniającej procedurze pokazaliśmy, jak wyizolować RNA z embrionów zebrafish w celu syntezy cDNA. W niniejszym materiale przedstawiliśmy sposób znakowania i hybrydyzacji cDNA na platformie mikroarray z oligonukleotydami w celu zbadania globalnych profili ekspresji genów.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze pamiętać o stosowaniu wysokiej jakości CD NA oraz unikać wystawiania barwnika trzy na bezpośrednie światło. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.