Globalna analiza ekspresji genów przy użyciu platformy mikromacierzy oligonukleotydowych danio pręgowanego

Ta procedura rozpoczyna się od CDNA, które zostało zsyntetyzowane z matrycy wysokiej jakości RNA. CDNA jest najpierw znakowany barwnikiem fluorescencyjnym SI trzy. Po zakończeniu reakcji znakowania, znakowane CDNA jest oczyszczane, izolowane i oceniana jest jakość reakcji znakowania.

Oznaczone CDNA jest następnie hybrydyzowane na mikromacierzy. Po hybrydyzacji macierze są analizowane w celu określenia względnych poziomów ekspresji genów w próbkach. Cześć, nazywam się Sam Peterson i pracuję w laboratorium dr Jennifer Freeman w Szkole Nauk o Zdrowiu na Uniwersytecie Purdue.

Wcześniej pokazaliśmy, jak wyodrębnić RNA z zarodków danio pręgowanego i przekształcić to RNA w CDNA. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę znakowania i hybrydyzacji tego CDNA z platformą mikromacierzy oligonukleotydowej danio pręgowanego w celu zbadania globalnych profili ekspresji genów. Zazwyczaj używamy tej procedury do badania zróżnicowanej ekspresji genów w odpowiedzi na ekspozycję na toksynę.

Więc zacznijmy. Eksperyment z mikromacierzą wymaga minimalnego środowiska oświetleniowego, aby zapobiec fotodegradacji barwnika fluorescencyjnego SI trzy używanego do znakowania, aby rozpocząć znakowanie CD NA za pomocą sci trzy haw następujących składników systemu znakowania genomu bio prime array CGH 2,5 x losowy bufor starterowy, 10 mieszanin X-D-C-T-P i woda wolna od nukleaz. Ponadto rozmrozić jednomilimolowy zapas z trzech znakowanych DCTP SI po rozmrożeniu, krótko odwirować lub odczynniki w połączonej probówce o grubych ściankach o grubości 0,6 mililitra.

500 nanogramów CDNA 40 mikrolitrów, 2,5 x losowy bufor starterowy i woda wolna od nukleaz, aby uzyskać całkowitą objętość 86 mikrolitrów. Dobrze wymieszaj i krótko odwiruj, a następnie inkubuj reakcję w temperaturze stu stopni Celsjusza w termocyklerze przez pięć minut. Pod koniec inkubacji natychmiast przenieść reakcję do zawiesiny łaźni lodowej na 10 minut.

Następnie wyjmij polimerazę egzoDNA z zamrażarki i umieść na lodzie. Następnie dodać do probówki reakcyjnej 10 mikrolitrów 10 X-D-C-T-P Wymieszać dwa mikrolitry jednego milimolowego SI 3D CTP i dwa mikrolitry polimerazy oczyszczającej DNA XO, dobrze wymieszać i krótko odwirować. Na koniec inkubować reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin, a po zakończeniu etykietowania w termocyklerze.

Przystąp do czyszczenia i wytrącania oznakowanego CDNA. Aby rozpocząć czyszczenie oznaczonego CDNA. Umieść kolumnę MicroCon w rurce o pojemności 1.5 mililitra.

Dodaj 300 mikrolitrów bez 0,1 XSSC do kolumny, a następnie dodaj reakcję etykietowania. Odwirować kolumnę przy stężeniu 16,100 G przez 10 minut w czterech stopniach SIU. Zwróć uwagę, że przepływ może być jasnoróżowy.

Odrzuć przepływ i dodaj kolejne 300 mikrolitrów 0,1 XSSE do kolumny. Następnie powtórzyć wirowanie w temperaturze 16, 100 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie odrzuć przepływ i dodaj dodatkowe 300 mikrolitrów T 0,1 XSSC do kolumny, a następnie odwiruj przy 16, 100 G przez 12 minut w czterech stopniach Celsjusza po tym ostatnim płukaniu.

Przepływ powinien być czysty, a na kolumnie widoczny jest różowy CDNA. Ponownie, wyrzuć przepływ z tego ostatniego prania, aby uniknąć oznaczonej płyty CD NA. Dodaj 100 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do kolumny. Wyjmij kolumnę z mikroprobówki wirówkowej i odwróć do nowej probówki.

Następnie odwirować odwróconą kolumnę o stężeniu 2,300 G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Oznaczone CDNA rozpuszcza się w wodzie na dnie probówki. Sprawdź wspomniany CDNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop ND 1000 zgodnie z instrukcjami producenta.

Obliczyć stężenie DNA i ocenić włączenie barwnika zgodnie z opisem w dołączonym pisemnym protokole. Jeśli CDNA jest wystarczająco oznakowany, umieścić sześć mikrogramów w nowej probówce, aby wytrącić oznakowaną mieszaninę CD NA w naut 0,1 x objętość trzech molowych octanu sodu o pH 5,2 i jeden x objętość. Izopropanol inkubujący ciemność przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Mając na uwadze, że wszystkie dotychczasowe kroki zostały przeprowadzone w minimalnym oświetleniu. Następnie odwirować próbkę o stężeniu 16, 100 G przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu ostrożnie wyrzuć natant SUP, nie naruszając osadu DNA, który jest różowy.

Na koniec umyć przez dodanie 500 mikrolitrów, 70% etanolu i wymieszać za pomocą delikatnej wirówki inwersyjnej przy 16, 100 G przez pięć minut. W temperaturze pokojowej usuń supinat, odwróć probówkę i pozostaw granulkę do wyschnięcia na pięć minut. Oznaczone CDNA jest gotowe do hybrydyzacji.

Przed rozpoczęciem hybrydyzacji włącz system hybrydyzacji zwinnej generacji i pozwól mu zrównoważyć się do 42 stopni Celsjusza. Zacznij od rozpuszczenia oznakowanej osadki CD NA w pięciu mikrolitrach wody wolnej od nukleaz do rozpuszczonej osadki. Dodaj składniki hybrydyzacji z zestawu do hybrydyzacji Roche Nimble Gen Bufor hybrydowy A i oligo wyrównawczy do całkowitej objętości 18 mikrolitrów, jak opisano w dołączonym pisemnym protokole.

Dobrze wymieszaj i krótko zakręć tubką, aby zebrać zawartość na dnie. Następnie denaturuj oznaczone CDNA, umieszczając probówkę w temperaturze 95 stopni Celsjusza na pięć minut. Natychmiast przenieś lampę do systemu hybrydyzacji zwinnej generacji, aż macierze będą gotowe.

Należy pamiętać, że mikromacierze wymagają ostrożnego obchodzenia się i przechowywania. Zwinne matryce genowe Roche są przechowywane w ciemności ze środkiem osuszającym w temperaturze pokojowej. Załaduj tablicę do narzędzia do wyrównywania miksera precyzyjnego.

PMA T załaduj jeden mieszalnik X na PMA T i usuń pasek kleju za pomocą kleszczyków. Po załadowaniu macierzy i miksera bezpiecznie zamknij PMA T. Następnie odłącz matrycę i mieszalnik od PMA T, wywierając nacisk na mieszalnik przez otwór w PMA t.

Na koniec użyj brayera, aby wywrzeć nacisk na zewnętrzną część miksera, aby upewnić się, że układ jest uszczelniony i usunąć wszelkie pęcherzyki. Następnie umieść kompleks mieszalnika matrycowego w systemie hybrydyzacji w celu ogrzania, aby załadować próbkę CDNA do macierzy. Używaj przemieszczenia powoli i ze stałym naciskiem.

Dodaj 15 mikrolitrów oznakowanej próbki do portu napełniania pośrodku miksera. Zetrzyj nadmiar próbki z otworów portów i uszczelnij je paskami samoprzylepnymi. Następnie zamknij zatrzask.

Teraz zacznij mieszać roztwór hybrydyzacyjny za pomocą programu B w systemie hybrydyzacji zwinnej generacji. Pozwól mikromacierzy na hybrydyzację przez 16 do 20 godzin Po hybrydyzacji mikromacierz zostanie umyta i zeskanowana, gdy hybrydyzacja zbliża się do zakończenia. Przygotuj się do skanowania, włączając skaner z matrycą genów 4 000 B i pozwól mu się rozgrzać przez około 15 minut.

Następnie przygotuj do mycia jeden A, jeden B, dwa i trzy, zgodnie z opisem w dołączonym pisemnym protokole. Przedwojenny bufor mycia należy buforować od jednego A do 42 stopni Celsjusza, ale pozostałe pozostawić w temperaturze pokojowej. Gdy bufor do mycia jeden A się rozgrzeje, wlej go do naczynia.

Zanurz stojak do szkiełek w buforze myjącym jeden B. Teraz wyjmij kompleks mieszalnika matrycowego z systemu hybrydyzacji zwinnej generacji i wsuń do przyrządu. Rozpocznij mycie od zanurzenia zespołu w wstępnie ciepłym buforze mycia jeden A i ostrożnie wyjmij mikser, odrywając go od szkiełka. Następnie wyjmij matrycę z przyrządu i mieszaj przez 15 sekund w buforze myjącym jeden A. Szybko przenieś matrycę do stojaka do szkiełek do szkiełek zanurzonych w buforze do mycia jeden B i energicznie mieszaj stojak do szkiełka przez dwie minuty.

Następnie przenieś ruszt szkiełkowy do buforu myjącego numer dwa i mieszaj przez jedną minutę. Na koniec przenieś ruszt szkiełkowy do buforu myjącego numer trzy i mieszaj przez 15 sekund. Zakończ myjki, przenosząc matrycę do wirówki do suszenia szkiełek i wiruj przez dwie minuty po odwirowaniu.

Zeskanuj matrycę natychmiast, ponieważ D jest wrażliwy na światło i ozon, rozpocznij skanowanie, ładując kod kreskowy tablicy do skanera z matrycą genów 4 000 B. W zestawie ustawień sprzętowych laser 532 nm ma wartość PMT ustawioną na 500, ustaw moc na 100% rozmiar piksela na pięć mikronów, linie na średnią na jeden i pozycję ostrości na zero mikronów. Po zakończeniu konfiguracji wyświetl podgląd tablicy.

Wybierz obszar do skanowania, a następnie zeskanuj go. Po zakończeniu skanowania sprawdź histogram obrazu. Idealnie, jeden E minus pięć znormalizowanych zliczeń powinien znajdować się przy limicie nasycenia 65 000, co oznacza, że około 1 do 2% cech jest nasyconych.

Jeśli znormalizowane liczby są mniejsze niż jeden E minus pięć, zwiększ wzmocnienie PMT i ponownie zeskanuj slajd. Jeśli znormalizowane liczby są większe niż jeden E minus pięć, zmniejsz wzmocnienie PMT i ponownie zeskanuj slajd, zapisz obraz i użyj programu do analizy danych do normalizacji danych i obliczenia wartości intensywności. W wyniku reakcji znakowania rutynowo otrzymuje się co najmniej 10 mikrogramów znakowanego CDNA.

Włączenie barwnika można obliczyć za pomocą prostego stosunku barwnika bazowego, w którym stosunek nukleotydu do SI trzy jest równy stosunkowi A dwa 60 do pięciu 50 pomnożonego przez 23 punkty 15. Dobra reakcja da wartość od 50 do 80. Dopuszczalna hybrydyzacja będzie miała od jednego do 2% nasyconych cech plonowania.

Jeden E minus pięć znormalizowanych zliczeń przy limicie nasycenia 65 000. Po ustawieniu wartości PMT jakość hybrydyzacji zbliżonej do 500 można również ocenić jakościowo, przeglądając zeskanowany obraz mikromacierzy i oceniając intensywność wyrównanych oligonukleotydów do innych cech macierzy. Zeskanowany obraz powinien być również oceniany pod kątem konkretnych plam lub plam kurzu w obszarze matrycy.

W późniejszej analizie wykres punktowy może być używany do obrazowania danych analizy w celu określenia względnych poziomów ekspresji genów w próbkach i zidentyfikowania genów o zróżnicowanej ekspresji. Geny, które są wyrażane w różny sposób, będą znacznie odbiegać od linii najlepszego dopasowania w procedurze uzupełniającej. Pokazaliśmy Ci, jak wyekstrahować RNA z zarodków danio pręgowanego do syntezy c CD NA. Tutaj właśnie pokazaliśmy, jak znakować i hybrydyzować CD NA na platformie mikropromieniowania oligonukleotydowego w celu zbadania globalnych profili ekspresji genów.

Wykonując tę procedurę, zawsze pamiętaj, aby używać wysokiej jakości płyty CD NA i unikać wystawiania miejsca na bezpośrednie działanie światła. Więc to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.