Name: Fosfoproteomika ilościowa w Saccharomyces cerevisiae stymulowanych kwasami tłuszczowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-12T23:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Poznaj ilościową fosfoproteomikę w Saccharomyces cerevisiae stymulowanych kwasami tłuszczowymi. Metoda obejmuje kriolizę, frakcjonowanie HILIC i wzbogacanie IMAC do analizy fosfopeptydów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować dr. Richowi Rogersowi za pomoc techniczną przy analizach spektrometrii mas oraz pomocne dyskusje, a także dr. Robowi Moritzowi, dr. Jeffowi Ranishowi i dr. Hamidowi Mirzai za pomocne dyskusje.
Praca ta była finansowana przez NIH Centers of Excellence.

Wzrost komórek i pożywki
<ol>
 <li>Pojedynczą kolonię komórek BY4742Δarg4Δlys1 inkubowano przez noc w 100 mL pożywki bogatej do uzyskania OD600 wynoszącej 1,0, a następnie zaszczepiono do dwóch 1-litrowych kultur minimalnego podłoża drożdżowego (0,17% Yeast Nitrogen Base bez siarczanu amonu lub aminokwasów, 0,5% siarczanu amonu) zawierającego pełny zestaw aminokwasów, uzupełnionego o 20mg/L izotopowo lekkiej lub ciężkiej argininy (13C6 15N4; Isotec) oraz lizyny (13C6 15N2; Isotec).</li>
 <li>Komórki hodowano przez 18 godzin do uzyskania OD600 wynoszącej 1,8. Kluczowe jest, aby komórki przeszły przez co najmniej 9 generacji w celu pełnej inkorporacji znakowanych izotopów. Próbkę lekką odwirowano, przemyto sterylną wodą, ponownie zaszczepiono do pożywki zawierającej oleinian (izotopowo lekka arginina i lizyna, 0,2% oleinianu (Sigma Chemicals) oraz 0,5% Tween 40 (Sigma Chemicals)) i stymulowano przez kolejne 85 minut. W ten sposób otrzymano izotopowo lekką (pod względem argininy i lizyny) próbkę stymulowaną oleinianem oraz izotopowo ciężką próbkę referencyjną hodowaną na glukozie.</li>
</ol>
Lizą komórek, izolacja i frakcjonowanie peptydów
<ol start="3">
 <li>Zważyć butelkę do wirowania. Zebrać próbki poprzez wirowanie przez 3 minuty. Usunąć medium i odessać nadmiar cieczy. Zważyć osad wraz z butelką (zazwyczaj uzyskamy od 1-2 gramów), a następnie gwałtownie zamrozić w ciekłym azocie. Dodać do zamrożonych osadów w ciekłym azocie objętość buforu do rozcierania równą masie osadu (fosforanowy bufor solny (PBS, Gibco), 10% glicerol, inhibitory proteaz (SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets, Sigma) oraz inhibitory fosfataz HALT (Thermo Scientific)).</li>
 <li>Zamrozić naczynie do rozcierania w ciekłym azocie. Odczekać, aż ciekły azot przestanie wrzeć. Przenieść osad do naczynia do rozcierania wraz z zamrożonymi kulkami mielącymi.</li>
 <li>Rozcierać przy 600 rpm w cyklach 1 min 20 s z odwróceniem kierunku przez 3 minuty. Ponownie zamrozić naczynie do rozcierania w ciekłym azocie. Powtórzyć czynność jeszcze 4 razy, tak aby całkowity czas rozcierania wyniósł 15 minut.</li>
 <li>Zebrać zamrożony materiał rozcierany do probówki Falcon 50 ml i umieścić na suchym lodzie. Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
 <li>Przygotować 10 ml roztworu 8M mocznika, 0,1M wodorowęglanu amonu, 0,1M Tris pH 8,6. Dodać 3 objętości buforu mocznikowego do 1 objętości zamrożonego materiału rozcieranego (na przykład 3 ml buforu mocznikowego dodać do 1 grama osadu z 1 ml buforu PBS). Natychmiast poddać mieszaninę sonikacji za pomocą sonikatora z sondą (pulsy 2-10 sekundowe). Trzymać końcówkę sondy blisko dna probówki, aby zapobiec pienieniu się roztworu. Materiał rozcierany powinien natychmiast przejść do roztworu.</li>
 <li>Oczyścić lizat poprzez wirowanie przez 5 minut w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Przenieść nadsącz do nowych probówek.</li>
 <li>Przygotować świeżą alikwot 0,5M fosfiny [2-karboksyetylowej] (TCEP) w Tris. Dodać do próbki w stosunku 1:100, aby uzyskać stężenie końcowe 5mM. Inkubować w 37°C przez 1 h.</li>
 <li>Alkilowanie zredukowanych cystein. Pozostawić do ochłodzenia do temperatury pokojowej. Przygotować świeżą alikwot 1M jodoacetamidu. Przechowywać w ciemności (owijamy probówkę folią). Dodać do stężenia końcowego 20mM. Inkubować w ciemności przez 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Zneutralizować jodoacetamid za pomocą 20mM DTT z roztworu stokowego 1M w temperaturze pokojowej przez 1 h.</li>
 <li>Oznaczyć ilość białka za pomocą standardowego testu Bradforda lub BCA (nieopisanego). Pobrać próbkę do analizy metodą SDS PAGE poniżej.</li>
 <li>Aby zweryfikować wbudowanie ciężkich izotopów, użyć 100 μl zredukowanego i alkilowanego lizatu. Rozcieńczyć 1:4 w dH2O, poddać sonikacji i dodać trypsynę w stosunku białko do trypsyny 50:1. Trawić przez minimum 4 godziny, wysuszyć próbkę w wirówce odparowującej (speed vac), a następnie odsolić za pomocą kolumienek C18 Ultramicrospin (The Nest Group).
 <ol>
 <li>Nawodnić kolumienkę 100 μl acetonitrylu.</li>
 <li>Zrównoważyć 200 μl 0,1% TFA.</li>
 <li>Resuspendować wysuszoną próbkę w 200 μl 0,1% TFA. Nałożyć na kolumienkę. Wirować przy ~200 x g lub minimalnej prędkości wymaganej do przepływu przez kolumienkę.</li>
 <li>Przemyć dwukrotnie 200 μl 0,1% TFA.</li>
 <li>Eluować dwukrotnie 50 μl 60% acetonitrylu, 0,1% TFA.</li>
 <li>Wysuszyć próbkę w wirówce odparowującej.</li>
 <li>Resuspendować próbkę w 20 μl 0,1% kwasu mrówkowego. Nałożyć 2 μl na spektrometr mas. Sprawdzić wbudowanie izotopowo ciężkiej argininy i lizyny poprzez przesunięcie o 10 i 8 Daltonów w odpowiednich widmach m/z. Wbudowanie dla każdego aminokwasu powinno wynosić od 96 do 98%.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Zmieszać równoważne ilości (mg białek) próbek izotopowo ciężkich i lekkich.</li>
 <li>Rozcieńczyć próbkę 1:4 w 20% metanolu.</li>
 <li>Dodać trypsynę w stosunku 1:200. Inkubować przez noc w 37°C.</li>
 <li>Sprawdzić kompletność trawienia za pomocą SDS PAGE. Nałożyć 2 i 4 μl próbki przed trawieniem oraz 8 i 16 μl po trawieniu trypsyną. Zwizualizować za pomocą barwienia Coomassie, czy trawienie zostało zakończone. Jeśli nie jest kompletne, krótko poddać próbkę sonikacji za pomocą sonikatora z sondą i ponownie trawić trypsyną.</li>
 <li>Wysuszyć próbkę w wirówce odparowującej. Po wysuszeniu dodać 200 μl przefiltrowanej dH2O i mieszać w wirówce do całkowitego rozpuszczenia osadu. Ponownie wysuszyć próbkę w wirówce odparowującej. Ponownie resuspendować w dH2O. Ponownie wysuszyć próbkę.</li>
 <li>Resuspendować osad w 0,1% kwasie trifluorooctowym (TFA; Sigma). Sprawdzić za pomocą pasków pH, czy pH wynosi około 3. W razie potrzeby zakwasić 10% TFA.</li>
 <li>Odwirować ewentualny osad.</li>
 <li>Odsolić próbki na kolumience Waters Sep-Pak Vac 500 mg C18. Nie przeciążać tych kolumienek. Maksymalna ilość to 5 mg, lecz lepiej nałożyć nieco mniej. W razie potrzeby podzielić próbkę na kilka kolumienek.
 <ol>
 <li>Nawodnić kolumienkę 5 ml 100% acetonitrylu. Wirować przy ~200 x g lub minimalnej prędkości wymaganej do przepływu przez kolumienkę.</li>
 <li>Zrównoważyć kolumienkę 5 ml 0,1% TFA. Nałożyć próbkę. Zebrać przesącz i nałożyć ponownie.</li>
 <li>Przemyć 5 ml 0,1% TFA. Powtórzyć.</li>
 <li>Eluować 2 ml 60% acetonitrylu, 0,1% TFA.</li>
 <li>Wysuszyć próbkę w wirówce odparowującej.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
 Frakcjonowanie peptydów i izolacja fosfopeptydów
<ol>
<li>Peptydy są frakcjonowane na kolumnie HILIC. Używamy kolumny analitycznej TOSOH TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm z kolumną guardingową. Należy poświęcić odpowiednią ilość czasu na ten etap: kolumnę płucze się przez 2 godziny przy 90% A, a następnie przeprowadza dwa puste gradienty przed załadowaniem próbki. Przyjmuje się, że maksymalna ładowność kolumny o tej wielkości wynosi około XX; zazwyczaj nie ładujemy więcej niż 5 mg na jeden rozdział.</li>
<li>Rozpuszczalnik A – 98% ACN/0,1% TFA 
Rozpuszczalnik B – 2% ACN/0,1% TFA 
Załadunek w 90% A przez 20', przejście z 90% A do 85% A przez 5', z 85% A do 60% A przez 40', z 60% A do 0% A przez 5', z 0% A do 90% A przez 5'.</li>
<li>Prędkość przepływu wynosi 1ml/min, a frakcje są zbierane w odstępach 2-minutowych, zaczynając od gradientu od 85% A do 60% A.</li>
<li>Łączy się frakcje, aby zredukować ich liczbę do 10. Większa liczba frakcji prawdopodobnie zapewni szerszy zakres pokrycia fosfoproteomu.</li>
</ol>
Wzbogacanie fosfopeptydów
<ol>
<li>Fosfopeptydy są wzbogacane przy użyciu żelu PHOS-Select Iron Affinity. Żywicę IMAC rozdzielamy na alikwoty, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Należy przygotować 50 ml roztworu ładunkowego składającego się z 250 mM kwasu octowego i 30% ACN. pH należy dostosować do wartości 2,7 za pomocą HCl. Osady resuspensuje się w 500 μl roztworu ładunkowego. Należy sprawdzić pH i w razie potrzeby skorygować je za pomocą HCl lub NaOH.</li>
<li>W odpowiedniej kolumnie należy wstępnie przemyć 200 μl kulek IMAC. Stosujemy kolumny wirowkowe Molbiotec. 
Do każdej frakcji dodaje się 15 μl 50% zawiesiny (żel w roztworze ładunkowym) i inkubuje próbki przez 30' w rotatorze typu end-over-end. Przechowuje się przepływ do analizy.</li>
<li>Próbki przemywa się 3 razy roztworem ładunkowym i raz 500 μl filtrowanej dH2O.</li>
<li>Peptydy elui się przez 2-3 min przy użyciu 400 μl buforu 50 mM Na2HPO4 (pH 8,4). Eluat przenosi się do szklanej fiolki.</li>
<li>Roztwór zakwasza się do pH 3 za pomocą 5 μl 100% kwasu mrówkowego, zamraża szokowo w ciekłym azocie, a następnie osusza próbkę w wirówce próżniowej (speed vac).</li>
<li>Fosfopeptydy resuspensuje się w 200 μl 0,1% TFA i oczyszcza na kolumnie C18 zgodnie z opisem powyżej. Eluowane próbki osusza się w wirówce próżniowej.</li>
<li>Peptydy resuspensuje się w 20 μl 0,1% kwasu mrówkowego. Do analizy spektrometrem mas stosuje się 2 μl lub taką ilość, jaka jest wymagana.</li>
</ol>
Uwagi
W znacznej części niniejszego protokołu praca odbywa się „na ślepo”. Lizę komórek można monitorować za pomocą western blottingu oraz testów Bradforda lub BCA, a trawienie trypsyną można również łatwo ocenić. Kolumna HILIC wygeneruje ślad podobny do przedstawionego tutaj lub do tych opisanych przez innych autorów [1, 2], w zależności od użytego urządzenia do chromatografii cieczowej. Próbki są monitorowane za pomocą spektrometrii mas; przed przeprowadzeniem kosztownych analiz na urządzeniu o wysokiej rozdzielczości i wysokiej dokładności masy, należy przetestować próbki na tańszych urządzeniach, takich jak LCQ lub MALDI. Na koniec, jeśli odparowuje się próbkę zawierającą kwas, należy użyć szkła.

<ol><li>Albuquerque, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidimensional+chromatography+technology+for+in-depth+phosphoproteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).</li>
<li>McNulty, D. E., Annan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography+reduces+the+complexity+of+the+phosphoproteome+and+improves+global+phosphopeptide+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).</li>
<li>Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Gruhler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteomics+applied+to+the+yeast+pheromone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).</li>
<li>Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of fission yeast.</a> J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).</li>
<li>Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCX%2FIMAC+enrichment+approach+for+global+phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).</li>
<li>Jensen, S. S., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+impact+of+some+experimental+procedures+on+different+phosphopeptide+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).</li>
<li>Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li>
<li>Pinkse, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+isolation+at+the+femtomole+level+of+phosphopeptides+from+proteolytic+digests+using+2D-NanoLC-ESI-MS%2FMS+and+titanium+oxide+precolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns.</a> Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).</li>
<li>Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteome+analysis+using+a+dendrimer+conjugation+chemistry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry.</a> Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).</li>
<li>Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+the+analysis+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).</li>
<li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+distinct%2C+overlapping+segments+of+the+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome.</a> Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).</li>
</ol>

Metoda ta pozwoli na wzbogacenie frakcji fosfopeptydów, które można poddać analizie ilościowej. W niniejszym protokole można zmienić szereg parametrów, jednak najważniejszą kwestią jest zachowanie stanu fosforylacji. Przygotowanie komórek do analizy ilościowej można przeprowadzić na kilka różnych sposobów; na przykład w przypadku braku możliwości znakowania komórek in vivo, po ekstrakcji można zastosować tagi takie jak ICAT[3] lub ITRAC [4], aby różnicowo oznakować dwie hodowle na potrzeby analizy ilościowej.</p...

<table><tbody><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-arginina-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;,&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-lizyna-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>609021</td><td></td></tr><tr><td>GIBCO&amp;#8482; roztwór fosforanowo-buforowany (PBS) 7,4 (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki z inhibitorem proteaz SigmaFAST</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów fosfataz Pierce Halt</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Młyn kulowy Retsch PM100 </td><td>Retsch</td><td>20.540.0001</td><td></td></tr><tr><td>Stalowy naczynie mielące Retsch 125 ml</td><td>Retsch</td><td>01.462.0148</td><td></td></tr><tr><td>kolumna Ultramicrospin C18</td><td>Grupa Nest</td><td>SUM SS10</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak Vac 500 mg C18</td><td>Waters</td><td>WAT043395</td><td></td></tr><tr><td>kolumna analityczna TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>13071</td><td>Jest to kolumna chromatograficzna HILIC.</td></tr><tr><td>Kolumna ochronna 4,6 mm ID x 1 cm</td><td>Tosoh Corp.</td><td>19021</td><td>Zalecamy stosowanie tej kolumny ochronnej w celu przedłużenia żywotności kolumny HILIC.</td></tr><tr><td>PHOS-Select&amp;#8482; Żel powinowactwa do żelaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9740</td><td>Oto żywica IMAC. Należy ją podzielić na aalikwoty i przechowywać.</td></tr></tbody></table>

ilościowa fosfoproteomika w saccharomyces cerevisiae stymulowanych kwasami tłuszczowymi

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Niniejszy protokół opisuje hodowlę oraz stymulację kwasem tłuszczowym – oleinianem – komórek S. cerevisiae znakowanych izotopami ciężkimi i lekkimi. Komórki są rozcierane przy użyciu procedury kriolizy w młynku kulowym, a otrzymany materiał jest wprowadzany do roztworu poprzez solubilizację mocznikiem. Procedura ta umożliwia lizę komórek w stanie metabolicznie nieaktywnym, co pozwala na zachowanie stanu fosforylacji i zapobiega reorganizacji fosfoproteomu podczas lizy komórkowej. Po redukcji, alkilacji i trawieniu białek trypsyną, próbki są odsalane na kolumnach C18, a stopień ich złożoności jest ograniczany poprzez frakcjonowanie z wykorzystaniem chromatografii oddziaływań hydrofilowych (HILIC). Kolumny HILIC preferencyjnie zatrzymują cząsteczki hydrofilowe, co jest wysoce przydatne w fosfoproteomice. Peptydy fosforylowane mają tendencję do eluowania w późniejszym etapie profilu chromatograficznego niż ich niefosforylowane odpowiedniki. Po frakcjonowaniu fosfopeptydy są wzbogacane z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa do jonów metali, która opiera się na powinowactwie elektrostatycznym w celu wzbogacenia frakcji fosfopeptydów. Po zakończeniu tej procedury próbki są gotowe do analizy ilościowej metodą spektrometrii mas.

Opis ilościowej procedury fosforylacji z wykorzystaniem kriolizy, solubilizacji mocznikiem, frakcjonowania HILIC oraz wzbogacania peptydów fosforylowanych metodą IMAC.

Ilościowa fosfoproteomika w Saccharomyces cerevisiae stymulowanych kwasami tłuszczowymi

Niniejszy protokół opisuje hodowlę oraz stymulację kwasem tłuszczowym oleinianem komórek S. cerevisiae znakowanych izotopowo ciężko i lekko. Komórki są rozcierane ...

Fosforylacja jest kluczowym mechanizmem sygnalizacji komórkowej sterującym procesami od lokalizacji białek po transkrypcję DNA, a badanie samych grup fosforanowych za pomocą spektrometrii mas stanowi ekscytujący nowy postęp w badaniach nad sygnalizacją i proteomiką. Komórki z różnymi znacznikami poddaje się lizie w młynku kulowym, następnie redukcji, alkilacji, mieszaniu i trawieniu. Przetrawione peptydy są frakcjonowane za pomocą chromatografii oddziaływań hydrofilowych, a fosfopeptydy są wzbogacane z frakcji metodą wzbogacania iMac.Frakcje wzbogacone w fosfopeptydy są następnie identyfikowane za pomocą msm. Dzień dobry, jestem Ramsey Celine z grupy E w Instytucie Biologii Trwałości. Dzisiaj przedstawimy procedurę ekstrakcji metabolicznie znakowanych fosfopeptydów.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do ilościowych badań proteomu fossa. Przejdźmy zatem do realizacji. Procedura ta rozpoczyna się od hodowli komórek drożdży znakowanych izotopowo lekko i ciężko.Najpierw zaszczep 100 mililitrów pożywki bogatej pojedynczą kolonią komórek drożdży. Inkubuj tę kulturę przez noc do uzyskania OD 600 wynoszącej 1,0. Następnie wykorzystaj ją do zaszczepienia dwóch kultur po 1 litr pożywki minimalnej zawierającej pełny zestaw aminokwasów i uzupełnionej o 20 miligramów na litr izotopowo.Normalną lub izotopowo ciężką argininę i lizynę hoduj w obu kulturach o objętości jednego litra przez 18 godzin, aż do osiągnięcia OD 600 na poziomie 1,8. Jest to krytyczne, aby komórki przeszły przez co najmniej dziewięć generacji w celu pełnej inkorporacji znakowanych izotopów. Gdy komórki w pełni inkorporują znakowane izotopy, odwiruj komórki, które były hodowane w pożywce z izotopowo normalną argininą i lizyną.Aby otrzymać pellet komórkowy, należy przemyć pellet sterylną wodą, a następnie przenieść go do pożywki zawierającej oleinian oraz izotopowo lekką argininę i lizynę i stymulować przez 85 minut. W ten sposób otrzymuje się izotopowo lekką próbkę stymulowaną oleinianem. Druga hodowla, prowadzona w pożywce z izotopowo ciężką argininą i lizyną, nie jest stymulowana oleinianem i będzie służyć jako izotopowo ciężka próbka referencyjna hodowana na glukozie.Aby zebrać jeden litr, kulturę rozdziela się pomiędzy cztery 250 mililitrowe butelki do wirowania. Po wirowaniu komórki zbiera się do jednej probówki, usuwając medium tak, aby pozostało jedynie 100 mililitrów, a następnie resuspendując komórki i przenosząc je do kolejnej probówki. Na koniec zbiera się jeden duży osad w jednej probówce i wiruje go przez trzy minuty przy 4 000 RPM.Po usunięciu medium wagę butelki wirówkowej z osadem porównuje się z wagą pustej butelki wirówkowej. Po wirowaniu należy usunąć medium i odessać nadmiar cieczy z butelek, a następnie zważyć osady; typowa wydajność wynosi od jednego do dwóch gramów. Następnie osady należy gwałtownie zamrozić w ciekłym azocie i dodać do nich bufor do homogenizacji zawierający inhibitory proteaz i fosfataz.Objętość dodanego buforu do homogenizacji powinna być równoważna masie osadu. Zamrozić naczynie do homogenizacji w ciekłym azocie. Poczekać, aż ciekły azot przestanie wrzeć.Za pomocą szpachelki odłupać fragment osadu i przenieść go do naczynia mielącego zawierającego zamrożone kulki mielące. Mielić osad przy 600 RPM, stosując cykl jednominutowy z 22-sekundowym odwróceniem kierunku obrotów przez trzy minuty. Ponownie zamrozić naczynie mielące w ciekłym azocie.Powtórz proces mielenia jeszcze czterokrotnie, aby łączny czas trwał 15 minut. Czas mielenia kończy się, gdy obie próbki zostaną zmielone. Zbierz zamrożony materiał do probówek typu Falcon o pojemności 50 ml i przechowuj w zamrożeniu w ciekłym azocie lub w suchym lodzie.Przechowywać zmieloną datę w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Izolację i frakcjonowanie peptydów rozpoczyna się od ich alkilacji. Pierwszym krokiem jest solubilizacja próbki w roztworze mocznika.Rozpuść każdą próbkę zmielonej tkanki, dodając trzy objętości buforu mocznika na jedną objętość zamrożonej próbki. Na przykład, do granulatu o masie jeden gram dodaje się trzy mililitry buforu RIA. Z jednym mililitrem buforu PBS.Natychmiast poddaj mieszaninę sonikacji za pomocą sondy. Wykonaj sonikację końcówką. Trzymaj końcówkę blisko dna probówki, aby zapobiec pienieniu się roztworu.Zmielona tkanka powinna zostać niezwłocznie przeniesiona do roztworu. Odwiruj lizaty przy 6 000 RPM przez pięć minut w celu ich sklarowania. W temperaturze czterech stopni Celsjusza przenieś nadfiltr do nowych probówek.Aby rozpocząć reakcję redukcji, do każdej próbki dodaj świeżo przygotowany 0,5 molarny TRIS, dwa karboksylowe LITAL PHOSPHINE lub TCEP w rozcieńczeniu 1:100. Aby uzyskać końcowe stężenie TCEP wynoszące 5 milimolarnych, inkubuj próbki w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Po inkubacji w temperaturze 37 °C pozwól próbkom ostygnąć do temperatury pokojowej.Następnie należy dodać świeżo przygotowany 1 M acetamid jodowy do stężenia końcowego 20 mM i inkubować w ciemności przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinnej inkubacji reakcję z acetamidem jodowym należy przerwać, dodając 20 mM DTT. Próbkę pozostawić w temperaturze pokojowej na jedną godzinę.Zredukowane i alkilowane lizaty są teraz gotowe do trawienia trypsyną. Na tym etapie próbki lizatów mogą zostać wykorzystane do oznaczania ilości białka, analizy metodą SDS-PAGE w celu weryfikacji lizy komórek oraz analizy spektrometrycznej w celu potwierdzenia wbudowania ciężkich izotopów. Aby rozpocząć trawienie trypsyną, zmieszaj równoważne ilości próbek izotopowo ciężkich i lekkich.Rozcieńcz próbkę w stosunku jeden do czterech w 20%metanolu i dodaj trypsynę w rozcieńczeniu jeden do 200. Inkubuj próbkę przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia, po zweryfikowaniu całkowitego trawienia za pomocą elektroforezy SDS-PAGE i barwienia kumasy, odparuj próbkę w wirówce odparowującej (speed vac) do całkowitego wysuszenia.Dodaj 200 µL filtrowanej wody destylowanej i mieszaj w wortexie, aż osad całkowicie się rozpuści. Osusz próbkę w wirówce próżniowej (speedvac) i ponownie zawieś w wodzie destylowanej. Po ponownym osuszeniu próbki, zawieś osad w 0,1% kwasie trifluorooctowym (TFA); w razie potrzeby sprawdź paskami pH, czy wartość pH wynosi około 3. Zakwasz 10% TFA, aby wytrącić ewentualny osad.Próbka trawiona trypsyną zostanie teraz odsolona przy użyciu kolumny C 18 VAC 500 milligram firmy water set pack. W celu rozpoczęcia, należy nawilżyć kolumnę pięcioma mililitrami 100% acetonitrylu, wirując z prędkością około 200 ×g lub minimalną prędkością wymaganą do przepływu przez kolumnę. Następnie należy zrównoważyć kolumnę pięcioma mililitrami 0,1% TFA i nałożyć próbkę.Należy uważać, aby nie przeciążyć kolumny, a w razie potrzeby podzielić próbkę pomiędzy kilka kolumn. Przedmuchy należy zbierać do pojemnika na odpady, a następnie w razie potrzeby ponownie załadować kolumnę i przemyć ją pięcioma mililitrami 0,1% TFA. Powtórzyć to przemywanie i eluować dwiema mililitrami 60% acetonitrylu z 0,1% TFA; eluat (EEU) należy zebrać poprzez wirowanie.Osusz próbkę w wirówce próżniowej (speed vac), a następnie zawiesić osuszoną próbkę w 200 µL rozpuszczalnika B. Zawieszona próbka jest teraz gotowa do frakcjonowania peptydów. Przeprowadzić frakcjonowanie peptydów na kolumnie analitycznej TSK gel AMIDE 80 z kolumną zabezpieczającą. Wykonać ten krok z należytą starannością.Prowadź kolumnę przez dwie godziny przy 90% rozpuszczalnika A, a następnie przeprowadź dwa puste gradienty przed nałożeniem próbki. Zazwyczaj nie nakładamy więcej niż 5 mg na jeden cykl na kolumnę tej wielkości; nowoczesne, a nawet starsze urządzenia do chromatografii cieczowej umożliwiają zautomatyzowany wtrysk próbki, zbieranie frakcji, kontrolę szybkości przepływu oraz mieszanie gradientowe.Wartości te ustawia się na początku analizy zgodnie z opisem. Następnie ładuje się 90%A przez 20 minut, zmienia się proporcję z 90%A na 85%A w ciągu pięciu minut, z 85%A na 60%A w ciągu 40 minut, z 60%A na 0%a w ciągu pięciu minut oraz z 0%A na 90%a w ciągu pięciu minut. Przepływ ustawia się na 1 mL/min i zbiera frakcje w odstępach dwuminutowych.Zaczynając od gradientu od 85%A do 60%A, należy połączyć frakcje, aby zredukować ich liczbę do 10; zwiększenie liczby frakcji prawdopodobnie zapewni szerszy zakres pokrycia fosfoproteomu. Fosfopeptydy są wzbogacane za pomocą chromatografii powinowactwa do jonów metali. Jako żywicy iMac wykorzystujemy żel Phos Select Iron Affinity.W pierwszej kolejności Resus zawiesza pellety w 500 µL roztworu obciążającego. Następnie do każdej frakcji dodaje 15 µL 50% zawiesiny i inkubuje próbki przez 30 minut w rotacji end-over-end. Następnie przepływ jest zachowany do analizy.Próbkę przemyć trzykrotnie roztworem obciążającym, a po przemyciach raz 500 µL filtrowanej wody destylowanej; następnie eluować peptydy przez dwie do trzech minut przy użyciu 400 µL 50 mM buforu fosforanowego sodu. Eluowane peptydy przenieść do szklanej fiolki. Do peptydów dodać pięć µL 100% kwasu mrówkowego, aby zakwasić środowisko do pH 3; resuspender fosfopeptydy w 200 µL 0,1% TFA i ponownie odsolić za pomocą kolumny C 18 zgodnie z wcześniejszym opisem, a następnie odparować próbki po elucji w wirówce odparowującej (speed vac).Na koniec resuspenduj fosfopeptydy w 20 µL 0,1% kwasu mrówkowego. Próbki są teraz gotowe do analizy ilościowej za pomocą spektrometrii mas. Przedstawiony jest tutaj chromatogram z frakcjonowania całkowitych peptydów komórkowych z wykorzystaniem chromatografii H-I-L-I-C.Na tym zapisie można zaobserwować, że choć fosfopeptydy występują w całym profilu elucji, większość fosforylowanych reszt jest zatrzymywana niemal do końca tego profilu. Przedstawiliśmy właśnie sposób rozcierania komórek, trawienia białek, frakcjonowania peptydów oraz wzbogacania w fosfopeptydy przy użyciu chromatografii powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu fosforylacji oraz sprawdzaniu pH roztworów buforowych.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

quantitative-phosphoproteomics-fatty-acid-stimulated-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ilościowa fosfoproteinomika w stymulowanej kwasami tłuszczowymi Saccharomyces cerevisiae

W niniejszej pracy opisujemy nową ilościową technikę proteomiczną służącą do identyfikacji kompleksów białkowych u Saccharomyces cerevisiae. W badaniu tym wykorzystaliśmy metodę SILAC wraz z oczyszczaniem powinowactwowym, a następnie tandemową spektrometrią mas, aby z wysoką specyficznością zidentyfikować partnerów wiążących białko ER, Scs2p.

Identyfikacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

Opisujemy nową ilościową metodę lipidomiki służącą do identyfikacji licznych gatunków lipidów w drożdżach z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją przez elektroryś spray w trybie skanowania przeglądowego (ESI/MS). Metoda ta przewyższa obecnie dostępne metody identyfikacji i oznaczania ilościowego lipidów pod względem zdolności do rozdzielania różnych form cząsteczkowych lipidów, czułości oraz szybkości analizy.

Ilościowa ocena lipidomu drożdży z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją elektrorsprayową

Prezentowane są dwie uzupełniające się metody oparte na cytometrii przepływowej i mikroskopii, które umożliwiają ilościowe określenie, na poziomie pojedynczej komórki, dynamiki ekspresji genów indukowanej aktywacją szlaku MAPK u drożdży.

Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Wiele przewidywanych (fosfo)lipaz jest słabo scharakteryzowanych pod względem specyficzności substratowej i funkcji fizjologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół optymalizacji aktywności enzymów, poszukiwania naturalnych substratów i proponowania funkcji fizjologicznych tych enzymów.

Definiowanie specyficzności substratowej dla kandydatów na lipazę i fosfolipazę

Ten protokół opisuje procedurę ekstrakcji i wzbogacania fosfopeptydów z linii komórkowych lub tkanek raka prostaty w celu analizy fosfoproteomu za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Wzbogacanie fosfopeptydem w połączeniu z bezznacznikową ilościową spektrometrią mas w celu zbadania fosfoproteomu w raku prostaty

Prezentujemy protokół wykorzystujący chromatografię cieczową w połączeniu z tandemową spektrometrią mas do identyfikacji i ilościowego oznaczania głównych lipidów komórkowych u Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda ilościowej oceny głównych klas lipidów w komórce drożdży jest wszechstronna, solidna i czuła.

Analiza ilościowa lipidomu komórkowego Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Przedstawione tutaj jest podejście fosfoproteomiczne, a mianowicie fosfoproteomiczne oparte na końcówce do ekstrakcji stop and go, które zapewnia wysoką przepustowość i głębokie pokrycie fosfoproteomu Arabidopsis. Podejście to wyznacza przegląd sygnalizacji stresu osmotycznego u Arabidopsis.

Fosfoproteomiczna strategia profilowania sygnalizacji stresu osmotycznego u rzodkiewnika

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Tutaj przedstawiono protokół metabolicznego znakowania drożdży kwasem 14C-octowym, który jest sprzężony z chromatografią cienkowarstwową w celu oddzielenia obojętnych lipidów.

Analiza neutralnej syntezy lipidów w Saccharomyces cerevisiae za pomocą znakowania metabolicznego i chromatografii cienkowarstwowej

Tutaj wprowadzamy protokół do używania substratów z powierzchni drożdży do testów modyfikacji enzymatycznej. Platformę zademonstrowano, wykorzystując analizę aktywności defosforylacji fosfatazy tyrozynowej SHP-2 w stosunku do jednego z jej substratów jako reprezentatywny test modyfikacji enzymatycznej.

Modyfikacja enzymatyczna i cytometria przepływowa oceny białek powierzchniowych drożdży

Poznaj ilościową fosfoproteomikę w Saccharomyces cerevisiae stymulowanych kwasami tłuszczowymi. Metoda obejmuje kriolizę, frakcjonowanie HILIC i wzbogacanie IMAC do analizy fosfopeptydów.

Ilościowa fosfoproteomika w Saccharomyces cerevisiae stymulowanych kwasami tłuszczowymi

Przeglądaj więcej filmów