Metoda pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząstek
7 września 2009
Prezentujemy in vitro, dwukolorowy test fluorescencyjny, aby zobrazować fuzję pojedynczych cząsteczek wirusa z płynną dwuwarstwą docelową. Znakując cząsteczki wirusa fluoroforami, które w różny sposób barwią błonę wirusową i jej wnętrze, jesteśmy w stanie monitorować kinetykę hemifuzji i tworzenia porów.
Szkiełka nakrywkowe stosowane w tym teście są funkcjonalizowane dekstryną, a następnie włączane do mikroprzepływowych komórek przepływowych. Następnie każda komórka przepływowa jest inkubowana z zawiesiną liposomów, które łączą się, tworząc dwuwarstwę lipidową na uwodnionej dekstrynie. Pod mikroskopem fluorescencyjnym dodaje się wirusa znakowanego fluoro czterema i streptawidynę znakowaną fluoresceiną, a następnie wirusa pozwala się zadokować do dwuwarstwy.
Napływ kwaśnego buforu inicjuje fuzję wirusa z dwuwarstwą, a kamera cyfrowa rejestruje zmiany fluorescencji podczas całego testu. Cześć, nazywam się Daniel Floyd i pracuję w laboratorium Anine Vanian na Wydziale Chemii Biologicznej i Farmakologii Molekularnej na Uniwersytecie Harvarda. Dzisiaj pokażę Wam metodę wizualizacji kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczej cząsteczki.
Używamy tej procedury w laboratorium, aby zbadać, w jaki sposób wirus dostaje się do komórek gospodarza. Więc zacznijmy. Rozpocznij ten protokół od przygotowania szkiełek nakrywkowych funkcjonalizowanych dekstryną.
Pierwszym krokiem jest sonikacja szkiełek nakrywkowych w roztworach 10% detergentu, jednego molowego wodorotlenku potasu acetonu i 100% sonikatu etanolu przez 30 minut na roztwór. I spłucz wodą dejonizowaną między operacjami. Po ostatniej sonikacji opłucz szkiełka nakrywkowe w wodzie, a następnie wysusz je w inkubatorze o temperaturze 80 stopni Celsjusza.
Następnie umieść szkiełka nakrywkowe w urządzeniu do usuwania powłok z plazmy tlenowej na trzy minuty. Ten etap utlenia powierzchnię szkiełek, dzięki czemu szkło staje się jednolicie hydrofilowe i reaktywne w kolejnych etapach silosowania. Następnie zanurz szkiełka nakrywkowe w świeżym roztworze 0,2% gly oxy propyl trimeth oxypro trim methoxy w izopropanolu i inkubuj przez pięć minut.
Następnie kilkakrotnie spłucz szkiełka nakrywkowe izopropanolem. Szkiełka nakrywkowe z powłoką Slan należy umieścić w temperaturze 80 stopni Celsjusza na jedną godzinę. Aby utwardzić, ten krok pozwala slanowi kowalencyjnie związać się ze szkłem.
Po utwardzeniu ułóż szkiełka nakrywkowe płasko po wewnętrznej stronie plastikowego pudełka do zamrażania. Przykryj górną powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego około jednym mililitrem roztworu dekstryny. 30% wagowo na objętość w wodzie.
Zamknij zamrażarkę i pozostaw szkiełka nakrywkowe w cichym miejscu na 24 do 36 godzin. Następnego dnia odlej nadmiar dekstryny, chwytając szkiełka nakrywkowe plastikowymi kleszkami i włóż je z powrotem do ceramicznego stojaka. Opłucz je kilkakrotnie wodą i pozwól im moczyć się w wodzie przez 48 godzin.
Pojemnik można delikatnie wymieszać na rotatorze stołowym, wysuszyć szkiełka nakrywkowe w piekarniku nastawionym na 80 stopni Celsjusza i przechowywać w odkurzaczu, osuszyć, aż będziesz gotowy do następnego kroku. Powlekanie szkiełek nakrywkowych mieszaniną liposomów w celu utworzenia dwuwarstwy strugarki. Następnym krokiem jest przygotowanie liposomów do utworzenia dwuwarstwy lipidowej w kapturze, połączenie wszystkich lipidów rozpuszczonych w chloroformie w szklanej probówce.
Preparat liposomowy zawiera stronę zwojów dia, która wiąże cząsteczki wirusa oraz biotynylowany lipid, który wiąże sprzężony ze streptawidyną wskaźnik pH fluoresceinę. Następnie odparować rozpuszczalnik pod strumieniem argonu lub azotu. I usuń pozostały rozpuszczalnik, pozostawiając probówkę w próżniowym osuszaczu na dwie godziny.
Ponownie zawiesić wysuszoną folię lipidową w 400 mikrolitrach buforu HNE. Następnie przenieś zawiesinę do plastikowej probówki z mikrowirówką. Zawiesinę zamrozić w kąpieli ciekłego azotu i rozmrozić w ciepłej łaźni wodnej.
Powtórz ten cykl zamrażania i rozmrażania cztery razy po cyklach zamrażania i rozmrażania. Użyj wytłaczarki lipidowej wyposażonej w filtr membranowy o długości 100 nanometrów, aby wytłoczyć zawiesinę lipidową. 25 razy po wytłoczeniu zawiesina powinna wydawać się bardziej przezroczysta.
Przechowuj liposomy w temperaturze pokojowej i wykorzystaj dzień przygotowania. Teraz, gdy lipidy są gotowe do pracy, przygotuj mikroprzepływową komórkę przepływową. Najpierw weź szkiełko kwarcowe o wymiarach 20 na 20 na trzy milimetry i użyj diamentowego zadzioru, aby wywiercić dwa jednomilimetrowe otwory po przeciwnych stronach.
Wytnij kwadrat o średnicy 20 milimetrów z arkusza podwójnej taśmy klejącej i za pomocą żyletki. Wytnij odcinek o wymiarach 15 na dwa milimetry od środka. Odklej jedną stronę podkładu taśmy i przyklej taśmę do szkiełka kortowego.
Przyklej drugą stronę do funkcjonalnego szkiełka nakrywkowego, teraz przyciętego na 20 centymetrów długości rurki polietylenowej i włóż je do otworów w szkiełku kwarcowym. Na koniec uszczelnij komorę przepływową pięciominutowym klejem epoksydowym. Rozprowadź klej po bokach szkiełka kwarcowego, aby przykleić go do szkiełka nakrywkowego.
Użyj jeszcze dwóch kropli kleju, aby uszczelnić połączenie między rurką a zjeżdżalnią kwarcową. Po utwardzeniu kleju zagruntować komorę przepływową i rurki buforem HNE. Następnie, aby utworzyć podpartą dwuwarstwę lipidową, weź ekstrudowaną zawiesinę liposomową i wciągnij około 80 mikrolitrów do kanałów w dniu poprzedzającym eksperyment fuzji.
Rozpocznij znakowanie cząsteczek wirusa, aby oznaczyć wnętrze wirusa na czerwono. Połączyć 20 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu siarki, żwacza lub SRB z 10 mikrolitrami zawiesiny wirusa i pozostawić w temperaturze pokojowej na 20 godzin. Następnego dnia usuń nadmiar barwnika, przepuszczając zawiesinę wirusa przez kolumnę odsalającą PD 10 i rozcieńczając 800 mikrolitrami buforu HNE.
Kolumna powinna mieć wyraźny kolorowy pasek, który zawiera oznaczonego wirusa. Zbierz tę frakcję podczas etapu ellucjańskiego, a następnie oznacz otoczkę wirusa na zielono, dodając 13 mikrolitrów kalkomanią Octa, RUMINE one 10 lub RH one 10 C 18 do zawiesiny wirusowej znakowanej SRB. Wymieszać zawiesinę, podłączając probówkę do rotatora laboratoryjnego i pozostawić na trzy godziny.
Następnie usuń nadmiar wilgotności względnej 10 C 18 za pomocą kolumny odsalającej PD 10. Tak jak poprzednio, teraz wirus jest gotowy do testu fuzyjnego. Wykonaj test kinetyki fuzji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw immersyjny z olejkiem o dużej aperturze numerycznej.
Laser kryptonowy Argonne wzbudza czwórki fluorowe w błonie wirusowej i wnętrzu. Lustro dichroiczne następnie rozdziela emisje czerwonej i zielonej fluorescencji i niezależnie skupia obrazy na oddzielnych połówkach kamery CCD zwielokrotniającej elektrony lub kamery ze sprzężeniem ładunkowym. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopu i podłącz rurkę wylotową do pompy strzykawkowej ustawionej na przepływ 100 mikrolitrów na minutę.
Oczyść kanały przepływowe z nadmiaru liposomów, przepływając w 300 mikrolitrach HNE. Ustaw ostrość mikroskop i dostosuj moc lasera, aby oświetlić powierzchnię 350 watami na centymetr kwadratowy światła 488 nanometrów, aby wzbudzić czerwoną florę, czterema i 70 watami na centymetr kwadratowy światła 568 nanometrów, aby wzbudzić zieloną florę. Cztery. Teraz, gdy mikroskop jest gotowy, wirus oznakowany pompą rozcieńcza od jednego do stu do komory przepływowej.
Gdy wirus dyfunduje na dolną powierzchnię kanału przepływowego, cząsteczki zaczynają dokować. Przyklejone do strony zwojów DIA, wkomponowane w szkiełka nakrywkowe, płaskie dwuwarstwowe. Gdy gęstość zadokowanych cząstek osiągnie około kilkuset cząstek na pole widzenia, zacznij płynąć w roztworze dwóch mikrogramów na mililitr.
Streptawidyna znakowana fluoresceiną, fluorofor wrażliwy na pH, ponieważ znakowana streptawidyna wiąże się z cząsteczkami lipidów sprzężonymi z biotyną w dwuwarstwie. Ponownie pojawia się przyćmione zielone tło, przemyj kanał przepływu 300 mikrolitrami HNE. Teraz, gdy wirusy zadokowały, a powierzchnia dwuwarstwy jest pokryta fluoresceiną, nadszedł czas, aby rozpocząć test.
Wybierz obszar obrazowania, ustaw ostrość mikroskopu i przygotuj kamerę CCD do akwizycji obrazu poklatkowego. Ustaw czas naświetlania na 100 milisekund i zbieraj klatki z częstotliwością 10 herców. Zainicjuj fuzję błony wirusa, przepływając w kwaśnym buforze cytrynianu sodu.
Wraz ze spadkiem pH fluoresceina fluorescencja słabnie, wskazując czas zakwaszenia. Kamera CCD rejestruje dane przez cały czas trwania testu, które można wykorzystać do określenia czasu fuzji hemi i słabego powstawania, jak udokumentowała kamera CCD. Po spadku pH pojawiają się wybuchy zielonej fluorescencji, gdy błony wirusa i planera łączą się, lipidy mieszają się, a zielony barwnik w otoczce wirusa jest rozcieńczany w błonie płaskiej.
W przeciwieństwie do tego, po spadku pH następuje zanik czerwonej fluorescencji, ponieważ błony wirusowe i lipidowe tworzą pory, umożliwiając czerwonemu barwnikowi z wnętrza wirusa ucieczkę do przestrzeni wodnej poniżej płaskiej dwuwarstwy i poza zasięgiem wzroku, trendy te można również uwidocznić za pomocą zdjęć fluorescencyjnych przed i podczas fuzji. Na wykresie należy również przedstawić trajektorie intensywności fluorescencji dla każdej cząstki, jak pokazano w tym przykładzie, fuzja Hemi jest zdefiniowana jako punkt, w którym nachylenie intensywności zielonej fluorescencji znajduje się w najbardziej stromym momencie tworzenia porów jako punkt, w którym następuje rozpad czerwonej fluorescencji. Połączone dane z wielu eksperymentów w celu wygenerowania histogramów fuzji hemi i czasów opóźnienia tworzenia porów, jak pokazano tutaj, wykorzystując czas spadku pH jako t równy zero w celu zsynchronizowania danych z różnych eksperymentów.
Właśnie pokazałem wam sposób na zmierzenie kinetyki fuzji wirusów na poziomie pojedynczej cząsteczki. Podczas wykonywania tej procedury. Upewnij się, że używasz czystych szkiełek nakrywkowych, aby uzyskać jednorodną i płynną dwuwarstwę.
Staraj się również zminimalizować ilość światła używanego podczas obrazowania fluorescencyjnego, aby zminimalizować uszkodzenia fotograficzne. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia dwukolorowy test fluorescencyjny in vitro, zaprojektowany w celu wizualizacji fuzji pojedynczych cząstek wirusowych z płynną dwuwarstwą lipidową celu. Dzięki zastosowaniu fluoroforów barwiących różne składniki cząstek wirusowych możliwe jest skuteczne monitorowanie kinetyki hemifuzji oraz tworzenia się porów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirusologia
- Mikroskopia fluorescencyjna
- Chemia biofizyczna
Wstęp
- Zrozumienie fuzji wirusowej jest kluczowe dla opracowania strategii przeciwwirusowych.
- Analiza pojedynczych cząstek dostarcza informacji na temat dynamiki oddziaływań wirusowych.
- Techniki fluorescencyjne umożliwiają obserwację zdarzeń molekularnych w czasie rzeczywistym.
- Metoda ta zwiększa rozdzielczość kinetyki fuzji w porównaniu do analiz zbiorczych.
Cel badania
- W celu wizualizacji procesu fuzji pojedynczych cząsteczek wirusa.
- W celu analizy kinetyki hemifuzji i tworzenia porów.
- W celu pogłębienia zrozumienia mechanizmów wnikania wirusów.
Zastosowane metody
- Funkcjonalizacja szkiełek podstawowych dekstryną.
- Montaż szkiełek podstawowych w mikroprzepływowych komorach pomiarowych.
- Inkubacja z liposomami w celu utworzenia lipidowej dwuwarstwy.
- Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania procesów fuzji wirusowej.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząsteczek.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym kinetyki hemifuzji i tworzenia się porów.
- Demonstracja czułości i specyficzności analizy.
- Wgląd w mechanizmy wnikania wirusów do komórek gospodarza.
Wnioski
- Dwu kolorowy test fluorescencyjny jest cennym narzędziem do badania fuzji wirusowej.
- Metodę tę można zastosować do różnych typów wirusów w celu uzyskania szerszych informacji.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę do analizy skuteczności leków przeciwwirusowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowy pomiar kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząsteczek wypełnia istotną lukę w rozumieniu mechanistycznej sekwencji wnikania wirusów, co pozwala na uzyskanie wyższego poziomu pewności prognostycznej podczas walidacji celów w poszukiwaniu leków przeciwwirusowych. Test ten dostarcza szczegółowych danych kinetycznych, które pomagają we wczesnym etapie ograniczania ryzyka i wspierają decyzje dotyczące portfela badań poprzez rozróżnianie produktów pośrednich fuzji oraz czasu ich trwania. Podejście to zwiększa ciągłość translacyjną, prowadząc od wglądu w mechanizmy do dopasowania modeli przedklinicznych w badaniach i rozwoju skoncentrowanych na wirusologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę mechanizmów wnikania wirusów na poziomie molekularnym.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez rozróżnienie etapów hemifuzji i tworzenia porów.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki ilościowym pomiarom czasu życia produktów pośrednich fuzji.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie wyboru i selekcji celów przeciwwirusowych.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Tworzy walidowaną, powtarzalną platformę do ilościowego oznaczania zdarzeń fuzji pojedynczych cząsteczek.
- Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe wyniki dla dalszych etapów procesów przesiewowych związków.
- Umożliwia skalowalność testu oraz ponowne wykorzystanie platformy dla różnych systemów wirusowych.
- Wspiera wiarygodną ocenę inhibitorów fuzji oraz sond mechanistycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje mechanistyczne dane dotyczące fuzji z procesami wnikania wirusów istotnymi w przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość od mechanistycznych odkryć na etapie poszukiwań do walidacji w modelach przedklinicznych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o rozwoju kandydatów na leki przeciwwirusowe celujących w etapy fuzji, w oparciu o ocenę ryzyka.
- Wspiera rozwój biomarkerów translacyjnych poprzez powiązanie sygnatur kinetycznych z efektami funkcjonalnymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten test fuzji pojedynczych cząstek wpisuje się w continuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, łącząc badania mechanistyczne z badaniami translacyjnymi w obszarze B+R nad lekami przeciwwirusowymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków mechanizmów wnikania wirusów.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty do oceny związków i standaryzacji testów.
- Analityka: Umożliwia wyznaczenie parametrów kinetycznych i rozkładów statystycznych dla produktów pośrednich fuzji.
- Badania translacyjne: Łączy mechanistyczną kinetykę fuzji z walidacją modeli przedklinicznych i dopasowaniem biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje reużywalną platformę testową, którą można dostosować do wielu celów wirusowych i szlaków wnikania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów wirusowych.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne pomiary kinetyczne pojedynczych cząstek.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji go/no-go oraz efektywne pod kątem kapitałowym zarządzanie portfolio w odkrywaniu leków przeciwwirusowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów celujących w fuzję wirusową.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej oraz analizy pojedynczych cząstek.
- Wymaga dostępu do wysokoczułego oprzyrządowania obrazowego oraz infrastruktury mikrofluidycznych komór przepływowych.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów znakowania i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych systemów wirusowych może wymagać optymalizacji wyboru fluoroforów oraz składu dwuwarstwy.
- Uszkodzenia fotochemiczne oraz jednorodność dwuwarstwy stanowią ograniczenia praktyczne, które muszą być kontrolowane w celu zapewnienia wiarygodności analizy.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) z zakresu biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Introduction
1:12
Preparing Dextran-Functionalized Coverslips
4:29
Preparing the Liposomes
8:28
Labeling the Virus Particles
6:41
Setting Up the Microfluidic Flow Cell
10:16
Observing Viral Fusion Kinetics Under the Microscope
13:10
Viral Hemifusion and Pore Formation Data: Microscope Footage, Fluorescence Intensity Trajectories, and Lag Times for Viral Hemifusion and Pore Formation
14:30
Conclusion
