Name: Metoda pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząstek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: Poznaj metodę pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząstek przy użyciu dwukolorowej fluorescencji. Technika ta umożliwia wizualizację hemifuzji i formowania porów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez granty NIH AI57159 (dla S.C.H.) oraz AI72346 (dla A.M.v.O.). S.C.H. jest badaczem w Howard Hughes Medical Institute.

Funkcjonalizacja szklanych lamellek
Planarna dwuwarstwa użyta w teście fuzji jest wspierana na uwodnionym filmie z dekstranu. Dekstran pełni rolę dystansera między planarną dwuwarstwą a powierzchnią szkła. Zapobiega to przywieraniu komponentów błony do powierzchni szklanej oraz zapewnia przestrzeń, do której zawartość cząstki wirusa może przedostać się w momencie fuzji. Szklane szkiełka podstawowe są funkcjonalizowane poprzez traktowanie silanem epoksydowym, co pozwala na chemiczne związanie dekstranu ze szkłem (Elender, et al. 1996).
<ol>
<li>Umieścić szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm w ceramicznym statywie do barwienia, a następnie włożyć statyw do słoika lub zlewki.</li>
<li>Napełnić naczynie 10% roztworem detergentu do szkła laboratoryjnego. Umieścić naczynie w myjce ultradźwiękowej na 30 minut.</li>
<li>Przepłukać naczynie i statyw ze szkiełkami wodą dejonizowaną, a następnie napełnić 1M wodorotlenkiem potasu. Ponownie umieścić naczynie w kąpieli ultradźwiękowej na kolejne 30 minut.</li>
<li>Powtórzyć tę procedurę czyszczenia, używając acetonu i etanolu.</li>
<li>Przepłukać szkiełka nakrywkowe wodą i osuszyć.</li>
<li>Na koniec oczyścić szkiełka nakrywkowe w urządzeniu do trawienia plazmą tlenową przez trzy minuty.</li>
<li>Ostatni etap czyszczenia utlenia powierzchnię, sprawiając, że szkło staje się jednorodnie hydrofilowe i reaktywne w kolejnych etapach silanizacji.</li>
<li>Przygotować 0,2% roztwór 3-glikydoksypropyltrimetoksysilanu w izopropanolu. Zanurzyć szkiełka nakrywkowe w tym roztworze na pięć minut.</li>
<li>Wylać roztwór silanu i kilkakrotnie przepłukać szkiełka nakrywkowe izopropanolem.</li>
<li>Szkiełka nakrywkowe są teraz pokryte warstwą silanu, jednak muszą zostać utwardzone, aby silan mógł utworzyć wiązania kowalencyjne ze szkłem. Umieścić szkiełka nakrywkowe w piekarniku ustawionym na 80 °C na jedną godzinę.</li>
<li>Podczas utwardzania szkiełek odważyć dekstran 500 i przygotować 30% (w/v) roztwór. Podgrzanie wody ułatwi rozpuszczanie. Na każde szkiełko zużyjemy około 1 ml tego roztworu. Po rozpuszczeniu dekstranu odgazować roztwór w eksykatorze próżniowym.</li>
<li>Po zakończeniu utwardzania silanizowanych szkiełek wyjąć je z ceramicznego statywu i ułożyć płasko wewnątrz plastikowego pudełka do zamrażarki. Za pomocą pipety 1 ml pokryć górną powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego ok. 1 ml roztworu dekstranu. Zamknąć pudełko i pozostawić w spokojnym miejscu na 24-36 godzin.</li>
<li>Trzymając szkiełka nakrywkowe plastikową pęsetą, odlać nadmiar dekstranu i umieścić je z powrotem w ceramicznym statywie. Kilkakrotnie przepłukać szkiełka nakrywkowe wodą, a następnie pozostawić je w wodzie do namoczenia na 48 godzin. Słoik można delikatnie mieszać na rotatorze stołowym.</li>
<li>Osuszyć szkiełka nakrywkowe w piekarniku ustawionym na 80 °C i przechowywać w eksykatorze próżniowym.</li>
</ol>
Przygotowanie liposomów
Wsparte dwuwarstwy lipidowe są tworzone poprzez adsorpcję liposomów do zfunkcjonalizowanego dekstranem szkiełka podstawowego. Zaadsorbowane liposomy łączą się ze sobą, aż do momentu pęknięcia błony i jej rozprzestrzenienia płasko po powierzchni.
<ol>
<li>Typowa formulacja liposomów stosowana w tym teście składa się z 1,2-dioleoil- sn- glicero-3-fosfocholin (DOPC), 1-oleoil-2-palmitoil- sn- glicero-3-fosfocholin (POPC), cholesterolu, bydlęcego disialogangliozydy mózgowego (GD1a) oraz N-((6-(biotynoilo)amino)heksanoilo)-1,2-diheksadekanoil- sn- glicero-3-fosfoetanolaminy w stosunku 4:4:2:0,1:5x10-5. Wszystkie składniki są przechowywane w roztworach chloroformu lub chloroformu i metanolu.</li>
<li>Przygotować mieszaninę zawierającą dwa mikromole lipidów, przenosząc odpowiednie objętości każdego składnika do szklanej probówki. Odparować rozpuszczalnik w strumieniu argonu lub azotu. Usunąć pozostały rozpuszczalnik, pozostawiając probówkę w deskryptorze próżniowym przez dwie godziny.</li>
<li>Resuspender wysuszony film lipidowy w 400 µL buforu HNE (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, 0,1 mM EDTA).</li>
<li>Przenieść zawiesinę do plastikowej probówki do mikrocentryfugi. Zamrozić zawiesinę w kąpieli z ciekłym azotem, a następnie rozmrozić w ciepłej kąpieli wodnej. Powtórzyć ten cykl zamrażania i rozmrażania cztery razy.</li>
<li>Złożyć ekstruder lipidowy z filtrem membranowym z poliwęglanu o porach 100 nm i poddać zawiesinę lipidową ekstruzji 25 razy. Po ekstruzji zawiesina powinna stać się bardziej przezroczysta.</li>
<li>Liposomy należy wykorzystać w dniu ich przygotowania. Do momentu użycia mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Przygotowanie mikrofluidycznej celi przepływowej
Prostą mikrofluidyczną komorę przepływową wykonuje się poprzez umieszczenie dwustronnej taśmy klejącej pomiędzy szkiełkiem kwarcowym a funkcjonalizowanym szkiełkiem nakrywką.
<ol>
<li>Należy przygotować kwarcową płytkę o wymiarach 20x20x3 mm. Za pomocą diamentowego wiertła należy wywiercić dwa otwory o średnicy 1 mm po przeciwnych stronach.</li>
<li>Z arkusza dwustronnej taśmy klejącej należy wyciąć kwadrat o boku 20 mm, a następnie za pomocą żyletki wyciąć z jego środka sekcję o wymiarach 15 x 2 mm.</li>
<li>Należy odkleić papier zabezpieczający z jednej strony taśmy i przykleić ją do kwarcowej płytki. Drugą stronę należy przykleić do funkcjonalizowanej lamellki.</li>
<li>Należy odciąć dwa odcinki rurki polietylenowej o długości 20 cm i wprowadzić je do otworów w kwarcowej płytce.</li>
<li>Komorę przepływową należy uszczelnić 5-minutowym klejem epoksydowym.</li>
<li>Po utwardzeniu kleju należy napełnić komorę przepływową i rurki buforem.</li>
<li>Na tym etapie można utworzyć wspieraną dwuwarstwę lipidową, zaciągając około 80 µL zawiesiny liposomów do kanałów.</li>
</ol>
Znakowanie cząsteczek wirusa
<ol>
<li>Do testu fuzji zazwyczaj wykorzystuje się wirusa grypy A H3N2 (X-31), jednak pomyślnie stosowano również inne szczepy grypy oraz inne wirusy.</li>
<li>Wirus jest znakowany do dwóch różnych barwników fluorescencyjnych, co pozwala na detekcję hemifuzji i tworzenia się porów.</li>
<li>Rozpuścić sulforodaminę B (SRB) w buforze HNE w celu przygotowania roztworu 20 mM. Połączyć 20 µL roztworu barwnika z 10 µL zawiesiny wirusowej i pozostawić w temperaturze pokojowej na 20 godzin. W tym czasie barwnik będzie powoli gromadzić się wewnątrz cząsteczek wirusa.</li>
<li>Usunąć nadmiar barwnika, przepuszczając zawiesinę wirusową przez kolumnę odsalającą PD-10. Jeśli użyto wystarczającej ilości materiału wirusowego, w kolumnie widoczny będzie kolorowy prążek. Prążek ten zawiera znakowany wirus i może zostać zebrany podczas elucji.</li>
<li>W przypadku braku widocznego prążka, zbierać frakcje o objętości 200 µL i określić, które z nich zawierają znakowany wirus, mierząc absorbancję przy 565 nm na spektrofotometrze. Wirus powinien zostać eluowany w całkowitej objętości około 0,8 ml.</li>
<li>Zznakować otoczkę wirusa, dodając 13 µL roztworu oktadecylrodaminy 110 (Rh110C18) o stężeniu 2 mM w dimetylformamidzie (DMF) do zawiesiny wirusa znakowanego SRB.</li>
<li>Mieszać zawiesinę, mocując probówkę w rotatorze laboratoryjnym, i pozostawić na 3 godziny.</li>
<li>Oczyścić wirusa z nadmiaru Rh110C18, używając kolumny odsalającej PD-10 zgodnie z wcześniej opisaną procedurą.</li>
</ol>
Konfiguracja mikroskopu
Eksperyment jest przeprowadzany na mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w obiektyw imersyjny olejowy o wysokiej aperturze numerycznej (NA), odpowiednim do mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Linie 488 i 568 nm z gazowego lasera argonowo-kryptonowego są wykorzystywane do wzbudzenia wirusa znakowanego Rh110C18 i SRB. Jednoczesne obrazowanie każdego znacznika jest realizowane poprzez rozdzielenie zielonej i czerwonej emisji fluorescencji za pomocą lustra dichroicznego i niezależne ogniskowanie obrazów na oddzielnych połowach kamery CCD z mnożeniem elektronów.
Wykonanie analizy
Przeprowadzenie testu fuzji obejmuje etapową aplikację komponentów biochemicznych wewnątrz celi przepływowej: utworzenie planarnej dwuwarstwy lipidowej, dokowanie znakowanych cząstek wirusa, pokrycie powierzchni fluoresceiną oraz zainicjowanie reakcji za pomocą buforu o niskim pH (Rysunek 1A).
<ol>
<li>Zamocuj celę przepływową na stoliku mikroskopu i podłącz rurkę wylotową do pompy strzykawkowej ustawionej na przepływ z prędkością 40 µL/min.</li>
<li>Oczyść kanały przepływowe z nadmiaru liposomów, przepływając 300 µL HNE.</li>
<li>Ustaw ostrość mikroskopu i dostosuj moc lasera tak, aby oświetlić powierzchnię natężeniem 350 W/cm2 światła o długości fali 488 nm oraz 70 W/cm2 światła o długości fali 568 nm. W przypadku użycia obiektywu imersyjnego olejowego 60x o aperturze NA 1,45, ustaw natężenie laserów odpowiednio na 100 µW i 20 µW.</li>
<li>Wprowadź za pomocą pompy znakowany wirus (rozcieńczony 1/100) do celi przepływowej. W miarę dyfuzji wirusa do dolnej powierzchni kanału przepływowego, cząsteczki zaczną przylegać do gangliozydu wbudowanego w lipidową dwuwarstwę.</li>
<li>Po osiągnięciu odpowiedniej gęstości zakotwiczonych cząsteczek wirusa (do około 1000 cząsteczek na pole widzenia), przełącz rurkę wlotową na roztwór zawierający 2 µg/mL streptawidyny znakowanej fluoresceiną. Znakowana streptawidyna zwiąże się z cząsteczkami lipidów sprzężonymi z biotyną w dwuwarstwie, w wyniku czego widoczne będzie słabe zielone tło.</li>
<li>Przemyj kanał przepływowy 300 µL HNE.</li>
<li>Wybierz obszar obrazowania, ustaw ostrość mikroskopu i przygotuj kamerę CCD do akwizycji obrazów w odstępach czasu (time-lapse). Ustaw czas ekspozycji na 100 ms i zbieraj klatki z częstotliwością 10 Hz.</li>
<li>Inicjuj fuzję, wprowadzając bufor kwaśny zawierający 10 mM cytrynianu sodu i 140 mM NaCl. pH buforu powinno być dostosowane tak, aby znajdowało się poniżej krytycznego pH wirusa poddanego badaniu. Wirus X-31 ulega fuzji przy pH poniżej 5,5.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1B przedstawia migawki wirionów zadokowanych do dwuwarstwy przed i w trakcie fuzji. Każda plamka ograniczona dyfrakcyjnie reprezentuje pojedynczą cząstkę wirusa. Fluorescencja czerwona i zielona została oddzielnie odwzorowana na górnej i dolnej połowie kamery CCD, co umożliwia jednoczesną obserwację otoczki wirusowej oraz markerów zawartości. W kanale zielonym zazwyczaj występuje dwa razy więcej plamek niż w czerwonym, co odzwierciedla niższą wydajność znakowania barwnikiem zawartości w porównaniu z markerem otoczki. Zielona fluorescencja tła emitowana przez związaną z powierzchnią fluoresceinę znika po dodaniu buforu cytrynianowego, co pozwala wyznaczyć czas rozpoczęcia reakcji fuzji. Zdarzenia hemifuzji są wykrywane jako rozbłyski fluorescencji zielonej, gdy wygaszony Rh110C18 w otoczce wirusowej dyfunduje przez szyjkę hemifuzji i ulega rozcieńczeniu w membranie planarnej. Wokół cząstek w stanie hemifuzji widoczna jest rozszerzająca się na zewnątrz chmura fluorescencyjna, co świadczy o swobodnej dyfuzji barwnika związanego z grupą acylofattylową w membranie planarnej. Formowanie porów obserwuje się jako zanik fluorescencji czerwonej pochodzącej z SRB uwięzionego wewnątrz cząstek wirusowych. Otwarcie poru fuzyjnego pozwala barwnikowi na ucieczkę do przestrzeni wodnej poniżej planarnej dwuwarstwy i poza obszar obserwacji.
Trajektorie intensywności fluorescencji dla każdej cząsteczki, wykreślone na podstawie zintegrowanych intensywności poszczególnych cząsteczek, ułatwiają wyznaczenie wydajności oraz czasu hemifuzji i tworzenia się porów (Ryc. 1C). Moment zdarzeń hemifuzji i tworzenia się porów określa się jako punkt, w którym występuje maksymalne nachylenie impulsu fluorescencji Rh110C18 lub spadku sygnału SRB. W udanym eksperymencie około 50% cząsteczek znakowanych Rh110C18 generuje sygnały odwygaszania fluorescencji (dequenching), a 30% cząsteczek znakowanych SRB daje sygnał nadający się do analizy. Spośród cząsteczek znakowanych obydwoma barwnikami, około 10% wykazuje sygnały zarówno mieszania lipidów, jak i tworzenia się porów.
Ryc. 2A-C przedstawia rozkład czasów opóźnienia hemifuzji i tworzenia porów w typowym doświadczeniu. Ryc. 2D-F pokazuje rozkłady zdarzeń połączone z pięciu doświadczeń przeprowadzonych w tych samych warunkach. Nawet przy niewielkiej liczbie obserwacji kształt histogramów jest wyraźny. Ponieważ każde doświadczenie jest synchronizowane poprzez detekcję czasu spadku pH, można łączyć wiele doświadczeń i uzyskiwać szczegółowe informacje o etapach pośrednich ograniczających szybkość reakcji.
<img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1a.jpg" border="0" alt="Schemat mikroskopii wirusa grypy; znakowanie barwnikami fluorescencyjnymi; oddziaływanie z dwuwarstwą lipidową; time-lapse." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="figure 1"> <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1b.jpg" border="0" alt="Wykres fluorescencji w funkcji czasu; tworzenie porów, hemifuzja, czujnik pH; kinetyka eksperymentalna." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="figure 1"> Rysunek 1. Projekt eksperymentalny. A) Cząsteczki wirusa są znakowane dwoma barwnikami fluorescencyjnymi w celu monitorowania kinetyki hemifuzji i tworzenia porów fuzyjnych. Fluorescencja jest zbierana przez obiektyw mikroskopu o wysokiej aperturze numerycznej (NA) i obrazowana na detektorze CCD. B) Obrazy fluorescencyjne przed (lewo) i w trakcie (prawo) fuzji pojedynczych cząsteczek wirusa. Górna i dolna połowa każdego obrazu odpowiada odpowiednio fluorescencji czerwonej i zielonej tego samego obszaru wspieranej dwuwarstwy o wymiarach ~ 50 x 100 mm2. C) Intensywność fluorescencji czerwonego znacznika zawartości wirusa SRB (górna linia), zielonego barwnika błonowego Rh110C18 (środkowa linia) oraz fluoresceinowego czujnika pH (dolna linia) pozwala na precyzyjne określenie czasu, który upłynął między spadkiem pH, hemifuzją a fuzją. Proszę <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig1.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.
<img border="0" src="/files/ftp_upload/1484/1484fig2tmb.jpg" alt="Wykresy histogramowe hemifuzji i tworzenia porów; częstotliwość względem czasu; analiza procesu fuzji." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="rycina 2"> Rycina 2. Kinetyka fuzji wirusa znakowanego fluorescencyjnie. Rozkłady czasu, który upłynął między spadkiem pH a hemifuzją (A, D) oraz tworzeniem porów (B, E). Wzrost i spadek rozkładów wskazują na obecność wielu etapów pośrednich. Przejście między hemifuzją a otwarciem poru fuzyjnego dla poszczególnych cząsteczek ma rozkład wykładniczy, co sugeruje istnienie jednego etapu ograniczającego szybkość reakcji. Panele A-C przedstawiają wyniki pojedynczego eksperymentu. Panele D-F zostały zestawione z pięciu oddzielnych eksperymentów przeprowadzonych w tych samych warunkach. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig2.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 2.

<ol><li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalisation+of+Si%2FSiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li>
<li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li>
</ol>

Przygotowanie płynnych i ciągłych wspieranych dwuwarstw lipidowych może być trudne. Śladowe ilości zanieczyszczeń lub defekty powierzchni zapobiegają rozprzestrzenianiu się dwuwarstw. Niezbędne jest staranne oczyszczenie oraz naniesienie jednorodnej warstwy dekstranu.
Przedłużające się obrazowanie cząsteczek wirusa może prowadzić do wybielenia znaczników fluorescencyjnych lub ich dezaktywacji. Tego rodzaju fotouszkodzenia są dobrze znane w dziedzinach obrazowania biologicznego i badań pojedyn...

<table><tbody><tr><td>Kwadratowe szkiełka nakrywkowe Corning, 25 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS286525</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety z topionego kwarcytu</td><td>Szkło techniczne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kasetka do barwienia</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>(3-glicydoksypropylo)trimetoksysilan</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIG5840.1</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran T-500</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 4006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;1,2-dioleinoglicero-3-fosfocholina (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitylo-2-oleoylo-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;1-palmitylo-2-oleo-glicero-3-fosfocholina (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-((6-(biotynoilo)amino)heksanoylo)-1,2-diheksadekanoylo-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-fosfo-&amp;#8211;tanolamina, sól trietyloamoniowa (biotyna-X DHPE)</td><td>Invitrogen</td><td>B1616</td><td></td></tr><tr><td>Koniugat streptawidyny z fluoresceiną</td><td>Invitrogen</td><td>S-869</td><td></td></tr><tr><td>Disialogangliozyd GD&lt;sub&gt;1a&lt;/sub&gt; z mózgu bydlęcego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2392</td><td></td></tr><tr><td>Miniwytłaczarka</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>filtry membranowe z poliwęglanu o porach 0,1 mikrona</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>dyski drenażowe 10 mm (podpory membran)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>230300</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa sulforodaminy B</td><td></td><td>S1402</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina 110 oktadecyl (Rh110C18)</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Zobacz&lt;/em&gt; Floyd &lt;em&gt;i wsp.&lt;/em&gt; 2008 dla protokołu syntezy</td></tr><tr><td>kolumny odsalające PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop fluorescencyjny Nikon</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>obiektyw Plan Apo TIRF 60x 1,45 NA</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>laser Ar/Kr Innova 70C Spectrum</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702213</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząsteczek

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Fuzja błon jest kluczowym etapem podczas wnikania wirusów otoczkowych do komórek. Konwencjonalne testy fuzji zazwyczaj raportują dużą liczbę zdarzeń fuzji, co utrudnia ilościową analizę sekwencji zaangażowanych w ten proces kroków molekularnych. Opracowaliśmy dwukolorowy test fluorescencyjny in vitro do monitorowania kinetyki fuzji pojedynczych cząsteczek wirusa z docelową dwuwarstwą na podłożu o charakterze płynnym.
Cząsteczki wirusa grypy inkubuje się z zielonym lipofilnym fluoroforem w celu zabarwienia błony oraz z czerwonym hydrofilnym fluoroforem w celu zabarwienia wnętrza wirusa. Na funkcjonalizowanem dekstranem szklanym podłożu komory przepływowej osadzamy lipidową dwuwarstwę zawierającą gangliozydy, inkubujemy cząsteczki wirusa na płaskiej dwuwarstwie, a następnie rejestrujemy za pomocą kamery CCD fluorescencję obszaru o wymiarach 100 x 100 μm2, zawierającego kilkaset cząsteczek. Dzięki obrazowaniu fluorescencji czerwonej i zielonej możemy jednocześnie monitorować zachowanie barwnika błonowego (zielonego) oraz zawartości wodnej (czerwonej) cząsteczek.
Po obniżeniu pH do wartości poniżej pH fuzji, cząsteczki połączą się z błoną. Hemifuzja, czyli zlewanie się zewnętrznej warstwy błony wirusowej z zewnętrzną warstwą błony docelowej, będzie widoczna jako nagła zmiana zielonej fluorescencji cząsteczki. Następnie, w wyniku fuzji dwóch pozostałych, oddalonych od siebie warstw, utworzy się por, a emitujący czerwone światło fluorofor w cząsteczce wirusa zostanie uwolniony pod błonę docelową. Zjawisko to spowoduje spadek czerwonej fluorescencji poszczególnych cząsteczek. Na koniec, zintegrowana fluorescencja fluoroforu wrażliwego na pH, wbudowanego w błonę docelową, pozwoli określić dokładny moment spadku pH.
Z trzech śladów fluorescencji w funkcji czasu można teraz w prosty sposób wyodrębnić wszystkie istotne zdarzenia (spadek pH, mieszanie lipidów podczas hemifuzji, mieszanie zawartości po utworzeniu poru) dla każdej cząstki z osobna. Poprzez zestawienie czasów trwania poszczególnych przejść dla wielu pojedynczych cząstek w histogramach, możemy określić czasy życia odpowiadających im stanów pośrednich. Nawet ukryte stany pośrednie, które nie posiadają bezpośredniego mierzalnego parametru fluorescencyjnego, mogą zostać bezpośrednio zwizualizowane na podstawie tych histogramów.

Przedstawiamy dwukolorowy test fluorescencyjny in vitro, służący do wizualizacji fuzji pojedynczych cząsteczek wirusa z płynną dwuwarstwą docelową. Poprzez znakowanie cząsteczek wirusowych fluoroforami, które różnicowo barwią błonę wirusa oraz jego wnętrze, jesteśmy w stanie monitorować kinetykę hemifuzji i tworzenia się porów.

Metoda pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząsteczek

Fuzja błon jest niezbędnym etapem podczas wnikania wirusów otoczkowych do komórek. Konwencjonalne testy fuzji zazwyczaj informują o dużej liczbie zdarzeń fuzji...

Kryszalki użyte w tym teście są funkcjonalizowane dekstryną, a następnie wbudowane w mikrofluidyczne komory przepływowe. Następnie każda komora przepływowa jest inkubowana z zawiesiną liposomów, które fuzują, tworząc lipidową dwuwarstwę na nawilżonej dekstrynie. Pod mikroskopem fluorescencyjnym dodaje się wirusy znakowane barwnikiem fluoro four oraz streptawidynę znakowaną fluoresceiną, po czym pozwala się wirusom na przyłączenie do dwuwarstwy.Napływ buforu kwasowego inicjuje fuzję wirusa z dwuwarstwą, a kamera cyfrowa rejestruje zmiany fluorescencji w trakcie całego badania. Cześć, nazywam się Daniel Floyd i pracuję w laboratorium Anine Vanian w Departamencie Chemii Biologicznej i Farmakologii Molekularnej na Uniwersytecie Harvarda. Dzisiaj zaprezentuję metodę wizualizacji kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząsteczek.Stosujemy tę procedurę w laboratorium, aby badać sposób, w jaki wirus przedostaje się do komórek gospodarza. Zatem zacznijmy. Rozpocznij ten protokół od przygotowania szkiełek podstawowych funkcjonalizowanych dekstryną.Pierwszym krokiem jest sonikacja szkiełek nakrywkowych w roztworach 10% detergentu, jednomolowego wodorotlenku potasu w acetonie oraz 100% etanolu; sonikację należy prowadzić przez 30 minut w każdym roztworze. Pomiędzy poszczególnymi etapami szkiełka należy płukać wodą dejonizowaną. Po ostatniej sonikacji szkiełka nakrywkowe należy opłukać wodą, a następnie wysuszyć w inkubatorze w temperaturze 80 °C.Następnie umieść szkiełka nakrywkowe w urządzeniu do trawienia plazmą tlenową na trzy minuty. Krok ten utlenia powierzchnię szkiełek, sprawiając, że szkło staje się jednorodnie hydrofilowe i reaktywne w kolejnych etapach sylilizacji. Następnie zanurz szkiełka nakrywkowe w świeżym roztworze 0,2% gly oxy propyl trimeth oxypro trim methoxy w izopropanolu i inkubuj przez pięć minut.Następnie kilkakrotnie wypłucz szkiełka nakrywkowe izopropanolem. Umieść pokryte warstwą silanu szkiełka w temperaturze 80 °C na jedną godzinę. Ten etap utwardzania pozwala na utworzenie wiązań kowalencyjnych silanu ze szkłem.Po utwardzeniu ułożyć szkiełka nakrywkowe płasko wewnątrz plastikowego pudełka do zamrażarki. Pokryć górną powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego około 1 ml roztworu dekstryny (30% w/v w wodzie).Zamknąć pudełko do zamrażarki i pozostawić szkiełka nakrywkowe w spokojnym miejscu na 24 do 36 godzin. Następnego dnia odlać nadmiar dekstryny, chwytając szkiełka nakrywkowe plastikową pęsetą, i umieścić je z powrotem w ceramicznym stojaku. Przepłukać je wodą kilka razy i pozostawić do namoczenia w wodzie na 48 godzin. pojemnik można delikatnie mieszać na rotatorze laboratoryjnym; należy wysuszyć szkiełka nakrywkowe w piekarniku ustawionym na 80 °C i przechowywać je w eksykatorze próżniowym do momentu przejścia do następnego etapu. Pokrywanie szkiełek nakrywkowych mieszaniną liposomów w celu utworzenia płaskiej dwuwarstwy. Kolejnym krokiem jest przygotowanie liposomów do utworzenia lipidowej dwuwarstwy; w komorze z laminarnym przepływem powietrza należy połączyć wszystkie lipidy rozpuszczone w chloroformie w szklanej probówce.Formulacja liposomów zawiera stronę ganglia dia, która wiąże cząsteczki wirusa, oraz lipid biotynilowany, który wiąże koniugowany ze streptawidyną wskaźnik pH fluoresceinę. Następnie odparuj rozpuszczalnik w strumieniu argonu lub azotu. Pozostały rozpuszczalnik usuń, pozostawiając probówkę w deskrykatorze próżniowym przez dwie godziny.Resuspenduj wysuszoną warstwę lipidową w 400 µL buforu HNE. Następnie przenieś zawiesinę do plastikowej probówki do mikrocentryfugi. Zamroź zawiesinę w kąpieli z ciekłym azotem, a następnie rozmroź w ciepłej kąpieli wodnej.Powtórz ten cykl zamrażania i rozmrażania cztery razy po cyklach zamrażania i rozmrażania. Użyj ekstrudera lipidów wyposażonego w filtr membranowy o rozmiarze 100 nanometrów, aby przeprowadzić ekstruzję zawiesiny lipidowej. Po 25 krotnej ekstruzji zawiesina powinna stać się bardziej przejrzysta.Liposomy należy przechowywać w temperaturze pokojowej i wykorzystać w dniu przygotowania. Po przygotowaniu lipidów należy przygotować mikrofluidyczną komorę przepływową. Najpierw należy wziąć płytkę kwarcową o wymiarach 20 x 20 x 3 mm i za pomocą diamentowego wiertła wywiercić dwa otwory o średnicy 1 mm po przeciwnych stronach.Z arkusza dwustronnej taśmy klejącej wytnij za pomocą żyletki kwadrat o boku 20 mm. Z jego środka wytnij fragment o wymiarach 15 × 2 mm. Oderwij papier zabezpieczający z jednej strony taśmy i przyklej ją do szkiełka przedmiotowego.Przykleić drugą stronę do funkcjonalizowanego szkiełka nakrywkowe, a następnie dociąć rurkę polietylenową do długości 20 centymetrów i wprowadzić ją do otworów w płytce kwarcowej. Na koniec uszczelnić celę przepływową pięciominutowym klejem epoksydowym. Rozprowadzić klej wzdłuż krawędzi płytki kwarcowej, aby połączyć ją ze szkiełkiem nakrywkowym.Użyj dwóch kolejnych kropel kleju, aby uszczelnić połączenie między rurką a szkiełkiem kwarcowym. Po utwardzeniu kleju należy nasycić komorę przepływową i rurkę buforem HNE. Następnie, aby utworzyć wspieraną lipidową dwuwarstwę, pobierz zawiesinę ekstrudowanych liposomów i wprowadź około 80 µL do kanałów w dniu poprzedzającym eksperyment fuzji.Rozpocznij znakowanie cząstek wirusa, aby zabarwić wnętrze wirusa na czerwono. Połącz 20 µL świeżo przygotowanego roztworu sulforumiany rodaminy (SRB) z 10 µL zawiesiny wirusowej i pozostaw w temperaturze pokojowej na 20 godzin. Następnego dnia usuń nadmiar barwnika, przepuszczając zawiesinę wirusową przez kolumnę odsalającą PD 10 i rozcieńczając ją 800 µL buforu HNE.Kolumna powinna posiadać wyraźny kolorowy prążek, który zawiera znakowany wirus. Następnie należy zebrać tę frakcję podczas etapu elucji, znakować otoczkę wirusową na zielono poprzez dodanie 13 µL Octa decal, RUMINE one 10 lub RH one 10 C 18 do znakowanej SRB zawiesiny wirusowej. Zawiesinę należy wymieszać, mocując probówkę do rotatora laboratoryjnego i pozostawić na trzy godziny.Następnie usuń nadmiar RH one 10 C 18 za pomocą kolumny odsalającej PD 10. Tak jak wcześniej, wirus jest teraz gotowy do testu fuzji. Przeprowadź analizę kinetyki fuzji przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw imersyjny olejowy o wysokiej aperturze numerycznej.Laser kryptonowy Argonne wzbudza fluorofory w błonie oraz wnętrzu wirusa. Lustro dichroiczne rozdziela następnie czerwone i zielone emisje fluorescencji i niezależnie skupia obrazy na oddzielnych połowach kamery z urządzeniem CCD (charge coupled device) z mnożeniem elektronów. Zamocuj szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopu i podłącz rurkę wylotową do pompy strzykawkowej ustawionej na przepływ 100 µL na minutę.Oczyść kanały przepływowe z nadmiaru liposomów, przepływając 300 µL HNE. Ustaw ostrość mikroskopu i dostosuj moc lasera tak, aby oświetlić powierzchnię światłem o długości fali 488 nm z mocą 350 W/cm², w celu wzbudzenia fluoroforu czerwonego, oraz światłem o długości fali 568 nm z mocą 70 W/cm², w celu wzbudzenia fluoroforu zielonego. Po przygotowaniu mikroskopu wpompuj do komory przepływowej wirusa znakowanego, rozcieńczonego w stosunku 1:100.W miarę jak wirus dyfunduje do dolnej powierzchni kanału przepływowego, cząsteczki zaczynają się dokować. Przywierają one do strony zwojów DIA, wbudowanych w szkiełka nakrywkowe, w błonę dwuwarstwową. Gdy gęstość dokowanych cząsteczek osiągnie poziom około kilkuset cząsteczek na pole widzenia, należy rozpocząć przepływ roztworu o stężeniu 2 µg/mL.Streptawidyna znakowana fluoresceiną, fluorofor wrażliwy na pH, w momencie gdy znakowana streptawidyna wiąże się z cząsteczkami lipidów sprzężonymi z biotyną w dwuwarstwie. Ponownie pojawia się słabe zielone tło, należy przepłukać kanał przepływowy 300 µL HNE. Po zadokowaniu wirusów i pokryciu powierzchni dwuwarstwy fluoresceiną można rozpocząć analizę.Wybierz obszar obrazowania, ustaw ostrość mikroskopu i przygotuj kamerę CCD do akwizycji obrazów w odstępach czasu. Ustaw czas ekspozycji na 100 milliseconds i zbieraj klatki z częstotliwością 10 hertz. Zainicjuj fuzję błony wirusa, wprowadzając kwaśny bufor cytrynianu sodu.Wraz ze spadkiem pH fluorescencja fluoresceiny słabnie, co pozwala precyzyjnie określić moment zakwaszenia. Kamera CCD rejestruje dane przez cały czas trwania analizy, co umożliwia wyznaczenie czasu hemifuzji oraz powstania poru, zgodnie z zapisem z kamery CCD. Po spadku pH występują rozbłyski zielonej fluorescencji w momencie fuzji błon wirusowej i płaskiej, kiedy lipidy mieszają się, a zielony barwnik w otoczce wirusa ulega rozcieńczeniu w błonie płaskiej.W przeciwieństwie do tego, po spadku pH następuje zanik fluorescencji czerwonej, ponieważ w błonach wirusowych i lipidowych tworzą się pory, które umożliwiają wydostanie się czerwonego barwnika z wnętrza wirusa do przestrzeni wodnej pod płaską dwuwarstwą i poza pole widzenia; trendy te można również zwizualizować za pomocą migawek fluorescencyjnych przed i w trakcie fuzji. Należy również wykreślić trajektorie intensywności fluorescencji dla każdej cząsteczki, jak pokazano w tym przykładzie. Hemifuzję definiuje się jako punkt, w którym nachylenie intensywności fluorescencji zielonej jest największe, natomiast formowanie porów jako punkt, w którym następuje zanik fluorescencji czerwonej. Połączone dane z wielu eksperymentów służą do generowania histogramów czasów opóźnienia hemifuzji i formowania porów, jak pokazano tutaj, przyjmując moment spadku pH jako t równy zero w celu synchronizacji danych z różnych doświadczeń.Przedstawiłem właśnie sposób pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząstek. Wykonując tę procedurę, należy upewnić się, że używane szkiełka nakrywkowe są czyste, aby uzyskać jednorodną i płynną dwuwarstwę.Należy również starać się ograniczyć ilość światła używanego podczas obrazowania fluorescencyjnego, aby zminimalizować uszkodzenia fotochemiczne. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

method-for-measurement-viral-fusion-kinetics-at-single-particle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząstek

Genomika pojedynczych wirusów (SVG) to metoda izolacji i amplifikacji genomów pojedynczych wirionów. Zawiesiny wirusowe mieszaniny różnych szczepów są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej na preparat mikroskopowy z osobnymi studzienkami zawierającymi agarozę, co pozwala na przechwycenie wirionu i ograniczenie fragmentacji genomu podczas dalszej obróbki. Amplifikacja całego genomu jest przeprowadzana za pomocą wielokrotnej amplifikacji z wypieraniem (MDA), w wyniku czego otrzymuje się...

Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów z wykorzystaniem metody „Single Virus Genomics”

Ten film demonstruje test do oceny środków przeciwwirusowych, które są ukierunkowane na określone etapy wnikania wirusa do komórek gospodarza i fuzji z endosomem. Komórki są inkubowane w niskiej temperaturze, a następnie zakażone HCV. Niska temperatura umożliwia wiązanie wirusa z komórkami gospodarza, ale hamuje internalizację poprzez endocytozę. Dodaje się testowy związek przeciwwirusowy, a komórki inkubuje się w temperaturze fizjologicznej. To przejście do wyższej temperatury ułatwia wnikanie...

Test do oceny wpływu badanych związków na wnikanie wirusa i fuzję w komórkach gospodarza

Dołączanie wirionów do powierzchni jest wymogiem do obrazowania pojedynczego wirionu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości lub mikroskopii sił atomowych (AFM). W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania próbki do kontrolowanej adhezji wirionów do powierzchni szklanych, odpowiednią do stosowania w obrazowaniu AFM i fluorescencji o wysokiej rozdzielczości.

Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczego wirionu i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości

Prezentujemy protokół opisujący półilościową metodę pomiaru zarówno przyczepiania wirusa grypy A do komórek A549, jak i internalizacji cząsteczek wirusa do komórek docelowych za pomocą cytometrii przepływowej.

Pomiar przyczepiania i internalizacji wirusa grypy A w komórkach A549 za pomocą cytometrii przepływowej

Pierwszym krokiem w cyklu życia arenawirusa jest dołączenie cząsteczek wirusa do komórek gospodarza. Przedstawiamy ilościowy test oparty na (q)RT-PCR do ultraczułego wykrywania i ilościowego oznaczania zdarzeń związanych z przyłączeniem arenawirusa.

Bardzo czuły test do pomiaru przyłączenia komórki arenawirusa

Wirusy lub pęcherzyki zewnątrzkomórkowe były wychwytywane immunologicznie za pomocą nanocząsteczek magnetycznych 15 nm sprzężonych z przeciwciałami rozpoznającymi antygeny powierzchniowe. Uchwycone wiriony lub pęcherzyki znakowano fluorescencyjnymi przeciwciałami przeciwko innym antygenom powierzchniowym. Powstałe kompleksy rozdzielono w silnym polu magnetycznym i przeanalizowano za pomocą konwencjonalnych cytometrów przepływowych wyzwalanych fluorescencją.

Wirometria przepływowa do analizy widm antygenowych wirionów i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Prezentujemy otwarty instrument do analizy wysokiej zawartości (HCA) wykorzystujący automatyczne obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do oznaczania interakcji białek za pomocą odczytów opartych na transferze energii rezonansu Förstera (FRET). Akwizycja danych dla tego urządzenia openFLIM-HCA jest kontrolowana przez oprogramowanie napisane w μManager, a analiza danych odbywa się w FLIMfit.

Analiza Open Source o wysokiej zawartości z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Rutynowe metody wykrywania wykorzystujące amplifikację genomu wirusa są ograniczone przez ich niezdolność do odróżnienia cząsteczek zakaźnych od niezakaźnych. Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowych protokołów alternatywnych metod wspomagających dyskryminację zakaźnych cząstek norowirusa za pomocą wiązania aptamerów, dynamicznego rozpraszania światła i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Alternatywne metody in vitro do oznaczania integralności strukturalnej kapsydu wirusa

Opisujemy test oparty na komórkach, który informuje o fuzji HIV-1 poprzez ekspresję białka zielonej fluorescencji wykrywalnego za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Może być stosowany do testowania inhibitorów wnikania wirusa (szczególnie na etapie fuzji) w systemach infekcji bezkomórkowych i międzykomórkowych.

Wysokoprzepustowy test fuzji błony wirusowej aktywowanej Cre-Lox w celu identyfikacji inhibitorów fuzji błony wirusowej HIV-1

W tym manuskrypcie przedstawiono protokół do wykonywania pomiarów aktywności transkrypcyjnej BK-poliomawirusa opartego na FACS przy użyciu komórek HEK293T transfekowanych dwukierunkowym plazmidem reporterowym wykazującym ekspresję tdTomato i eGFP. Metoda ta pozwala ponadto na ilościowe określenie wpływu nowych związków na transkrypcję wirusa.

Pomiar aktywności transkrypcyjnej sterowanej przez niekodujący region kontrolny BK-poliomawirusa za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

Poznaj metodę pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząstek przy użyciu dwukolorowej fluorescencji. Technika ta umożliwia wizualizację hemifuzji i formowania porów w czasie rzeczywistym.

Metoda pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząsteczek

Przeglądaj więcej filmów