Name: In vivo (in vivo) Obrazowanie głębokich warstw kory mózgowej za pomocą mikropryzmatu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę głębokiego obrazowania kory mózgowej myszy za pomocą mikropryzmatów szklanych. Technika umożliwia wizualizację wszystkich sześciu warstw kory z szerokim polem widzenia i rozdzielczością pozwalającą obserwować kolce dendrytyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Anthony’emu J. Koleske za udostępnienie myszy YFP.

Część 1: Optyka mikropryzmatów i konfiguracja mikroskopu
<ol>
<li>Stosowane przez nas mikropryzmaty to pryzmaty prostokątne o wymiarach 1 mm, wykonane ze szkła BK7 zakupionego w Optosigma Corporation (Rysunek 1). W miarę możliwości do manipulowania mikropryzmatami należy używać pęsety.</li>
<li>Przeciwprostokątna mikropryzmatu jest powlekana wzmocnionym srebrem, aby zapewnić współczynnik odbicia powyżej 97% w zakresie od 400 do 2000 nm. Zapewnia to wewnętrzne odbicie zarówno światła wzbudzenia lasera, jak i emitowanej fluorescencji.</li>
<li>Mikropryzmaty należy zawsze przenosić za pomocą pęsety, jeśli jest to możliwe. Przez cały czas należy nosić rękawiczki, aby utrzymać pryzmat w czystości.</li>
<li>Używamy zbudowanego na zamówienie mikroskopu dwufotonowego zdolnego do obrazowania małych zwierząt. Zwierzę, przymocowane do urządzenia stereotaktycznego, umieszcza się na zmotoryzowanym stole 3-osiowym.</li>
<li>Mikroskop jest połączony z komputerem PC z systemem Windows uruchamiającym oprogramowanie ScanImage. ScanImage to oprogramowanie do akwizycji obrazu napisane w języku Matlab przez Pologruto i wsp. 1.</li>
<li>W przypadku obrazowania za pomocą mikropryzmatów zbieramy obrazy o rozdzielczości 1024 x 1024 lub 512 x 512 pikseli. Dodatkowo zazwyczaj skanujemy z prędkością 2 ms/linię lub 4 ms/linię.</li>
<li>W eksperymentach stosuje się dwa rodzaje obiektywów: 
<ul>
<li>Obiektyw powietrzny o niższej aperturze numerycznej (NA) do obrazowania w szerokim polu widzenia (patrz Tabela odczynników i sprzętu).</li>
<li>Obiektyw powietrzny o wyższej NA z szklaną obrączką korekcyjną, zdolną do minimalizacji aberracji sferycznych wywołanych przez 0 – 2 mm szkła (patrz Tabela odczynników i sprzętu).</li>
</ul>
</li>
<li>Gdy zwierzę jest gotowe do obrazowania pod obiektywem o małym powiększeniu, należy dopasować kwadratowy wzór skanowania rastrowego lasera do górnej części mikropryzmatu. Pomoże to zorientować obraz i efektywnie wykorzystać moc lasera.</li>
<li>Używając obiektywu o wyższej NA z szklaną obrączką korekcyjną, ustaw obrączkę tak, aby korygowała ok. 1 mm szkła. Gdy podczas eksperymentu pojawi się obraz fluorescencyjny, można ostrożnie sięgnąć do wnętrza mikroskopu, aby zoptymalizować ustawienie obrączki korekcyjnej w celu maksymalizacji rozdzielczości obrazowania.</li>
</ol>
Część 2: Operacja zwierzęca bez przeżycia i implantacja mikropryzmatu
<ol>
<li>Całkowity czas trwania procedury, od pierwszego nacięcia do zakończenia obrazowania, zależy od celów eksperymentu. Można jednak oczekiwać, że procedura chirurgiczna w modelu nieprzeżywalnym oraz umieszczenie mikropryzmatu zajmą około 30 – 40 minut.</li>
<li>Myszy (P30-P60) są ważone i poddane odpowiedniej anestezji za pomocą wtrysku d.o. (I.P.) ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) do poziomu odpowiedniego dla procedur chirurgicznych.</li>
<li>Przez cały czas trwania eksperymentu należy sprawdzać zwierzę co 15-20 minut, aby ocenić poziom anestezji. Jeśli zwierzę reaguje na mocne uciśnięcie palca stopy, wymagana jest dodatkowa dawka ketaminy/ksylazyny. Zazwyczaj dawka uzupełniająca stanowi jedną trzecią dawki początkowej i może być przygotowana wcześniej w strzykawce do natychmiastowego wtrysku d.o. w razie potrzeby.</li>
<li>Po prawidłowym znieczuleniu myszy większość włosów na głowie zwierzęcia jest zgolona przy użyciu trymera z głowicą nr 40.</li>
<li>Pozostałe włosy na głowie są poddawane działaniu preparatu Nair®, aby pomóc w stworzeniu powierzchni wolnej od włosów, które mogłyby przeszkodzić w pracy mikropryzmatu podczas obrazowania. Po 5 minutach preparat Nair® jest usuwany za pomocą patyczka z bawełnianym końcem.</li>
<li>Znieczulone zwierzę jest odpowiednio umieszczane w stereotaktycznym uchwycie dla myszy. Podczas procedur chirurgicznych i sesji obrazowania zwierzę spoczywa na wypełnionej wodą podkładce grzewczej ustawionej na 36 stopni Celsjusza.</li>
<li>Po prawidłowym unieruchomieniu głowy zwierzęcia skalpelem wykonuje się jedno czyste nacięcie wzdłuż linii środkowej czaszki w celu oddzielenia skóry.</li>
<li>Niewielką ilość 3% nadtlenku wodoru nanosi się na patyczek z bawełnianym końcem i aplikuje na czaszkę, aby usunąć błony znajdujące się między czaszką a skórą.</li>
<li>Nadtlenek wodoru pomaga również w zlokalizowaniu punktu bregma, który jest kluczowym punktem orientacyjnym przy określaniu miejsca wykonania kraniotomii i wprowadzenia mikropryzmatu.</li>
<li>Przed rozpoczęciem kraniotomii odpowiednio reguluje się pręty uszne i pręt zgryzowy, aby przechylić odsłoniętą czaszkę tak, by była ona w zasadzie równoległa do stołu. Zapewnia to lepszą platformę do kraniotomii. Dodatkowo sprawia to, że górna powierzchnia pryzmatu jest prostopadła do wpadającego światła wzbudzenia, co pomaga zminimalizować aberracje optyczne podczas obrazowania.</li>
<li>Mały wiertło dentystyczne (rozmiar głowicy ~0,8 mm) jest podłączone do narzędzia Dremel® za pomocą elastycznego przedłużenia. W przypadku kraniotomii prędkość ustawiamy na około 7 000 do 10 000 obr./min.</li>
<li>Wiertłem dentystycznym wykonuje się płytkie nacięcia wzdłuż czaszki, aż do utworzenia kwadratowego rowka w kości. Boki kwadratu mają długość około 2-3 mm i są wyśrodkowane 1,5 mm za tylną krawędzią (caudal) i 1 mm bocznie (lateral) względem punktu bregma.</li>
<li>Następnie kontynuuje się ścieńczanie kości, aż powstanie niewielki otwór w czaszce. Pincetą można unieść płat kostny z czaszki.</li>
<li>Przed wprowadzeniem mikropryzmatu do kory należy usunąć oponę twardą. Krwawienie najlepiej kontrolować, pozwalając krwi ściąć się na powierzchni przez kilka minut. Następnie, przed wprowadzeniem mikropryzmatu, skrzepniętą krew usuwa się za pomocą gąbki chirurgicznej.</li>
<li>Aby ułatwić wyrównanie pryzmatu z korą, pionową ściankę mikropryzmatu ustawia się równolegle do uchwytów pincety.</li>
<li>Trzymając pryzmat w odpowiedni sposób, wprowadza się cały mikropryzmat, aż jego góra zrówna się z powierzchnią nowokory.</li>
<li>Przy prawidłowym wprowadzeniu mikropryzmat powinien pozostać w odpowiedniej pozycji. Ewentualne krwawienie jest minimalne i można je wchłonąć niewielką gąbką chirurgiczną. Gdy pryzmat znajdzie się na miejscu, zwierzę jest gotowe do obrazowania.</li>
<li>Mikropryzmat po użyciu u zwierzęcia może być wykorzystany wielokrotnie. Wymaga jednak odpowiedniego oczyszczenia w celu usunięcia pozostałości materiału biologicznego. Można to osiągnąć poprzez zanurzenie pryzmatu w niewielkiej objętości kwasu HCl, a następnie w metanolu. Oczyszczony mikropryzmat można następnie zawinąć w papier do soczewek do czasu kolejnego użycia.</li>
</ol>
Część 3: Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig1.jpg" alt="Mikroskopia; porównanie rozmiaru nanostruktury z linijką; badanie z zakresu nauki o materiałach; precyzyjna produkcja." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1: Zdjęcia mikropryzmatu prostokątnego. Pryzmaty wykorzystane w tym eksperymencie to pryzmaty szklane BK7 o rozmiarze 1 mm, z wzmocnioną powłoką srebrową na przeciwprostokątnej, aby umożliwić wewnętrzne odbicie światła wzbudzenia i emisji.
<img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig2.jpg" alt="Wizualizacja sieci neuronowej, obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający neurony mózgu, badania naukowe." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2: Obraz neuronów piramidowych YFP z warstwy V. Obrazowanie z szerokim polem widzenia z użyciem mikropryzmatu ujawnia dużą populację ciał komórek piramidowych na głębokości ~800 – 900 μm od powierzchni kory. Dodatkowo można rozpoznać dendryty apikalne rozciągające się w górę w kierunku warstwy I. Pasek skali = 200 μm.
<img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig3.jpg" alt="Obraz mikroskopowy przedstawiający strukturę filamentów białkowych z zaznaczonymi punktami zainteresowania." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3: Obiektyw o większej aperturze numerycznej stosowany w połączeniu z mikropryzmatem zapewnia rozdzielczość przestrzenną wystarczającą do rozdzielenia kolców dendrytycznych na dendrytach apikalnych neuronów piramidowych warstwy V. Pasek skali = 10 μm.
<img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig4.jpg" alt="Obraz mikroskopowy przedstawiający strukturę sieci neuronalnej, metoda fluorescencyjna, badanie neurologiczne." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4: Obraz uzyskany przy użyciu mikropryzmatu i wstrzyknięcia barwnika fluorescencyjnego do żyły ogonowej. Obraz przedstawia pionowe naczynia o dużym kalibrze wychodzące z głębokich obszarów mózgu oraz mniejsze kapilary odgałęziające się przez objętość kory. Pasek skali = 200 μm.
<img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig5.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, wizualizacja sieci neuronów, badanie optyczne, analiza emisji." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> Rysunek 5: Przy użyciu obiektywu o wyższej aperturze numerycznej sieć naczyń włosowatych w nowokorze może być obrazowana z większą szczegółowością. Pasek skali = 50 μm.
<img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig6.jpg" alt="Dynamika przepływu ścinającego, schemat eksperymentalny z polem wektorów prędkości i analizą czasowo-przestrzenną." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> Rysunek 6: Mikropryzmaty umożliwiają również obrazowanie erytrocytów (RBC) przepływających przez naczynia. Erytrocyty nie absorbują barwnika fluorescencyjnego, w związku z czym są widoczne jako ciemne pasma przecinające naczynie. Poprzez skanowanie liniowe w poprzek naczynia można uzyskać pomiary strumienia i prędkości erytrocytów. Pasek skali = 10 μm (poziomy pasek na górnym i dolnym obrazie) oraz 250 ms (pionowy pasek na dolnym obrazie).

<ol><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i regulacjami określonymi przez IACUC Uniwersytetu Yale.

Wykorzystanie mikropryzmatu w eksperymencie obrazowania jest stosunkowo proste i oferuje wiele zalet w badaniach in vivo nad neokorą. Reprezentatywne przykłady z zastosowaniem tej techniki obejmują obrazy uzyskane z myszy transgenicznych wykazujących ekspresję żółtego białka fluorescencyjnego w neuronach warstwy V kory. Dzięki zastosowaniu mikropryzmatów można zaobserwować skupisko dużych ciał komórek piramidowych w warstwie V, niemal 1 mm poniżej powierzchni kory. Widoczne są również dendryty apikalne, które przechodzą ...

<table><tbody><tr><td>Z podwyższoną srebrną powłoką refleksyjną-(R77)</td><td>OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)</td><td>055-0010</td><td>Z podwyższoną srebrną powłoką refleksyjną-(R77)</td></tr><tr><td>Dekstran fluoresceinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70</td><td>70 kDa </td></tr><tr><td>Obiektyw powietrzny 4x, NA 0,28</td><td>Olympus Corporation</td><td>XLFLUOR 4x/340</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw powietrzny 40x, NA 0,60</td><td>Olympus Corporation</td><td>LUCPLFLN</td><td>Z korekcją szkiełka coverglass 0-2 mm</td></tr></tbody></table>

obrazowanie in vivo głębokich warstw kory mózgowej z wykorzystaniem mikropryzmatu

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Przedstawiamy protokół obrazowania in vivo tkanki korowej z wykorzystaniem sondy do obrazowania głębokich struktur mózgu w kształcie mikropryzmatu. Mikropryzmaty mają rozmiar 1 mm i posiadają powłokę refleksyjną na przeciwprostokątnej, co umożliwia wewnętrzne odbicie światła wzbudzenia i emisji. Sonda z mikropryzmatem pozwala na jednoczesne obrazowanie wielu warstw kory z perspektywy typowej zazwyczaj tylko dla preparatów skrawkowych. Obrazy są zbierane z szerokim polem widzenia (~900 μm). Ponadto przedstawiamy szczegóły dotyczące procedury chirurgicznej w trybie non-survival oraz konfiguracji mikroskopu. Reprezentatywne wyniki obejmują obrazy neuronów piramidowych warstwy V z myszy Thy-1 YFP-H, pokazujące ich dendryty apikalne przechodzące przez powierzchowną warstwę kory i rozgałęziające się w kępki. Rozdzielczość była wystarczająca do obrazowania kolców dendrytycznych w pobliżu somy neuronów warstwy V. Iniekcja barwnika fluorescencyjnego do żyły ogonowej ujawnia złożoną sieć naczyń krwionośnych w korze. Skanowanie liniowe erytrocytów (RBCs) przepływających przez naczynia kapilarne pozwala na wyznaczenie prędkości oraz natężenia przepływu RBC. Ta nowatorska sonda z mikropryzmatem stanowi elegancką, a zarazem potężną nową metodę wizualizacji głębokich struktur komórkowych i funkcji kory in vivo.

Wprowadzenie prawokątnych mikropryzmatów do nowokory mózgu myszy umożliwia głębokie obrazowanie wielu warstw kory z perspektywy typowej dla preparatów przekrojowych. Mikropryzmaty o rozmiarze jednego milimetra zapewniają szerokie pole widzenia (~900 μm) oraz rozdzielczość przestrzenną wystarczającą do zobrazowania kolców dendrytycznych. Prezentujemy obrazowanie neuronów warstwy V oraz obrazowanie naczyń krwionośnych nowokory z wykorzystaniem mikropryzmatów.

Obrazowanie in vivo głębokich warstw kory mózgowej z wykorzystaniem mikropryzmatu

Przedstawiamy protokół obrazowania tkanki kory mózgu in vivo z wykorzystaniem sondy do obrazowania głębokich struktur mózgu w kształcie mikropryzmatu. Mikropryzmaty mają rozmiar 1 mm ...

Techniki mikroskopii fluorescencyjnej mają ograniczoną zdolność obrazowania struktur głęboko w tkance, zwłaszcza w materiałach o wysokim stopniu rozpraszania światła, takich jak tkanka mózgowa. Nawet w przypadku mikroskopii dwufotonowej może być bardzo trudno uzyskać wysokiej jakości obrazy in vivo struktur neuronalnych znajdujących się głębiej niż 500 mikronów od powierzchni nowokory. Tutaj zielona linia wskazuje głębokość 500 mikronów.Generalnie warstwy czwarta, piąta i szósta nowokory powinny znajdować się w odległości większej niż 500 mikronów od powierzchni. Pokażemy, w jaki sposób szklany mikropryzmat o średnicy jednego milimetra wprowadzony do nowokory może przekazywać światło do powierzchownych i głębokich warstw kory oraz z powrotem. Dzięki zastosowaniu tej techniki u myszy możliwe jest uzyskanie pola widzenia o szerokości jednego milimetra i jednoczesna wizualizacja wszystkich sześciu warstw kory w perspektywie obrazowania, która zazwyczaj jest dostępna jedynie w przypadku slice'owanych tkanek mózgu.Mikropryzmaty zapewniają szerokie pole widzenia umożliwiające wizualizację ciał komórek piramidalnych warstwy V wraz z ich długimi dendrytami apikalnymi oraz złożonej sieci naczyń krwionośnych w neocortex, zachowując jednocześnie rozdzielczość przestrzenną pozwalającą na rozróżnienie kolców dendrytycznych i przepływu erytrocytów przez mikrokapilary. Nazywam się Thomas Chia i jestem studentem studiów doktoranckich w laboratorium profesora Michaela Levine'a na Wydziale Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu Yale. Protokół, który omówimy w tym filmie, dotyczy zastosowania szklanych mikropryzmatów kątowych o rozmiarze 1 mm w celu generowania obrazów fluorescencyjnych struktur znajdujących się na głębokości 1 mm w neocortex myszy.Stosowane przez nas mikroprisma to pryzmaty prostokątne o boku jednym milimetrem, wykonane ze szkła BK7, zakupione w Opto Sigma Corporation. Mikropryzmaty są w miarę możliwości przenoszone za pomocą pincety. Przeciwprostokąt mikropryzmatu jest pokryty wzmocnionym srebrem, aby zapewnić współczynnik odbicia powyżej 97% w zakresie od 400 do 2000 nanometrów.Zapewnia to wewnętrzne odbicie zarówno światła wzbudzenia laserowego, jak i rejestrowanej fluorescencji. Używamy zbudowanego na zamówienie mikroskopu dwufotonowego przystosowanego do obrazowania małych zwierząt. Zwierzę przymocowane do urządzenia stereotaktycznego jest umieszczane na zmotoryzowanym stole trójosiowym.Mikroskop jest podłączony do komputera z systemem Windows z zainstalowanym oprogramowaniem scan image. Oprogramowanie scan image to program do akwizycji obrazu napisany w języku MATLAB przez Polo Gudo i współpracowników. W przypadku obrazowania mikroprismy zbieramy obrazy w rozdzielczości 10 24 na 10 24 lub 512 na 512 pikseli.Dodatkowo zazwyczaj wykonujemy skanowanie z czasem 2 ms na linię lub 4 ms na linię. Ważnym aspektem tego protokołu jest rodzaj obiektywów mikroskopowych stosowanych wraz z mikroprismami. W eksperymentach wykorzystuje się dwa rodzaje obiektywów.Obiektyw po lewej stronie to obiektyw powietrzny o niskiej aperturze numerycznej, przeznaczony do obrazowania szerokich pól widzenia; w tym przypadku jest to obiektyw Olympus 4x 0,28 NA. Obiektyw po prawej stronie to obiektyw powietrzny 40x 0,60 o wysokiej NA, wyposażony w szklaną obręcz korekcyjną pozwalającą zminimalizować aberracje sferyczne wywołane przez od 0 do 2 mm szkła. Aby przygotować mysz do operacji i wprowadzenia mikropryzmatu, pierwszym krokiem jest prawidłowe znieczulenie zwierzęcia do poziomu odpowiedniego dla procedur chirurgicznych.W pierwszej kolejności rejestruje się masę ciała zwierzęcia w celu ustalenia dawki. Do strzykawki pobiera się odpowiednią objętość mieszaniny ketaminy i ksylazyny. Leki anestetyczne podaje się poprzez wstrzyknięcie domięśniowe (IP), używając igły o rozmiarze 28G.Gdy mysz osiągnie poziom znieczulenia odpowiedni do procedur chirurgicznych, większość sierści na głowie zwierzęcia zostaje zgolona przy użyciu trymera z ostrzem nr 40. Następnie pozostałe włosy na głowie są traktowane woskiem, aby pomóc w uzyskaniu powierzchni wolnej od włosów, które mogłyby przeszkadzać mikropryzmatowi. W trakcie obrazowania, po pięciu minutach, wosk jest usuwany za pomocą patyczka z watą, a znieczulone zwierzę zostaje prawidłowo umieszczone w stereotaktycznym uchwycie dla myszy.Podczas procedur chirurgicznych i sesji obrazowania zwierzę jest utrzymywane na wypełnionej wodą podkładce grzewczej ustawionej na 36 °C. Po odpowiednim unieruchomieniu głowy zwierzęcia wykonuje się jedno czyste nacięcie wzdłuż linii pośrodkowej czaszki. Aby oddzielić skórę, niewielką ilość 3% nadtlenku wodoru nanosi się na patyczek higieniczny, a następnie aplikuje na czaszkę w celu usunięcia błon znajdujących się pomiędzy czaszką a skórą.Nadtlenek wodoru pomaga również uwidocznić BMA, który jest kluczowym punktem orientacyjnym określającym miejsce wykonania kraniotomii i wprowadzenia mikropryzmatu. Przed rozpoczęciem kraniotomii poprawnie reguluje się wsporniki uszne i paszcze, aby przechylić odsłoniętą czaszkę tak, by była ona zasadniczo równoległa do stołu. Zapewnia to lepszą stabilność podczas wykonywania kraniotomii.Mały wiertłak dentystyczny zostaje podłączony do urządzenia Dremel w celu wykonania kraniotomii. Prędkość obrotową ustawiamy na około 7 000 do 10 000 obr./min. Wiertłakiem dentystycznym wykonuje się nacięcia wzdłuż czaszki, aż do momentu utworzenia w kości kwadratowego rowka.Boki kwadratu mają około dwóch do trzech milimetrów długości i są wycentrowane. 1,5 milimetra w kierunku przednim i jeden milimetr bocznie pozostawiamy, kontynuując cieńczenie kości, aż w czaszce powstanie niewielki otwór. Płat kostny można unieść za pomocą pęsety.Przed wprowadzeniem mikropryzmatu do kory należy usunąć oponę twardą. Krwawienie najlepiej opanować, pozwalając krwi krzepnąć na powierzchni przez kilka minut. Następnie skrzepłą krew usuwa się za pomocą gąbki chirurgicznej, aby ułatwić wyrównanie pryzmatu z korą.Pionowa ściana mikropryzmatu jest ustawiona równolegle do uchwytów pęsety. Po prawidłowym uchwyceniu, cały mikropryzmat jest wsuwany, aż jego górna krawędź zrówna się z powierzchnią nowokory. Tutaj widzimy pryzmat osadzony w nowokorze.Po prawidłowym włożeniu mikroprisma powinien on pozostać w odpowiedniej pozycji. Ewentualne krwawienie jest minimalne i może zostać wchłonięte za pomocą małej gąbki chirurgicznej. Po umieszczeniu pryzmatu zwierzę jest gotowe do obrazowania.Pod obiektywem o małym powiększeniu można zaobserwować rastrowanie wiązką lasera po mikroprizmacie na powierzchni mózgu. Oto kilka reprezentatywnych przykładów obrazów uzyskanych od myszy transgenicznych wykazujących ekspresję żółtego białka fluorescencyjnego. W warstwie piątej neuronów korowych z zastosowaniem mikroprizmatów można dostrzec skupisko dużych ciał komórek piramidalnych w warstwie piątej, niemal jeden milimetr poniżej powierzchni kory.Widoczne są również dendryty apikalne, które przebiegają przez wszystkie warstwy powierzchowne, a następnie rozgałęziają się w kępki. Dzięki zastosowaniu obiektywu o wysokiej aperturze numerycznej z korekcją szklanego pierścienia możliwe jest w tym przypadku rozdzielenie kolców dendrytycznych. Na dendrytach apikalnych neuronów parametalicznych warstwy piątej kolce dendrytyczne są strukturami submikronowymi, a kilka z nich zostało zidentyfikowanych na obrazie za pomocą żółtych grotów strzałek. Można również znakować naczynia krwionośne kory barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak dekstran fluoresceiny, stosując uznane techniki wstrzykiwania do żyły ogonowej.Stosując tę technikę, można zaobserwować naczynia o większej średnicy z głębszych warstw, które rozciągają się w stronę PIA i rozgałęziają, tworząc sieć mikrokapilar. Tę delikatną sieć mikrokapilar w neokorze najlepiej ocenić, używając obiektywu o wysokiej aperturze numerycznej. Ponadto, poprzez skanowanie liniowe, możliwe jest pomiar prędkości i przepływu czerwonych krwinek z głębokich kapilar neokory.Czerwona linia wskazuje wzór skanowania linii na obrazie naczyni włosowatego przez mikropryzmat. Ponieważ erytrocyty nie pochłaniają barwnika fluorescencyjnego, będą one widoczne jako ciemne smugi. Obraz na dole jest wynikiem skanowania liniowego, w którym jeden wymiar przestrzenny jest wyrażony w AEs, a drugi wymiar czasowy.Na podstawie tych danych można obliczyć strumień i prędkość erytrocytów w kapilarze. Po zastosowaniu mikropryzmatu u zwierzęcia można go wykorzystać kilkukrotnie. Należy jednak odpowiednio go oczyścić, aby usunąć wszelki pozostały materiał biologiczny.Można to osiągnąć poprzez zanurzenie pryzmatu w niewielkiej objętości kwasu solnego, a następnie w metanolu. Oczyszczony mikroprism można następnie owinąć papierem soczewkowym do momentu użycia. To kończy nasz protokół dotyczący stosowania mikroprism do obrazowania korowego in vivo u myszy.Wykorzystanie mikropryzmatów w eksperymencie obrazowania jest stosunkowo proste i oferuje wiele zalet w przypadku badań in vivo w obrębie nowokory. Mamy nadzieję, że uznali Państwo tę technikę za interesującą i że znajdzie ona zastosowanie w Państwa laboratorium w przyszłości. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia.

in-vivo-imaging-of-deep-cortical-layers-using-a-microprism

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In vivo Obrazowanie warstw kory mózgowej za pomocą mikroprizmatu

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

W tym filmie i materiałach uzupełniających przedstawiamy protokół przewlekłego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu z wykorzystaniem preparacji z cienkiej czaszki.

Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy z wykorzystaniem preparatu z pocienioną czaszką

Zależne od doświadczenia zmiany molekularne w neuronach są niezbędne dla zdolności mózgu do adaptacji w odpowiedzi na wyzwania behawioralne.  Opisano tutaj metodę obrazowania dwufotonowego in vivo, która umożliwia śledzenie takich zmian molekularnych w poszczególnych neuronach korowych za pomocą genetycznie kodowanych reporterów.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w neuronach korowych

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Tutaj prezentujemy procedurę wykonywania wielkoskalowego obrazowania Ca2+ z rozdzielczością komórkową w wielu warstwach kory mózgowej u swobodnie poruszających się myszy. Setki aktywnych komórek można obserwować jednocześnie za pomocą miniaturowego mikroskopu montowanego na głowie w połączeniu z wszczepioną sondą pryzmatyczną.

Wielowarstwowe obrazowanie kory Ca2+ u swobodnie poruszających się myszy z sondami pryzmatycznymi i zminiaturyzowaną mikroskopią fluorescencyjną

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Prezentujemy protokół obrazowania in vivo dwufotonowego do obrazowania kory mózgowej noworodków myszy. Metoda ta jest odpowiednia do analizy dynamiki rozwojowej neuronów korowych, mechanizmów molekularnych kontrolujących dynamikę neuronów oraz zmian w dynamice neuronów w modelach chorób.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie neuronów korowych u nowonarodzonych myszy

Ten artykuł opisuje metodę przewlekłej obserwacji in vivo spoczynkowego mikrogleju w mysim hipokampie CA1 przy użyciu precyzyjnie kontrolowanej chirurgii i mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy

Po zintegrowaniu z płytą czołową i konstrukcją optyczną kompatybilną zarówno z mikroskopami jedno-, jak i dwufotonowymi, soczewka mikropryzmatyczna daje znaczącą przewagę w pomiarze odpowiedzi neuronalnych w pionowej kolumnie w różnych warunkach, w tym w dobrze kontrolowanych eksperymentach w stanach skupienia na głowie lub naturalnych zadaniach behawioralnych u swobodnie poruszających się zwierząt.

Długoterminowe obrazowanie zidentyfikowanych populacji neuronów za pomocą mikropryzmatów u zwierząt swobodnie poruszających się i z unieruchomioną głową

Protokół ten zawiera szczegółowy opis krok po kroku podejścia dla przewlekłego modelu myszy z przewlekłym oknem czaszki oraz mikronaczyniowym zatorem naczyniowym, zoptymalizowanego do mikroskopii in vivo dwufotonowej z użyciem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych.

Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo neuronów podwzgórza za pomocą miniaturyzowanego mikroskopu (miniscope) u swobodnie zachowujących się myszy podczas manipulacji stanem społecznym (izolacja społeczna i spotkanie społeczne). Metoda ta umożliwia obrazowanie aktywności podwzgórza w rozdzielczości pojedynczych neuronów, reprezentując potrzeby społeczne i nasycenie, umożliwiając mechanistyczne badania homeostazy społecznej.

In Vivo Obrazowanie wapnia mikroskopem miniaturowym w podwzgórzu w celu zrozumienia zachowań społecznych u myszy

Poznaj metodę głębokiego obrazowania kory mózgowej myszy za pomocą mikropryzmatów szklanych. Technika umożliwia wizualizację wszystkich sześciu warstw kory z szerokim polem widzenia i rozdzielczością pozwalającą obserwować kolce dendrytyczne.

Obrazowanie in vivo głębokich warstw kory mózgowej z wykorzystaniem mikropryzmatu

Przeglądaj więcej filmów