In vivo (in vivo) Obrazowanie głębokich warstw kory mózgowej za pomocą mikropryzmatu

Mikropryzmaty pod kątem prostym wstawione do kory nowej myszy pozwalają na głębokie obrazowanie wielu warstw kory mózgowej z punktu widzenia zwykle spotykanego w warstwie. Mikropryzmaty o średnicy jednego milimetra oferują szerokie pole widzenia (~900 μm) i rozdzielczości przestrzenne wystarczające do rozdzielenia kolców dendrytycznych. Pokazujemy obrazowanie neuronów warstwy V i obrazowanie naczyń noczu za pomocą mikropryzmatów.

Techniki mikroskopii fluorescencyjnej mają ograniczoną zdolność do obrazowania struktur głęboko w tkance, zwłaszcza w materiałach silnie rozpraszających światło, takich jak tkanka mózgowa. Nawet w przypadku mikroskopii dwufotonowej uzyskanie wysokiej jakości obrazów in vivo struktur neuronalnych, które znajdują się głębiej niż 500 mikronów od powierzchni kory nowej, może być bardzo trudne. Tutaj zielona linia oznacza głębokość 500 mikronów.

Ogólnie rzecz biorąc, warstwy kory nowej czwarta, piąta i szósta znajdują się na wysokości większej niż 500 mikronów od powierzchni. Pokażemy, w jaki sposób jednomilimetrowy szklany mikropryzmat umieszczony w korze nowej może przekazywać światło do i na zewnątrz z powierzchownych i głębokich warstw korowych. Korzystając z tej techniki u myszy, możliwe jest uzyskanie jednomilimetrowego pola widzenia i jednoczesna wizualizacja wszystkich sześciu warstw korowych z perspektywy obrazowania, zwykle znajdującej się tylko w pociętej tkance mózgowej.

Mikropryzmaty oferują szerokie pole widzenia, zdolne do wizualizacji ciał komórek parametalicznych warstwy piątej z ich długimi dendrytami wierzchołkowymi i złożoną siecią naczyń krwionośnych w korze nowej, a wszystko to przy zachowaniu rozdzielczości przestrzennych zdolnych do rozwiązywania kolców dendrytycznych i przepływu czerwonych krwinek przez mikronaczynia włosowate. Nazywam się Thomas Chia i jestem doktorantem w laboratorium profesora Michaela Levine'a na Wydziale Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu Yale. Protokół, który omówimy w tym filmie, będzie dotyczył tego, jak używać mikropryzmatów szklanych o kącie prostym o średnicy jednego milimetra do generowania obrazów fluorescencyjnych struktur o głębokości jednego milimetra w korze nowej myszy.

Używane przez nas mikropryzmaty to jednomilimetrowe pryzmaty kątowe wykonane ze szkła BK seven zakupionego od Opto Sigma Corporation. Mikropryzmaty są obsługiwane za pomocą kleszczy, gdy tylko jest to możliwe. Przeciwprostokątna mikropryzmatu jest pokryta wzmocnionym srebrem, aby zapewnić współczynnik odbicia większy niż 97% od 400 do 2000 nanometrów.

Zapewnia to wewnętrzne odbicie zarówno światła wzbudzenia lasera, jak i dopuszczonej fluorescencji. Używamy specjalnie zbudowanego mikroskopu dwufotonowego zdolnego do obrazowania małych zwierząt. Zwierzę podłączone do urządzenia stereotaktycznego umieszcza się na trzyosiowym zmotoryzowanym stoliku.

Mikroskop jest podłączony do komputera z systemem Windows, na którym uruchomiono skanowany obraz. Skanowanie obrazu za pomocą oprogramowania to oprogramowanie do akwizycji obrazów napisane w MATLAB przez Polo Gudo i wsp. W przypadku obrazowania mikropryzmatycznego zbieramy obrazy w rozdzielczości 10 24 na 10 24 lub pięć 12 na pięć 12 pikseli.

Ponadto zazwyczaj skanujemy z prędkością dwóch milisekund na linię lub czterech milisekund na linię. Ważnym aspektem tego protokołu jest rodzaj obiektywów mikroskopowych stosowanych w połączeniu z mikropryzmatami. W eksperymentach wykorzystywane są dwa rodzaje celów.

Obiektyw po lewej stronie to obiektyw powietrzny o niskiej aperturze numerycznej do obrazowania w szerokim polu widzenia, w tym przypadku obiektyw Olympus o wymiarach cztery x 0,28 NA. Obiektyw po prawej stronie to obiektyw powietrzny o wymiarach 40 x 0,60 z kołnierzem korekcyjnym ze szklanym kołnierzem, który jest w stanie zminimalizować aberracje sferyczne wywołane przez zero do dwóch milimetrów szkła. W celu przygotowania myszy do zabiegu chirurgicznego i wprowadzenia mikropryzmatu, pierwszym krokiem jest odpowiednie znieczulenie zwierzęcia do poziomu odpowiedniego do zabiegów chirurgicznych.

Po pierwsze, waga zwierzęcia jest rejestrowana na podstawie ustalonej dawki. Odpowiednią objętość koktajlu ketaminy i ksylazyny pobiera się do strzykawki. Leki znieczulające są dostarczane przez wstrzyknięcie IP za pomocą igły o rozmiarze 28.

Gdy mysz znajdzie się w płaszczyźnie znieczulenia odpowiedniej do zabiegów chirurgicznych, większość włosów na głowie zwierzęcia jest golona za pomocą drżenia z ostrzem o numerze 40. Następnie na pozostałe włosy na głowie nakłada się natar, aby pomóc stworzyć powierzchnię wolną od włosów, które mogą przeszkadzać mikropryzmatowi. Podczas obrazowania, po pięciu minutach, NA jest czyszczony za pomocą wacika z bawełnianą końcówką, znieczulone zwierzę jest odpowiednio umieszczane w urządzeniu stereotaktycznym myszy.

Podczas zabiegów chirurgicznych i sesji obrazowania zwierzę jest trzymane na wypełnionej wodą poduszce grzewczej ustawionej na 36 stopni Celsjusza. Gdy głowa zwierzęcia jest prawidłowo zamocowana na miejscu, wykonuje się jedno czyste nacięcie wzdłuż przyśrodkowej linii czaszki. Aby oddzielić skórę, niewielką ilość 3% nadtlenku wodoru umieszcza się na waciku z bawełnianą końcówką i nakłada na czaszkę, aby usunąć błony między czaszką a skórą.

Nadtlenek wodoru pomaga również ujawnić BMA, główny punkt orientacyjny w wiedzy, gdzie wykonać kraniotomię i wprowadzić mikropryzmat. Przed rozpoczęciem kraniotomii pręty uszne i pręt zgryzowy są odpowiednio wyregulowane, aby przechylić odsłoniętą czaszkę tak, aby znajdowała się w zasadzie na poziomie stołu. Zapewnia to lepszą platformę do kraniotomii.

Mały wiertło dentystyczne jest podłączony do narzędzia Dremel do kraniotomii. Ustawiamy prędkość na około 7 000 do 10 000 obr./min. Zadzior dentystyczny przesuwa się wzdłuż czaszki, aż w kości utworzy się kwadratowy rowek.

Boki kwadratu mają około dwóch do trzech milimetrów długości i są wyśrodkowane. 1,5 milimetra rozpieszczania i jeden milimetr boczny rema kontynuują przerzedzenie kości, aż do utworzenia małego otworu w czaszce. Para kleszczy może podnieść płat kostny.

Opona twarda musi zostać usunięta, zanim mikropryzmat będzie mógł zostać wprowadzony do kory. Krwawienie najlepiej kontrolować, pozwalając krwi krzepnąć na powierzchni przez kilka minut. Następnie zakrzepła krew jest usuwana za pomocą gąbki chirurgicznej, aby pomóc w wyrównaniu pryzmatu z korą.

Pionowa powierzchnia mikropryzmatu jest ustawiona równolegle do uchwytów na kleszczach. Przy prawidłowym trzymaniu pryzmatu wprowadza się cały mikropryzmat tak długo, aż górna część pryzmatu zrówna się z powierzchnią kory nowej. Tutaj możemy zobaczyć pryzmat spoczywający w korze nowej.

Po prawidłowym włożeniu mikropryzmat powinien pozostać we właściwej pozycji. Krwawienie, które powstaje, jest minimalne i może zostać wchłonięte za pomocą małej gąbki chirurgicznej. Po umieszczeniu pryzmatu zwierzę jest gotowe do obrazowania ze zwierzęciem.

Pod obiektywem o małym powiększeniu można zobaczyć laserowy skan rastrowy nad mikropryzmatem na powierzchni mózgu. Oto kilka reprezentatywnych przykładów obrazów wykonanych od transgenicznych myszy wykazujących ekspresję żółtego białka fluorescencyjnego. W warstwie piątej neuronów korowych za pomocą mikropryzmatów można zobaczyć zbiór dużych ciał komórek parametalicznych w warstwie piątej, prawie jeden milimetr poniżej powierzchni kory

Widoczne są również dendryty wierzchołkowe, które rozciągają się przez wszystkie powierzchowne warstwy przed rozejściem się w kępki za pomocą obiektywu o dużej aperturze numerycznej ze szklaną obrożą korekcyjną, w tym przypadku możliwe jest rozpoznanie kolców dendrytycznych. Na dendrytach wierzchołkowych neuronów parametalicznych warstwy piątej, kolce dendrytyczne są strukturami submikronowymi, a kilka z nich jest identyfikowanych na obrazie za pomocą żółtych grotów strzałek. Można również oznaczyć korowe naczynia krwionośne barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak dekstran fluoresceinowy, stosując sprawdzone techniki wstrzykiwania żył ogonowych.

Korzystając z tej techniki, można zobaczyć naczynia większego kalibru z głębokich warstw rozciągających się w kierunku PIA i rozgałęziających się, tworząc sieć mikronaczyń włosowatych. Tę delikatną sieć mikronaczyń włosowatych w korze nowej najlepiej docenić za pomocą obiektywu o dużej aperturze numerycznej. Ponadto możliwe jest zmierzenie prędkości i strumienia czerwonych krwinek z głębokich naczyń włosowatych kory nowej za pomocą skanowania liniowego.

Czerwona linia wskazuje wzór skanowania linii na obrazie kapilarnym przez mikropryzmat. Ponieważ czerwone krwinki nie pobierają barwnika fluorescencyjnego, pojawią się jako ciemne smugi. Obraz na dole jest wynikiem skanowania linii z wymiarem przestrzennym w jednym AE i wymiarem czasowym w drugim.

AE z tego mogą obliczyć strumień i prędkość czerwonych krwinek przez naczynia włosowate. Po użyciu mikropryzmatu u zwierzęcia można go ponownie użyć kilka razy. Musi być jednak odpowiednio oczyszczony, aby usunąć pozostały materiał biologiczny.

Można to osiągnąć, zanurzając pryzmat w niewielkiej objętości kwasu solnego, a następnie zanurzając go w metanolu. Czysty mikropryzmat można następnie owinąć papierem do soczewek do czasu użycia funkcji. Na tym kończy się nasz protokół dotyczący stosowania mikropryzmatów do obrazowania kory mózgowej in vivo u myszy.

Zastosowanie mikropryzmatów w eksperymencie obrazowym jest stosunkowo proste i oferuje wiele korzyści, jeśli chodzi o badania in vivo kory nowej. Mamy nadzieję, że jest to interesująca technika, którą możesz wykorzystać w swoim laboratorium w przyszłości. Dzięki za oglądanie i powodzenia.