Ilościowa ocena lipidomu drożdży przy użyciu spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylaną

Protokół ten pozwala szybko przeanalizować główne składniki lipidów drożdży. Rozpoczyna się od zebrania i umycia komórek drożdży. Umyte komórki umieszcza się w mieszaninie jednego lub dwóch chloroformów, metanolu i poddaje lizie za pomocą szklanych kulek.

Dodanie chloroformu i wody rozdziela te dwie fazy. Faza organiczna jest zbierana, suszona, a film lipidowy następnie rozpuszczany w chloroformie w celu przechowywania przed spektroskopią mas. Wyekstrahowane lipidy rozcieńcza się w chloroformie i metanolu wodorotlenkiem amonu i dodaje mieszaninę wzorców wewnętrznych.

Roztwór lipidowy można teraz wstrzykiwać bezpośrednio do spektrometru masowego. Cześć, nazywam się Simon Bork i pracuję w laboratorium Vladimira Teco na Wydziale Biologii Uniwersytetu Concordia. Dzisiaj pokażę Wam metodę ilościowego oznaczania lipidów drożdży za pomocą spektroskopii mas.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania zmian lipidów drożdży w różnych warunkach wzrostu. Więc zacznijmy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy zawiesić wcześniej przygotowane zamrożone granulki drożdży w 1,6 mililitra lodu, zimnej wodzie destylowanej i przenieść 1,6 mililitra zawiesiny komórek do szybkoobrotowych szklanych probówek wirówkowych.

Należy pamiętać, że podczas tej procedury wszystkie manipulacje z wyekstrahowanymi lipidami są wykonywane za pomocą szklanych pipet lub strzykawek. Ponieważ tworzywa sztuczne będą wytwarzać duży sygnał tła, jeśli wejdą w kontakt z chloroformem, rozpocznij ekstrakcję lipidów, dodając sześć mililitrów mieszanki metanolu chloroformu w stosunku jeden do dwóch i 0,8 mililitra szklanych kulek odmierzonych w probówce einor do zawiesiny komórki. Dokładne objętości nie są krytyczne, o ile zachowany jest stosunek jeden do dwóch do 0,8 dla chloroformu, metanolu i drożdży zawieszonych w wodzie. Wir.

Zawiesinę komórkową i szklane kulki mieszać dwa razy przez jedną minutę za każdym razem, kontynuować dodając dwa mililitry chloroformu i delikatnie mieszając, a następnie inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej z okazjonalnym mieszaniem. Po pięciominutowej inkubacji dodaj dwa mililitry wody destylowanej i delikatnie wymieszaj. Następnie ponownie inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej z okazjonalnym mieszaniem.

Również w tym przypadku ważniejsze jest utrzymanie proporcji dwa do dwóch do 1,8 dla chloroformu, metanolu i wody, a nie określonej objętości. Po zakończeniu drugiej inkubacji. Wirować przez pięć minut w temperaturze 3000 G w temperaturze pokojowej, zebrać cały supernatant z tej pierwszej ekstrakcji do nowej probówki wirówki ze szkła o dużej prędkości i dodać 3,2 mililitra chloroformu do pozostałych granulek komórkowych W celu drugiej ekstrakcji lipidów.

Wirować granulki komórkowe z dodatkiem chloroformu dwa razy przez jedną minutę za każdym razem. Następnie wirować przez pięć minut w temperaturze 3000 Gs W temperaturze pokojowej dodać supernatant z tej drugiej ekstrakcji do supernatantu zebranego po pierwszej ekstrakcji. Następnie odwirować zebrane supernatanty przez pięć minut.

W temperaturze 3000 g w temperaturze pokojowej wyekstrahowane lipidy rozpuszczają się teraz w dolnej fazie organicznej. Wyrzuć górną fazę wodną i przenieś dolną fazę do nowej szklanej probówki wirówkowej o dużej prędkości. Aby uzyskać czystsze widma na wirówce spektrometru masowego, fazę organiczną przez pięć minut w temperaturze 3000 G w temperaturze pokojowej i przenieść cały supernatant do szklanej fiolki.

Wysuszyć rozpuszczone lipidy w azocie, rozpuścić wysuszony film lipidowy w 500 mikrolitrach chloroformu i przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do momentu przygotowania próbek za pomocą spektrometrii mas. Rozpocząć od przygotowania wzorcowej mieszaniny lipidów w chloroformie, zgodnie z tabelą pierwszą, która znajduje się w dołączonym pisemnym protokole. Każdy lipid reprezentuje inną klasę.

Roztwór ten może być przechowywany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania przed wstrzyknięciem wyekstrahowanych lipidów do spektrometru masowego. Połączone 10 mikrolitrów próbki z 10 mikrolitrami standardowej mieszanki lipidów. Należy pamiętać, że stosunek wzorca do próbki można zmienić w razie potrzeby.

Rozpuścić mieszaninę próbki i wzorcowych lipidów za pomocą spektrometru mas o dwóch masach od Q do F o mikromasie, wyposażonego w źródło nanoelektronsprayu działającego z natężeniem przepływu jednego mikrolitra na minutę. Ustawienia są szczegółowo opisane w tabeli drugiej dołączonego pisemnego protokołu. Chociaż zastosowanie wysokiej rozdzielczości spektrometru mas od Q do F jest korzystne, nie jest to wymóg obowiązkowy.

Dokładne parametry przyrządu będą się różnić w zależności od spektrometru masowego. Po pozyskaniu danych widma mas są wygładzane, tło jest odejmowane, a piki są wyśrodkowane. Na koniec wyeksportuj listę szczytów do programu Excel.

Następnie znormalizuj piki każdej szklanki lipidowej do ich wewnętrznego standardu. W zależności od zastosowania może być konieczne wykonanie dalszej obróbki końcowej, takiej jak izotop de i dekonwolucja. Metoda ta pozwala na szybkie, dogłębne określenie głównych składników lipidów drożdży.

Tutaj podkreśliliśmy jeden lipid, który został de izotop de splątany i znormalizowany do swojego wewnętrznego standardu. Właśnie pokazaliśmy, jak wyizolować lipidy drożdży i jak określić lipidy drożdży za pomocą spektroskopii mas z jonizacją z elektrowyświetlaczem. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby unikać stosowania tworzyw sztucznych i utrzymywać próbkę w liniowym zakresie stężeń.

Ta metoda jest dość elastyczna i w wielu woluminach można ją zmieniać w razie potrzeby. Ten protokół ekstrakcji jest również odpowiedni dla innych metod analizy lipidów, takich jak chromatografia cienkowarstwowa i wielowymiarowa spektroskopia mas. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.