Name: Ilościowa ocena lipidomu drożdży przy użyciu spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylaną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-21T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj ilościową analizę lipidomu drożdży przy użyciu spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylaną. Ta metoda umożliwia szybką identyfikację i kwantyfikację licznych gatunków lipidów z wysoką czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Alainowi Tessierowi za cenne rady, dyskusje oraz wsparcie techniczne. Dziękujemy Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry na Concordia University za wyjątkowe usługi. Praca ta była finansowana z grantów CIHR oraz NSERC w Kanadzie. V.I.T. jest Nowym Badaczem CIHR oraz Katedrą Badawczą Concordia University w zakresie genomiki, biologii komórki i starzenia.

Materiały i metody
<ol>
	<li>Szczepy drożdży i warunki hodowli 
		Szczep typu dzikiego BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) hodowano w bogatym medium YEPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% glukozy). Komórki hodowano w temperaturze 30°C przy wytrząsaniu obrotowym z prędkością 200 rpm w kolbach Erlenmeyera przy stosunku „objętość kolby/objętość medium” wynoszącym 5:1.</li>
	<li>Przechowywanie komórek drożdży do ekstrakcji lipidów 
		<ol>
 	<li>Kulturę komórek o objętości 50 ml zebrano poprzez wirowanie przy 3000 x g przez 5 minut.</li>
			<li>Przemyto dwukrotnie zimną wodą.
				<ol style=" list-style-type:lower-alpha;">
					<li>Resuspendowano osad w 25 ml lodowatej wody</li>
					<li>Odwirowano komórki w wirówce przy 3000 x g przez 5 minut</li>
				</ol></li>
			<li>Resuspendowano osad i przeniesiono do probówki typu Eppendorf</li>
			<li>Odwirowano przy 16 000 x g przez 2 minuty, usunięto nadsącz i zamrożono&nbsp; w temperaturze -80°C do czasu użycia (stosujemy zlewkę z alkoholem izopropylowym przechowywaną w zamrażarce -80°C, można również użyć ciekłego azotu)</li></ol></li>
			<li>Odczynniki 
			Chloroform i metanol klasy biotechnologicznej pochodziły z firmy Sigma-Aldrich. Wolne kwasy tłuszczowe i triacyloglicerole zakupiono w firmie Larodan (Malmo, Szwecja). Różne rodzaje fosfolipidów – w tym fosfatydycholina, fosfatydyloetanoloamina, fosfatydyloinozytol, fosfatydyloseryna, kwas fosfatydowy oraz kardiolipiny – otrzymano z firmy Avanti Polar Lipid (Alabaster, AL, USA). Wysokoobrotowe szklane probówki wirówkowe z zakrętkami wyłożonymi teflonem pochodziły z firmy Fisher.</li>
		</ol>
Ekstrakcja lipidów
Jest to modyfikacja protokołu opisanego przez Bligha i Dyera8. Wszystkie manipulacje z ekstrahowanymi lipidami należy przeprowadzać przy użyciu szklanych pipet lub strzykawek; tworzywa sztuczne wywołają silny sygnał tła w przypadku kontaktu z chloroformem. Dokładne objętości nie są krytyczne, o ile zachowane zostaną proporcje 1:2:0,8 dla chloroformu - MeOH - H2O w kroku 3 oraz 2:2:1,8 dla chloroformu - MeOH - H2O w kroku 7.
<ol>
<li>Zamrożone komórki zawiesić w 1.6 ml lodowatej destylowanej H2O.</li>
<li>Przenieść 1.6 ml zawiesiny komórkowej do szklanych probówek do wirowania wysokoprędkościowego.</li>
<li>Do zawiesiny komórkowej dodać 6 ml mieszaniny chloroformu i MeOH (1:2) oraz 0.8 ml kulek szklanych.</li>
<li>Zawiesinę komórkową z kulkami szklanymi mieszać w vorteksie dwukrotnie przez 1 min.</li>
<li>Dodać 2 ml chloroformu i delikatnie wymieszać.</li>
<li>Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej, okazjonalnie mieszając.</li>
<li>Dodać 2 ml destylowanej H2O i delikatnie wymieszać.</li>
<li>Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej, okazjonalnie mieszając.</li>
<li>Wirować przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Całą fazę ciekłą zebrać do nowej szklanej probówki do wirowania wysokoprędkościowego.</li>
<li>Do osadów komórkowych z etapu 9 dodać 3.2 ml chloroformu.</li>
<li>Mieszać w vorteksie dwukrotnie przez 1 min.</li>
<li>Wirować przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Nastanad osad dodać do fazy ciekłej z etapu 10.</li>
<li>Wirować przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Odlać górną fazę (wodną) i przenieść dolną fazę (organiczną) do nowej szklanej probówki do wirowania wysokoprędkościowego.</li>
<li>Wirować przez 5 min przy 3000 x g w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Cały naddatek przenieść do szklanej fiolki i wysuszyć w strumieniu azotu.</li>
<li>Film lipidowy rozpuścić w 500 μl chloroformu i przechowywać w temperaturze -20°C.</li>
</ol>
Analiza lipidów za pomocą spektrometrii mas
Należy wcześniej przygotować mieszaninę wzorców lipidów w chloroformie zgodnie z Tabelą 1, a także roztwór zapasowy MeOH - chloroform (1:1) z 0,1% (v/v) wodorotlenku amonu.
<ol><li>Przed wstrzyknięciem połączyć 10 μl próbki z 10 μl standardowej mieszaniny lipidów podanej w Tabeli 1, w 200 μL mieszaniny chloroform : metanol w stosunku 1:1 z dodatkiem 0,1% NH4OH.
<ul><li>Stosunek standardu do próbki można zmienić w zależności od potrzeb.</li></ul></li>
<li>Rozdzielenie lipidów przeprowadzić przy użyciu spektrometru mas Micromass Q-TOF 2 wyposażonego w źródło nano-elektrospray pracujące z szybkością przepływu 1 μl/min.
<ul><li>Dokładne parametry instrumentu będą się różnić w zależności od urządzenia. Ustawienia dla spektrometru Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) wyposażonego w źródło nano-elektrospray znajdują się w Tabeli 2. Choć wykorzystaliśmy wysoką rozdzielczość spektrometru mas typu Q-TOF, nie jest ona wymogiem obligatoryjnym.</li></ul></li>
<li>Po akwizycji widma masowe są wygładzane, poddawane odjęciu tła oraz centrowaniu, a następnie lista pików jest eksportowana do programu Excel. Piki każdej klasy lipidów są następnie normalizowane do ich standardu wewnętrznego. W zależności od zastosowania może być konieczne przeprowadzenie dalszego przetwarzania danych, takiego jak deizotopowanie i dekonwolucja.</li></ol>
Tabela 1. Wewnętrzne standardy lipidowe, ich stężenia w mieszaninie standardowej oraz tryb MS dla ich analizy.
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>Klasa lipidów</td>
 <td>Standardowy skład łańcucha</td>
 <td>Masa standardu</td>
 <td>Stężenie (μg/ml)</td>
 <td>Tryb MS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kwas fosfatydowy</td>
 <td>14:0/14:0</td>
 <td>591.40</td>
 <td>100</td>
 <td>Negatywny</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fosfatydyloetanoloamina</td>
 <td>14:0/14:0</td>
 <td>634.45</td>
 <td>200</td>
 <td>Negatywny</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fosfatydyloinozytol</td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Negatywny</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fosfatydyloseryna</td>
 <td>14:0/14:0</td>
 <td>622.37</td>
 <td>40</td>
 <td>Negatywny</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kardiolipina</td>
 <td>4x14:0</td>
 <td>619.92</td>
 <td>100</td>
 <td>Negatywny</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wolne kwasy tłuszczowe</td>
 <td>19:0</td>
 <td>297.28</td>
 <td>100</td>
 <td>Negatywny</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fosfatydylocholina</td>
 <td>14:0/14:0</td>
 <td>650.48</td>
 <td>100</td>
 <td>Pozytywny</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triacyloglicerole</td>
 <td>13:0/13:0/13:0</td>
 <td>698.63</td>
 <td>200</td>
 <td>Pozytywny</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
Tabela 2. Ustawienia instrumentu Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) wyposażonego w źródło nano-elektrospray.
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>&nbsp; </td>
 <td>Przepływ</td>
 <td>Napięcie stożka</td>
 <td>Napięcie kapilary</td>
 <td>Gaz kolizyjny</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tryb dodatni</td>
 <td>1μl/min</td>
 <td>-28 v</td>
 <td>3.0 kv</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tryb ujemny</td>
 <td>1μl/min</td>
 <td>30 v</td>
 <td>-3.2 kv</td>
 <td>10</td>
 </tr>
</tbody>
</table>

<ol><li>Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+lipokine%2C+a+lipid+hormone+linking+adipose+tissue+to+systemic+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism.</a> Cell. 134, 933-944 (2008).</li>
<li>Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+defines+the+interactome+of+the+major+ADP%2FATP+carrier+protein+of+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane.</a> J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).</li>
<li>Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+signal+from+inside+the+peroxisome+initiates+its+division+by+promoting+the+remodeling+of+the+peroxisomal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).</li>
<li>Russell, S. J., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+regulation+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocrine regulation of ageing.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).</li>
<li>Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+storage+and+degradation+of+neutral+lipids+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).</li>
<li>Br&uuml, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &amp, F. T., Lehmann, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+biological+membrane+lipids+at+the+low+picomole+level+by+nano-electrospray+ionization+tandem+mass+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).</li>
<li>Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry+%28ESI-MS%2FMS%29+analysis+of+the+lipid+molecular+species+composition+of+yeast+subcellular+membranes+reveals+acyl+chain-based+sorting%2Fremodeling+of+distinct+molecular+species+en+route+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
</ol>

Metoda ta umożliwia szybką ilościową ocenę lipidomu drożdży przy użyciu łatwo dostępnych, niedrogich materiałów. Metoda pozwala na identyfikację większości gatunków lipidów występujących w komórkach drożdży z wyjątkiem diacylogliceryli, ergosteroli i estrów ergosterylu, choć lipidy te można zidentyfikować, zastępując wodorotlenek amonu wodorotlenkiem litu. Opisana metoda umożliwia identyfikację i oznaczanie ilościowe lipidów przy stężeniach tak niskich jak μg/ml, przy czym liniowość stężeń obejmuje od 2 do 3 rzędów wielk...

ilościowa ocena lipidomu drożdży z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją elektrorsprayową

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipidy są jedną z głównych klas biomolekuł i odgrywają istotne role w dynamice błon, magazynowaniu energii oraz sygnalizacji1-4. Drożdżowiec piekarniczySaccharomyces cerevisiae, jednokomórkowy eukariont możliwy do modyfikacji genetycznej i biochemicznej, o zsekwencjonowanym genomie i bardzo prostym lipidomie, stanowi cenne modelowe narzędzie do badania funkcji biologicznych różnych gatunków lipidów u wielokomórkowych eukariontów2,3,5.S. cerevisiaema 10 głównych klas lipidów o długości łańcucha głównie 16 lub 18 atomów węgla oraz o stopniu nienasycenia równym zero lub jednemu6,7. Istniejące metody identyfikacji i ilościowego oznaczania lipidów – takie jak chromatografia cieczowa wysokiej rozdzielczości, chromatografia cienkowarstwowa, mikroskopia fluorescencyjna oraz chromatografia gazowa połączona z MS – są dobrze ugruntowane, jednak charakteryzują się niską czułością, niewystarczającym rozdzieleniem różnych form molekularnych lipidów, wymagają one pochodzenia lipidów przed analizą lub mogą być czasochłonne. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy opis naszego podejścia eksperymentalnego mającego na celu przezwyciężenie tych wewnętrznych ograniczeń poprzez zastosowanie skanowania badawczego ESI/MS do identyfikacji i ilościowego oznaczania pełnego zestawu lipidów w komórkach drożdży. Opisana metoda nie wymaga chromatograficznego rozdzielania złożonych mieszanek lipidów wyizolowanych z komórek drożdży, co znacznie przyspiesza proces pozyskiwania danych. Ta metoda umożliwia identyfikację i oznaczenie ilościowe lipidów w stężeniach rzędu g/ml i została pomyślnie zastosowana do oceny lipidomów całych komórek drożdży oraz ich oczyszczonych organelli. Ekstrakcja lipidów z całych komórek drożdży w celu zastosowania tej metody analizy lipidów trwa od dwóch do trzech godzin. Uruchomienie każdego próbek ekstrahowanych i wysuszonych lipidów na spektrometrze masowym Q-TOF wyposażonym w źródło nano-elektrospreju trwa zaledwie pięć do dziesięciu minut.

Opisujemy nową ilościową metodę lipidomiki służącą do identyfikacji licznych gatunków lipidów w drożdżach z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją przez elektroryś spray w trybie skanowania przeglądowego (ESI/MS). Metoda ta przewyższa obecnie dostępne metody identyfikacji i oznaczania ilościowego lipidów pod względem zdolności do rozdzielania różnych form cząsteczkowych lipidów, czułości oraz szybkości analizy.

Ilościowa ocena lipidomu drożdży z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją elektrorsprayową

Lipidy stanowią jedną z głównych klas biomolekuł i odgrywają istotne role w dynamice błon, magazynowaniu energii oraz sygnalizacji1-4. Drożdże pączkujące...

Niniejszy protokół umożliwia szybką analizę głównych składników lipidów drożdżowych. Procedurę rozpoczyna się od zebrania i przemycia komórek drożdży. Przemyte komórki umieszcza się w mieszaninie chloroformu i metanolu w stosunku od 1:1 do 2:1, a następnie poddaje lizie za pomocą szklanych kulek.Dodanie chloroformu i wody powoduje rozdzielenie obu faz. Fazę organiczną zbiera się i osusza, a następnie film lipidowy rozpuszcza w chloroformie w celu przechowywania przed spektrometrią mas. Ekstrahowane lipidy rozcieńcza się w chloroformie i metanolu z wodorotlenkiem amonu, po czym dodaje mieszaninę standardów wewnętrznych.Roztwór lipidów można teraz wstrzyknąć bezpośrednio do spektrometru mas. Cześć, jestem Simon Bork z laboratorium Vladimira Teco w Departamencie Biologii Uniwersytetu Concordia. Dzisiaj zaprezentuję metodę ilościowego oznaczania lipidów drożdżowych przy użyciu spektrometrii mas.Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania zmian w lipidach drożdży w różnych warunkach wzrostu. Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, resuspenduj wcześniej przygotowane mrożone pellety drożdży w 1,6 mililitrów lodowatej wody destylowanej, a następnie przenieś 1,6 mililitrów zawiesiny komórkowej do szklanych probówek do wirówki wysokich obrotów.Należy pamiętać, że w całej tej procedurze wszystkie manipulacje z wyekstrahowanymi lipidami wykonuje się przy użyciu szklanych pipet lub strzykawek. Ponieważ tworzywa sztuczne generują silny sygnał tła w kontakcie z chloroformem, ekstrakcję lipidów należy rozpocząć od dodania do zawiesiny komórkowej sześciu mililitrów mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku jeden do dwóch oraz 0,8 mililitrów kulek szklanych odmierzonych w probówce typu einor. Dokładne objętości nie są krytyczne, o ile zachowany zostanie stosunek jeden do dwóch do 0,8 dla chloroformu, metanolu i drożdży zawieszonych w wodzie. Wymieszać w wstrząsaciu typu vortex. Zawiesinę komórkową z kuleczkami szklanymi miesza się dwukrotnie po jednej minucie, następnie dodaje dwa mililitry chloroformu, miesza delikatnie i inkubuje przez pięć minut w temperaturze pokojowej, sporadycznie mieszając. Po pięciu minutach inkubacji dodaje dwa mililitry wody destylowanej i miesza delikatnie. Następnie ponownie inkubuje przez pięć minut w temperaturze pokojowej, sporadycznie mieszając.Tutaj również ważniejsze od konkretnej objętości jest zachowanie stosunku 2:2:1.8 dla chloroformu, metanolu i wody. Po zakończeniu drugiej inkubacji odwirować próbkę przez pięć minut przy 3000 Gs w temperaturze pokojowej, zebrać cały nadsącz z tej pierwszej ekstrakcji do nowej szklanej probówki do wirowania wysokich prędkości i dodać 3,2 ml chloroformu do pozostałego osadu komórkowego w celu przeprowadzenia drugiej ekstrakcji lipidów.Osady komórkowe z dodanym chloroformem mieszaj w wibratorze typu vortex dwa razy po jednej minucie. Następnie wiruj przez pięć minut przy 3000 Gs. W temperaturze pokojowej dodaj nadsącz z tej drugiej ekstrakcji do nadsączu zebranego po pierwszej ekstrakcji. Następnie wiruj zebrane nadsącze przez pięć minut.Po wirowaniu z prędkością 3000 Gs w temperaturze pokojowej wyekstrahowane lipidy znajdują się teraz w dolnej fazie organicznej. Odrzuć górną fazę wodną i przelej dolną fazę do nowej szklanej probówki do wirowania wysokiego. Aby uzyskać czystsze widma w spektrometrze mas, wiruj fazę organiczną przez pięć minut z prędkością 3000 Gs w temperaturze pokojowej, a następnie przelej cały supernatant do szklanej fiolki.Wysuszyć rozpuszczone lipidy w strumieniu azotu, rozpuścić wysuszoną warstwę lipidową w 500 µL chloroformu i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy próbek metodą spektrometrii mas. Rozpocząć od przygotowania mieszaniny wzorcowej lipidów w chloroformie, zgodnie z listą zamieszczoną w tabeli 1 w załączonym protokole pisemnym. Każdy lipid reprezentuje inną klasę.Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania przed wstrzyknięciem wyekstrahowanych lipidów do spektrometru mas. Połączono 10 µL próbki z 10 µL mieszaniny standardów lipidowych. Należy pamiętać, że stosunek standardu do próbki można zmienić w zależności od potrzeb.Rozdziel mieszaninę lipidów z próbek i standardów za pomocą spektrometru mas Q-TOF, wyposażonego w źródło nano-elektrospray pracujące przy szybkości przepływu 1 µL/min. Ustawienia szczegółowo opisano w tabeli 2 dołączonego protokołu pisemnego. Choć wysoka rozdzielczość spektrometru mas Q-TOF jest korzystna, nie jest ona wymogiem obligatoryjnym.Dokładne parametry instrumentu będą się różnić w zależności od spektrometru mas. Po akwizycji danych widma mas są wygładzane, odejmowane jest tło, a piki są centrowane. Na koniec należy wyeksportować listę pików do programu Excel.Następnie należy znormalizować piki każdego szkła lipidowego względem ich standardu wewnętrznego. W zależności od zastosowania może być konieczne przeprowadzenie dalszej obróbki, takiej jak usunięcie izotopów oraz dekonwolucja. Metoda ta pozwala na szybkie i szczegółowe oznaczenie głównych składników lipidomu drożdży.Tutaj wyróżniliśmy jeden lipid, który został poddany dekonwolucji izotopowej i znormalizowany względem wzorca wewnętrznego. Przedstawiliśmy właśnie sposób izolacji lipidów drożdżowych oraz metodę ich oznaczania z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją elektrorzutową. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o unikaniu stosowania tworzyw sztucznych oraz utrzymywaniu stężenia próbki w zakresie liniowym.Metoda ta jest dość elastyczna i w wielu przypadkach objętości mogą być zmieniane według potrzeb. Niniejszy protokół ekstrakcji nadaje się również do innych metod analizy lipidów, takich jak chromatografia cienkowarstwowa oraz wielowymiarowa spektrometria mas. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

a-quantitative-assessment-yeast-lipidome-using-electrospray

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena ilościowa lipidomiu drożdży przy użyciu spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpyłową

W niniejszej pracy opisujemy nową ilościową technikę proteomiczną służącą do identyfikacji kompleksów białkowych u Saccharomyces cerevisiae. W badaniu tym wykorzystaliśmy metodę SILAC wraz z oczyszczaniem powinowactwowym, a następnie tandemową spektrometrią mas, aby z wysoką specyficznością zidentyfikować partnerów wiążących białko ER, Scs2p.

Identyfikacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

Opis ilościowej procedury fosforylacji z wykorzystaniem kriolizy, solubilizacji mocznikiem, frakcjonowania HILIC oraz wzbogacania peptydów fosforylowanych metodą IMAC.

Ilościowa fosfoproteomika w Saccharomyces cerevisiae stymulowanych kwasami tłuszczowymi

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Tutaj prezentujemy implementację MATLAB automatycznego wykrywania i ilościowego opisu kropelek lipidów w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej rozszczepienia i pączkowania komórek drożdży.

Analiza zawartości kropelek lipidów w drożdżach rozszczepialnych i pączkujących przy użyciu zautomatyzowanego przetwarzania obrazu

Prezentujemy protokół wykorzystujący chromatografię cieczową w połączeniu z tandemową spektrometrią mas do identyfikacji i ilościowego oznaczania głównych lipidów komórkowych u Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda ilościowej oceny głównych klas lipidów w komórce drożdży jest wszechstronna, solidna i czuła.

Analiza ilościowa lipidomu komórkowego Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Tutaj przedstawiono protokół metabolicznego znakowania drożdży kwasem 14C-octowym, który jest sprzężony z chromatografią cienkowarstwową w celu oddzielenia obojętnych lipidów.

Analiza neutralnej syntezy lipidów w Saccharomyces cerevisiae za pomocą znakowania metabolicznego i chromatografii cienkowarstwowej

Niniejszy film prezentuje przygotowanie ultrascienistej warstwy matrycy/analitu do analizy peptydów i białek za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-MS).

Przygotowanie próbek do analizy MALDI: metoda ultracienkiej warstwy

Metoda SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies) łączy wzbogacanie peptydów metodą powinowactwa z masową spektrometrią z rozcieńczeniem izotopem stabilnym (MRM-MS), aby zapewnić ilościowe pomiary peptydów jako substytutów odpowiadających im białek. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół z wykorzystaniem cząstek magnetycznych w formacie częściowo zautomatyzowanym.

Ilościowe oznaczanie białek z wykorzystaniem immunoafinityjnego wzbogacania peptydów sprzężonego ze spektrometrią mas

Spektrometria mas MALDI-TOF została z powodzeniem wykorzystana do monitorowania wymiany wodoru/deuteru w wiązaniach amidowych podczas aktywacji kinazy białkowej Pak2.

Analiza aktywacji Pak2 za pomocą wymiany wodoru na deuter w wiązaniach amidowych oraz spektrometrii mas MALDI-TOF

Poznaj ilościową analizę lipidomu drożdży przy użyciu spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylaną. Ta metoda umożliwia szybką identyfikację i kwantyfikację licznych gatunków lipidów z wysoką czułością.

Ilościowa ocena lipidomu drożdży z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją elektrorsprayową

Przeglądaj więcej filmów