Izolacja i ekspansja w surowicy zwierzęcej ludzkich mezenchymalnych komórek zrębu pochodzących z pępowiny (MSC) i komórek progenitorowych tworzących kolonie śródbłonka (ECFC)

Ten protokół opisuje izolację i późniejszą ekspansję mezenchymalnych komórek zrębu i komórek tworzących kolonie śródbłonka bez użycia surowicy zwierzęcej do generowania autologicznych par do celów eksperymentalnych przeszczepów.

Ludzka pępowina jest łatwo dostępnym źródłem komórek progenitorowych. W tym artykule opisano protokół izolacji, a następnie ekspansji komórek progenitorowych śródbłonka i CFC, subpopulacji komórek w obrębie ściany naczynia i mezenchymalnych komórek progenitorowych. MSCs pochodzące z pojedynczej ludzkiej pępowiny.

Najpierw za pomocą nożyczek wzdłużnie przeciąć wzdłuż ludzkiej żyły pępowinowej i zeskrobać komórki z wewnętrznej powierzchni naczynia. Przenieś komórki ze skrobaka do kolby i poczekaj na wyrostek kolonii. Niektóre z zeskrobanych komórek będą wykazywać fenotyp progenitorowy i będą się silnie rozmnażać, tworząc duże kolonie.

Po namnażeniu się tych komórek, e CFC mogą być namnażane w nowych kolbach. W celu dalszej analizy można również wyizolować populację komórek mezenchymalnych z ludzkiej pępowiny. Pokrój części pępowiny na małe kawałki i przenieś je na sterylną płytkę hodowlaną.

Po kilku dniach wyrost komórek zrębu będzie widoczny wokół fragmentów tkanki rdzenia międzynaczyniowego. Przenieś te komórki do nowych kolb i rozwiń je do dalszej analizy. Protokół ten pozwala na uzyskanie dwóch rodzajów linii komórek progenitorowych z jednego sznura materiału wyjściowego w ciągu trzech do czterech tygodni.

Cześć, nazywam się Andreas Danish i pracuję w laboratorium dr T. Stronga w jednostce badawczej zajmującej się komórkami macierzystymi na Uniwersytecie Medycznym w Austrii. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę izolacji, ekspansji i analizy ludzkich komórek mezenchymalnych i śródbłonka kanałów z jednego kodu pępowinowego. Tylko jedna uwaga na temat terminologii.

Nasze komórki nazywane są multipotencjalnymi, mezenchymalnymi komórkami zrębu lub MME i śródbłonkiem tworzącymi okrężnicy pro komórki lub e CSC. Używamy tej procedury w naszym laboratorium do badania funkcji i biologii niehematycznych komórek progenitorowych. Więc zacznijmy.

Przed przystąpieniem do izolacji komórek należy przetrzeć kaptur do hodowli tkankowej z przepływem laminarnym inadiną i zebrać sterylne płytki do hodowli komórkowych. Kolby do hodowli komórkowych, sterylizowane narzędzia chirurgiczne PBS, skrobaki do komórek, uchwyt na probówkę, 25-mililitrowe paski i pięciomililitrowa strzykawka wyposażona w igłę z końcem. Pamiętaj, aby podgrzać dwukomórkową pożywkę do hodowli alfa MEM i EGM w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni.

Teraz przenieś pępowinę do przepływu laminarnego i umyj ją dwukrotnie w PBS. Aby usunąć zanieczyszczającą krew, użyj sterylnej pięciomililitrowej strzykawki, aby kaniulować żyłę pępowinową po jednej stronie. Teraz przepłucz żyłę pępowinową PBS, aż płyn wypłynie.

Drugi koniec przewodu staje się całkowicie przezroczysty bez czerwonego odcienia. Rozpocznij izolację kolonii śródbłonka tworzącej komórkę progenitorową, wypełniając kolbę o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych 15 do 20 mililitrami wstępnie podgrzanego podłoża EGM dwa. Umieść pępowinę na nowej płytce wypełnionej sterylnym PBS i za pomocą nożyczek chirurgicznych przeciąć pępowinę na dwie części, z których każda ma około pięciu centymetrów długości.

Teraz włóż jedno ostrze nożyczek chirurgicznych i przetnij żyłę wzdłużnie. W tym momencie asystent może użyć kleszczy do przytrzymania żyły podczas wykonywania dalszych cięć. Umieść sznurek z otwartą żyłą w nowej płytce.

Bez PBS użyj skrobaka do komórek, aby przetrzeć wewnętrzną powierzchnię żyły na obszarze co najmniej jednego centymetra. Umyć skrobak w dwóch pożywkach EGM, aby uwolnić wtarte komórki naczynia do kolby. Ta procedura będzie musiała zostać powtórzona do 10 razy.

Zamknij kolbę i umieść ją w inkubatorze ustawionym na 37 stopni, 5% dwutlenku węgla i 95% wilgotności. Teraz, gdy e CFC zostały wyizolowane, przejdźmy do MSC. Teraz, gdy warstwa śródbłonka została zeskrobana, użyj sterylnego skalpela, aby pociąć pępowinę na bardzo małe kawałki.

Jeden do dwóch milimetrów. Maksymalnie użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść te kawałki na wstępnie oznakowaną płytkę hodowlaną. Pozostaw płytkę otwartą na co najmniej pięć minut przed napełnieniem jej medium, aby kawałki mogły przylgnąć do plastikowej powierzchni.

Używając najniższej możliwej prędkości, delikatnie dodaj 30 do 35 mililitrów wstępnie podgrzanego MEM zmodyfikowanego alfa. Zamknij płytkę i umieść ją w inkubatorze ustawionym na 37 stopni z 5% dwutlenkiem węgla i 95% wilgotnością. Wyrastanie mezenchymalnych komórek zrębu z kawałków pępowiny zajmie od trzech do siedmiu dni, po czym komórki mogą się rozprężać.

Tymczasem ECFC można rozbudować, co pokaże Ci się w kolejnym kroku. Następnego dnia użyj odwróconego mikroskopu, aby zbadać komórki. Jeśli procedura skrobania została wykonana prawidłowo, pierwsze proliferujące skupiska komórek będą całkowicie widoczne.

Wymień dwa podłoża E GM, aby usunąć wszystkie nieprzyłączone komórki i cząstki. Rozszerzaj komórki i wymieniaj jedną trzecią pożywki dwa razy w tygodniu. Po 10 do 12 dniach regularnie obserwuje się bardzo duże kolonie śródbłonka.

Teraz usuń pożywkę i przemyj PBS, aby pozbyć się pozostałego zużycia białka. 0,05% trypsyna 0,7 milimolowego EDTA, aby odłączyć komórki. Podczas przenoszenia komórek do nowych naczyń hodowlanych należy pamiętać o wyborze kolb o odpowiedniej wielkości, aby uzyskać niską gęstość wysiewu.

Pomoże to w dalszej ekspansji. Nasze laboratorium zwykle cofa potomstwo z ponad 20 dużych kolonii do czterech dwustu dwudziestu pięciu centymetrów kwadratowych kolb. Nie zapomnij wymienić jednej trzeciej podłoża dwa razy w tygodniu.

Podobny protokół jest używany do rozbudowy MSC w następnej sekcji. Po upływie trzech do siedmiu dni użyj odwróconego mikroskopu, aby sprawdzić, czy w pobliżu przyczepionej tkanki pojawiają się komórki w kształcie wrzeciona. Gdy wyrostek komórek jest wystarczający, kawałki mają tendencję do przyczepiania się, gdy tracą kontakt z plastikiem.

Po 10 do 12 dniach usuń kawałki tkanki. Odłączyć MSCs od tworzywa sztucznego za pomocą roztworu trypsyny EDTA i przenieść komórki do nowych, wstępnie napełnionych kolb hodowlanych o odpowiedniej wielkości i liczbie, aby zagwarantować niską gęstość wysiewu podczas ekspansji komórek. Konieczna będzie wymiana jednej trzeciej pożywki dwa razy w tygodniu, gdy oba typy komórek zostaną rozszerzone.

Barwienie, a następnie cytometria przepływowa mogą być przeprowadzone w celu wykrycia ekspresji markera powierzchniowego komórki wskazującego na fenotypy progenitorowe i ustalenia, czy nie ma zanieczyszczenia komórkami krwiotwórczymi. Wysiewaj czyste zebrane e CFC przy bardzo niskiej gęstości posiewu wynoszącej trzy lub 10 komórek na centymetr kwadratowy na płytkach do hodowli komórkowych, aby zagwarantować wzrost pojedynczej kolonii, wymieniaj jedną trzecią pożywki dwa razy w tygodniu po 14 dniach. Koniec kultury.

Usuń nośnik. Umyj dwukrotnie PBS i utrwal kolonie lodowatym roztworem utrwalającym Przez 15 minut w lodówce wylej roztwór utrwalający i pozostaw płytki otwarte do wyschnięcia na 10 minut. Nawadniaj komórki wodą destylowaną przez 10 minut.

Dodaj roztwór hematyny Harris i barwij utrwalone kolonie przez 12 minut. Usuń roztwór hematyny i spłucz płytki wodą z kranu. Aby pozbyć się pozostałego roztworu barwiącego.

Rób zdjęcia każdej kolonii za pomocą mikroskopu stereoskopowego i importuj pliki w formacie jpeg lub TIFF na swój komputer. Otwórz zdjęcia za pomocą oprogramowania obrazu J i przeanalizuj dokładną liczbę komórek każdej kolonii zgodnie z opisem w poniższej animacji. Otwórz oprogramowanie obrazu J i zaimportuj obraz kolonii za pomocą funkcji otwierania pliku w menu rozwijanym.

Kontynuuj, korzystając z procesu. Funkcja odejmowania tła. Użyj funkcji wyboru eliptycznego lub pędzla w menu obrazu J, aby oznaczyć margines kolonii.

Wyczyść otaczający obraz za pomocą funkcji edycji wyczyść na zewnątrz i przytnij obraz, wybierając opcję przycinania obrazu. Dostosuj próg ręcznie za pomocą funkcji regulacji progu obrazu, aby wszystkie komórki były całkowicie pokolorowane. Czerwony. Policz numer komórki kolonii, wybierając.

Analizuj, analizuj cząstki. Wybierz odpowiednie ustawienia zoptymalizowane dla każdego typu komórki i wybierz opcję OK Jeśli zostało wykonane poprawnie. Protokół ten pozwala na izolację praktycznie czystej populacji komórek, które mają wspólne cechy ludzkich śródbłonków i mezenchymalnych komórek progenitorowych, które są autologiczne względem siebie, ponieważ pochodzą z tego samego rdzenia.

Począwszy od piątego dnia, wrzecionowate komórki mezenchymalne pojawią się spod kawałka sznurka przymocowanego do płytki hodowlanej. Po jednym do dwóch dni pierwsze skupiska kolonii śródbłonka tworzące komórki progenitorowe lub e CFC staną się widoczne pod odwróconym mikroskopem. Owa raptownie rosnąca ogromna kolonia e-freonów uformowała się po 11 dniach.

Zarówno MSC, jak i E CFC mogą być przepasywane i dalej rozbudowywane. Zalecamy późniejszą analizę wszystkich produktów hodowlanych za pomocą cytometrii przepływowej w celu potwierdzenia odpowiedniego fenotypu. Należy pamiętać, że zarówno linia śródbłonka, jak i mezenchymy reagują na przeciwciała specyficzne dla CD 73, CD 1 46, CD 29 i CD 1 0 5.

Należy zauważyć, że MSCs wykazywały ekspresję uda jednego, który został wykryty przy użyciu przeciwciała anty CD 90. E CFC są dodatnie dla CD 31, który jest również nazywany cząsteczką adhezyjną komórek śródbłonka płytek krwi lub pcam. Powszechnie wiadomo, że ekspresja immunoreaktywności CD 34 w pępowinie przez E-CFC może być zmniejszona poprzez wielokrotne hodowle.

Markery krwinek, takie jak CD 45 H-L-A-D-R i CD 14, pozostały ujemne dla obu typów komórek. Hierarchię komórek progenitorowych wśród E CFC można ocenić za pomocą oprogramowania Image J, zliczając dokładną liczbę komórek każdej pojedynczej kolonii. Właśnie pokazaliśmy, jak izolować, rozszerzać i analizować maczugi i ECE z ludzkiego kodu pępowinowego podczas wykonywania tej procedury.

Ważne jest, aby pracować w sterylnych warunkach i sprawdzać fenotyp i czystość przed użyciem komórek w kolejnych badaniach. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.