Oczyszczanie określonej populacji komórek za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)

Cześć, jestem Hope Campbell, specjalistka cytometrii przepływowej z Instytutu Badań Krwi w Centrum Krwi w Wisconsin. Cześć, jestem STR Baso, jestem doktorantem w laboratorium dr Bonnie Dieter. Jestem również w Instytucie Badań Krwi w Centrum Krwi w Wisconsin.

Dzisiaj przeprowadzimy procedurę izolacji komórek za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie. Stosujemy tę procedurę w laboratorium do badania funkcji limfocytów i populacji komórek szpikowych. Zacznijmy.

W tej procedurze cztery limfocyty T B i CD zostaną oczyszczone z cytów myszy. Początkową liczbę komórek docelowych należy obliczyć na podstawie liczby potrzebnych komórek i szybkości odzyskiwania maszyny przy użyciu tej metody. Typowy wskaźnik odzysku dla limfocytów T B i CD wynosi 85 do 90%Początkowa populacja cytów SP to około 60 do 70% komórek B i 20 do 30% limfocytów T.

Tak więc, jeśli zaczniesz od 100 razy 10 do 6 komórek, będziesz w stanie odzyskać od 50 do 60 milionów komórek B i 20 do 30 milionów limfocytów T przed rozpoczęciem faktów. Roztwory i odczynniki potrzebne do sporządzenia protokołu należy umieścić na lodzie. Należą do nich bufor barwiący składający się z buforowanej fosforanami soli fizjologicznej z 3% buforem zawiesinowym surowicy cielęcej płodu składającym się z 25 milimolowych HEP przygotowanych w zrównoważonym roztworze soli Hanka lub HBSS zawierającym 3% płodowy roztwór witaminy B w surowicy cielęcej A, przygotowany w płodowej surowicy cielęcej, przeciwciała barwiące i kulki kompensacyjne.

Protokół ten wymaga również następujących materiałów eksploatacyjnych i odczynników: rurki stożkowe o pojemności 15 mililitrów, rurki przepływowe z polistyrenu lub polipropylenu o wymiarach 12 na 75 milimetrów. W tym celu należy również przygotować nylonowe sitko do komórek trien blue i probówki do sortowania hemocytometru do sortowania w tym celu.

Przy 300 mikrolitrach roztworu FCS do rur przepływowych lub jednym mililitrze roztworu HEPs FFC S na 15 mililitrowych rurek stożkowych. Należy je umieścić na lodzie do momentu rozpoczęcia procesu zbierania. Zacznij od wygenerowania zawiesiny pojedynczej komórki żądanej populacji komórek.

Jeśli komórki zostaną wyizolowane, przy użyciu tej procedury zostaną wyhodowane. Całe przygotowanie komórek powinno być przeprowadzone w kapturze do hodowli tkankowej. Używając sterylnej techniki, umyj komórki raz, dodając lodowaty bufor barwiący i resus, zawieszając komórki poprzez kilkakrotne odwrócenie probówki.

Następnie odwirowywać komórki przez siedem do ośmiu minut w temperaturze około 250 GS i czterech stopni Celsjusza. Warunki prania mogą się różnić w zależności od rodzaju komórek i stężenia. W przypadku cytów przemyj do 200 razy od 10 do sześciu komórek 10 mililitrami buforu barwiącego.

Ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację, tak aby osad komórek pozostał nienaruszony. Następnie ponownie zawieś komórki w lodowatym buforze barwiącym w stężeniu do 50 razy od 10 do szóstego na 100 mikrolitrów. Ponownie zawiesić osad komórkowy, przesuwając lub delikatnie obracając rurkę.

Następnie przenieś 0,25 do jednego razy 10 z sześciu komórek do nowej rurki przepływowej z polistyrenu lub polipropylenu o wymiarach 12 na 75 milimetrów na lodzie. I odłóż to na bok, aby użyć później jako niebarwioną próbkę kontrolną do pierwszej probówki, dodaj przeciwciała pierwszorzędowe do zawiesiny komórki, aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe. Tutaj czerwone sprzężone przeciwciała anty B 20 PE Texas są używane do barwienia komórek B, podczas gdy sprzężone ZI anty TCR R beta i/lub 700 sprzężone przeciwciała anty CD 4 są używane do barwienia limfocytów T zmieszanych przez strzepnięcie dna probówki lub przez światło.

Wirowanie, a następnie umieść komórki na lodzie i inkubuj w ciemności przez 20 do 30 minut. Po inkubacji przemyć znakowane komórki za pomocą preparatu Resus, zawieszając je w 10 mililitrach lodowatej zawiesiny, buforu i centrifikuji jak poprzednio, po ostrożnym usunięciu supernatantu. Powtórz ten krok, aby umyć komórki po raz drugi.

Na koniec ponownie zawieś komórki w lodowatym buforze zawiesiny. Jeśli przeciwciała pierwszorzędowe nie są bezpośrednio sprzężone z fluorem czterech, dodać znakowane przeciwciała drugorzędowe lub paciorkowiec AVID w koniugatu z zawiesiną komórkową i ponownie inkubować komórki na lodzie w ciemności przez 20 do 30 minut po inkubacji. Przemyć komórki dwukrotnie lodowatym buforem zawiesiny.

Po resusie zawiesić komórki w lodowatym buforze zawiesiny. Określ stężenie i żywotność komórek za pomocą ważnego barwnika, takiego jak błękit trianowy i cytometr hemologiczny. Dostosuj stężenie komórek do 10 do 20 razy od 10 do szóstych komórek na mililitr, dodając bufor zawiesinowy, aby uniknąć zatkania faksu skupiskami komórek, które mogły umrzeć podczas izolacji.

Procedura i barwienie. Przefiltrować komórki przez sitko kroplowe bezpośrednio przed rozpoczęciem protokołu sortowania. Wielkość porów sitka należy dobrać w zależności od typu komórki, w przypadku cytów stosuje się sitko o wielkości porów 40 mikrometrów.

Zbierz przefiltrowane komórki w 15-litrowej stożkowej rurce lub rurkach przepływowych o wymiarach 12 na 75 milimetrów, w zależności od objętości. I umieść komórki na lodzie, podczas gdy cytometr jest ustawiony do procedury sortowania. W przypadku stosowania kulek BD Comp jako jednokolorowych kontroli pozytywnych, należy przygotować jedną probówkę kontrolną dla każdego koloru użytego w teście oraz niebarwioną probówkę kontroli ujemnej.

Po dokładnym zawirowaniu zawiesin perełek dodaj jedną, upuść każdą z ujemnych i dodatnich zawiesin kulek do bufora zawiesiny o pojemności 100 mikrolitrów dla każdego użytego koloru i kontroli ujemnej. Następnie dodaj jeden mikrolitr znakowanego przeciwciała do każdej probówki kontroli dodatniej. W tym eksperymencie jedna probówka jest przygotowywana przy użyciu przeciwciał PE Texas'Red B dwa 20.

Jeden z użyciem fit ETCR beta przeciwciał i jeden z lor 700 CD cztery przeciwciała zmieszane przez strzepnięcie dna probówek i inkubować przez 15 do 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Umyj koraliki raz dwoma mililitrami barwnika, buforem i odwiruj w temperaturze 200 g przez 10 minut. Usunąć supernatant przez aspirację i ponownie zawiesić granulkę kulki w 200 do 500 mikrolitrach barwienia.

Konfiguracja bufora cytometru przepływowego różni się w zależności od producenta i powinna być wykonywana wyłącznie przez odpowiednio przeszkolony personel. Procedura sortowania komórek zostanie tutaj przeprowadzona przy użyciu arii defektów BD. Przed sortowaniem wybierz odpowiednią dyszę w zależności od typu ogniwa, które ma być sortowane.

Dostępne rozmiary arii faktów to 70 mikrometrów, 100 mikrometrów i 130 mikrometrów. Rozmiar dyszy powinien być co najmniej trzy razy większy od wielkości komórki, która ma być sortowana pod kątem limfocytów, wybiera się dyszę o średnicy 70 mikrometrów. Aseptyczne sortowanie komórek można przeprowadzić przy użyciu opcji sortowania aseptycznego urządzenia.

Korzystając z tej opcji, cała ścieżka osłony jest odkażana 70% etanolem zgodnie z instrukcjami producenta. Pamiętaj, aby wymienić filtry osłonowe i zastąpić PBS sterylnym PBS. Gdy cytometr będzie gotowy do pracy, umieść wstępnie schłodzone probówki zbiorcze zawierające sterty FCS w odpowiednim urządzeniu do pobierania.

Dostępne urządzenia zbierające mogą pomieścić do dwóch 15-mililitrowych rurek stożkowych. Cztery rurki o wymiarach 12 na 75 milimetrów lub cztery mikrorurki. Użyj probówek o wymiarach 12 na 75 milimetrów do zbierania mniej niż 1,5 razy 10 do szóstych komórek i 15 mililitrowych stożkowych probówek do zbierania 1,5 razy 10 do sześciu do 4,5 razy 10 do szóstych komórek.

Umieść odpowiednie urządzenie zbierające w komorze sortowania. Skieruj strumienie boczne do zainstalowanego urządzenia zbierającego w celu sortowania wielokolorowego. Cytometr należy najpierw skalibrować, aby uwzględnić nakładanie się widm między detektorami.

Pokazany tutaj przykład ilustruje nakładanie się widm emisyjnych dopasowania E i pe. To nakładanie się pokazane w ciemnym zacienionym obszarze nazywa się rozlewaniem. W tym przypadku rozlanie się PE zostanie wykryte w kanale fit E, a rozlanie się fit e zostanie wykryte w kanale PE.

To rozlanie się musi zostać skorygowane w celu wyeliminowania fluorescencji szczątkowej jednego piętra czwartego w innym kanale. Proces korygowania skutków ubocznych nazywa się kompensacją w celu przeprowadzenia kompensacji ręcznej. Użyj oprogramowania do cytometrii, aby skonfigurować szablon, który zawiera wykres dwóch zmiennych w celu wyświetlenia FSC rozproszenia do przodu i rozrzutu bocznego SSC oraz jeden histogram dla każdego fluro, który zostanie użyty.

Metoda ustawiania tych wykresów różni się w zależności od oprogramowania. Umieścić probówkę z kontrolą ujemną w porcie ładowania cytometru i rozpocząć gromadzenie danych w trakcie pracy próbki. Dostosuj FSC i SSC, aby umieścić populację zainteresowania na skali.

Następnie dostosuj ustawienia PMT fluorescencji, aby umieścić populację ujemną lub autofluorescencję w skrajnej lewej części histogramu. Nagrać probówkę kontroli ujemnej. Wyjmij probówkę kontroli ujemnej z portu ładowania cytometru i zastąp ją pierwszą probówką z kontrolą dodatnią.

Teraz rozpocznij akwizycję. Powtórzyć ten proces dla każdej z probówek kontroli dodatniej, rejestrując dane dla każdej probówki. Dla każdej kontroli dodatniej narysuj bramkę lub ramkę przedziału wokół zdarzeń zarejestrowanych na histogramie.

Następnie narysuj kolejną bramkę interwałową w ujemnej części histogramu. Wykonując kompensację ręczną, należy wziąć pod uwagę każdą fluro użytą w eksperymencie, dostosowując medianę wyników dodatnich, aż będzie równa medianie wyników ujemnych. Aby dostosować medianę, dostosuj wartości nakładania się widma, wyższe lub niższe, aż mediany dla każdego parametru fluorescencyjnego będą jak najbardziej zbliżone.

Korzystając z ustawień ustalonych dla dodatnich i ujemnych próbek kontrolnych, należy przygotować się do procedury sortowania, określając ustawienia chodu dla próbki doświadczalnej. Umieść probówkę z komórkami do sortowania w porcie ładowania cytometru i rozpocznij akwizycję z prędkością od 9 do 10 000 zdarzeń na sekundę. Wybierz wykres punktowy, aby wyświetlić punktowy do przodu i punktowy z boku.

Rozproszenie do przodu jest ogólnym wskaźnikiem rozmiaru komórki i jest umieszczane na osi x, podczas gdy rozproszenie boczne jest wskaźnikiem ziarnistości komórki i jest umieszczane na osi Y. Teraz brama populacji będącej przedmiotem zainteresowania. Po ustaleniu bramek sprawdź, czy temperatura portu ładowania cytometru jest ustawiona na cztery stopnie Celsjusza.

Następnie umieść probówkę z próbką eksperymentalną w porcie ładowania. Naciśnij opcję sortowania i rozpocznij akwizycję, probówki do zbierania należy umieszczać na lodzie w miarę ich napełniania. Kontynuuj sortowanie, aż zostanie zebrana żądana liczba komórek lub do momentu, gdy probówka z próbką będzie pusta.

Następnie przerwij sortowanie, ponownie wybierając przycisk sortowania i wyjmij próbkę z portu ładowania. Następnie umieść probówkę zbiorczą bezpośrednio w porcie ładowania cytometru i uzyskaj od 500 do 1000 zdarzeń. Korzystając z tych samych ustawień, które są używane do sortowania limfocytów T, procedura sortowania zwiększyła czystość z 21 do 99%W przypadku komórek B początkowa populacja komórek B wynosząca 5% została zwiększona do 98% po sortowaniu.

Właśnie pokazaliśmy, jak oczyścić populację limfocytów b i t z cytów za pomocą faksu. Pamiętaj, że fakty można wykorzystać do oczyszczenia dowolnej populacji komórek, jeśli można wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki i dostępne są odpowiednie przeciwciała. Ponadto komórki ułożone genetycznie z markerami fluorescencyjnymi można łatwo oczyścić bez użycia przeciwciał.

Ponadto zawsze pamiętaj, aby używać odpowiednich elementów sterujących w swoich eksperymentach i zawsze sprawdzaj konfigurację lasera cytometrii przepływowej, aby upewnić się, że używasz właściwych fluorochromów i upewnij się, że używasz odpowiednich bramek, aby prawidłowo znajdowały się wokół twoich populacji. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.