Name: Oczyszczanie określonej populacji komórek za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-10T18:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Poznaj metodę FACS do izolacji czystych populacji komórek B i CD4 T z mysich splenocytów. Technika ta umożliwia badanie funkcji limfocytów z wysoką czystością próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować dr. Billowi Cashdollarowi za wsparcie w korzystaniu z Flow Cytometry Core.

<ol><li>Przed rozpoczęciem procesu należy zebrać i przygotować następujące elementy:
<ol style="list-style-type:lower-roman;">
 <li>Lód</li>
 <li>Stożkowe probówki 15 ml do barwienia komórek oraz probówki do cytometrii 12 x 75 mm do barwienia kontroli jednobarwnych.</li>
 <li>Bufor do barwienia: solanka fosforanowa (PBS) + 3% płodowej surowicy bydlęcej (FCS)</li>
 <li>Pipety</li>
 <li>Blokada Fc (jeśli wymagana) i przeciwciała do barwienia. Przeciwciała muszą zostać poddane miareczkowaniu w celu uzyskania optymalnego barwienia.</li>
 <li>Kuleczki do kompensacji</li>
 <li>Bufor do zawiesiny: zrównoważony roztwór soli Hank'sa (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS</li>
 <li>Błękit trypanu i hemocytometr</li>
 <li>Sito do komórek (Nylon 40 μm)</li>
 <li>Probówki do zbierania: można zastosować dwa rodzaje probówek: a) polistyrenowe probówki 12 x 75 mm (zawierające 300 μl FCS i 25 mM HEPES) lub b) stożkowe probówki 15 ml (zawierające 1 ml FCS + 25 mM HEPES). Do zbierania sortowanych komórek można użyć dowolnej pożywki bogatej o wysokim stężeniu surowicy. </li>
</ol></li>
<li>Przygotować zawiesinę pojedynczych komórek z wyjściowej populacji komórkowej.</li>
<li>Opcjonalnie: Wzbogacić pożądaną populację komórek za pomocą metody puryfikacji masowej, takiej jak usuwanie dopełniacza lub sortowanie magnetyczne. Główną zaletą etapu wzbogacania jest skrócenie czasu sortowania.</li>
<li>Przemyć komórki raz buforem do barwienia.</li>
<li>Odlać supernatant i resuspendować komórki w buforze do barwienia przy stężeniu do 50 x 106 dla zapewnienia wydajnego barwienia.</li>
<li>Opcjonalnie: W przypadku komórek wykazujących wysoką ekspresję FcR, zablokować receptory za pomocą odpowiedniej metody blokowania. Zalecaną metodą jest użycie przeciwciała mAb wiążącego FcγR w lodzie przez 10-15 min. Przeciwciała te są dostępne w handlu.</li>
<li>Dodać odpowiednie przeciwciało mAb (w ustalonym stężeniu), aby zabarwić pożądaną populację komórek, i inkubować przez 20-30 min w lodzie w ciemności, a następnie przemyć dwukrotnie buforem do barwienia. Opcjonalnie: można zastosować barwienie barwnikiem żywotności, takim jak jodek propidyny, aby zidentyfikować martwe komórki (5). W przypadku barwienia wielokolorowego wymagane są kontrole jednobarwne. Do przygotowania kontroli jednobarwnych zgodnie z protokołem producenta używamy kuleczek BD CompBeads.</li>
<li>Jeśli nie stosowano przeciwciał bezpośrednio koniugowanych, powtórzyć krok 7, używając odpowiedniego przeciwciała wtórnego lub koniugatu streptawidyny.</li>
<li>Po przemyciu resuspendować komórki w pożywce hodowlanej i oznaczyć stężenie komórek przy użyciu barwnika żywotności, np. błękitu trypanu.</li>
<li>Dostosować stężenie komórek do 15-20 x 106/ml. W przypadku populacji komórkowych tworzących skupiska, które mogą zapchać instrument podczas sortowania, przefiltrować komórki przez sito.</li>
<li>Uruchomić i zoptymalizować sorter komórkowy. Proces konfiguracji cytometru przepływowego różni się w zależności od producenta i musi być przeprowadzony przez odpowiednio przeszkolony personel. Ogólne zalecenia są następujące:
<ol style="list-style-type:lower-roman;">
 <li>Wybrać odpowiednią dyszę w zależności od sortowanego typu komórek.</li>
 <li>W przypadku sortowania sterylnego, wysterylizować instrument.</li>
 <li>Przeprowadzić kontrolę jakości instrumentu za pomocą kuleczek, aby zweryfikować działanie laserów oraz dokładność sortowania. </li>
 <li>Zainstalować wymagane urządzenie do zbierania i ustawić strumienie boczne.</li>
 <li>Sprawdzić konfigurację laserów i detektorów instrumentu, aby określić możliwe do zastosowania znaczniki fluorescencyjne (nasz BD FACS Aria posiada trzy lasery i może wykrywać do dziewięciu kolorów).</li>
 <li>Po ustaleniu, jakie znaczniki fluorescencyjne zostaną użyte w sorterze, można przeprowadzić kompensację (zgodnie z poniższym opisem).</li>
</ol></li>
<li>Przeprowadzić kompensację, używając próbki kontrolnej negatywnej oraz kontroli pojedynczo pozytywnych. Kompensacja jest niezbędna do usunięcia nakładania się widm między dwoma detektorami. Należy zauważyć, że kompensacja nie jest niezawodna i jest negatywnie wpływana przez intensywność barwienia niektórych markerów oraz przez fluorescencję komórek o niskiej autofluorescencji, co może prowadzić do słabej rozdzielczości między populacjami słabo barwiącymi a negatywnymi. 
 Dla uzyskania najlepszych wyników, plan eksperymentu powinien zakładać użycie jasnych fluorochromów dla markerów o niskiej ekspresji lub tych, których wzorzec barwienia nie jest znany. Markery zapewniające dobrą separację populacji komórkowych i wysoce eksponowane powinny być używane z fluorochromami słabiej świecącymi, takimi jak te wzbudzane laserami czerwonymi lub fioletowymi.
<ol style="list-style-type:lower-roman;">
 <li>Kompensację można przeprowadzić za pomocą kuleczek do kompensacji, które są mikrocząsteczkami polistyrenu sprzężonymi z przeciwciałem specyficznym dla łańcucha lekkiego Kappa Ig myszy, szczura lub szczura/ chomika. Kuleczki te są łatwe do zabarwienia, dają silny sygnał i stanowią prosty sposób przygotowania kontroli jednobarwnych z tym samym fluoroforem co próbki eksperymentalne.</li>
 <li>Przygotować szablon zawierający wykres bivariant dla rozproszonego światła przedniego (FSC) i bocznego (SSC) oraz jeden histogram dla każdego użytego fluorochromu. </li>
 <li>Przeanalizować probówkę z kontrolą negatywną i dostosować FSC oraz SSC, aby umieścić badaną populację w odpowiedniej skali.</li>
 <li>Dostosować ustawienia PMT fluorescencji, aby umieścić populację negatywną lub autofluorescencję w lewej części histogramu.</li>
 <li>Zapisać dane z probówki kontrolnej negatywnej.</li>
 <li>Przeanalizować probówki z kontrolami pojedynczo pozytywnymi i zapisać dane dla każdej z nich. </li>
 <li>Wyznaczyć bramkę przedziałową wokół części pozytywnej danych na histogramie oraz drugą bramkę przedziałową na części negatywnej histogramu.</li>
 <li>Kompensację ręczną wykonuje się poprzez dostosowanie mediany (mediana jest lepszą miarą tendencji centralnej niż średnia w skali logarytmicznej) wartości dodatnich, aż stanie się ona równa medianie wartości ujemnych. Należy to zrobić dla każdego z fluorochromów użytych w eksperymencie. </li>
 <li>Aby dostosować medianę, należy zmieniać wartości nakładania widm (zwiększać lub zmniejszać), aż mediany dla każdego parametru fluorescencyjnego będą jak najbardziej zbliżone.</li>
 <li>Kompensację można również przeprowadzić automatycznie za pomocą oprogramowania analitycznego. Kompensacja automatyczna wykorzystuje zapisane dane z kontroli kompensacyjnych do obliczenia macierzy algebraicznej dla wszystkich fluoroforów użytych w eksperymencie. Wartości te służą do odjęcia wkładu kolorów niepodstawowych, które przenikają do detektora koloru podstawowego. </li>
</ol></li>
<li>Zarejestrować próbkę eksperymentalną do sortowania i użyć narzędzi bramkowania oraz metod podziału, aby zdefiniować interesujące populacje.
<ol style="list-style-type:lower-roman;">
 <li>Przygotować szablon eksperymentalny z wykresem kropkowym FSC vs. SSC i użyć narzędzia bramkowania (wielokąta, prostokąta, przedziału lub kwadrantu), aby wyznaczyć bramkę dla interesującej populacji. Wykres rozproszenia obrazuje właściwości fizyczne komórki, które są charakterystyczne dla danego typu komórek. </li>
 <li>Najlepszym sposobem określenia strategii bramkowania fluorescencji jest zastosowanie kontroli FMO (fluorescence minus one). W probówce kontrolnej FMO znajdują się wszystkie odczynniki użyte w eksperymencie z wyjątkiem jednego, który jest przedmiotem badania. FMO pomaga odróżnić populacje słabo zabarwione od szerokich populacji negatywnych. </li>
 <li>Użyć danych zapisanych z probówek FMO, aby określić miejsce rozmieszczenia bramek w próbce eksperymentalnej. </li>
</ol></li>
<li>Po wyznaczeniu bramek można je wybrać do sortowania do zewnętrznych probówek zbierających. Jednocześnie można sortować do czterech bramek (lub populacji), w zależności od dostępnego instrumentarium.</li>
<li>Analizować próbkę eksperymentalną w temperaturze 4 °C, włączyć płyty odchylające i przeprowadzić sortowanie próbki. Do probówki 12 x 75 mm można posortować od 5 x 105 do 1,5 x 106 komórek, a do stożkowej probówki 15 ml od 1,5 x 106 do 4,5 x 106 komórek.</li>
<li>Po uzyskaniu wymaganej liczby komórek ręcznie zatrzymać sortowanie.</li>
<li>Przeprowadzić analizę po sortowaniu, aby określić czystość posortowanych populacji komórkowych.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
Przedstawiliśmy tutaj wyniki sortowania komórek B i komórek T CD4 ze śledziony myszy (Rysunek 1). Splenocyty barwiono przeciwciałem anty-mysim B220 sprzężonym z PE Texas Red, anty-mysim TCRβ sprzężonym z FITC oraz anty-mysim CD4 sprzężonym z Alexafluor-700, aby zidentyfikować komórki B (B220+TCRβ-) i komórki T CD4 (CD4+TCRβ+). Sortowanie wykonano przy użyciu instrumentu BD FACS Aria. Po sortowaniu czystość komórek B wyniosła &gt;97%, a czystość komórek T CD4 &gt;98%.
<img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig1.jpg" alt="Rysunek 1" /> Rysunek 1. Czystość limfocytów B śledzionowych i limfocytów T CD4 po FACS. Splenocyty mysie barwiono przeciwciałami przeciwko antygenom B220, TCRβ oraz CD4 u myszy. FACS dla limfocytów B przeprowadzono przy użyciu urządzenia BD FACS Aria, stosując bramkowanie na komórki B220+TCRβ- (Rys. 1A, panel lewy, dolny prawy kwadrant). Przeprowadzono analizę po sortowaniu w celu określenia czystości limfocytów B (Rys. 1A, panel prawy). Barwienie B220 przedstawiono na osi x, a barwienie TCRβ na osi y. FACS dla limfocytów T CD4 przeprowadzono przy użyciu tego samego cytometru przepływowego, stosując bramkowanie na komórki TCRβ+CD4+ (Rys. 1B, panel lewy, górny prawy kwadrant). Przeprowadzono analizę po sortowaniu w celu określenia czystości limfocytów T CD4 (Rys. 1B, panel prawy). Barwienie TCRβ przedstawiono na osi x, a barwienie CD4 na osi y. Przedstawiono procent komórek dodatnich w każdym kwadrancie.

<ol><li>Herzenberg, L. A., De Rosa, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+and+the+FACS%3A+complementary+tools+for+immunobiology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies and the FACS: complementary tools for immunobiology and medicine.</a> Immunol Today. 21, 383-390 (2000).</li>
<li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGivan%2C+AL+%22Flow+cytometry+first+principles%22">Flow cytometry first principles</a>. , Wiley-Liss. New York. 273-273 (2001).</li>
<li>Hewitt, Z., Forsyth, N. R., Waterfall, M., Wojtacha, D., Thomson, A. J., McWhir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-activated+single+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells.</a> Cloning Stem Cells. 8, 225-234 (2006).</li>
<li>Walker, A., Parkhill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Single-cell genomics.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 176-177 (2008).</li>
<li>Sorensen, T. U., Gram, G. J., Nielsen, S. D., Hansen, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safe+sorting+of+GFP-transduced+live+cells+for+subsequent+culture+using+a+modified+FACS+vantage%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Safe sorting of GFP-transduced live cells for subsequent culture using a modified FACS vantage.</a> Cytometry. 37, 284-290 (1999).</li>
<li>Diamond, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDiamond%2C+RA+%22In+living+color%3A+Protocols+in+flow+cytometry+and+cell+sorting%22">In living color: Protocols in flow cytometry and cell sorting</a>. DeMaggio, S. , Springer. Berlin. 800-800 (2000).</li>
<li>Karabinus, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+sorting+of+human+sperm%3A+MicroSort+clinical+trial+update%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric sorting of human sperm: MicroSort clinical trial update.</a> Theriogenology. 71, 74-79 (2009).</li>
<li>Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seventeen-colour+flow+cytometry%3A+unravelling+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).</li>
<li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+flow+cytometry+data%3A+a+guide+for+the+perplexed%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nat Immunol. 7, 681-685 (2006).</li>
<li>Tung, J. W., Heydari, K., Tirouvanziam, R., Sahaf, B., Parks, D. R., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+flow+cytometry%3A+a+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Modern flow cytometry: a practical approach.</a> Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).</li>
</ol>

FACS jest wysoce wyspecjalizowaną techniką oczyszczania wybranych populacji komórek, która pozwala na uzyskanie bardzo wysokiej czystości (95-100%) sortowanej populacji. Dlatego technika ta jest szczególnie istotna w eksperymentach, w których wysoka czystość jest niezbędnym wymogiem (np. w analizie mikromacierzy). FACS wykazuje szczególną przewagę nad innymi dostępnymi metodami oczyszczania w sytuacjach, gdy populacja komórek wymaga oczyszczenia na podstawie słabo eksponowanego markera powierzchniowego lub gdy konieczne jest wyodrębnienie dwóch lub więcej populacji różniących się poziomem ekspresji tego samego markera powierzchniowego. Przykładem może być oczyszczanie limfocytów B strefy marginalnej (B220+CD21hiCD23int/low) oraz limfocytów B mieszkowych (B220+CD21int/lowCD23hi) na podstawie poziomów ekspresji CD21 i CD23. Innym coraz częściej stosowanym zastosowaniem FACS jest sortowanie pojedynczych komórek, co umożliwia analizę poszczególnych jednostek komórkowych (3, 4). FACS jest również powszechnie wykorzystywany do sortowania komórek wykazujących genetyczną ekspresję białek fluorescencyjnych, takich jak białka znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (5). Jeśli sortowanie jest przeprowadzane w warunkach sterylnych, komórki mogą być następnie hodowane. Jednakże w trakcie sortowania może dojść do obniżenia żywotności i wydajności odzysku komórek. Żywotność można poprawić, stosując optymalną dla danej linii komórkowej temperaturę sortowania oraz przetwarzając probówki odbiorcze natychmiast po ich wypełnieniu. Wydajność odzysku można zwiększyć poprzez zastosowanie polipropylenowych probówek odbiorczych, zbieranie sortowanych komórek w pożywkach bogatych w surowicę i okresowe odwracanie probówek, utrzymywanie probówek w optymalnej temperaturze oraz wirowanie sortowanych komórek przez ~10 min (http://cyto.mednet.ucla.edu/Protocol.htm).
Rozwój ultraszybkich sorterów rozszerzył możliwości zastosowania sortowania przepływowego w warunkach klinicznych. Potencjalne zastosowania kliniczne FACS obejmują oczyszczanie komórek macierzystych krwi z krwi ludzkiej do celów terapeutycznych, zastosowania w terapii nowotworów, alternatywę dla amniocentezy, sortowanie plemników ludzkich oraz wczesne wykrywanie chorób (6, 7).
W przypadku barwienia wielokolorowego kluczowym krokiem jest wybór przeciwciał, a fluorochromy dobiera się na podstawie systemu detekcji konkretnego urządzenia. Istnieje wiele firm sprzedających sortery komórkowe, a konfiguracja laserów różni się w zależności od potrzeb użytkownika. W związku z tym nie można po prostu użyć dokładnie tych samych przeciwciał, które zostały wykorzystane w opublikowanych badaniach, bez potwierdzenia ich kompatybilności. Aby zoptymalizować wybór przeciwciał, należy wziąć pod uwagę poziom ekspresji badanego białka. Zasadniczo do barwienia słabo eksponowanych markerów powierzchniowych należy używać przeciwciał znakowanych najjaśniejszymi dostępnymi fluorochromami, natomiast słabo świecące fluorochromy można zastosować do barwienia markerów powierzchniowych o wysokim poziomie ekspresji (8). Ponadto przeciwciała powinny być dobrane w taki sposób, aby nakładanie się ich widm emisji było minimalne. W barwieniu wielokolorowym niezwykle trudno jest dobrać fluorochromy, które nie wykazują żadnego nakładania się widm. W takiej sytuacji przeprowadza się kompensację.
Kompensacja jest niezbędna, aby matematycznie wyeliminować nakładanie się fluorescencji w widmach emisji różnych fluorochromów mierzonych przez detektory (8-10). Innymi słowy, fluorescencja nakładająca się z jednego fluorochromu jest odejmowana od widma emisji innego fluorochromu. Obliczenie kompensacji wymaga niebarwionej próbki kontrolnej oraz pojedynczych kontrol pozytywnych dla każdego fluorochromu użytego do barwienia wielokolorowego (9, 10). Kompensację można przeprowadzić z wykorzystaniem komórek lub kulek kalibracyjnych. Kuleczki są łatwe do zabarwienia, dają silny sygnał i stanowią prosty sposób przygotowania kontroli jednobarwnych zawierających te same fluorofory, co próbki eksperymentalne. Kuleczki do kompensacji są szczególnie korzystne, gdy białko powierzchniowe komórki, które jest przedmiotem badania, wykazuje niski poziom ekspresji, a populacja komórek budząca zainteresowanie jest ograniczona w początkowej populacji komórkowej.
Po wybraniu przeciwciał ich aktywność należy zoptymalizować poprzez przeprowadzenie analizy miareczkowania. Jest to szczególnie istotne w przypadku zastosowania cytometru FACS wyposażonego w bardzo silne lasery. Wykorzystanie suboptymalnych stężeń przeciwciał barwiących może prowadzić do słabej separacji pożądanej populacji komórek z całkowitej populacji komórek. Z kolei stosowanie wysokich stężeń przeciwciał zwiększa ryzyko niespecyficznego barwienia antygenów. Zatem miareczkowanie przeciwciał pozwoli na wybór takiego stężenia, które zapewni maksymalną jasność populacji pozytywnej przy minimalnym barwieniu tła (8).
FACS jest obecnie standardową techniką oczyszczania subpopulacji komórek. Może być wykorzystywany do separacji każdego typu komórek, z których można przygotować zawiesinę pojedynczych komórek i dla których dostępne są przeciwciała pozwalające zidentyfikować pożądaną populację komórkową. FACS jest metodą z wyboru w sytuacjach, gdy wymagane są wysokoczyste populacje komórek.

oczyszczanie specyficznej populacji komórek za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (facs)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Badania eksperymentalne i kliniczne często wymagają wysoce oczyszczonych populacji komórek. FACS jest preferowaną techniką oczyszczania populacji komórek o znanym fenotypie. Inne masowe metody oczyszczania obejmują panning, deplecję dopełniacza oraz separację za pomocą kulek magnetycznych. FACS posiada jednak szereg zalet w porównaniu z innymi dostępnymi metodami. Jest to metoda preferowana w sytuacjach, gdy wymagana jest bardzo wysoka czystość pożądanej populacji, gdy populacja komórek docelowych wykazuje bardzo niski poziom markerów identyfikacyjnych lub gdy populacje komórek wymagają separacji na podstawie różnic w gęstości markerów. Ponadto FACS jest jedyną dostępną techniką oczyszczania umożliwiającą izolację komórek na podstawie barwienia wewnętrznego lub wewnątrzkomórkowej ekspresji białek, takich jak genetycznie zmodyfikowane fluorescencyjne białka markerowe. FACS pozwala na oczyszczanie pojedynczych komórek na podstawie ich wielkości, ziarnistości i fluorescencji. Aby oczyścić komórki docelowe, są one najpierw barwione przeciwciałami monoklonalnymi (mAb) znakowanymi fluorescencyjnie, które rozpoznają specyficzne markery powierzchniowe na pożądanej populacji komórek (1). Możliwa jest również negatywna selekcja komórek niebarwionych. Oczyszczanie metodą FACS wymaga cytometru przepływowego z funkcją sortowania oraz odpowiedniego oprogramowania. W metodzie FACS komórki w zawiesinie przepływają w strumieniu kropel, z których każda zawiera jedną komórkę, przed wiązką lasera. System detekcji fluorescencji wykrywa komórki docelowe na podstawie określonych wcześniej parametrów fluorescencyjnych. Urządzenie nadaje ładunek kropli zawierającej komórkę docelową, a elektrostatyczny system odchylania umożliwia zbieranie naładowanych kropel do odpowiednich probówek (2). Skuteczność barwienia, a w konsekwencji sortowania, zależy w dużej mierze od doboru markerów identyfikacyjnych oraz wyboru przeciwciał mAb. Parametry sortowania można dostosować w zależności od wymaganej czystości i wydajności. Mimo że FACS wymaga specjalistycznego sprzętu i przeszkolonego personelu, jest to metoda z wyboru w izolacji wysoce oczyszczonych populacji komórek.

W przypadku wielu badań naukowych wymagających analizy biologicznej i chemicznej populacji komórek, komórki te muszą charakteryzować się wysokim stopniem czystości. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) jest doskonałą metodą pozyskiwania czystych populacji komórek.

Oczyszczanie specyficznej populacji komórek za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS)

Badania eksperymentalne i kliniczne często wymagają wysoko oczyszczonych populacji komórek. FACS jest preferowaną techniką oczyszczania populacji komórek o znanych ...

Dzień dobry, nazywam się Hope Campbell i jestem specjalistą w dziedzinie cytometrii przepływowej w Instytucie Badań nad Krwią (Blood Research Institute) przy Centrum Krwi Wisconsin (Blood Center of Wisconsin). Dzień dobry, jestem STR Baso, doktorantem w laboratorium dr Bonnie Dieter. Ja również pracuję w Instytucie Badań nad Krwią przy Centrum Krwi Wisconsin.Dzisiaj przeprowadzimy procedurę izolacji komórek przy użyciu fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Stosujemy tę procedurę w laboratorium do badania funkcji limfocytów oraz populacji komórek mieloidalnych. Zacznijmy.W niniejszej procedurze limfocyty B i T CD4 zostaną oczyszczone z leukocytów mysich. Początkowa liczba komórek docelowych powinna zostać obliczona na podstawie wymaganej liczby komórek oraz wydajności odzysku urządzenia przy zastosowaniu tej metody. Typowa wydajność odzysku dla limfocytów B i T CD4 wynosi od 85 do 90%. Początkowa populacja leukocytów z śledziony wynosi około 60 do 70% limfocytów B i 20 do 30% limfocytów T.Zatem, zaczynając od 100 × 10⁶ komórek, będzie można odzyskać od 50 do 60 milionów limfocytów B oraz od 20 do 30 milionów limfocytów T przed rozpoczęciem procesu FACS. Roztwory i odczynniki wymagane do protokołu należy umieścić w lodzie. Obejmują one bufor do barwienia składający się z soli fizjologicznej PBS z 3% płodowej surowicy cielęcej, bufor do zawieszenia składający się z 25 mM HEPES przygotowanego w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) zawierającym 3% płodowej surowicy cielęcej, roztwór 25 mM HEPES przygotowany w płodowej surowicy cielęcej, przeciwciała do barwienia oraz kuleki kompensacyjne.Ten protokół wymaga również następujących materiałów i odczynników: probówek stożkowych o pojemności 15 ml oraz probówek do cytometrii przepływowej z polistyrenu lub polipropylenu o wymiarach 12 × 75 mm. Należy również wcześniej przygotować nylonowe sitko do komórek, trypan blue, licznik komórek (hemocytometr) oraz probówki do zbierania posortowanych komórek.Przenieś 300 µL roztworu HEPES-FCS do probówek przepływowych lub 1 mL roztworu HEPES-FCS do stożkowych probówek o pojemności 15 mL. Probówki te należy przechowywać w lodzie do momentu rozpoczęcia procesu zbierania. Rozpocznij od przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek pożądanej populacji komórkowej.Jeśli komórki wyizolowane za pomocą tej procedury mają być hodowane, cały proces przygotowania komórek należy przeprowadzić w dygestorium do hodowli tkankowych. Stosując technikę sterylną, należy raz wypłukać komórki, dodając lodowaty bufor barwiący i resuspendując komórki poprzez kilkukrotne odwrócenie probówki.Następnie odwiruj komórki przez siedem do ośmiu minut przy około 250 ×g w temperaturze 4 °C. Warunki płukania mogą różnić się w zależności od typu i stężenia komórek. W przypadku cyto-komórek wypłucz do 200 × 10⁶ komórek przy użyciu 10 ml buforu barwiącego.Ostrożnie odessać supernatant, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Następnie zawiesić komórki w lodowatym buforze barwiącym w stężeniu do 50 × 10⁶ na 100 µL. Przesuspenderować osad komórkowy poprzez delikatne potrząsanie probówką lub lekkie wymieszanie na wirówce typu vortex.Następnie przenieś od 0,25 do 1 × 10⁶ komórek z sześciu studni do nowej probówki przepływowej o wymiarach 12 × 75 mm wykonanej z polistyrenu lub polipropylenu, umieszczonej w lodzie. Odstaw ją do późniejszego wykorzystania jako niezbarwioną próbkę kontrolną. Do pierwszej probówki dodaj przeciwciała pierwszorzędowe do zawiesiny komórkowej, aby uzyskać pożądane stężenie końcowe. W tym przypadku do barwienia limfocytów B stosuje się przeciwciała anty-B220 koniugowane z PE Texas Red, natomiast do barwienia limfocytów T stosuje się przeciwciała anty-TCRβ koniugowane z ZE lub przeciwciała anty-CD4 koniugowane z APC-700. Wymieszaj zawartość, delikatnie stukując dnem probówki lub lekko nią potrząsając.Wymieszać na wstrząsarze typu vortex, następnie umieścić komórki w lodzie i inkubować w ciemności przez 20 do 30 minut. Po inkubacji przemyć znakowane komórki przez resuspensję, zawieszając je w 10 mililitrach lodowatego buforu zawiesiny, a następnie odwirować jak poprzednio, po ostrożnym usunięciu supernatantu. Powtórzyć ten krok, aby przemyć komórki po raz drugi.Na koniec resuspenduj komórki w lodowatym buforze do zawiesiny. Jeśli przeciwciała pierwszorzędowe nie są bezpośrednio sprzężone z fluorochromem, dodaj do zawiesiny komórkowej znakowane przeciwciała drugorzędowe lub strepawidynę w sprzężeniu, a następnie ponownie inkubuj komórki na lodzie w ciemności przez 20 do 30 minut po przeprowadzeniu inkubacji. Przemyj komórki dwukrotnie lodowatym buforem do zawiesiny.Po resuspensji komórek w lodowatym buforze do zawieszenia należy oznaczyć stężenie oraz żywotność komórek, wykorzystując barwnik żywotności, taki jak błękit trypanowy, oraz hemosytometr. Stężenie komórek należy dostosować do poziomu od 10 do 20 × 10⁶ komórek/ml poprzez dodanie buforu do zawieszenia, aby uniknąć zapchania cytometru przepływowego skupiskami komórek, które mogły obumrzeć podczas izolacji.Procedura i barwienie. Tuż przed rozpoczęciem protokołu sortowania przefiltruj komórki przez sitko do kropelkowej filtracji. Wielkość oczek sitka należy dobrać w zależności od typu komórek; w przypadku cytometrii stosuje się sitko o rozmiarze oczek 40 µm.Zebrać przefiltrowane komórki do 15 litrowej probówki stożkowej lub probówek przepływowych 12 by 75 milimetrów, w zależności od objętości. Następnie umieścić komórki na lodzie podczas przygotowywania cytometru do procedury sortowania. W przypadku zastosowania kulek BD comp beads jako jednobarwnych kontroli pozytywnych, przygotować jedną probówkę kontrolną dla każdego koloru użytego w analizie oraz jedną probówkę kontrolną z niebarwionymi komórkami jako kontrolę negatywną.Po dokładnym wymieszaniu zawiesin kulek za pomocą wortexa, dodaj po jednej kropli zawiesiny kulek negatywnych i pozytywnych do 100 µL buforu do zawiesiny dla każdego użytego koloru oraz dla kontroli negatywnej. Następnie dodaj jeden mikrolitr znakowanego przeciwciała do każdej probówki z kontrolą pozytywną. W tym doświadczeniu jedna probówka jest przygotowywana z użyciem przeciwciał PE Texas Red B 20.Pomieszaj przeciwciała fit ETCR beta oraz przeciwciała lor 700 CD cztery, lekko uderzając w dno probówek, a następnie inkubuj przez 15 do 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Przemyj kuleczki raz 2 mL buforu do barwienia i wiruj przy 200 Gs przez 10 minut. Usuń nadpłyn poprzez aspirację i resuspenduj osad z kuleczek w 200 do 500 µL buforu do barwienia.Konfiguracja buforów w cytometrze przepływowym różni się w zależności od producenta i powinna być wykonywana wyłącznie przez odpowiednio przeszkolony personel. Procedura sortowania komórek zostanie tutaj przeprowadzona przy użyciu urządzenia BD FACS Aria. Przed sortowaniem należy wybrać odpowiednią dyszę, zależnie od rodzaju sortowanych komórek.Dostępne rozmiary dysz są to 70 µm, 100 µm oraz 130 µm. Rozmiar dyszy powinien być co najmniej trzykrotnie większy od rozmiaru sortowanych komórek; w przypadku limfocytów wybrano dyszę o rozmiarze 70 µm. Aseptyczne sortowanie komórek można przeprowadzić, korzystając z opcji sortowania aseptycznego instrumentu.Korzystając z tej opcji, całą ścieżkę osłony dekontaminuje się 70% etanolem zgodnie z instrukcjami producenta. Należy pamiętać o wymianie filtrów osłony oraz zastąpieniu PBS sterylnym PBS. Gdy cytometr będzie gotowy do pracy, należy umieścić schłodzone wcześniej probówki zbiorcze zawierające heaps FCS w odpowiednim urządzeniu zbierającym.Dostępne urządzenia do zbierania mogą pomieścić do dwóch probówek stożkowych o pojemności 15 ml, cztery probówki o wymiarach 12 × 75 mm lub cztery mikroprowóbki. Do zbierania mniej niż 1,5 × 10⁶ komórek należy używać probówek 12 × 75 mm, a do zbierania od 1,5 × 10⁶ do 4,5 × 10⁶ komórek — probówek stożkowych 15 ml.Umieść odpowiednie naczynie do zbierania w komorze zbiorczej sortownika. W przypadku sortowania wielokolorowego skieruj strumienie boczne do zainstalowanego naczynia. Cytometr musi zostać najpierw skalibrowany w celu skorygowania nakładania się widm między detektorami.Przykład przedstawiony tutaj ilustruje nakładanie się widm emisji fit E i pe. To nakładanie się, zaznaczone ciemnym obszarem, nazywa się spillover (przeciekiem). W tym przypadku spillover PE byłby wykrywany w kanale fit E, a spillover fit e byłby wykrywany w kanale PE.Należy skorygować to przenikanie sygnałów, aby wyeliminować resztkową fluorescencję jednego fluorochromu w innym kanale. Proces korygowania przenikania sygnałów nazywa się kompensacją. Aby przeprowadzić kompensację ręczną, należy użyć oprogramowania do cytometrii w celu przygotowania szablonu zawierającego wykres bivariantny do wyświetlania rozproszenia przedniego FSC i rozproszenia bocznego SSC oraz histogram dla każdego używanego fluorochromu.Metoda konfiguracji tych wykresów różni się w zależności od oprogramowania. Umieść probówkę z kontrolą negatywną w porcie ładowania cytometru i rozpocznij akwizycję danych podczas analizy próbki. Dostosuj FSC i SSC, aby umieścić badaną populację w odpowiedniej skali.Następnie dostrój ustawienia PMT fluorescencji tak, aby populacja negatywna lub autofluorescencja znajdowały się w skrajnej lewej części histogramu. Zarejestruj probówkę z kontrolą negatywną. Wyjmij probówkę z kontrolą negatywną z portu załadunkowego cytometru i zastąp ją pierwszą probówką z kontrolą pozytywną.Teraz rozpocznij akwizycję. Powtórz ten proces dla każdej z probek kontroli dodatniej, rejestrując dane dla każdej z nich. Dla każdej kontroli dodatniej wyznacz bramkę przedziałową (interval gate) lub obszar wokół zdarzeń zarejestrowanych na histogramie.Następnie narysuj kolejną bramkę przedziałową w ujemnej części histogramu. Podczas wykonywania kompensacji manualnej należy uwzględnić każdy fluorofor użyty w eksperymencie, dostosowując medianę populacji pozytywnej tak, aby była równa medianie populacji negatywnej. Aby skorygować medianę, należy zmieniać wartości nakładania się widm (spectral overlap), zwiększając lub zmniejszając je, aż mediany dla każdego parametru fluorescencyjnego będą do siebie jak najbliższe.Wykorzystując ustawienia ustalone dla próbek kontroli pozytywnej i negatywnej, przygotuj procedurę sortowania poprzez wyznaczenie ustawień bramkowania (gait settings) dla próbki badawczej. Umieść probówkę z komórkami przeznaczonymi do sortowania w porcie załadowczym cytometru i rozpocznij akwizycję z prędkością od 9 000 do 10 000 zdarzeń na sekundę. Wybierz wykres kropkowy, aby wyświetlić rozproszenie przednie (forward scatter) w relacji do rozproszenia bocznego (side scatter).Rozproszenie światła w przód (forward scatter) jest ogólnym wskaźnikiem wielkości komórek i jest umieszczane na osi X, natomiast rozproszenie światła pod kątem (side scatter) jest wskaźnikiem ziarnistości komórek i jest umieszczane na osi Y. Następnie wyznacz bramkę dla interesującej nas populacji. Po ustaleniu bramek upewnij się, że temperatura portu załadunkowego cytometru jest ustawiona na 4 °C.Następnie umieść probówkę z próbką eksperymentalną w porcie załadowania. Wybierz opcję sortowania i rozpocznij akwizycję; probówki do zbierania powinny być umieszczone w lodzie w miarę napełniania. Kontynuuj sortowanie, aż do momentu zebrania pożądanej liczby komórek lub do opróżnienia probówki z próbką.Następnie zatrzymaj sortowanie, ponownie wybierając przycisk sortowania, i wyjmij próbkę z portu załadowania. Następnie umieść probówkę do zbierania bezpośrednio na porcie załadowania cytometru i zarejestruj od 500 do 1000 zdarzeń. Przy zastosowaniu tych samych ustawień, które wykorzystano do sortowania limfocytów T, procedura sortowania zwiększyła ich czystość z 21 do 99%. W przypadku limfocytów B początkowa populacja wynosząca 5% została zwiększona do 98% po sortowaniu.Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak oczyszczać populacje limfocytów B i T z leukocytów za pomocą FACS. Należy pamiętać, że metoda FACS może być wykorzystana do oczyszczania dowolnej populacji komórek, pod warunkiem, że możliwe jest przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek i dostępne są odpowiednie przeciwciała. Ponadto komórki zmodyfikowane genetycznie za pomocą markerów fluorescencyjnych można łatwo oczyszczać bez użycia przeciwciał.Pamiętajcie również, aby zawsze stosować odpowiednie kontrole w swoich eksperymentach oraz zawsze sprawdzać konfigurację laserów w cytometrze przepływowym, aby upewnić się, że używacie właściwych fluorochromów, a także stosować odpowiednie bramki, tak aby właściwie obejmowały one analizowane populacje. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w Waszych eksperymentach.

purification-specific-cell-population-fluorescence-activated-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Oczyszczanie określonej populacji komórek metodą sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS)

Przedstawiono metodę izolacji specyficznych typów komórek z materiału roślinnego. Technika ta wykorzystuje transgeniczne linie markerowe wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w określonych typach komórek, dysocjację komórkową oraz sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Dodatkowo opracowano układ hodowlany, który umożliwia poddanie siewek Arabidopsis thaliana obróbce przed sortowaniem komórek.

Sortowanie komórek protoplastów roślinnych metodą fluorescencyjnej aktywacji (FACS)

Fibroblasty związane z nowotworem (CAFs) wspomagają inicjację, wzrost i progresję guza poprzez sygnalizację promującą proliferację, angiogenezę i stan zapalny. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji czystych populacji prawidłowych fibroblastów oraz CAFs z pobranych na świeżo tkanek mysich i ludzkich za pomocą sortowania komórek, wykorzystując PDGFRα jako marker powierzchniowy.

Izolacja fibroblastów prawidłowych i związanych z nowotworem z tkanek świeżych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Celem tego protokołu jest użycie techniki sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) do sortowania określonych typów komórek nerwowych w celu późniejszej analizy ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, markerów epigenetycznych i/lub ekspresji białek.

Wykorzystanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją do zbadania ekspresji genów specyficznych dla typu komórki w tkance mózgowej szczura

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Ten protokół opisuje konfigurowalną funkcjonalizację powierzchni systemu destiobiotyny, streptawidyny i APTES w celu wyizolowania określonych typów komórek. Ponadto w niniejszym manuskrypcie omówiono zastosowania, optymalizację i weryfikację tego procesu.

Metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Zgłaszamy protokół wykorzystujący sortowanie komórek aktywowane fluorescencją do izolowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) o wysokiej czystości ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń do badań funkcjonalnych pDC.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu oczyszczenia plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Miliony ludzi cierpią na choroby zwyrodnieniowe siatkówki, które prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Wspólnym elementem wielu z tych chorób jest utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC). Ten szczegółowy protokół opisuje izolację pierwotnych mysich RGC przez selekcję dodatnią i ujemną za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

Koralowce tworzą bioróżnorodne ekosystemy ważne zarówno dla ludzi, jak i organizmów morskich. Jednak nadal nie rozumiemy pełnego potencjału i funkcji wielu komórek koralowców. W tym miejscu przedstawiamy protokół opracowany do izolacji, znakowania i rozdzielania populacji kamiennych komórek koralowców.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu izolacji populacji komórek skleraktynów

Tutaj prezentujemy strategię immunofenotypowania do charakterystyki różnicowania megakariocytów i pokazujemy, jak ta strategia pozwala na sortowanie megakariocytów na różnych etapach za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją. Metodologia ta może być stosowana do pierwotnych tkanek ludzkich, ale także do megakariocytów wytwarzanych w hodowli in vitro.

Immunofenotypowanie i sortowanie komórek ludzkich MK ze źródeł pierwotnych u ludzi lub zróżnicowanych in vitro z progenitorów hematopoetycznych

Poznaj metodę FACS do izolacji czystych populacji komórek B i CD4 T z mysich splenocytów. Technika ta umożliwia badanie funkcji limfocytów z wysoką czystością próbek.

Oczyszczanie specyficznej populacji komórek za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS)

Przeglądaj więcej filmów