Oczyszczanie specyficznej populacji komórek za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS)

Dzień dobry, nazywam się Hope Campbell i jestem specjalistą w dziedzinie cytometrii przepływowej w Instytucie Badań nad Krwią (Blood Research Institute) przy Centrum Krwi Wisconsin (Blood Center of Wisconsin). Dzień dobry, jestem STR Baso, doktorantem w laboratorium dr Bonnie Dieter. Ja również pracuję w Instytucie Badań nad Krwią przy Centrum Krwi Wisconsin.

Dzisiaj przeprowadzimy procedurę izolacji komórek przy użyciu fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Stosujemy tę procedurę w laboratorium do badania funkcji limfocytów oraz populacji komórek mieloidalnych. Zacznijmy.

W niniejszej procedurze limfocyty B i T CD4 zostaną oczyszczone z leukocytów mysich. Początkowa liczba komórek docelowych powinna zostać obliczona na podstawie wymaganej liczby komórek oraz wydajności odzysku urządzenia przy zastosowaniu tej metody. Typowa wydajność odzysku dla limfocytów B i T CD4 wynosi od 85 do 90%. Początkowa populacja leukocytów z śledziony wynosi około 60 do 70% limfocytów B i 20 do 30% limfocytów T.

Zatem, zaczynając od 100 × 10⁶ komórek, będzie można odzyskać od 50 do 60 milionów limfocytów B oraz od 20 do 30 milionów limfocytów T przed rozpoczęciem procesu FACS. Roztwory i odczynniki wymagane do protokołu należy umieścić w lodzie. Obejmują one bufor do barwienia składający się z soli fizjologicznej PBS z 3% płodowej surowicy cielęcej, bufor do zawieszenia składający się z 25 mM HEPES przygotowanego w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) zawierającym 3% płodowej surowicy cielęcej, roztwór 25 mM HEPES przygotowany w płodowej surowicy cielęcej, przeciwciała do barwienia oraz kuleki kompensacyjne.

Ten protokół wymaga również następujących materiałów i odczynników: probówek stożkowych o pojemności 15 ml oraz probówek do cytometrii przepływowej z polistyrenu lub polipropylenu o wymiarach 12 × 75 mm. Należy również wcześniej przygotować nylonowe sitko do komórek, trypan blue, licznik komórek (hemocytometr) oraz probówki do zbierania posortowanych komórek.

Przenieś 300 µL roztworu HEPES-FCS do probówek przepływowych lub 1 mL roztworu HEPES-FCS do stożkowych probówek o pojemności 15 mL. Probówki te należy przechowywać w lodzie do momentu rozpoczęcia procesu zbierania. Rozpocznij od przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek pożądanej populacji komórkowej.

Jeśli komórki wyizolowane za pomocą tej procedury mają być hodowane, cały proces przygotowania komórek należy przeprowadzić w dygestorium do hodowli tkankowych. Stosując technikę sterylną, należy raz wypłukać komórki, dodając lodowaty bufor barwiący i resuspendując komórki poprzez kilkukrotne odwrócenie probówki.

Następnie odwiruj komórki przez siedem do ośmiu minut przy około 250 ×g w temperaturze 4 °C. Warunki płukania mogą różnić się w zależności od typu i stężenia komórek. W przypadku cyto-komórek wypłucz do 200 × 10⁶ komórek przy użyciu 10 ml buforu barwiącego.

Ostrożnie odessać supernatant, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Następnie zawiesić komórki w lodowatym buforze barwiącym w stężeniu do 50 × 10⁶ na 100 µL. Przesuspenderować osad komórkowy poprzez delikatne potrząsanie probówką lub lekkie wymieszanie na wirówce typu vortex.

Następnie przenieś od 0,25 do 1 × 10⁶ komórek z sześciu studni do nowej probówki przepływowej o wymiarach 12 × 75 mm wykonanej z polistyrenu lub polipropylenu, umieszczonej w lodzie. Odstaw ją do późniejszego wykorzystania jako niezbarwioną próbkę kontrolną. Do pierwszej probówki dodaj przeciwciała pierwszorzędowe do zawiesiny komórkowej, aby uzyskać pożądane stężenie końcowe. W tym przypadku do barwienia limfocytów B stosuje się przeciwciała anty-B220 koniugowane z PE Texas Red, natomiast do barwienia limfocytów T stosuje się przeciwciała anty-TCRβ koniugowane z ZE lub przeciwciała anty-CD4 koniugowane z APC-700. Wymieszaj zawartość, delikatnie stukując dnem probówki lub lekko nią potrząsając.

Wymieszać na wstrząsarze typu vortex, następnie umieścić komórki w lodzie i inkubować w ciemności przez 20 do 30 minut. Po inkubacji przemyć znakowane komórki przez resuspensję, zawieszając je w 10 mililitrach lodowatego buforu zawiesiny, a następnie odwirować jak poprzednio, po ostrożnym usunięciu supernatantu. Powtórzyć ten krok, aby przemyć komórki po raz drugi.

Na koniec resuspenduj komórki w lodowatym buforze do zawiesiny. Jeśli przeciwciała pierwszorzędowe nie są bezpośrednio sprzężone z fluorochromem, dodaj do zawiesiny komórkowej znakowane przeciwciała drugorzędowe lub strepawidynę w sprzężeniu, a następnie ponownie inkubuj komórki na lodzie w ciemności przez 20 do 30 minut po przeprowadzeniu inkubacji. Przemyj komórki dwukrotnie lodowatym buforem do zawiesiny.

Po resuspensji komórek w lodowatym buforze do zawieszenia należy oznaczyć stężenie oraz żywotność komórek, wykorzystując barwnik żywotności, taki jak błękit trypanowy, oraz hemosytometr. Stężenie komórek należy dostosować do poziomu od 10 do 20 × 10⁶ komórek/ml poprzez dodanie buforu do zawieszenia, aby uniknąć zapchania cytometru przepływowego skupiskami komórek, które mogły obumrzeć podczas izolacji.

Procedura i barwienie. Tuż przed rozpoczęciem protokołu sortowania przefiltruj komórki przez sitko do kropelkowej filtracji. Wielkość oczek sitka należy dobrać w zależności od typu komórek; w przypadku cytometrii stosuje się sitko o rozmiarze oczek 40 µm.

Zebrać przefiltrowane komórki do 15 litrowej probówki stożkowej lub probówek przepływowych 12 by 75 milimetrów, w zależności od objętości. Następnie umieścić komórki na lodzie podczas przygotowywania cytometru do procedury sortowania. W przypadku zastosowania kulek BD comp beads jako jednobarwnych kontroli pozytywnych, przygotować jedną probówkę kontrolną dla każdego koloru użytego w analizie oraz jedną probówkę kontrolną z niebarwionymi komórkami jako kontrolę negatywną.

Po dokładnym wymieszaniu zawiesin kulek za pomocą wortexa, dodaj po jednej kropli zawiesiny kulek negatywnych i pozytywnych do 100 µL buforu do zawiesiny dla każdego użytego koloru oraz dla kontroli negatywnej. Następnie dodaj jeden mikrolitr znakowanego przeciwciała do każdej probówki z kontrolą pozytywną. W tym doświadczeniu jedna probówka jest przygotowywana z użyciem przeciwciał PE Texas Red B 20.

Pomieszaj przeciwciała fit ETCR beta oraz przeciwciała lor 700 CD cztery, lekko uderzając w dno probówek, a następnie inkubuj przez 15 do 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Przemyj kuleczki raz 2 mL buforu do barwienia i wiruj przy 200 Gs przez 10 minut. Usuń nadpłyn poprzez aspirację i resuspenduj osad z kuleczek w 200 do 500 µL buforu do barwienia.

Konfiguracja buforów w cytometrze przepływowym różni się w zależności od producenta i powinna być wykonywana wyłącznie przez odpowiednio przeszkolony personel. Procedura sortowania komórek zostanie tutaj przeprowadzona przy użyciu urządzenia BD FACS Aria. Przed sortowaniem należy wybrać odpowiednią dyszę, zależnie od rodzaju sortowanych komórek.

Dostępne rozmiary dysz są to 70 µm, 100 µm oraz 130 µm. Rozmiar dyszy powinien być co najmniej trzykrotnie większy od rozmiaru sortowanych komórek; w przypadku limfocytów wybrano dyszę o rozmiarze 70 µm. Aseptyczne sortowanie komórek można przeprowadzić, korzystając z opcji sortowania aseptycznego instrumentu.

Korzystając z tej opcji, całą ścieżkę osłony dekontaminuje się 70% etanolem zgodnie z instrukcjami producenta. Należy pamiętać o wymianie filtrów osłony oraz zastąpieniu PBS sterylnym PBS. Gdy cytometr będzie gotowy do pracy, należy umieścić schłodzone wcześniej probówki zbiorcze zawierające heaps FCS w odpowiednim urządzeniu zbierającym.

Dostępne urządzenia do zbierania mogą pomieścić do dwóch probówek stożkowych o pojemności 15 ml, cztery probówki o wymiarach 12 × 75 mm lub cztery mikroprowóbki. Do zbierania mniej niż 1,5 × 10⁶ komórek należy używać probówek 12 × 75 mm, a do zbierania od 1,5 × 10⁶ do 4,5 × 10⁶ komórek — probówek stożkowych 15 ml.

Umieść odpowiednie naczynie do zbierania w komorze zbiorczej sortownika. W przypadku sortowania wielokolorowego skieruj strumienie boczne do zainstalowanego naczynia. Cytometr musi zostać najpierw skalibrowany w celu skorygowania nakładania się widm między detektorami.

Przykład przedstawiony tutaj ilustruje nakładanie się widm emisji fit E i pe. To nakładanie się, zaznaczone ciemnym obszarem, nazywa się spillover (przeciekiem). W tym przypadku spillover PE byłby wykrywany w kanale fit E, a spillover fit e byłby wykrywany w kanale PE.

Należy skorygować to przenikanie sygnałów, aby wyeliminować resztkową fluorescencję jednego fluorochromu w innym kanale. Proces korygowania przenikania sygnałów nazywa się kompensacją. Aby przeprowadzić kompensację ręczną, należy użyć oprogramowania do cytometrii w celu przygotowania szablonu zawierającego wykres bivariantny do wyświetlania rozproszenia przedniego FSC i rozproszenia bocznego SSC oraz histogram dla każdego używanego fluorochromu.

Metoda konfiguracji tych wykresów różni się w zależności od oprogramowania. Umieść probówkę z kontrolą negatywną w porcie ładowania cytometru i rozpocznij akwizycję danych podczas analizy próbki. Dostosuj FSC i SSC, aby umieścić badaną populację w odpowiedniej skali.

Następnie dostrój ustawienia PMT fluorescencji tak, aby populacja negatywna lub autofluorescencja znajdowały się w skrajnej lewej części histogramu. Zarejestruj probówkę z kontrolą negatywną. Wyjmij probówkę z kontrolą negatywną z portu załadunkowego cytometru i zastąp ją pierwszą probówką z kontrolą pozytywną.

Teraz rozpocznij akwizycję. Powtórz ten proces dla każdej z probek kontroli dodatniej, rejestrując dane dla każdej z nich. Dla każdej kontroli dodatniej wyznacz bramkę przedziałową (interval gate) lub obszar wokół zdarzeń zarejestrowanych na histogramie.

Następnie narysuj kolejną bramkę przedziałową w ujemnej części histogramu. Podczas wykonywania kompensacji manualnej należy uwzględnić każdy fluorofor użyty w eksperymencie, dostosowując medianę populacji pozytywnej tak, aby była równa medianie populacji negatywnej. Aby skorygować medianę, należy zmieniać wartości nakładania się widm (spectral overlap), zwiększając lub zmniejszając je, aż mediany dla każdego parametru fluorescencyjnego będą do siebie jak najbliższe.

Wykorzystując ustawienia ustalone dla próbek kontroli pozytywnej i negatywnej, przygotuj procedurę sortowania poprzez wyznaczenie ustawień bramkowania (gait settings) dla próbki badawczej. Umieść probówkę z komórkami przeznaczonymi do sortowania w porcie załadowczym cytometru i rozpocznij akwizycję z prędkością od 9 000 do 10 000 zdarzeń na sekundę. Wybierz wykres kropkowy, aby wyświetlić rozproszenie przednie (forward scatter) w relacji do rozproszenia bocznego (side scatter).

Rozproszenie światła w przód (forward scatter) jest ogólnym wskaźnikiem wielkości komórek i jest umieszczane na osi X, natomiast rozproszenie światła pod kątem (side scatter) jest wskaźnikiem ziarnistości komórek i jest umieszczane na osi Y. Następnie wyznacz bramkę dla interesującej nas populacji. Po ustaleniu bramek upewnij się, że temperatura portu załadunkowego cytometru jest ustawiona na 4 °C.

Następnie umieść probówkę z próbką eksperymentalną w porcie załadowania. Wybierz opcję sortowania i rozpocznij akwizycję; probówki do zbierania powinny być umieszczone w lodzie w miarę napełniania. Kontynuuj sortowanie, aż do momentu zebrania pożądanej liczby komórek lub do opróżnienia probówki z próbką.

Następnie zatrzymaj sortowanie, ponownie wybierając przycisk sortowania, i wyjmij próbkę z portu załadowania. Następnie umieść probówkę do zbierania bezpośrednio na porcie załadowania cytometru i zarejestruj od 500 do 1000 zdarzeń. Przy zastosowaniu tych samych ustawień, które wykorzystano do sortowania limfocytów T, procedura sortowania zwiększyła ich czystość z 21 do 99%. W przypadku limfocytów B początkowa populacja wynosząca 5% została zwiększona do 98% po sortowaniu.

Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak oczyszczać populacje limfocytów B i T z leukocytów za pomocą FACS. Należy pamiętać, że metoda FACS może być wykorzystana do oczyszczania dowolnej populacji komórek, pod warunkiem, że możliwe jest przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek i dostępne są odpowiednie przeciwciała. Ponadto komórki zmodyfikowane genetycznie za pomocą markerów fluorescencyjnych można łatwo oczyszczać bez użycia przeciwciał.

Pamiętajcie również, aby zawsze stosować odpowiednie kontrole w swoich eksperymentach oraz zawsze sprawdzać konfigurację laserów w cytometrze przepływowym, aby upewnić się, że używacie właściwych fluorochromów, a także stosować odpowiednie bramki, tak aby właściwie obejmowały one analizowane populacje. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w Waszych eksperymentach.