Profilowanie przeciwciał za pomocą systemów immunoprecypitacji lucyferazy (LIPS)

Niniejszy materiał wideo prezentuje etapy przeprowadzania testów Luminex (LIPS). Antygeny analizowane w teście są ekspresjonowane w komórkach CO one jako rekombinowane fuzje lucyferazy Renilla lub antygenu rook. Wykorzystuje się do tego surowe ekstrakty bez konieczności ich oczyszczania.

Analizę typu lips rozpoczyna się od inkubacji surowych ekstraktów antygenów grzyba rook z SRA pacjenta. Następnie mieszaninę przeciwciała i antygenu przenosi się z dołków mikrotitracyjnych na płytkę filtrującą 96-dołkową zawierającą kulki białka A/G w celu wychwycenia cząsteczek IgG, po uprzednim przemyciu płytki filtrującej z kulkami białka AG. Ilość związanego z przeciwciałami antygenu rook mierzy się poprzez dodanie substratu luminogennego, a jednostki światła odczytuje się za pomocą luminometru.

Witajcie, jestem dr Catherine Chang z Laboratorium Biologii Sensorycznej w Narodowym Instytucie Badań Nad Zębami i Twarzoczaszką. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę stosowania systemów immunoprecypitacji lucyferazy LIPS. W naszym laboratorium wykorzystujemy system LIPS do pomiaru mian przeciwciał w celu diagnostyki chorób i/lub infekcji.

Subst stratify stanów chorobowych, monitorowanie szczepień oraz inne zastosowania związane z generowaniem profili przeciwciał. Zatem zacznijmy. Przed rozpoczęciem transfekcji plazmidy dla fuzji z lucyferazą vanilla są przygotowywane z wyprzedzeniem, zgodnie z opisem w artykule z BMC biotechnology.

Plazmidowe DNA BYO etal 2005 przygotowuje się przy użyciu zestawu MIDI prep, uzyskując wydajność od jednego do trzech miligramów, a następnie przechowuje jako roztwór zapasowy o stężeniu jeden miligram na mililitr w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Komórki Cost one wykorzystywane do transfekcji hoduje się w DMEM 10%FCS zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli tkankowej. Na dzień przed transfekcją komórki Cost one przesiewa się do nowych szalek o wymiarach 100 na 20 milimetrów w zagęszczeniu około dwóch razy 10 do potęgi sześć komórek na płytkę i inkubuje w temperaturze 37 stopni Celsjusza do następnego dnia.

Komórki powinny osiągnąć 80 do 95% konfluencji. Pozostaw odczynnik do transfekcji FuGENE 6, przechowywany w temperaturze 4°C, do ogrzania do temperatury pokojowej. W czasie ogrzewania FuGENE oznakuj polipropylenowe probówki do wirówki o pojemności 1,5 ml dla każdego plazmidowego DNA przeznaczonego do transfekcji, uważając, aby nie dotykać ścianek probówek. Do probówek, które powinny już zawierać 94 µL medium Opti-MEM, dodaj 6 µL FuGENE 6 i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 1 do 2 µg plazmidowego konstruktu fuzji antygenu lucyferazy. Wymieszaj, odwracając probówkę kilkakrotnie, krótko odwiruj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Przenieś całe optymalne rozwiązanie fuzji DNA nr 6 do komórek, wkraplając je równomiernie do pożywki komórek cos-1. Inkubuj transfektowane komórki cos-1 przez dwa dni, a następnie zbierz je. Aby rozpocząć pozyskiwanie białka fuzyjnego, usuń pożywkę i przemyj komórki 6 mL PBS.

Odessać pozostały PBS z naczynia hodowlanego, dodać 1,4 ml zimnego buforu lizującego, zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i szybko przenieść połowę lizatu do każdej z dwóch probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml umieszczonych na lodzie. Do rozbicia komórek wykorzystuje się urządzenie Branson SOLIDIFIER 150. Umieścić probówkę do mikrowirówki zawierającą lizat komórkowy na lodzie i poddać działaniu impulsowemu przez pięć sekund.

Pięć sekund i pięć sekund. Przy ustawieniach sonikacji odpowiednio dwa, dwa i cztery. Odwiruj lizat komórkowy przy 12 500 RPM przez cztery minuty.

Wirowanie w temperaturze 4°C. Delikatne odwracanie probówek pomiędzy wirowaniami w celu usunięcia słabo przylegających zanieczyszczeń ze ścianek probówki. Następnie ostrożne przeniesienie supernatantu z obu probówek do nowej probówki do mikrowirówki umieszczonej na lodzie, tak aby nie naruszyć osadu.

Aby zmierzyć jednostki świetlne (lu) lizatu, należy rozcieńczyć 1 µL lizatu w 8 µL PBS w nowej probówce do wirówki; bezpośrednio do rozcieńczonej mieszaniny dodać 100 µL substratu OneCelent i natychmiast zmierzyć luminescencję w probówce za pomocą luminometru do probówek, stosując czas odczytu wynoszący 5 sekund od tego kroku w adelante. Pamiętaj o stosowaniu środków ostrożności podczas pracy z próbkami pochodzenia ludzkiego i zwierzęcego. Aby przygotować płytkę wzorcową z surowicą jako źródło przeciwciał pacjentów do profilowania antygenowego, należy najpierw dodać 450 µL buforu A do każdej studzienki 96-dołkowej polipropylenowej płyty mikrotiterowej z głębokimi studzienkami.

Na tym etapie do buforu A można dodać barwnik czerwień fenolową, który będzie służył jako znacznik do monitorowania przyszłych edycji próbek SRA oraz innych etapów analizy LPS. Następnie należy dodać 50 µL surowicy z każdej próbki do każdego dołka zawierającego 450 µL buforu. Uwaga: jest to rozcieńczenie SRA w buforze w stosunku 1:10.

Zazwyczaj do dwóch ostatnich dołków płyty macierzystej nie dodaje się SRA, ponieważ są one zarezerwowane dla próbek kontrolnych z buforem przed przechowywaniem płyty macierzystej do przyszłego użytku. Płytę poddaje się intensywnemu mieszaniu przez jedną do dwóch godzin na platformie rotacyjnej. Przy 650 RPM surowica pozostaje stabilna przez co najmniej miesiąc lub dłużej w temperaturze czterech stopni Celsius, a płytę można uszczelnić parafilmem, aby zapobiec odparowaniu, jeśli ma być ona przechowywana przed przeprowadzeniem testu LIPS. Należy przygotować arkusz zawierający numery identyfikacyjne próbek i przypisane im dołki na płycie macierzystej. Jako płyty robocze do badania surowic stosuje się polipropylenowe 96-dołkowe płytki mikrotitracyjne o niskim profilu.

W pierwszym kroku, do każdego dołka płytki 96-dołkowej należy dodać 40 µL buforu A za pomocą mikro pipety ośmiokanałowej. Następnie należy pobrać 10 µL rozcieńczonej surowicy z płytki matki i przenieść ją bezpośrednio do każdego dołka płytki roboczej, używając mikro pipety ośmiokanałowej. Po zakończeniu procesu płytkę matki należy uszczelnić parafinią, założyć pokrywkę, a następnie owinąć folią Saran i przechowywać w temperaturze 4 °C.

Następnie przygotowuje się master mix zawierający ekstrakt antygenu grona, tak aby do każdej studni dodać 1*10⁷ LU w 50 µL buforu A. Przygotuj tę mieszaninę master mix i pipetuj 50 µL mieszaniny antygenu grona do każdej studni. Przykryj płytkę pokrywą polistyrenową i inkubuj na wytrząsarce rotacyjnej przy 100 RPM przez jedną godzinę.

W temperaturze pokojowej, podczas inkubacji, wyjmij z lodówki 1,5 ml alikwoty 30% zawiesiny kulek białka AG Ultra Link w PBS. Dodaj pięć µL na dno każdej studni nowej 96-dołkowej płytki filtracyjnej HTS. Po godzinnej inkubacji płytki przenieś 100 µL mieszaniny reakcyjnej antygenu i przeciwciała do 96-dołkowych płytek filtracyjnych HTS zawierających kulki białka AG, używając mikropipety wielokanałowej. Inkubuj 96-dołkową płytkę filtracyjną na wytrząsarce obrotowej przez dodatkową godzinę przy 100 RPM w temperaturze pokojowej.

Następnie przemyj płytkę filtrującą, korzystając ze stacji automatyzacyjnej Biome FX. Przy użyciu kolektora próżniowego każda studnia jest płukana osiem razy 100 µL buforu A, a następnie dwukrotnie 100 µL PBS; po ostatnim płukaniu odłącz próżnię. Wyjmij płytkę filtrującą i osusz ją, przykładając stos ręczników papierowych lub papieru filtracyjnego, upewniając się, że usunięto wilgoć z górnej i dolnej strony płytki. Do pomiaru luminescencji w każdej studni płytki wykorzystuje się luminometr do mikro płytek Brt hold LB nine 60 Centro.

Włącz urządzenie i wypłucz wtryskiwacz wodą destylowaną. W cyklu mycia wtryskiwacza należy zastosować substrat INE, który służy do przygotowania i uruchomienia urządzenia; przygotowuje się go z zestawu substratów ranil firmy Promega zgodnie z instrukcjami producenta – zazwyczaj na jedną płytkę potrzeba sześciu mililitrów mieszaniny substratu. Wprowadź mieszaninę substratu do luminometru, a następnie otwórz plik programu zawierający ustawienia dotyczące wtryskiwania substratu i odczytu płytki.

Do tych pomiarów wstrzykuje się 50 µL substratu. Płytkę wstrząsa się przez dwie sekundy, po czym następuje pięciosekundowy odczyt luminescencji.

Uruchom program, który inicjuje odczyt płytki po zakończeniu pomiaru, a następnie niezwłocznie wyjmij filtrowaną płytkę mikrotitracyjną, aby zapobiec wyciekowi cieczy do luminometru. Dane są automatycznie eksportowane z programu microwind do formatu Excel w celu przeprowadzenia dalszej analizy. Wyniki z dwóch różnych pomiarów przy użyciu tych samych surowic należy uśrednić.

W celu wygenerowania wartości miana lu zaleca się wykonanie pomiarów dla każdej próbki. Próbki powtórzone powinny wykazywać wysoką zgodność wartości miana pomiędzy dwoma uruchomieniami. Na potrzeby wykreślania danych wartości miana lu można dodatkowo skorygować poprzez odjęcie tła buforu, jak pokazano tutaj.

Czułość i swoistość testu można również obliczyć, wykorzystując wartości odcięcia pochodzące ze średniej powiększonej o trzy lub pięć odchyleń standardowych próbek kontrolnych. Przedstawiliśmy właśnie sposób pomiaru mian przeciwciał za pomocą metody LIPS; LIPS wymaga minimalnej optymalizacji testu i ze względu na swoją prostotę może być wykorzystywana do generowania wysokiej jakości danych w czasie krótszym niż dwa tygodnie dla dowolnego antygenu. Podczas pracy z ludzkim surowicą należy pamiętać o zachowaniu odpowiednich środków ostrożności.

Należy pamiętać, że metoda lifts jest wysoce skalowalna, dzięki czemu może być stosowana zarówno do pomiaru niewielkiej liczby próbek przy użyciu mycia ręcznego, jak i pełnej płytki z wykorzystaniem zautomatyzowanej stacji roboczej. Ze względu na taką wszechstronność uważamy, że lifts będzie niezwykle użyteczna w analizie seroantygenowej i będzie miała szerokie zastosowanie w analizie chorób oraz w zdrowiu publicznym w ogóle. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach z profilowaniem przeciwciał.