Name: Profilowanie przeciwciał za pomocą systemów immunoprecypitacji lucyferazy (LIPS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-07T17:25:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Poznaj metodę LIPS do ilościowego oznaczania przeciwciał z surowych ekstraktów komórkowych. Technika ta wykorzystuje fuzje lucyferazy Renilla i umożliwia szybkie profilowanie immunologiczne w diagnostyce chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były wspierane przez Wewnątrzzakładowy Program Badawczy NIDCR.

1. Schematyczny przegląd:
Niniejszy film demonstruje etapy przeprowadzania testu LIPS. Antygeny są ekspresjonowane w komórkach Cos1 jako białka rekombinowane Renilla fuzje lucyferazy (Ruc) z antygenem oraz uzyskuje się surowe ekstrakty, które są wykorzystywane bez oczyszczania. Analizę LIPS rozpoczyna się od inkubacji surowyche Ruc-antygen ekstrakty z surowicami pacjentów w dołkach mikropłytki. Mieszaninę przeciwciało-antygen przenosi się następnie na 96-dołkową płytkę filtrującą zawierającą kulki z białkiem A/G w celu wychwycenia cząsteczek IgG. Po przemyciu płytki filtrującej z kulkami z białkiem A/G mierzy się ilość związanego z przeciwciałem antygenu Ruc poprzez dodanie podłoża coelenterazynowego, a jednostki światła mierzy się za pomocą luminometru.
CZĘŚĆ 1: Transfekcja plazmidów w celu produkcji białek fuzyjnych Renilla-antygen
Przygotowanie: Komórki Cos1 są hodowane w pożywce DMEM z dodatkiem 10% FCS zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli tkanek. Plazmidy dla fuzji lucyferazy Renilla zostały opisane wcześniej1. DNA dla tych plazmidów jest przygotowywane przy użyciu zestawu Midiprep firmy Qiagen. Wydajność powinna wynosić około 1 -3 mg. Należy zmierzyć stężenie DNA i przechowywać jako roztwór zapasowy o stężeniu 1000 μg/ml w temperaturze -20°C.
Procedura:
<ol>
<li>Na jeden dzień przed transfekcją przesiać komórki Cos-1 do nowych szalek 100 x 20 mm w zagęszczeniu około 2 X 106 na płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C.
</li>
<li>Następnego dnia komórki Cos-1 powinny osiągnąć 80-95% konfluencji. Oznaczyć polipropylenowe probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml dla każdego plazmidowego DNA przeznaczonego do transfekcji. Pozostawić odczynnik do transfekcji FuGENE-6, przechowywany w temperaturze 4° C, do ogrzania do temperatury pokojowej.</li>
<li>Do każdej probówki dodać 94 μl pożywki Opti-MEM. Następnie dodać 6 μl FuGENE 6 do pożywki Opti-MEM, unikając dotykania ścianek naczynia.
</li>
<li>Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Dodać 1-2 μg (z zapasu DNA 1mg/ml) plazmidu dla konstruktu fuzyjnego antygenu lucyferazy Renilla. Wymieszać, a następnie inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przenieść roztwór DNA-FuGENE 6-Opti-MEM do komórek, rozprowadzając go równomiernie kroplami do pożywki z komórkami Cos1.</li>
</ol>
CZĘŚĆ 2: Pozyskiwanie fuzji antygenów z Renilla
<ol>
<li>Dwa dni po transfekcji zbiera się komórki Cos-1. Procedurę rozpoczyna się od usunięcia medium, a następnie przemycia komórek 6 ml PBS. Po zlaniu PBS należy odpipetować pozostałości tego roztworu z naczynia hodowlanego.</li>
<li>Dodaje się 1,4 ml zimnego buforu do lizy składającego się z 50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 50% glicerolu oraz inhibitorów proteaz (2 tabletki kompletnego koktajlu inhibitorów miniproteaz na 50 ml buforu do lizy). Komórki zbiera się za pomocą skrobaka do komórek i szybko przenosi połowę lizatu do każdej z dwóch probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, umieszczonych w lodzie.</li>
<li>Do rozbicia komórek używa się sonifikatora Branson Sonifier 150. Probówkę do mikrowirówki zawierającą lizat komórkowy umieszcza się w lodzie i poddaje sonikacji w trzech impulsach po 5 s, 5 s i 5 s, przy ustawieniach sonikacji odpowiednio 2, 2 i 4.</li>
<li>Lizat komórkowy wiruje się przy 12 500 RPM w dwóch cyklach po 4 minuty w temperaturze 4 °C. Po pierwszym wirowaniu należy delikatnie odwrócić probówki, aby usunąć luźno przylegające zanieczyszczenia ze ścianek probówki. Po drugim wirowaniu ostrożnie przenosi się nadosad, nie naruszając osadu, z obu probówek do nowej probówki do mikrowirówki w lodzie.</li>
<li>Oblicza się jednostki światła (LU) na μl lizatu. Aby zmierzyć LU, 1 μl lizatu rozcieńcza się 8 μl PBS w nowej probówce do mikrowirówki. Bezpośrednio do rozcieńczonej mieszaniny dodaje się 100 μl podłoża coelenterazyny 1X i natychmiast mierzy się luminescencję w probówce za pomocą luminometru do probówek (20/20n Turner Scientific) z czasem odczytu 5 s.</li>
<li>Lizat antygenu Ruc przechowuje się w temperaturze -20° C przez 1-2 dni lub przez dłuższy czas w alikwotach w temperaturze -80° C.</li>
</ol>
CZĘŚĆ 3: Przygotowanie płytki matrycowej z surowicami
<ol>
<li>Przygotuj płytkę główną z surowicą, dodając najpierw 450 μl buforu A (50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1% Triton X-100) do każdego dołka polipropylowej płytki mikrotitracyjnej z 96 głębokimi dołkami. Na tym etapie do buforu A można dodać barwnik, czerwień fenolową (stężenie końcowe w buforze A wynosi 0,2 μg/ml), który będzie służył jako znacznik do monitorowania późniejszego dodawania próbek surowicy i innych etapów analizy LIPS.</li>
<li>Następnie dodaj 50 μl surowicy z każdej próbki do poszczególnych dołków zawierających 450 μl buforu A. Należy odnotować, że jest to rozcieńczenie surowicy w buforze A w stosunku 1:10. Zazwyczaj surowicy nie dodaje się do dwóch ostatnich dołków płytki głównej, ponieważ są one zarezerwowane dla próbek ślepych z samym buforem.</li>
<li>Przed użyciem płytka główna jest intensywnie wstrząsana (przez 1-2 godziny) na platformie rotacyjnej. Surowica w płytce głównej jest stabilna przez co najmniej 1 miesiąc (lub dłużej) w temperaturze 4° C, pod warunkiem prawidłowego przechowywania w celu zapobiegania odparowaniu.</li>
<li>Jak opisano poniżej, płytka główna dostarcza po 10 μl rozcieńczonej surowicy, które są wielokrotnie pobierane w celu profilowania surowicy przeciwko wielu antygenom. Można stosować również większe lub mniejsze płytki główne. Gdy płytka nie jest używana, należy ją szczelnie zabezpieczyć Parafilmem.</li>
</ol>
CZĘŚĆ 4: Analiza LIPS
<ol>
<li>Do badania surowic wykorzystuje się polipropylenowe płytki mikrotitracyjne z 96 płytkimi dołkami. W pierwszym kroku, za pomocą mikropipety 8-kanałowej, należy dodać 40 μl buforu A do każdego dołka płytki 96-dołkowej.</li>
<li>Następnie należy pobrać 10 μl rozcieńczonej surowicy (ekwiwalent 1 μl surowicy) z płytki matki i przenieść bezpośrednio do każdego dołka płytki roboczej za pomocą mikropipety 8-kanałowej.</li>
<li>Następnie przygotowuje się mieszaninę główną (master mix) zawierającą ekstrakt antygenu Ruc w taki sposób, aby do każdego dołka dodać 1 X 107 jednostek świetlnych (LU) w 50 μl buforu A. Można zastosować mniejsze ilości (nawet 1 X 106), co jednak skutkuje niższym zakresem dynamicznym. Po przygotowaniu mieszaniny głównej należy pipetować 50 μl mieszaniny antygenu Ruc do każdego dołka.</li>
<li>Płytkę inkubuje się na wytrząsarce obrotowej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Podczas inkubacji, do dna każdego dołka nowej płytki filtracyjnej HTS z 96 dołkami (Millipore, Bedford, MA) należy dodać 5 μl 30% zawiesiny kulek Ultralink protein A/G (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) w PBS.</li>
<li>Po 1-godzinnej inkubacji, za pomocą mikropipety 8-kanałowej, należy przenieść 100 μl mieszaniny reakcyjnej antygenu Ruc i przeciwciał na płytki filtracyjne HTS z 96 dołkami zawierające kulki białka A/G.</li>
<li>Płytkę filtracyjną 96-dołkową inkubuje się na wytrząsarce obrotowej przez dodatkową 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Następnie płytkę filtracyjną przemywa się na manifoldzie próżniowym. Każdy dołek należy przemyć 8 razy 100 μl buforu A, a następnie dwukrotnie 100 μl PBS. Można to przeprowadzić ręcznie lub za pomocą robotycznej stacji pipetującej.</li>
<li>Po ostatnim płukaniu należy wyłączyć próżnię. Płytkę filtracyjną wyjmuje się i osusza za pomocą ręczników papierowych lub papieru filtracyjnego, dbając o usunięcie wilgoci z górnej i dolnej części płytki.</li>
</ol>
CZĘŚĆ 5: Pomiar luminescencji i analiza danych
Przygotowanie:
Do pomiaru luminescencji w każdej studzience przy użyciu pojedynczego wtryskiwacza wykorzystuje się luminometr do mikropłytek Berthold LB 960 Centro. Po włączeniu urządzenia należy przepłukać wtryskiwacz wodą destylowaną H2O, korzystając z cyklu mycia wtryskiwacza. Podłoże z koelenterazyną przygotowuje się przy użyciu zestawu do podłoży Renilla firmy Promega zgodnie z instrukcją producenta. Zazwyczaj przygotowuje się 6 ml mieszaniny podłoża z koelenterazyną 1X (tj. 60 μl roztworu zapasu koelenterazyny oraz 6 ml buforu 1X), co wystarcza do przygotowania urządzenia i przebadania jednej pełnej płytki 96-dołkowej. Przed analizą płytki luminometr do mikropłytek Berthold LB 960 Centro należy nasycić podłożem z koelenterazyną 1X. Należy otworzyć plik programu zawierający ustawienia wtryskiwania podłoża i odczytu płytki. W przypadku tych pomiarów wtryskuje się 50 μl podłoża z koelenterazyną, płytkę wstrząsa się przez 2 sec, a następnie przeprowadza 5-sekundowy odczyt luminescencji.
<ol>
<li>Chociaż luminometr do płytek posiada możliwość odczytu całej płytki, można również wybrać odczyt częściowy (w menu odczytu). Uruchom program, aby rozpocząć odczyt płytki.</li>
<li>Po zakończeniu pomiaru niezwłocznie wyjmij mikrofiltracyjną płytkę miareczkową, aby zapobiec rozlaniu cieczy w luminometrze. Wyeksportuj dane wygenerowane w programie MikroWin do formatu Excel w celu przeprowadzenia analizy.</li>
<li>Zaleca się ocenę surowic w dwóch niezależnych seriach pomiarowych. Dane są następnie uśredniane, aby uzyskać wartości miana w LU dla każdej próbki. Wartości te mogą być dalej korygowane poprzez odjęcie wartości tła dla buforu.</li>
<li>Dodatkową analizę danych, taką jak wyznaczenie wartości odcięcia (cutoff), można przeprowadzić, obliczając średnią powiększoną o 3 lub 5 odchylenia standardowe wartości kontrolnych.</li>
</ol>

<ol><li>Burbelo, P. D., Goldman, R., Mattson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunoprecipitation+method+for+quantitatively+measuring+antibody+responses+in+clinical+sera+samples+by+using+mammalian-produced+Renilla+luciferase-antigen+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A simplified immunoprecipitation method for quantitatively measuring antibody responses in clinical sera samples by using mammalian-produced Renilla luciferase-antigen fusion proteins.</a> BMC Biotechnol. 5, 22-22 (2005).</li>
<li>Burbelo, P. D., Leahy, H. P., Iadarola, M. J., Nutman, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Four-Antigen+Mixture+for+Rapid+Assessment+of+Onchocerca+volvulus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">A Four-Antigen Mixture for Rapid Assessment of Onchocerca volvulus Infection.</a> PLoS Negl Trop Dis. 3, e438-e438 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+luminescent+profiling+of+anti-La+and+other+autoantibodies+in+Sj+gren%E2%80%99s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust luminescent profiling of anti-La and other autoantibodies in Sj gren’s syndrome.</a> Autoimmunity. 139, 241-245 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+antibody+quantification+and+generation+of+whole+proteome+antibody+response+profiles+using+LIPS+%28luciferase+immunoprecipitation+systems%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Rapid antibody quantification and generation of whole proteome antibody response profiles using LIPS (luciferase immunoprecipitation systems).</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 889-895 (2007).</li>
<li>Burbelo, P. D., Groot, S., Dalakas, M. C., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+definition+profiling+of+autoantibodies+to+glutamic+acid+decarboxylases+GAD65%2FGAD67+in+stiff-person+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">High definition profiling of autoantibodies to glutamic acid decarboxylases GAD65/GAD67 in stiff-person syndrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 366, 1-7 (2008).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+luminescence+assay+for+autoantibodies+to+mammalian+cell-prepared+insulinoma-associated+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">A new luminescence assay for autoantibodies to mammalian cell-prepared insulinoma-associated protein 2.</a> Diabetes Care. 31, 1824-1826 (2008).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+diagnosis+of+human+herpes+simplex+virus+type+1+and+2+infections+by+luciferase+immunoprecipitation+system+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serological diagnosis of human herpes simplex virus type 1 and 2 infections by luciferase immunoprecipitation system assay.</a> Clin Vaccine Immunol. 16, 366-371 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+quantitative+serological+detection+of+anti-cytomegalovirus+%28CMV%29+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Highly quantitative serological detection of anti-cytomegalovirus (CMV) antibodies.</a> Virol J. 6, 45-45 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-antigen+mixture+containing+v-cyclin+for+serological+screening+of+human+herpesvirus+8+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Four-antigen mixture containing v-cyclin for serological screening of human herpesvirus 8 infection.</a> Clin Vaccine Immunol. 16, 621-627 (2009).</li>
<li>Ramanathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+luciferase+immunoprecipitation+systems+assay+enhances+the+sensitivity+and+specificity+of+diagnosis+of+Strongyloides+stercoralis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A luciferase immunoprecipitation systems assay enhances the sensitivity and specificity of diagnosis of Strongyloides stercoralis infection.</a> J Infect Dis. 198, 444-451 (2008).</li>
</ol>

Metoda LIPS wymaga minimalnej optymalizacji testu i dzięki swojej prostocie zazwyczaj pozwala na uzyskanie wysokiej jakości danych w czasie krótszym niż dwa tygodnie dla dowolnego antygenu. Najbardziej czasochłonnymi etapami są klonowanie i generowanie odpowiedniego plazmidowego wektora ekspresyjnego zawierającego fuzję Ruc-antygen. Po przygotowaniu tych plazmidów można szybko przebadać za pomocą LIPS pojedyncze lub wiele antygenów zgodnie z powyższym opisem. Należy zauważyć, że LIPS jest bardzo wszechstronny, dzięki czemu surowice można testować również w formacie probówkowym lub alternatywnie na mikrotitracyjnej płycie filtracyjnej z pomocą robota BIOMEK2 lub myjki do płytek z filtracją próżniową. Ten wysoce skalowalny system umożliwia równoległe profilowanie LIPS panelu ludzkich autoantygenów3 lub całego proteomu wirusa4. Prawdopodobnie wiele różnych profili przeciwciał generowanych przez LIPS znajdzie zastosowanie w diagnostyce3-9, odkrywaniu antygenów9, śledzeniu przebiegu leczenia10 oraz monitorowaniu szczepionek, co ma szerokie implikacje dla konkretnych stanów chorobowych i zdrowia publicznego w ogóle.

<table><tbody><tr><td>Zestaw HiSpeed Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli tkankowej 100 x 20 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6</td><td>Roche Group</td><td>1814443</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny, mini koktajl inhibitorów proteaz</td><td>Roche Group</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowa płytka 96-dołkowa DeepWell 1 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-120</td><td>Płytka głęboko dołkowa z pokrywką i uszczelnieniem z Parafilmu</td></tr><tr><td>Polipropylenowa płytka mikrotytrowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-120</td><td></td></tr><tr><td>Płytka filtrująca HTS</td><td>EMD Millipore</td><td>MSBVN1B50</td><td></td></tr><tr><td>Ultralink Immobilized Protein A/G</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>53133 (10ml)</td><td></td></tr><tr><td>System do analizy lucyferazy Renilla</td><td>Promega Corp.</td><td>E2820</td><td>Na 2000 analiz</td></tr><tr><td>Luminometr do mikro płytek Centro</td><td>Berthold Technologies</td><td>LB 960</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie przeciwciał za pomocą systemów immunoprecypitacji lucyferazy (lips)

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologie służące do kompleksowego zrozumienia i ilościowego określania profili przeciwciał przeciwko autoantygenom i czynnikom zakaźnym mogą dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmów chorób oraz pomóc w wyłonieniu nowych markerów do substratyfikacji schorzeń o różnych cechach klinicznych i lepszego zrozumienia patogenezy. Opracowaliśmy wysoce ilościową metodę o nazwie systemy immunoprecypitacji lucyferazy (LIPS) do profilowania odpowiedzi przeciwciał w surowicach pacjentów na autoantygeny oraz antygeny patogenów związanych z infekcją. W przeciwieństwie do testów ELISA, wysoce czuła metoda LIPS jest łatwa do wdrożenia w celu badania profili humoralnej odpowiedzi serologicznej na różne antygeny w uniwersalnym formacie i pozwala na uzyskanie dynamicznego zakresu miana przeciwciał do 6 log10dla niektórych antygenów. W badaniach tych profilowanie ilościowe za pomocą LIPS w celu analizy humoralnych odpowiedzi pacjentów przeciwko panelom antygenów, a nawet całemu proteomowi niektórych patogenów (np. HIV), jest zazwyczaj bardziej informacyjne niż testowanie pojedynczego antygenu metodą ELISA. Ponadto LIPS eliminuje czas i wysiłek potrzebny na otrzymanie wysokiej czystości antygenów, a także pracochłonne etapy optymalizacji testów niezbędne w przypadku standardowych testów ELISA. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół opisujący techniczne aspekty przeprowadzania analiz LIPS w celu sprawnego profilowania odpowiedzi przeciwciał na pojedyncze lub wiele antygenów.

Opisano techniczne aspekty przeprowadzania metody LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems). Ogólne podejście polega na ekspresji chimerycznych genów kodujących antygeny połączone z lucyferazą Renilla (Ruc) w komórkach ssaków. Następnie przygotowuje się surowe ekstrakty antygenów-Ruc, które bez oczyszczania są wykorzystywane w testach immunoprecypitacyjnych do ilościowego oznaczenia przeciwciał.

Profilowanie przeciwciał za pomocą systemów immunoprecypitacji lucyferazy (LIPS)

Technologie umożliwiające kompleksowe zrozumienie i ilościowe określenie profili przeciwciał przeciwko autoantygenom i czynnikom zakaźnym mogą dostarczyć nowych informacji na temat chorób...

Niniejszy materiał wideo prezentuje etapy przeprowadzania testów Luminex (LIPS). Antygeny analizowane w teście są ekspresjonowane w komórkach CO one jako rekombinowane fuzje lucyferazy Renilla lub antygenu rook. Wykorzystuje się do tego surowe ekstrakty bez konieczności ich oczyszczania.Analizę typu lips rozpoczyna się od inkubacji surowych ekstraktów antygenów grzyba rook z SRA pacjenta. Następnie mieszaninę przeciwciała i antygenu przenosi się z dołków mikrotitracyjnych na płytkę filtrującą 96-dołkową zawierającą kulki białka A/G w celu wychwycenia cząsteczek IgG, po uprzednim przemyciu płytki filtrującej z kulkami białka AG. Ilość związanego z przeciwciałami antygenu rook mierzy się poprzez dodanie substratu luminogennego, a jednostki światła odczytuje się za pomocą luminometru.Witajcie, jestem dr Catherine Chang z Laboratorium Biologii Sensorycznej w Narodowym Instytucie Badań Nad Zębami i Twarzoczaszką. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę stosowania systemów immunoprecypitacji lucyferazy LIPS. W naszym laboratorium wykorzystujemy system LIPS do pomiaru mian przeciwciał w celu diagnostyki chorób i/lub infekcji.Subst stratify stanów chorobowych, monitorowanie szczepień oraz inne zastosowania związane z generowaniem profili przeciwciał. Zatem zacznijmy. Przed rozpoczęciem transfekcji plazmidy dla fuzji z lucyferazą vanilla są przygotowywane z wyprzedzeniem, zgodnie z opisem w artykule z BMC biotechnology.Plazmidowe DNA BYO etal 2005 przygotowuje się przy użyciu zestawu MIDI prep, uzyskując wydajność od jednego do trzech miligramów, a następnie przechowuje jako roztwór zapasowy o stężeniu jeden miligram na mililitr w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Komórki Cost one wykorzystywane do transfekcji hoduje się w DMEM 10%FCS zgodnie ze standardowymi protokołami hodowli tkankowej. Na dzień przed transfekcją komórki Cost one przesiewa się do nowych szalek o wymiarach 100 na 20 milimetrów w zagęszczeniu około dwóch razy 10 do potęgi sześć komórek na płytkę i inkubuje w temperaturze 37 stopni Celsjusza do następnego dnia.Komórki powinny osiągnąć 80 do 95% konfluencji. Pozostaw odczynnik do transfekcji FuGENE 6, przechowywany w temperaturze 4°C, do ogrzania do temperatury pokojowej. W czasie ogrzewania FuGENE oznakuj polipropylenowe probówki do wirówki o pojemności 1,5 ml dla każdego plazmidowego DNA przeznaczonego do transfekcji, uważając, aby nie dotykać ścianek probówek. Do probówek, które powinny już zawierać 94 µL medium Opti-MEM, dodaj 6 µL FuGENE 6 i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 1 do 2 µg plazmidowego konstruktu fuzji antygenu lucyferazy. Wymieszaj, odwracając probówkę kilkakrotnie, krótko odwiruj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Przenieś całe optymalne rozwiązanie fuzji DNA nr 6 do komórek, wkraplając je równomiernie do pożywki komórek cos-1. Inkubuj transfektowane komórki cos-1 przez dwa dni, a następnie zbierz je. Aby rozpocząć pozyskiwanie białka fuzyjnego, usuń pożywkę i przemyj komórki 6 mL PBS.Odessać pozostały PBS z naczynia hodowlanego, dodać 1,4 ml zimnego buforu lizującego, zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i szybko przenieść połowę lizatu do każdej z dwóch probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml umieszczonych na lodzie. Do rozbicia komórek wykorzystuje się urządzenie Branson SOLIDIFIER 150. Umieścić probówkę do mikrowirówki zawierającą lizat komórkowy na lodzie i poddać działaniu impulsowemu przez pięć sekund.Pięć sekund i pięć sekund. Przy ustawieniach sonikacji odpowiednio dwa, dwa i cztery. Odwiruj lizat komórkowy przy 12 500 RPM przez cztery minuty.Wirowanie w temperaturze 4°C. Delikatne odwracanie probówek pomiędzy wirowaniami w celu usunięcia słabo przylegających zanieczyszczeń ze ścianek probówki. Następnie ostrożne przeniesienie supernatantu z obu probówek do nowej probówki do mikrowirówki umieszczonej na lodzie, tak aby nie naruszyć osadu.Aby zmierzyć jednostki świetlne (lu) lizatu, należy rozcieńczyć 1 µL lizatu w 8 µL PBS w nowej probówce do wirówki; bezpośrednio do rozcieńczonej mieszaniny dodać 100 µL substratu OneCelent i natychmiast zmierzyć luminescencję w probówce za pomocą luminometru do probówek, stosując czas odczytu wynoszący 5 sekund od tego kroku w adelante. Pamiętaj o stosowaniu środków ostrożności podczas pracy z próbkami pochodzenia ludzkiego i zwierzęcego. Aby przygotować płytkę wzorcową z surowicą jako źródło przeciwciał pacjentów do profilowania antygenowego, należy najpierw dodać 450 µL buforu A do każdej studzienki 96-dołkowej polipropylenowej płyty mikrotiterowej z głębokimi studzienkami.Na tym etapie do buforu A można dodać barwnik czerwień fenolową, który będzie służył jako znacznik do monitorowania przyszłych edycji próbek SRA oraz innych etapów analizy LPS. Następnie należy dodać 50 µL surowicy z każdej próbki do każdego dołka zawierającego 450 µL buforu. Uwaga: jest to rozcieńczenie SRA w buforze w stosunku 1:10.Zazwyczaj do dwóch ostatnich dołków płyty macierzystej nie dodaje się SRA, ponieważ są one zarezerwowane dla próbek kontrolnych z buforem przed przechowywaniem płyty macierzystej do przyszłego użytku. Płytę poddaje się intensywnemu mieszaniu przez jedną do dwóch godzin na platformie rotacyjnej. Przy 650 RPM surowica pozostaje stabilna przez co najmniej miesiąc lub dłużej w temperaturze czterech stopni Celsius, a płytę można uszczelnić parafilmem, aby zapobiec odparowaniu, jeśli ma być ona przechowywana przed przeprowadzeniem testu LIPS. Należy przygotować arkusz zawierający numery identyfikacyjne próbek i przypisane im dołki na płycie macierzystej. Jako płyty robocze do badania surowic stosuje się polipropylenowe 96-dołkowe płytki mikrotitracyjne o niskim profilu.W pierwszym kroku, do każdego dołka płytki 96-dołkowej należy dodać 40 µL buforu A za pomocą mikro pipety ośmiokanałowej. Następnie należy pobrać 10 µL rozcieńczonej surowicy z płytki matki i przenieść ją bezpośrednio do każdego dołka płytki roboczej, używając mikro pipety ośmiokanałowej. Po zakończeniu procesu płytkę matki należy uszczelnić parafinią, założyć pokrywkę, a następnie owinąć folią Saran i przechowywać w temperaturze 4 °C.Następnie przygotowuje się master mix zawierający ekstrakt antygenu grona, tak aby do każdej studni dodać 1*10⁷ LU w 50 µL buforu A. Przygotuj tę mieszaninę master mix i pipetuj 50 µL mieszaniny antygenu grona do każdej studni. Przykryj płytkę pokrywą polistyrenową i inkubuj na wytrząsarce rotacyjnej przy 100 RPM przez jedną godzinę.W temperaturze pokojowej, podczas inkubacji, wyjmij z lodówki 1,5 ml alikwoty 30% zawiesiny kulek białka AG Ultra Link w PBS. Dodaj pięć µL na dno każdej studni nowej 96-dołkowej płytki filtracyjnej HTS. Po godzinnej inkubacji płytki przenieś 100 µL mieszaniny reakcyjnej antygenu i przeciwciała do 96-dołkowych płytek filtracyjnych HTS zawierających kulki białka AG, używając mikropipety wielokanałowej. Inkubuj 96-dołkową płytkę filtracyjną na wytrząsarce obrotowej przez dodatkową godzinę przy 100 RPM w temperaturze pokojowej.Następnie przemyj płytkę filtrującą, korzystając ze stacji automatyzacyjnej Biome FX. Przy użyciu kolektora próżniowego każda studnia jest płukana osiem razy 100 µL buforu A, a następnie dwukrotnie 100 µL PBS; po ostatnim płukaniu odłącz próżnię. Wyjmij płytkę filtrującą i osusz ją, przykładając stos ręczników papierowych lub papieru filtracyjnego, upewniając się, że usunięto wilgoć z górnej i dolnej strony płytki. Do pomiaru luminescencji w każdej studni płytki wykorzystuje się luminometr do mikro płytek Brt hold LB nine 60 Centro.Włącz urządzenie i wypłucz wtryskiwacz wodą destylowaną. W cyklu mycia wtryskiwacza należy zastosować substrat INE, który służy do przygotowania i uruchomienia urządzenia; przygotowuje się go z zestawu substratów ranil firmy Promega zgodnie z instrukcjami producenta – zazwyczaj na jedną płytkę potrzeba sześciu mililitrów mieszaniny substratu. Wprowadź mieszaninę substratu do luminometru, a następnie otwórz plik programu zawierający ustawienia dotyczące wtryskiwania substratu i odczytu płytki.Do tych pomiarów wstrzykuje się 50 µL substratu. Płytkę wstrząsa się przez dwie sekundy, po czym następuje pięciosekundowy odczyt luminescencji.Uruchom program, który inicjuje odczyt płytki po zakończeniu pomiaru, a następnie niezwłocznie wyjmij filtrowaną płytkę mikrotitracyjną, aby zapobiec wyciekowi cieczy do luminometru. Dane są automatycznie eksportowane z programu microwind do formatu Excel w celu przeprowadzenia dalszej analizy. Wyniki z dwóch różnych pomiarów przy użyciu tych samych surowic należy uśrednić.W celu wygenerowania wartości miana lu zaleca się wykonanie pomiarów dla każdej próbki. Próbki powtórzone powinny wykazywać wysoką zgodność wartości miana pomiędzy dwoma uruchomieniami. Na potrzeby wykreślania danych wartości miana lu można dodatkowo skorygować poprzez odjęcie tła buforu, jak pokazano tutaj.Czułość i swoistość testu można również obliczyć, wykorzystując wartości odcięcia pochodzące ze średniej powiększonej o trzy lub pięć odchyleń standardowych próbek kontrolnych. Przedstawiliśmy właśnie sposób pomiaru mian przeciwciał za pomocą metody LIPS; LIPS wymaga minimalnej optymalizacji testu i ze względu na swoją prostotę może być wykorzystywana do generowania wysokiej jakości danych w czasie krótszym niż dwa tygodnie dla dowolnego antygenu. Podczas pracy z ludzkim surowicą należy pamiętać o zachowaniu odpowiednich środków ostrożności.Należy pamiętać, że metoda lifts jest wysoce skalowalna, dzięki czemu może być stosowana zarówno do pomiaru niewielkiej liczby próbek przy użyciu mycia ręcznego, jak i pełnej płytki z wykorzystaniem zautomatyzowanej stacji roboczej. Ze względu na taką wszechstronność uważamy, że lifts będzie niezwykle użyteczna w analizie seroantygenowej i będzie miała szerokie zastosowanie w analizie chorób oraz w zdrowiu publicznym w ogóle. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach z profilowaniem przeciwciał.

antibody-profiling-by-luciferase-immunoprecipitation-systems-lips

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Profilowanie przeciwciał przez układy immunoprecypitacyjne luciferase (LIPS)

Test ELISA można łatwo przekształcić w analizę Luminex xMAP, a dzięki zaletom multipleksowania można jednocześnie przesiewowo badać kilka przeciwciał w celu zidentyfikowania optymalnej pary przeciwciał, co prowadzi do zwiększenia czułości i zakresu dynamicznego przy jednoczesnym obniżeniu kosztów analizy.

Konwersja testu ELISA typu capture na test Luminex xMAP z wykorzystaniem metody wielipleksowego przesiewania przeciwciał

Film demonstruje test lucyferazy używany do ilościowego oznaczania białek znakowanych lucyferazy. W teście wykorzystuje zmodyfikowany enzym lucyferazy składający się z dużego fragmentu, który wiąże się z małym fragmentem, który jest sprzężony z interesującym białkiem. Związane podjednostki tworzą aktywny enzym, który w obecności substratu uwalnia sygnał luminescencyjny. Sygnał ten jest następnie oznaczany ilościowo za pomocą luminometru.

Test lucyferazy: wysokoprzepustowy test do pomiaru sygnałów luminescencyjnych przy użyciu zaprojektowanych bioreporterów opartych na systemie nanolucyferazy

Ten film demonstruje użycie testu ELISpot do oceny funkcji komórek B wydzielających przeciwciała, ASC. Przeciwciała wydzielane przez ASC oddziałują z fragmentami przeciwciał poliklonalnych związanymi z błoną, które są wykrywane przez przeciwciała IgG lub IgM sprzężone z enzymem. Kolorowa plamka wytworzona w każdym dołku wskazuje na obecność specyficznego izotypu przeciwciała, który koreluje z aktywnością wydzielniczą limfocytów B.

Ocena funkcjonalna limfocytów B wydzielających przeciwciała za pomocą testu ELISpot

Interakcje białko-białko mogą zachodzić zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie komórki. Aby zbadać te interakcje, stosuje się tradycyjną koimmunoprecypitację i nowoczesny test ligacji zbliżeniowej. W tym badaniu porównujemy te dwie metody wizualizacji rozkładu oddziaływań NF90-RBM3 w jądrze i cytoplazmie.

Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ

Zademonstrowano test immunologiczny oparty na naczyniach włosowatych, wykorzystujący komercyjną platformę do pomiaru docelowych białek z całkowitych preparatów białkowych. Ponadto parametry testowe czasu ekspozycji, stężenia białka i rozcieńczenia przeciwciał są zoptymalizowane pod kątem systemu modelowego hodowli komórkowych.

Procedura i kluczowe strategie optymalizacyjne dla zautomatyzowanej metody immunologicznego opartego na elektroforetycznych naczyniach włosowatych

Badanie wielu, endogennych modyfikacji potranslacyjnych dla docelowego białka może być niezwykle trudne. Opisane tutaj techniki wykorzystują zoptymalizowany bufor do lizy i system filtrów opracowany ze specyficznymi matrycami powinowactwa do kierowania PTM, do wykrywania modyfikacji acetylacji, ubikwitynacji, SUMOylacji 2/3 i fosforylacji tyrozyny dla białka docelowego przy użyciu jednego, usprawnionego systemu.

Wykorzystanie kompleksowego systemu wzbogacania immunoprecypitacji w celu zidentyfikowania endogennego profilu modyfikacji potranslacyjnej dla białek docelowych

Tutaj pokazujemy, jak używać testu ligacji zbliżeniowej (PLA) do wizualizacji heterodimeryzacji MST1/MST2 w stałych komórkach z wysoką czułością.

Wykrywanie heterodimeryzacji izoform białek za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ

Tutaj prezentujemy biosensor oparty na lucyferazie, który pozwala określić ilościowo aktywność kinazy dużego supresora nowotworów (LATS) - centralnej kinazy w szlaku sygnałowym Hippo. Ten bioczujnik ma różnorodne zastosowania w badaniach podstawowych i translacyjnych mających na celu zbadanie regulatorów szlaku hipopotama in vitro i in vivo.

Monitorowanie aktywności szlaku sygnałowego hipopotama za pomocą biosensora LATS (Large Tumor Suppressor) opartego na lucyferazie

Metoda BSelex do identyfikacji i odzyskiwania pojedynczych przeciwciał specyficznych dla antygenu z komórek jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej łączy cytometrię przepływową z PCR pojedynczych komórek i klonowaniem.

Metoda przesiewowa pojedynczych komórek w celu selekcji i odzyskiwania przeciwciał o pożądanej swoistości ze wzbogaconych populacji komórek B ludzkiej pamięci

Opisany protokół opisuje procedurę wytwarzania kompleksu białkowego HiBiT wiążącego receptor domeny oraz jego zastosowanie do szybkiego i czułego wykrywania przeciwciał SARS-CoV-2.

Wykrywanie przeciwciała domeny wiążącej receptor SARS-CoV-2 za pomocą bioreportera opartego na HiBiT

Poznaj metodę LIPS do ilościowego oznaczania przeciwciał z surowych ekstraktów komórkowych. Technika ta wykorzystuje fuzje lucyferazy Renilla i umożliwia szybkie profilowanie immunologiczne w diagnostyce chorób.

Profilowanie przeciwciał za pomocą systemów immunoprecypitacji lucyferazy (LIPS)

Przeglądaj więcej filmów