Badanie agresji u Drosophila (muszek owocówek)

Nazywam się Sarah Ertel i jestem pracownikiem postdoktoranckim w laboratorium EDA Kravitza tutaj, w Katedrze Neurobiologii w Harvard Medical School. Nazywam się Sibu. Jestem studentem medycyny z Niemiec i odbywam tutaj staż badawczy w laboratorium Kravitza.

Chcemy pokazać Państwu, w jaki sposób organizujemy walki oraz badamy agresję u muszek owocówek. Pierwszym krokiem jest przygotowanie probówek izolacyjnych, co polega na podgrzaniu pożywki dla muszek w kuchence mikrofalowej i dodaniu 1,5 ml pożywki do probówki hodowlanej po jej zastygnięciu. Następnie zamykamy ją watą.

Pierwszym krokiem jest pozyskanie społecznie naiwnych much. Nie miały one kontaktu z innymi osobnikami. W tym celu pobieramy poczwarki w późnym stadium rozwoju z wybranych linii much, a następnie ostrożnie usuwamy je z fiolki za pomocą pęsety.

Należy wziąć przygotowaną fiolkę do izolacji, usunąć watę i delikatnie umieścić w niej poczwarkę, a następnie zakręcić fiolkę i ją opisać. Poczwarki zostają umieszczone z powrotem w inkubatorze z kontrolowaną temperaturą i cyklem dobowym. Następnego dnia sprawdzamy, czy poczwarki przekształciły się w dorosłe osobniki, a następnie zapisujemy datę wylęgu much.

Następnie pozostawiamy je na trzy do pięciu dni, a w tym czasie nakładamy farbę na tylną część odwłoków much, aby móc je zidentyfikować. Teraz przygotowujemy komory do właściznych walk. W tym celu używamy dwóch zwykłych szkiełek przedmiotowych, odmierzamy środek i zaznaczamy go rysikiem diamentowym, nacinając powierzchnię, a następnie odnajdując krawędź nacięcia, dzięki czemu szkiełko przedmiotowe powinno łatwo pęknąć na pół. Dobrze.

Następnie krawędzie szkiełek sklejamy za pomocą kleju. Potem obie połowy są ze sobą sklejone, tworząc pudełko. Możemy oczyścić je 70% etanolem, a następnie wodą, aby usunąć pozostałości z palców.

Wypełnij dno komory 1% agros i umieść komorę wewnątrz. Zapewni to odpowiednią wilgotność dla much. Następnie chcemy dostarczyć muchom coś, o co będą mogły walczyć.

Zatem, mimo że faktyczny rozmiar komory można uznać za terytorium, dostarczamy im pokarm. Pokarm ten umieszczamy w fiolce scyntylacyjnej. Tworzy to dodatkowy poziom potencjalnej terytorialności, której pojedyncza mucha mogłaby chcieć bronić.

Teraz wezmę świeżo podgrzaną w mikrofalówce pożywkę i przeleję ją do kubeczków z pożywką, które w rzeczywistości są nakrętkami do probówek scyntylacyjnych; będą one służyć jako arena walki, na której muchy będą później walczyć. Ważne jest, aby powierzchnia była lekko wypukła, co pozwoli na obejrzenie całej jej powierzchni. Należy również unikać powstawania pęcherzyków powietrza, ponieważ stanowiłyby one przeszkodę dla much podczas poruszania się po kubeczku z pożywką, co jest istotne, aby zwabić muchy do pożywki.

Dodamy również kroplę pasty drożdżowej na środek naczynia z pożywką. Najpierw musimy przygotować pastę drożdżową. W tym celu pobieramy żywą pastę drożdżową, umieszczamy ją w naczyniu z pożywką, następnie dodajemy kroplę wody i mieszamy, aż powstanie pasta.

Po ostygnięciu kubeczków z pożywką należy nałożyć pastę drożdżową lub jej niewielką kroplę na środek kubeczka. Znajdujemy się obecnie w pomieszczeniu do obserwacji behawioralnych, jednym z dwóch takich pomieszczeń. To pomieszczenie jest całkowicie zaciemnione po wyłączeniu wszystkich świateł, a wilgotność i temperatura w nim są kontrolowane.

Utrzymujemy temperaturę na poziomie 25°C i staramy się zachować wilgotność powyżej 40%, aby w przypadku muszek kontrolować jak najwięcej parametrów. Teraz przygotuję klatki. Przyniesione wcześniej przygotowane kubki z pożywką znajdują się tutaj i zamierzam umieścić je w tych komorach.

Postaraj się umieścić je na środku komory. Nakładamy pokrywkę. Dobrze. Teraz użyję tego aspiratora, aby odessać muchy – dokładnie parę much.

W związku z tym wezmę dwie muchy, odessę je tutaj, a następnie umieszczę w komorze. Tak postąpię. Teraz będę trzymać fiolkę w ten sposób, ponieważ wiadomo, że muchy poruszają się przeciwnie do kierunku działania grawitacji i w stronę światła, więc mają tendencję do przemieszczania się w górę.

Dzięki temu łatwiej mi je złapać podczas usuwania waty. Jak widać, w tej chwili w pułapce znajdują się obie muchy. Muszę również upewnić się, że ponieważ są to muchy malowane, wybiorę jedną malowaną oraz jedną niemalowaną.

Lub jeśli użyjemy dwóch kolorów, jednego pomalowanego w jeden kolor, a drugiego w inny, mimo że mają ten sam genotyp. Teraz umieszczam je w odpowiedniej komorze. Usuwam kulkę wosku.

Znajduje się tam niewielki otwór, przez który wprowadzam muchy; staram się ustawić pokrywkę w taki sposób, aby muchy nie mogły uciec podczas stukania. Muchy opadną nieco w dół, a następnie delikatnie dmucham, aby nie robić tego zbyt gwałtownie, gdyż mogłoby to zakłócić ich stan. Potrzebują one od trzech do powiedzmy 40 minut, aby uspokoić się i zapoznać z otoczeniem w komorze.

Następnie zaczną zajmować naczynie z pokarmem i rozpocznie się walka. Teraz wezmę całą komorę i umieszczę ją przed kamerą, a następnie muszę dostosować wysokość tak, aby filmować naczynie z pokarmem pod niewielkim kątem, aby było ono w całości widoczne. I aby całe naczynie z pokarmem znajdowało się w ostrości.

Ważne jest również pomieszczenie, w którym przygotowywane są te testy agresji. Jest to odizolowany pokój, wolny od ruchu i hałasu. Utrzymuje się w nim temperaturę 25 °C i staramy się zachować wilgotność na poziomie od 45 do 55%, aby zapewnić muszkom odpowiednie warunki do zachowania zdrowia i dobrostanu w tej sytuacji.

Dodatkowo przyciemniamy światła górne, aby światło nad naczyniem z pokarmem również stanowiło atrakcję dla muszek. Wykorzystanie DFA jako modelu oraz tego rodzaju konfiguracji pozwala nam badać nie tylko intensywność agresji, ale także konkretne wzorce agresywnych zachowań, które obserwujemy. Jesteśmy bardzo zainteresowani poznaniem tego, w jaki sposób mózg jest okablowany podczas rozwoju, a następnie, jak objawia się to u osobnika dorosłego, który nie nauczył się tych zachowań.

W związku z tym wychodzą natychmiast, gdy widzą, że zaczynają one wchodzić w interakcje z innymi muchami. Wiedzą, jak gwałtownie atakować, wiedzą, jak być agresywnymi. Chcemy zatem dowiedzieć się, w jaki sposób te zachowania są zakodowane w układzie nerwowym much i jak są następnie kontrolowane.