Name: Zastosowanie SC1 (pluripotyny) w celu wspomagania samoodnawiania mESC w przypadku braku LIF (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Poznaj metodę utrzymywania samoodnawiania mysich komórek macierzystych ES za pomocą cząsteczki SC1 jako ekonomicznej alternatywy dla czynnika LIF. Technika ta umożliwia zachowanie pluripotencji przy niższych kosztach badań.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować dr. Sheng Dinga z The Scripps Research Institute oraz dr. Hongkui Denga z Uniwersytetu Pekińskiego za pomoc i wskazówki.

1. Przygotowanie płytek z komórkami karmionymi MEF
<ol>
<li>Na dzień przed hodowlą komórek ES rozmrozić jedną fiolkę napromieniowanych komórek zasilających MEF E14.5 CF-1 (patrz: nasza procedura rozmrażania komórek ES).</li>
<li>Wysiać komórki zasilające MEF w gęstości 10 000 komórek/dołek na płytce 12-dołkowej. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37°C i przy 5% CO2. Pożywka dla komórek MEF: DMEM uzupełniony o 10% ES-PBS, 1X glutaminę oraz 1X nieistotne aminokwasy.</li>
</ol>
2. Utrzymanie zdolności do samoodnawiania komórek ES myszy
<ol>
<li>Odczepić komórki ES za pomocą trypsyny. Wysiać komórki w gęstości 50 000 cells/well na uprzednio przygotowane płytki z warstwą wspomagającą MEF w pożywce wzrostowej (Knockout MEM uzupełniony o 15% KSR, 4 mM L-glutaminy, 0,1 mM aminokwasów niepodstawowych i 1X BME) z dodatkiem SC1 w żądanym stężeniu (użyto 100 nM, 300 nM i 1 μM). Dodano również studzienkę kontrolną pozytywną, uzupełnioną o 1000 μ/ml LIF. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
<li>Hodować komórki w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 3-4 dni w każdym pasażu. Odświeżać pożywkę co 48 godzin.</li>
<li>Pasażować komórki w stosunku od 1:10 do 1:15 za pomocą trypsyny, aby utrzymać gęstość zbliżoną do początkowej gęstości wysiewu. Po 5 pasażach można zbadać komórki pod kątem ekspresji typowych markerów pluripotencji, stosując immunocytochemię.</li>
</ol>
3. Badanie markerów pluripotencji metodą immunocytochemiczną
<ol>
<li>Delikatnie przemyć komórki trzykrotnie za pomocą PBS.</li>
<li>Utrwalić komórki, dodając 500 μl utrwalacza, i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Delikatnie przemyć komórki trzykrotnie za pomocą PBS.</li>
<li>Zablokować nieswoiste wiązania, dodając 500 μl buforu blokującego, i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Inkubować komórki z 250 μl specyficznego przeciwciała pierwszorzędowego (użyto Nanog, Sox2, SSEA1 oraz Oct4 w następujących rozcieńczeniach: 1:500, 1:2000, 1:500 i 1:500).</li>
<li>Delikatnie przemyć komórki trzykrotnie za pomocą PBS.</li>
<li>Inkubować komórki z 250 μl przeciwciała wtórnego przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem (użyto przeciwciał osiołkowych anty-mysich sprzężonych z Alexa Fluor® 555 w rozcieńczeniu 1:2000 oraz osiołkowych anty-króliczych sprzężonych z Alexa Fluor® 488 w rozcieńczeniu 1:2000).</li>
<li>Delikatnie przemyć komórki trzykrotnie za pomocą PBS.</li>
<li>Do ostatniego przemycia dodać DAPI (stężenie końcowe 1 μg/ml) i inkubować przez 5 minut w celu wizualizacji jąder komórkowych.</li>
<li>Przeanalizować komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
1. Wyniki morfologiczne:
Mysie komórki ES (ESC R1) hodowano na komórkach zasilających MEF w obecności LIF lub SC1 w celu utrzymania samoodnawiania w stanie niedróżnicowanym. Po drugim pasażu zaobserwowano różnicowanie komórek pozbawionych LIF lub SC1 (kontrola negatywna), a po 5 pasażach praktycznie nie stwierdzono kolonii niedróżnicowanych. Kolonie traktowane LIF (kontrola pozytywna) pozostawały w stanie niedróżnicowanym przez wszystkie 5 pasaży komórek. Komórki traktowane SC1 w stężeniach 300 nM lub 100 nM również pozostały niedróżnicowane po 5 pasażach, natomiast w przypadku komórek traktowanych 1 μM SC1 doszło do śmierci komórek po czwartym pasażu. (ryc. 2 notatki aplikacyjnej) Tabela 1 podsumowuje obserwacje morfologiczne.
2. Ekspresja markerów pluripotencji
Komórki ES myszy utrzymywane przez 5 pasaży utrwalono i poddano badaniu immunocytochemicznemu w kierunku SSEA1, Oct4, Nanog i Sox2. Ekspresja markerów była podobna do komórek utrzymywanych w LIF. (rys. 3 i 4 notatki aplikacyjnej)
<img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="Mikroskopia kontrastowa komórek R1 hodowanych w LIF i SC1; porównanie morfologii komórek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1: Porównanie morfologii komórek hodowanych w LIF lub SC1. Nie zaobserwowano różnic w morfologii.
<img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="Immunocytochemia komórek R1, warunki LIF i SC1, markery Nano, Sox, SSEA, Oct, DAPI, 10X." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2 i 3"> Rycina 2 i Rycina 3: Barwienie Nanog, SSEA1, Sox2 i Oct4 komórek ES hodowanych z dodatkiem SC1 lub LIF (ryc. 4 notatki aplikacyjnej). Komórki hodowane w SC1 wykazują ekspresję markerów pluripotencji podobną do komórek hodowanych w LIF.
Tabela 1
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>Kontrola negatywna</td>
 <td>Kontrola pozytywna LIF</td>
 <td>SC1 1uM</td>
 <td>SC1 300 nM</td>
 <td>SC1 100 nM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1. pasaż</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2. pasaż</td>
 <td>Częściowa morfologia zróżnicowana</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3. pasaż</td>
 <td>Większość komórek zróżnicowana</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4. pasaż</td>
 <td>Brak kolonii ESC</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 <td>Obserwowano śmierć komórek</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5. pasaż</td>
 <td>zróżnicowane</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 <td>Obserwowano śmierć komórek</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 <td>Normalna morfologia komórek ES</td>
 </tr>
</tbody>
</table>

<ol><li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li>
<li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acat.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li>
</ol>

Autorzy tego artykułu są zatrudnieni przez firmę Stemgent, która produkuje odczynniki i instrumenty wykorzystane w niniejszym artykule.

Mała cząsteczka SC1 może być wykorzystana do utrzymania zdolności do samoodnawiania przy jednoczesnym zachowaniu stanu niedróżnicowania w komórkach ES myszy. Przed jednak zastosowaniem jej w nieprzebadanej linii komórkowej należy przeprowadzić miareczkowanie w celu ustalenia optymalnego stężenia. Przykładowo, przetestowano trzy stężenia na linii komórek ES myszy ESC R1. Stężenia 100 nM oraz 300 nM pozwoliły na utrzymanie komórek ES myszy, natomiast stężenie 1 μM okazało się toksyczne.
SC1 może być również stosowane w warunkach bez użycia komórek karmionek.

<table><tbody><tr><td>SC1</td><td>Stemgent</td><td>04-0011</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało SSEA-1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>21702</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało Nanog</td><td>Abcam</td><td>ab21603</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało Sox2</td><td>Chemicon International</td><td>Ab5603</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało Oct4</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie sc1 (pluripotin) w celu wspierania samoodnowy mesc wobec braku lif

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mysie embrionalne komórki macierzyste (ES) są konwencjonalnie hodowane z czynnikiem hamującym białaczkę (LIF), aby utrzymać zdolność do samoodnawiania.1Jednakże LIF jest kosztowny, a aktywacja szlaku LIF/JAK/STAT3 nie jest absolutnie wymagana do utrzymania stanu samoodnawiania.2Mała cząsteczka SC1 może stanowić ekonomiczną alternatywę dla LIF. SC1 działa poprzez podwójne hamowanie Ras-GAP oraz ERK1.3Ilustracja jego mechanizmu działania sprawia, że jest to przydatne narzędzie do badania podstawowego molekularnego mechanizmu samoodnowy. W niniejszym materiale przedstawiamy procedurę hodowli komórek ES myszy w obecności SC1 i wykazujemy, że są one zdolne do utrzymania samoodnowy przy braku LIF. Komórki hodowane z SC1 wykazywały podobną morfologię w porównaniu z komórkami utrzymywanymi z LIF. Obie grupy wykazywały typową morfologię komórek ES myszy po pięciu pasażach. Ekspresja typowych markerów pluripotencji (Oct4, Sox2, Nanog oraz SSEA1) została zaobserwowana po pięciu pasażach w obecności SC1. Ponadto SC1 nie wywołał widocznej toksyczności w komórkach ES myszy.

SC1 działa poprzez podwójne hamowanie Ras-GAP oraz ERK1. Przebadaliśmy funkcję SC1 w wspieraniu samoodnawiania się mysich komórek ES w obecności braku LIF i wykazaliśmy, że SC1 jest w stanie utrzymać samoodnawianie się kultur mysich komórek ES.

Zastosowanie SC1 (Pluripotin) w celu wspierania samoodnowy mESC wobec braku LIF

Mysie embrionalne komórki macierzyste (ES) są konwencjonalnie hodowane z zastosowaniem czynnika hamującego białaczki (LIF) w celu utrzymania zdolności do samoodnowy.1 Jednakże LIF jest kosztowny i ...

Cześć, nazywam się Sarah NAU i pracuję w laboratorium STEM Gen w Bostonie. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę utrzymania zdolności do samoodnawiania mysich embrionalnych komórek macierzystych w obecności małej cząsteczki C1.Jednakże L jest kosztowny. Dlatego przedstawimy tutaj ekonomiczną alternatywę w postaci małej cząsteczki SC one. W ostatniej części filmu pokażemy porównanie ekspresji markerów pluripotencji między komórkami hodowanymi w L a tymi hodowanymi w SC one.Zacznijmy zatem. Na jeden dzień przed hodowlą embrionalnych komórek macierzystych rozmroź ampułkę napromieniowanych komórek karmicieli. Wysiej komórki karmiciele z gęstością 10 000 komórek na studzienkę.W płytce 12-dołkowej inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C przy 5% carbon dioxide. Następnego dnia wykonać wysiew. Komórki ES na warstwie wspierającej MEF wysiać w gęstości 50 000 komórek na dołek na przygotowanych płytkach z warstwą wspierającą w pożywce wzrostowej uzupełnionej o SC one w pożądanych stężeniach; zastosowano 100 nM, 300 nM oraz 1 µM.Jako kontrolę przygotowujemy dołek uzupełniony o 1000 µg/ml LIF. Następnie inkubujemy komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2.Następnego dnia należy odświeżyć pożywkę w celu zapewnienia ciągłości hodowli. Pożywkę należy wymieniać co 48 godzin, a komórki pasażować w stosunku 1:10 co trzy do czterech dni, aby utrzymać gęstość zbliżoną do początkowej gęstości zasiewu. Po pięciu pasażach można sprawdzić ekspresję typowych markerów pluripotencji za pomocą immunochemii, aby rozpocząć analizę immunochemiczną komórek macierzystych.Zacznij od delikatnego trzykrotnego przemycia komórek PBS. Utrwal komórki, dodając 500 µL 4% paraformaldehydu na 20 minut w temperaturze pokojowej. Po ponownym trzykrotnym przemyciu komórek w PBS, zablokuj niespecyficzne wiązania, dodając 500 µL buforu blokującego na jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Następnie dodaj 250 µL przeciwciała pierwszorzędowego do komórek i inkubuj je przez noc w temperaturze 4 °C. W tym doświadczeniu przeprowadzamy inkubację z przeciwciałami przeciwko nano SOX2, SSEA1 oraz OCT4. Po kolejnej serii płukań inkubuj komórki z 250 µL przeciwciała wtórnego sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem; wypłucz komórki po raz ostatni, dodając DAPI w końcowym stężeniu 1 µg/mL do ostatniej porcji płuczki.Następnie inkubuj komórki przez pięć minut w celu zabarwienia jąder. Na koniec poddaj komórki analizie pod mikroskopem fluorescencyjnym. Przedstawione tutaj obrazy w polu jasnym ukazują mysie komórki ES hodowane na komórkach dokarmiających w obecności LIF lub SC one w celu utrzymania zdolności do samoodnawiania w stanie nieróżnicowania.Tutaj przedstawiono komórki ES myszy, które były hodowane przez pięć pasaży. Komórki utrwalono i poddano badaniu immunohistochemicznemu w kierunku SSEA 1, OCT 4, Nanog oraz SOX 2. Ekspresja markerów w komórkach hodowanych w C 1 była podobna do ekspresji w komórkach hodowanych w LIF.Właśnie pokazaliśmy, jak użyć małej cząsteczki SC one do utrzymania zdolności do samoodnowy w embrionalnych komórkach macierzystych myszy. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że przed zastosowaniem SC one w nieprzebadanej linii komórkowej należy przeprowadzić miareczkowanie w celu ustalenia optymalnego stężenia. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

the-use-sc1-pluripotin-to-support-mesc-self-renewal-absence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zastosowanie SC1 (Pluripotin) do wspierania samoregeneracji mESC w przypadku braku LIF

Opisujemy test z reporterem fluorescencyjnym służący do szybkiej identyfikacji i charakterystyki genów regulujących utrzymanie oraz samoodnawianie embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Analiza reporterowa Oct4GiP w celu badania genów regulujących utrzymanie i samoodnawianie macierzystych komórek embrionalnych myszy

Mysi fibroblast embrionalny może być przeprogramowany w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z niską wydajnością poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Rzadkimi produktami pośrednimi reakcji przeprogramowania są FACS izolowane przez znakowanie przeciwciałami przeciwko producentom powierzchni komórek Thy-1.2, Ssea-1 i Epcam.

Oczyszczanie za pośrednictwem markerów powierzchniowych komórek iPS z reprogramowalnego modelu myszy

Tutaj prezentujemy ilościowy i skalowalny protokół do przeprowadzania ukierunkowanych badań przesiewowych małych cząsteczek dla regulatorów kinaz naiwnie zaszczepionego przejścia pluripotencjalnego.

Prosta metoda identyfikacji kinaz, które regulują pluripotencję embrionalnych komórek macierzystych za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych inhibitorów

Białka często zawierają wiele domen, które mogą pełnić różne funkcje komórkowe. Nokauty genów (KO) nie uwzględniają tej różnorodności funkcjonalnej. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na wymianie kasetowej za pośrednictwem rekombinacji (RMCE) oparte na strukturze i funkcji w embrionalnych komórkach macierzystych KO, które pozwala na molekularną sekcję różnych domen funkcjonalnych lub wariantów białka.

Badania strukturyczno-funkcjonalne w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z wykorzystaniem wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy

Ten protokół opisuje przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i błonowych mezenchymalnych komórek macierzystych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu nieintegrującego podejścia epizodycznego w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach. Szczegółowo opisano procedury ekstrakcji, hodowli, przeprogramowania i charakterystyki powstałych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą rygorystycznych metod.

Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Opisaliśmy szczegółowo dwa protokoły chemiczne do hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy. Ta nowa metoda wykorzystuje synergiczne mechanizmy promowania utleniania za pośrednictwem Tet (przez witaminę C) i tłumienia syntezy de novo 5-metylocytozyny (przez PD0325901) w celu utrzymania hipometylacji DNA i pluripotencji embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Alternatywna metoda hodowli w celu utrzymania genomowej hipometylacji embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu inhibitora MEK PD0325901 i witaminy C

Przedstawiamy protokół do wydajnej, masowej i szybkiej chemicznej rewersji konwencjonalnych linii komórek ludzkich o uprzywilejowanej linii pluripotentnych komórek macierzystych (hPSC) w epigenomicznie stabilny naiwny stan pluripotentny przypominający epiblast preimplantacyjny. Metoda ta powoduje zmniejszenie ekspresji genów o uprzywilejowanej linii i znaczną poprawę kierowanej różnicowania wieloliniowego w szerokim zakresie konwencjonalnych linii hPSC.

Chemiczna rewersja konwencjonalnych ludzkich komórek pluripotentnych do stanu naiwnego z poprawioną wieloliniową zdolnością do różnicowania

Oto protokół do identyfikacji interakcji genetycznych za pomocą zwiększonej liczby kopii u Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta pozwala naukowcom identyfikować, klonować i testować supresory w krótko żyjących mutantach drożdży. Testujemy wpływ wzrostu liczby kopii SIR2 na długość życia w autofagii mutanta zerowego.

Ekran supresorowy do charakterystyki powiązań genetycznych regulujących chronologiczną długość życia u Saccharomyces cerevisiae

Prezentujemy tutaj metodę, która łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoryką, aby efektywnie generować komórki pluripotencjalne ssaków, bez potrzeby transfekcji genów lub wektorów retrowirusowych. Strategia ta jest zatem obiecująca dla medycyny translacyjnej i stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych.

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

Zestaw do fluorescencyjnego wykrywania proteaz został opracowany do pomiaru aktywności proteaz metodą fluorometrii. Nadaje się on również do wykrywania śladowych ilości zanieczyszczeń proteazami. Metoda opiera się na proteolitycznej hydrolizie opatentowanej formulacji substratu kazeinowego znakowanego FITC.

Zastosowanie zestawu do fluorescencyjnego wykrywania proteaz w celu oznaczenia aktywności proteazy

Poznaj metodę utrzymywania samoodnawiania mysich komórek macierzystych ES za pomocą cząsteczki SC1 jako ekonomicznej alternatywy dla czynnika LIF. Technika ta umożliwia zachowanie pluripotencji przy niższych kosztach badań.

Zastosowanie SC1 (Pluripotin) w celu wspierania samoodnowy mESC wobec braku LIF

Przeglądaj więcej filmów