Name: Metody badania brzanki szczęki danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj metody badania regeneracji brzanki szczęki u danio pręgowanego. Film demonstruje chirurgiczny protokół amputacji, przygotowanie próbek do analizy histologicznej oraz zastosowanie tego modelu w biologii regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Metody te zostały opracowane przez E.E.L. podczas urlopu naukowego w laboratorium J.T. Wsparcie zapewniły Rada Badawcza Uniwersytetu DePaul oraz grant NIH/NIDCR R01 przyznany J.T. (DE016678). Z wdzięcznością dziękujemy za pomoc Caroline Hunter, techniku ds. opieki nad zwierzętami w placówce zebrafish core facility CMRC, oraz Paulinie Pawluczuk, naszej asystentce laboratoryjnej na studiach licencjackich.

Hodowla rybek danio
Ryby danio są utrzymywane i hodowane zgodnie ze standardowymi metodami 1. Po późnym okresie larwalnym stadium rozwojowe ryby danio można określić na podstawie jej długości standardowej (SL), czyli odległości w milimetrach w linii prostej od najbardziej przedniego punktu górnej wargi do nasady płetwy ogonowej (najbardziej tylna płytka hypuralna)2. W około jednym miesiącu po zapłodnieniu (10-12 mm SL) wąsy nosowe i szczękowe pojawiają się odpowiednio jako przezroczyste pączki nabłonkowe w pobliżu jam węchowych oraz na tylnych narożnikach szczęk. W miarę dojrzewania ryb danio, wąsy rozrastają się w wąskie, przypominające wibrysy wyrostki. Ponieważ wąs szczękowy jest większy (2-3 mm) i łatwiejszy w manipulacji, nasz protokół dotyczy wyłącznie tego konkretnego wyrostka; podobne techniki można jednak dostosować do mniejszego wąsa nosowego.
Przycinanie wąsików
<ol>
 <li>Znieczulić dorosłe danio przebrone na odpowiednim etapie rozwoju (np. 1,5-2,5 cm SL, ~3-6 miesięcy po zapłodnieniu) poprzez zanurzenie w 0,015% MS-222 (metanosulfonian etylu 3-aminobenzoesanu) buforowanym do pH 7,0 w wodzie systemowej. Obserwować ryby, aż ustaną ruchy pływackie, a wentylacja skrzeli stanie się powolna i regularna. W zależności od wielkości ryb pełne znieczulenie trwa około 2-5 minut.</li>
 <li>Używając siatki akwariowej, przenieść po 1-3 ryby na złożony kawałek mokrego ręcznika papierowego w szalce Petriego. Za pomocą tępej szpatułki ułożyć ryby równolegle do siebie, stroną lewą boczna do góry. Złożyć część mokrego ręcznika papierowego na części ogonowej ryby, zakrywając całe ciało aż do operculum (pokrywy skrzeli), aby utrzymać skórę i skrzela w wilgotności podczas procedury.</li>
 <li>Obejrzeć szalkę Petriego pod stereomikroskopem, używając niskokątowego światła padającego do oświetlenia obszaru głowy. Skupić się na podstawie lewego wąsa szczękowego, który wystaje z tylnego brzusznego rogu szczęki (Ryc. 1). <img src="/files/ftp_upload/1558/1558fig1.jpg" alt="Schemat anatomiczny ryby z zaznaczoną strukturą szczęki i opisanymi częściami do celów edukacyjnych." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1.</li>
 <li>Mocno chwycić trzon wąsa nieco dystalnie od krawędzi szczęki. Unieść trzon wąsa i wprowadzić ramiona precyzyjnych nożyczek sprężynowych tuż proksymalnie do pęsety. Nożyczki można oprzeć o pęsetę dla stabilizacji. Przesunąć ramiona nożyczek wzdłuż trzonu wąsa, aż krawędź tnąca zbliży się do krawędzi szczęki. Zamknąć nożyczki, aby przeciąć trzon wąsa. Odcięty wąs, wciąż trzymany pęsetą, można usunąć do fiksacji lub dalszej obserwacji.</li>
 <li>Natychmiast przenieść rybę do małego zbiornika z czystą wodą systemową (~500 mL) zawierającej jedną kroplę błękitu metylenowego, aby zapobiec powierzchownym infekcjom grzybiczym. Pozostawić rybę do regeneracji na noc. Następnego ranka zwrócić rybę do systemu hodowlanego. Regeneracja wąsów jest maksymalna po 2 tygodniach.</li>
</ol>
Zalewanie agarem dopasowanych par barbeli
<ol>
 <li>Pobierz ryby, stosując odpowiednią technikę eutanazji, i utrwal w 50 mL probówce w 4% paraformaldehydzie w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), mieszając w temperaturze 4°C przez noc. Objętość utrwalacza powinna być co najmniej dziesięciokrotnie większa od objętości tkanki. Po utrwaleniu zutylizuj odpady z paraformaldehydu w odpowiednim pojemniku i dokładnie wypłucz tkankę w kilku zmianach PBS.</li>
 <li>Przygotuj w 250 mL kolbie szklanej 150 mL 2% agarozy (Tm ~37°C) w wodzie destylowanej. Podgrzewaj w mikrofalówce lub na płycie grzewczej, okresowo mieszając, aż do całkowitego rozpuszczenia. Równoważ temperaturę stopionego roztworu w łaźni wodnej o temperaturze 50-60°C.</li>
 <li>Zmontuj standardowy zestaw do elektroforezy w żelu, mocując małą uszczelnioną formę do żelu (10 x 10 cm; objętość żelu ~100 mL) do ścianek komory buforowej. Włóż 2-4 grzebienie do próbek o małych zębach (4 x 1,5 mm).</li>
 <li>Na płaskiej powierzchni wlej stopioną agarozę do formy tak, aby tylko zakryła podstawę grzebieni, tworząc bardzo płytkie dołki. Natychmiast umieść pozostałą agarozę z powrotem w ciepłej łaźni wodnej; zostanie ona wykorzystana później do zatopienia tkanki (Kroki 9-12). Włóż długą szklaną pipetę Pasteura do kolby, aby pipeta miała tę samą temperaturę co agaroza.</li>
 <li>Pozostaw żel do stwardnienia na 20-30 minut. Wyjmij grzebienie, a następnie wyjmij formę zawierającą stwardniały żel z komory buforowej. Mocno zaklej otwarte boki formy taśmą laboratoryjną, aby żel nie wysunął się na zewnątrz. Taśma powinna wystawać kilka milimetrów ponad powierzchnię agarozy, aby umożliwić późniejsze dodanie dodatkowej agarozy (Krok 13).</li>
 <li>Ustaw formę z żelem na stole stereomikroskopu. Powiększ pusty dołek i ustaw ostrość krawędzi.</li>
 <li>Na powierzchnię agarozy sąsiadującą z dołkiem nanieś pipetą kroplę wody lub buforu zawierającego utrwalone próbki wąsów rybich (np. zregenerowane i kontrolne). Używając zgiętych szpilek entomologicznych, przesuń wilgotne próbki do dołka i dociśnij je do dna. Zorientuj trzony wąsów równolegle do siebie i wyrównaj je wzdłuż przeciwległych długich krawędzi dołka. Napięcie powierzchniowe pomoże utrzymać tkankę w pozycji.</li>
 <li>Przed zatopieniem, za pomocą cienkiej końcówki pipety lub rogu chusteczki laboratoryjnej, usuń nadmiar płynu z dołka. Pracuj szybko, aby nie dopuścić do wyschnięcia tkanki.</li>
 <li>Używając podgrzanej szklanej pipety Pasteura, delikatnie nanieś świeżą stopioną agarozę do wnętrza i wokół próbek, aby unieruchomić tkankę wąsów. Nie przepełniaj dołka. Zanim agaroza stwardnieje, dokonaj ostatecznych korekt ustawienia za pomocą szpilek entomologicznych.</li>
 <li>Umieść ponumerowaną papierową etykietę próbki obok dołka i zabezpiecz ją małą kroplą agarozy.</li>
 <li>Powtórz kroki od 6 do 10 dla każdego dołka z próbkami.</li>
 <li>Jeśli jest to wymagane do kalibracji obrazu, włóż kawałek papieru z wydrukowaną skalą mikrometryczną (np. <a href="http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/">http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/</a>) na dno pustego dołka. Wygładź papier na dnie dołka i pokryj go ciepłą agarozą.</li>
 <li>Po zatopieniu wszystkich próbek powierzchnia żelu będzie nieregularna, z zastygłymi kroplami agarozy. Połóż żel na płaskiej powierzchni i delikatnie wlej dodatkową stopioną agarozę, aż górna powierzchnia stanie się jednolita. Użyj najmniejszej ilości agarozy niezbędnej do uzyskania gładkiej powierzchni; zbyt duża ilość agarozy utrudni fotografowanie w świetle przechodzącym. Pozostaw tę górną warstwę do stwardnienia.</li>
 <li>Żel można teraz sfotografować na stole stereomikroskopu, aby zarejestrować morfologię makroskopową każdej pary wąsów. Kalibrację obrazu uzyskuje się poprzez sfotografowanie zatopionej skali mikrometrycznej.</li>
 <li>Cały żel można przechowywać zawinięty w mokre ręczniki papierowe i szczelnie zamknięty w plastikowej torbie w temperaturze 4° przez kilka tygodni.</li>
 <li>Do dalszych analiz bloki agarowe zawierające dopasowaną parę wąsów można wyciąć z żelu skalpelem lub ostrzem żyletki i przetworzyć metodą histologii parafinowej lub kriosekcjonowania zgodnie ze standardowymi metodami3,4. Alternatywnie, poszczególne wąsy można wypreparować z agarozy za pomocą cienkich igieł, wypłukać w wodzie i poddać innym aplikacjom (np. immunohistochemii całego preparatu lub mikroskopii konfokalnej).</li>
</ol>

<ol><li>Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Howe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+length%3A+Not+quite+so+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Fisheries+Research+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Standard length: Not quite so standard.</a> Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+Embedding+Tissue+Samples+for+Sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).</li>
<li>Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+bud+development+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio.</a> Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).</li>
</ol>

Wąsik szczękowy danio pręgowanego jest niewykorzystanym w pełni systemem tkankowym do badania wzrostu, utrzymania i regeneracji kilku typów komórek u tych ryb. Choć wyrostek wąsika nie posiada odpowiednika u ludzi, zawarte w nim typy komórek są wysoce konserwatywne, co umożliwia badanie skóry, gruczołów, melanocytów, naczyń krwionośnych i nerwów w optycznie przejrzystej i anatomicznie prostej strukturze cylindrycznej. Podobnie jak w przypadku dobrze przebadanej płetwy ogonowej, regenerację tkanki wąsika można wywołać poprzez amputację. Wykorzystując brzeg szczęki jako punkt orientacyjny, płaszczyznę amputacji można wyznaczyć precyzyjnie, co ułatwia pomiar odrastania wąsika. Doświadczonemu operatorowi każda operacja zajmuje zaledwie kilka sekund. Rekonwalescencja przebiega szybko i do tej pory nie stwierdziliśmy krótkoterminowych ani długoterminowych skutków wpływających na zachowanie ryb. Danio pręgowane z jednym wąsikiem szczękowym pływają, jedzą i rozmnażają się równie efektywnie jak grupy kontrolne nieoperowane, a ich przeżywalność do czasu pobrania tkanek, nawet do 6 miesięcy po operacji, jest porównywalna. Przewiduje się, że fizjologiczny wpływ tej operacji jest minimalny, ponieważ 1) pozajęzykowe kubki smakowe znajdujące się na wąsiku występują również w wielu innych częściach nabłonka ryby, w tym na wargach, policzkach i głowie5, oraz 2) różnicujące się kubki smakowe pojawiają się na regenerującym się wąsiku w ciągu 72 godzin (LeClair et al., niepublikowane dane). Dzięki temu wąsik szczękowy stanowi małoinwazyjny system do badania gojenia ran, rewaskularyzacji i reinnerwacji w kontekście dorosłego kręgowca.
Po chirurgicznym indukowaniu regeneracji, wąsiki można pobierać w określonych odstępach czasu w celu wykonania pomiarów morfometrycznych i/lub analizy mikroskopowej utrwalonej tkanki. Wąsik szczękowy ma wygodną długość (2-3 mm) i średnicę (100-200 mm), zbliżoną do wymiarów zarodka danio pręgowanego, co ułatwia stosowanie wielu standardowych protokołów, w tym histologii parafiniowej, kriosekcjonowania, immunohistochemii całych preparatów oraz hybrydyzacji in situ. Suma tych cech sprawia, że wąsik szczękowy jest wysoce funkcjonalnym modelem in vivo do badania naprawy i regeneracji tkanek.

<table><tbody><tr><td>Stereomikroskop sekcyjny z prześwietlającym i padającym światłowodowym oświetleniem jest wymagany do przycinania wąsików oraz zatapiania w agarozy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda z systemu hodowli ryb</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 zbiorniki do krzyżowania zebrafish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS-222 (metanosulfonian etylu 3-aminobenzoanu; Sigma Chemical #E10521-10G)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sterylna płytka Petri 120-mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mokre ręczniki papierowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tępa metalowa szpatułka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #55 Bio Inox (Fine Science Tools #11255-20)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-nożyczki sprężynowe Vannasa (Fine Science Tools #15000-00)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>przeciwdrożny środek przeciwgrzybiczy z błękitem metylenowym (Drs. Foster &amp;amp; Smith #CD-905781)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mały akwariowy siatkowy chwytak do ryb</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd w 1x fosforanie buforowanym solą (PF-PBS), rozdzielony na probówki stożkowe 50 mL i przechowywany w zamrożeniu w -20&amp;deg;C do momentu użycia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x fosforan buforowany solą (pH 7,27-6)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szklana kolba 250 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2% agaroza w wodzie destylowanej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>standardowy mały zestaw do elektroforezy w żelu agarozowym (rozmiar żelu = ok. 10 cm kwadrat)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>grzebień do próbek elektroforetycznych z drobnymi zębami (rozmiar zęba 4 x 1,5 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ciepła łaźnia wodna (50-60&amp;deg;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>taśma laboratoryjna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>czarne emaliowane szpilki entomologiczne, rozmiar 000 (Fine Science Tools #26000-25)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-2 uchwyty do szpilek (Fine Science tools #26016-12)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9-calowa szklana pipeta Pasteura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gruszka lub pompa do pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ręczniki laboratoryjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>małe papierowe etykiety</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(opcjonalnie) wydrukowana skala kalibracyjna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mokre ręczniki papierowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plastikowy woreczek strunowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>skalpel/żyletka (do wycinania bloków agarozy)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metody badania wąsika szczękowego danio pręgowanego

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Wąsiki są skórnymi wyrostkami sensorycznymi występującymi u ryb, gadów i płazów. Danio pręgowany, Danio rerio, rozwija dwie pary wąsików – krótką parę nozdrzową oraz dłuższą parę szczękową. Tkanka wąsików składa się z komórek pochodzenia ektodermalnego, mezodermalnego i z grzebienia nerwowego, w tym z komórek skóry, gruczołów, pąków smakowych, melanocytów, naczyń krwionośnych i nerwów sensorycznych. W przeciwieństwie do większości tkanek u osobników dorosłych, wąsik szczękowy jest optycznie przezroczysty, co pozwala na wizualizację rozwoju i utrzymania tych typów tkanek w całym cyklu życiowym.
W niniejszym filmie przedstawiono wczesny rozwój wąsika szczękowego (rozpoczynający się w przybliżeniu miesiąc po zapłodnieniu) oraz zaprezentowano protokół chirurgiczny służący do indukowania regeneracji tego wyrostka u osobników dorosłych (&gt;3 miesiące po zapłodnieniu). W skrócie, lewy wąsik szczękowy znieczulonej ryby zostaje uniesiony sterylną pęsetą tuż za krawędzią tylną szczęki. Cienkie, sterylne nożyczki sprężynowe zostają ustawione przy pęsecie, aby przeciąć trzon wąsika na tym poziomie, co wyznacza punkt orientacyjny dla płaszczyzny amputacji. Przyrost regeneracyjny można mierzyć w odniesieniu do tej płaszczyzny oraz w porównaniu z wąsikiem przeciwległym. Tkanka wąsika regeneruje się szybko, osiągając maksymalny stopień odrostu w ciągu 2 tygodni od urazu.
Techniki analizy zregenerowanego wąsika obejmują preparowanie oraz zatapianie dopasowanych par wąsików (zregenerowanego i kontrolnego) w studzienkach standardowego żelu do elektroforezy DNA. Zatopione okazy można wygodnie fotografować pod stereomikroskopem w celu oceny morfologii ogólnej i morfometrii; mogą być one przechowywane przez wiele tygodni przed dalszymi zastosowaniami, takimi jak histologia w parafinie, kriosekcjonowanie i/lub immunohistochemia całych preparatów. Metody te czynią z wąsika szczękowego nowy system tkankowy in vivo do badania zdolności regeneracyjnych wielu typów komórek w kontekście genetycznym danio pręgowanego.

Wąsik szczękowy danio pręgowanego jest integumentarnym organem zmysłowym zawierającym pochodne ektodermy, mezodermy i grzebienia nerwowego. Co istotne, u osobników dorosłych wąsik ten potrafi zregenerować się po amputacji proksymalnej. Niniejszy film przedstawia rozwój wąsika szczękowego oraz prezentuje protokół chirurgiczny indukcji regeneracji, a następnie proces pobierania, zatapiania i obrazowania preparatów wąsików.

Metody badania wąsika szczękowego danio pręgowanego

Wąsiki są skórnymi wyrostkami czuciowymi występującymi u ryb, gadów i płazów. Danio rerio, ryba dana, rozwija dwie pary wąsików – krótkie wąsiki nosowe...

Marbles (kuleczki) stanowią heterogenną grupę struktur sensorycznych występujących u płazów, gadów i ryb. Danio pręgowany wykształca dwie pary marbles: mniejszą parę nosową oraz większą parę szczękową. Te przezroczyste wyrostki mogą być wykorzystywane do badania rozwoju, utrzymania oraz regeneracji kilku typów komórek danio pręgowanego.Niniejszy film przedstawia rozwój marmuru szczękowego i demonstruje protokół chirurgiczny służący do indukowania regeneracji. Kolce są zbierane kilka dni lub tygodni później, a następnie przeprowadza się sekcję oraz zatapianie regeneratów i kontroli. Witajcie, jestem Elizabeth LeClair z laboratorium LeClair na Uniwersytecie DePaul, a ja jestem Ya Chesky z Northwestern University Feinberg School of Medicine oraz Children's Memorial Research Center.Dzisiaj zaprezentujemy procedury służące do badania kości szczękowej danio pręgowanego. Wykorzystujemy te metody do badania wzrostu i rozwoju kości szczękowej u danio pręgowanego. Zapraszamy do oglądania.Około 30 do 40 dni po zapłodnieniu, wąsik szczękowy pojawia się jako przezroczysty pączek nabłonkowy w pobliżu tylnego brzusznego narożnika szczęki. W miarę dojrzewania danio pręgowanego, wąsik przekształca się w wąską wyrostkę w kształcie wici o długości kilku milimetrów. Dojrzały wąsik zawiera kilka ważnych typów komórek, w tym komórki pigmentowe, komórki gruczołowe, pąki smakowe, naczynia krwionośne oraz nerwy zmielinizowane.Co najważniejsze, marmurek pozostaje przezroczysty na wszystkich etapach swojego rozwoju. Podobnie jak inne organy danio pręgowanego, wąsik szczękowy może regenerować się po amputacji proksymalnej. W tej sekcji przedstawiamy procedurę odcinania wąsika u podstawy szczęki.Zabieg ten można również nazwać ektomią jednostronną. W dniu operacji należy przygotować dwa małe zbiorniki z wodą dla ryb: jeden do znieczulenia i jeden do rekonwalescencji. Zbiornik do znieczulenia zawiera 0.015% trica w buforze o pH 7.0.W wodzie dla ryb zbiornik do rekonwalescencji zawiera ryby, wodę oraz kroplę błękitu metylenowego w celu zapobiegania infekcjom grzybiczym. Znieczul od jednej do trzech dorosłych rybek danio, zanurzając je w zbiorniku z tricainem; obserwuj je do momentu ustania ruchów pływających oraz do czasu, aż wentylacja skrzeli stanie się powolna i regularna. W zależności od wielkości ryby, pełne znieczulenie może zająć od dwóch do pięciu minut.Za pomocą siatki do ryb akwariowych przenieś ryby na zwilżony ręcznik papierowy umieszczony w szalce Petriego. Używając tępej szpatułki, ułóż ryby równolegle do siebie. Z lewą stroną boczną skierowaną do góry, załóż część ręcznika papierowego na ryby, aby utrzymać ich wilgotność.Następnie obejrzyj szalkę Petriego pod mikroskopem stereoskopowym, wykorzystując światło padające pod niskim kątem w celu oświetlenia głowy. Używając pęsety precyzyjnej, ustaw ostrość na podstawie lewej marmurowej wyrostka szczękowego. Mocno chwyć trzonek marmuru nieco dystalnie względem krawędzi szczęki.Podnieś kuleczkę szklaną i wsuń precyzyjne nożyczki sprężynowe tuż proksymalnie względem pęsety, aby zapewnić stabilizację. Nożyczki mogą dotykać pęsety lub alternatywnie dna szalki Petriego. Przesuń ostrza nożyczek wzdłuż trzpienia kuleczki, aż krawędź tnąca znajdzie się w pobliżu krawędzi szczęki górnej.Przetnij trzasteczkę marmurową i usuń amputowany fragment. Tkankę tę można utrwalić i przeanalizować osobno. Po zabiegu przenieś rybę do zbiornika rekonwalescencyjnego.Pozostaw ryby do rekonwalescencji przez kilka godzin lub na całą noc, a następnie przenieś je z powrotem do systemu hodowlanego. Odczekaj od jednego do dwóch tygodni do czasu regeneracji kolców. W następnej sekcji pokażemy, jak przygotować utrwaloną tkankę marmurową do analizy.Procedura ta rozpoczyna się od wykorzystania osobników marble, które zostały pobrane i utrwalone dni, tygodnie lub miesiące po zabiegu chirurgicznym. Przemyj utrwaloną tkankę w buforowym roztworze soli fizjologicznej i wypreparuj zregenerowany barb z lewej strony głowy. Nie pomiń prawego barbu, który służy jako kontrola do tymczasowego przechowywania.Każdą dopasowaną parę kulek pipetuj do kropli soli fizjologicznej na szalce Petriego. Przykryj pokrywką i pozostaw na blacie na czas nieobecności. Aby przygotować żel, podgrzewaj 150 milliliters 2%agros aż do całkowitego rozpuszczenia.Wyrównoważ roztwór w kąpieli wodnej o temperaturze od 50 do 60 °C. Następnie przygotuj standardowy zestaw do elektroforezy żelowej i wprowadź od jednego do czterech małych grzebieni do próbek. Wlej roztopioną agarozę do formy żelowej na płaskiej powierzchni, dodając ilość wystarczającą jedynie do uformowania bardzo płytkich dołków.Niezwłocznie przenieś pozostałe żele do ciepłej łaźni wodnej. Włóż długą szklaną pipetę Pasteura tak, aby pipeta osiągnęła tę samą temperaturę co żele. Po ostygnięciu żelu wyjmij grzebienie, a następnie formę do żelu.Aby mocno przymocować żel, zaklej oba jego boki wybraną kolorową taśmą laboratoryjną. Taśma powinna wystawać kilka milimetrów ponad powierzchnię agarosu, aby umożliwić późniejsze dolanie dodatkowych warstw agarosy. Umieść formę do żelu na stole stereomikroskopu. Powiększ pustą studzienkę i ustaw ostrość na jej krawędziach.Za pomocą uchwytów z wygiętymi szpilkami entomologicznymi przenieś kulki z szalki Petriego na powierzchnię żelu obok otworu. Wsuń kulki do otworu i dociśnij je do dna. Ustaw sztangi równolegle do siebie i przy długich krawędziach otworu. Przed utwardzeniem użyj cienkiej pipety lub chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć nadmiar cieczy.Używając ogrzanej pipety szklanej, ostrożnie dodaj świeży, stopiony agros wokół tkanki. Wprowadź ostatnie korekty przed stwardnieniem agrosu i nie przepełniaj dołka. Zanotuj numer preparatu, umieszczając obok niewielką, ponumerowaną karteczkę papieru.Po zatopieniu wszystkich okazów wyrównaj górną powierzchnię żelu, wylewając na wierzch cienką warstwę aros. Użyj tak małej ilości, jak to możliwe, aby żel pozostał przezroczysty do celów fotograficznych. Po stwardnieniu żelu można go sfotografować pod mikroskopem stereoskopowym, aby zarejestrować rozmiar i kształt każdej pary marmurków oraz zebrać pomiary morfometryczne do dalszej analizy.Bloki agaru zawierające dopasowane pary kuleczek można wyciąć z żelu za pomocą skalpela lub żyletki. Następnie można je poddać obróbce do histologii parafinowej lub kriosekcjonowania standardowymi metodami. Alternatywnie, poszczególne kuleczki można wypreparować z agaru za pomocą cienkich igieł płukanych w wodzie, a następnie wykorzystać w innych analizach, takich jak immunohistochemia całych preparatów lub mikroskopia konfokalna.Na koniec cały żel można zamknąć w szczelnym worku i przechowywać w chłodni. Próbki zachowają trwałość przez kilka tygodni. Przedstawiliśmy sposób obserwacji i analizy rozwijającego się oraz regenerującego się łuku szczękowego.Jest to nowy system w organizmie zebrafish, więc pozostaje wiele do odkrycia. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

methods-for-the-study-of-the-zebrafish-maxillary-barbel

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metody badania wąsika szczękowego daniosza pręgowanego

Obrazowanie konfokalne w czasie jest potężną techniką przydatną do charakteryzowania rozwoju embrionalnego. W tym miejscu opisujemy metodologię i charakteryzujemy morfogenezę twarzoczaszki w zarodkach typu dzikiego, a także pdgfra, smad5 i zmutowanych smo.

Analiza morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4D

Ponieważ wiele modeli chorób neurologicznych i nieneurologicznych u danio pręgowanego jest badanych na dorosłych rybach, a nie na zarodkach/larwach, opracowaliśmy ilościowy test regeneracyjny linii bocznej, który może być zastosowany do modeli chorób u dorosłych ryb danio pręgowanego. Test polegał na rozdzielczości na poziomie 1) neuromastu i 2) poszczególnych komórek rzęsatych.

Test do regeneracji linii bocznej u dorosłych danio pręgowanych

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Analiza metodą elementów skończonych jest często używanym narzędziem do badania właściwości mechanicznych konstrukcji pod obciążeniem. Tutaj zastosujemy jego zastosowanie do modelowania biomechaniki szczęki danio pręgowanego.

Budowa modeli elementów skończonych w celu zbadania biomechaniki szczęk danio pręgowanego

Ten manuskrypt opisuje metody zapisów elektrofizjologicznych z neuronów rdzeniowych zarodków i larw danio pręgowanego. Preparat utrzymuje neurony in situ i często wiąże się z minimalnym rozwarstwieniem. Metody te pozwalają na badanie elektrofizjologiczne różnych neuronów rdzeniowych, od początkowego nabycia pobudliwości elektrycznej do wczesnych stadiów larwalnych.

Przygotowanie rdzenia kręgowego danio pręgowanego in situ do zapisów elektrofizjologicznych z rdzeniowych neuronów czuciowych i ruchowych

Celem tego protokołu jest zmiana penetracji śmiercionośnych zmutowanych fenotypów szkieletowych u danio pręgowanego poprzez selektywną hodowlę. Śmiertelne mutanty nie mogą być dorosłe do dorosłości i rozmnażane samodzielnie, dlatego ten protokół opisuje metodę śledzenia i selekcji penetracji przez wiele pokoleń za pomocą testów potomstwa.

Przesuwająca się penetracja śmiertelnych mutantów szkieletowych danio pręgowanego za pomocą testów potomstwa

Ten manuskrypt opisuje prostą metodę behawioralnego pomiaru stresu u dorosłego gryba. Podejście to wykorzystuje wrodzoną tendencję do tego, że danio pręgowany preferuje dolną połowę zbiornika, gdy jest w stanie stresu. Opisano również metody sprzężenia testu z farmakologią.

Behawioralne podejścia do badania wrodzonego stresu u danio pręgowanego

Przejrzystość optyczna jest główną zaletą dla biologicznej i fizjologicznej pracy komórek u danio pręgowanego. Opisano solidne metody pomiaru wzrostu komórek u poszczególnych zwierząt, które pozwalają na nowy wgląd w to, w jaki sposób wzrost mięśni szkieletowych i sąsiednich tkanek jest zintegrowany ze wzrostem całego ciała.

Wielokrotne pomiary wzrostu mięśni szkieletowych w czasie rzeczywistym u poszczególnych żywych ryb danio pręgowanych poddanych zmienionej aktywności elektrycznej

Ten protokół opisuje zbieranie i wizualizację elasmoidalnych łusek danio pręgowanego podczas regeneracji in vivo. Ponadto przedstawiono hodowlę ex vivo tych łusek do 7 dni po zbiorach.

Regeneracja łusek danio pręgowanego w kulturze łusek toto i ex vivo

Opisany tutaj protokół przedstawia prostą i łatwą do wykonania procedurę barwienia i preparowania chrząstek twarzoczaszki u 5-dniowej larwy danio pręgowanego. Może być używany do badania anatomii, kształtu i wielkości tych struktur w różnych warunkach rozwojowych.

Rozwarstwienie tkanek twarzoczaszki danio pręgowanego po zabarwieniu błękitem alcyjskim

Praca ta opisuje protokół do ilościowego określania kształtu chrząstki czaszkowo-twarzowej za pomocą wolnego oprogramowania (tpsDigs2, MorphoJ i PAST) do pomiaru zmian struktury twarzy u larw danio dano.

Morfometryczne analizy kształtu: narzędzie analityczne do kwantyfikacji kształtu czaszkowo-twarzowego u danio pręgowanego

Poznaj metody badania regeneracji brzanki szczęki u danio pręgowanego. Film demonstruje chirurgiczny protokół amputacji, przygotowanie próbek do analizy histologicznej oraz zastosowanie tego modelu w biologii regeneracyjnej.

Metody badania wąsika szczękowego danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów