Name: Izolacja i przeszczepienie hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 38 s
Description: Poznaj metodę izolacji i przeszczepienia hematopoetycznych komórek macierzystych u myszy. Technika obejmuje sterylizację, preparację kości i sortowanie komórek, co umożliwia badanie regeneracji krwi in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<p class="jove_title">Przygotowanie całkowitego szpiku kostnego</p>
<ol>
<li>Uśmierca się cztery &nbsp;myszy B6 i przeprowadza sekcję w celu pobrania kości piszczelowych, udowych, miednic oraz kręgosłupa.</li>
<li>Podczas sekcji kończyny i kości utrzymuje się w PBS z 2% FCS inaktywowanym ciepłem (opcjonalnie 2mM EDA – medium do sekcji).</li>
<li>Oczyszczone kości rozcieramy w moździerzu z tłuczkiem w medium do sekcji. Efektywnym sposobem jest rozcieranie kości piszczelowych, udowych i miednic każdej myszy, a następnie po dwa kręgosłupy naraz.</li>
<li>Mieszaninę komórek uzyskaną od każdej myszy przechowuje się oddzielnie i filtruje przez filtr 40μm do probówki typu Falcon 50ml. W ten sposób każda probówka zawiera mieszaninę komórek uzyskanych ze wszystkich kości kończyn jednej myszy oraz połowę mieszaniny uzyskanej z dwóch kręgosłupów. Na tym etapie filtr służy do oddzielenia fragmentów kostnych.</li>
<li>Zazwyczaj zaleca się dwukrotne rozcieranie kości kończyn, aby uzyskać białe fragmenty kostne (pozbawione szpiku), oraz 2- lub 3-krotne rozcieranie fragmentów kręgosłupa.</li>
<li>Uzupełnia się objętość w probówkach w celu ich zbalansowania, a następnie wiruje przez 5 min przy 1200rpm.</li>
<li>Odsysa się nadosad i rozluźnia osad poprzez przesuwanie probówek po statywie (krok ten jest istotny po każdej wirowaniu, aby zminimalizować powstawanie grudek i stratę komórek). Każdą zawiesinę resuspensuje się w 1 ml PBS z 2% FCS (od tego momentu BEZ EDTA), jeśli przeprowadza się usuwanie linii komórkowych (lineage depletion), lub w dowolnej innej dogodnej objętości.</li>
</ol>
<p class="jove_title">Deplecja linii komórkowych</p>
<ol>
<li>Procedura ta pozwala na wyeliminowanie komórek silnie zróżnicowanych i uzyskanie bardzo heterogennej populacji komórek, wzbogaconej o komórki macierzyste i progenitorowe. W przypadku sortowania HSC etap ten drastycznie redukuje liczbę komórek poddawanych sortowaniu, co skraca czas trwania procesu i umożliwia sortowanie HSC z większej liczby myszy, pozwalając tym samym na uzyskanie większej liczby HSC w ramach jednej sesji sortowania.</li>
<li>Jeśli planują Państwo przeprowadzić sortowanie w późniejszym terminie, należy odobrać 50&mu;l mieszaniny komórkowej (zazwyczaj pobieram niewielką ilość z każdej probówki) do kontroli sortowania (kontroli niebarwionych oraz kontroli jednobarwnych dla Sca1, c-Kit, CD48, Flk2). </li>
<li>Dodaj 30 μl koktajlu Lin na probówkę. Koktajl lineage zawiera szereg przeciwciał, których skład niestety nieco różni się w zależności od&nbsp;laboratorium do laboratorium. W laboratorium Scaddena stosujemy przeciwciała biotynilowane przeciwko Gr1, Ter119, CD4, CD8, CD3 oraz B220. Ich końcowe rozcieńczenie w barwieniu wynosi 1:700. </li>
<li>Wymieszać krótko za pomocą wortexa i inkubować przez 15 min w temperaturze 4&deg;C. </li>
<li>Podczas inkubacji przygotować kolumny na magnesach oraz probówki do elucji o pojemności 15 ml pod kolumnami. Odgazować PBS za pomocą filtra steriflip (pod wpływem aspiracji próżniowej powinny pojawić się małe pęcherzyki powietrza przemieszczające się ku powierzchni PBS), a następnie zrównoważyć kolumny, aplikując 3 ml odgazowanego PBS do każdej z nich. </li>
<li>Przepływ przez kolumnę wynosi około 1 ml/5 min, zatem przygotowanie kolumn do użycia zajmuje około 15 min. </li>
<li>Po zakończeniu inkubacji dopełnić probówki PBS z 2% FCS i wirować przez 5 min przy 1200 obr./min. </li>
<li>Odssać nadosad, rozbić osady i resuspendować w 1 ml odgazowanego PBS na probówkę. </li>
<li>Jeśli sortowanie będzie przeprowadzane w późniejszym terminie, należy pobrać próbkę całkowitego szpiku kostnego jako kontrolę barwienia pojedynczego koloru dla frakcji Lineage (15 ml, niewielka ilość z każdej probówki). </li>
<li>Dodać kulki streptawidyny (30 µl/probówkę), szybko wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować przez 15 min w temperaturze 4&deg;C. </li>
<li>Po zakończeniu inkubacji dodać 2 ml odgazowanego PBS do każdej probówki. Pod kolumnami umieścić nowe probówki do zbierania frakcji, a następnie nanieść każdą zawiesinę na kolumnę, filtrując ją przez 40&mu;m filtr </li>
<li>Do każdej probówki dodaj kolejne 3 ml odgazowanego PBS w celu przemycia. Gdy kolumny będą puste, nanieś zawiesinę ponownie, korzystając z tego samego 40&mu;m filtr. </li>
<li>Eluat zawiera mieszaninę komórek po deplecji linii komórkowych, która jest heterogenną populacją wzbogaconą w komórki macierzyste i progenitorowe. Połącz zawartość 4 probówek w 2 probówki. Wirować przez 5 min przy 1500 obr./min. </li>
<li>Odssać nadsącz. Osad powinien być biały lub przeważnie biały. Rozbić osady i zawiesić je wspólnie w łącznie 1 ml PBS z 2% FCS, jeśli sortowanie będzie przeprowadzane w późniejszym terminie; w przeciwnym razie zawiesić w dowolnej, wygodnej objętości. </li>
</ol>
<p class="jove_title">Sortowanie frakcji LKS lub długoterminowych HSC</p>
<ol>
<li>Odbierz próbkę kontrolną do barwienia pojedynczego koloru z populacji pozbawionej komórek lineage (15 ml). Pozwoli to na ocenę wydajności procesu deplekcji lineage.</li>
<li>Mieszaninę komórek przeznaczoną do sortowania barwi się w probówce 15 ml.</li>
</ol>
<p class="jove_content">Dodaj przeciwciała:</p>
<p class="jove_content">
<table border="0">
<tbody>
<tr>
<td>Sca PE-Cy5.5</td>
<td>1: 100</td>
<td>10ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Kit APC</td>
<td>1:100</td>
<td>10ml</td>
</tr>
<tr>
<td>SA PE-Cy7</td>
<td>1:500</td>
<td>2ml</td>
</tr>
</tbody>
</table>
</p>
<p class="jove_content">Aby sortować długoterminowe HSC, należy również&nbsp;dodać:</p>
<p class="jove_content">
<table border="0">
<tbody>
<tr>
<td class="jove_content">CD48 FITC</td>
<td class="jove_content">1:1000</td>
<td class="jove_content">1ml</td>
</tr>
<tr>
<td class="jove_content">Flk2 PE</td>
<td class="jove_content">1:200</td>
<td class="jove_content">5ml</td>
</tr>
</tbody>
</table>
</p>
<p class="jove_content">Należy również przygotować kontrole barwienia pojedynczego, wykorzystując całkowity szpik kostny odłożony po sekcji oraz całkowity szpik kostny barwiony na markery lineage. Barwienia te można przeprowadzić bezpośrednio w probówkach do FACS.</p>
<p class="jove_content"><em class="jove_content">Upewnij się, że pracujesz w ciemności!</em></p>
<ol>
<li>Szybko wymieszać za pomocą wibratora (vortex) i inkubować w temperaturze 4°C przez 20 do 30 minut, ponownie mieszając w połowie czasu inkubacji.</li>
<li>Aby wypłukać nadmiar przeciwciał, dopełnić probówki roztworem PBS 2% FCS i wirować przez 5 min przy 1500 rpm.</li>
<li>Usunąć nadsącz, resuspendować wszystkie osady i przenieść je do nowych probówek do FACS z nakrętkami z filtrem. Przejście komórek przez te filtry może zająć trochę czasu; ważne jest, aby następnie dodać nieco więcej PBS w celu wypłukania filtra i zminimalizowania utraty komórek. Krok ten jest niezbędny, aby uniknąć zapchania sortera, co jest najgorszym koszmarem każdego użytkownika sortera komórkowego.</li>
<li>Przekazując komórki do pracowni sortowania komórek, należy pamiętać o przygotowaniu probówki z PBS 10% HI FCS, do której będą zbierane komórki.</li>
<li>W przypadku sortowania komórek LKS, otrzymana zostanie heterogenna populacja zawierająca HSC o długo- i krótkoterminowej zdolności do repopulacji oraz progenitorów multipotencjalnych. Średnia wydajność wynosi 300 000 komórek LKS z 4 myszy.</li>
<li>Jeśli zastosowano również przeciwciała przeciwko CD48 i Flk2, można wyodrębnić poszczególne populacje LT-HSC, ST-HSC oraz MPP. LT-HSC stanowią najrzadszą populację. Średnia wydajność wynosi od 50 000 do 60 000 komórek z 4 myszy.</li>
</ol>

izolacja i transplantacja hematopoetycznych komórek macierzystych (hsc)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Izolacja i transplantacja hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC)

<p>Nazywam się Christina Ceso. Jestem pracownikiem postdoktorskim w laboratorium Davida Denna i zajmuję się badaniami nad hematopoetycznymi komórkami macierzystymi. Dzisiaj będziemy oczyszczać długoterminowe zdolne do regeneracji hematopoetyczne komórki macierzyste, a następnie przeszczepimy je myszy.</p><p>Zaczynamy od spryskania myszy alkoholem, aby przede wszystkim wysterylizować skórę oraz zapobiec przeszkadzaniu włosów podczas sekcji. Do sekcji używamy PBS z 2% serum. Przecinam skórę na grzbiecie i rozsuwam ją, aby odsłonić tkankę.</p><p>Aby wyizolować piszczel, trzymam ją pęsetą. Przecinam ścięgno nad kolanem oraz mięśnie poniżej kolana, a następnie przecinam staw kolanowy, tak aby piszczel nie była już połączona z resztą kończyny, i wyciągam ją w celu izolacji. Następnie trzymam piszczel do góry nogami i za pomocą nożyczek oddzielam stopę od piszczeli, aby uzyskać kość udową.</p><p>Przecinam mięśnie wokół kości udowej, a następnie zwichuję kość udową w stawie biodrowym. Aby wyizolować biodro, przecinam mięśnie wokół kości biodrowej po stronie ogona myszy, a następnie oddzielam biodro od ciała myszy. W celu wyizolowania kręgosłupa przecinam ogon jak najbliżej początku grzbietu, a następnie wykonuję </p>

isolation-and-transplantation-of-hematopoietic-stem-cells-hscs

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i przeszczepianie komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs)

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek CD34+ naczelnych innych niż człowiek z przygotowanego szpiku kostnego, modyfikowanie genów tych komórek za pomocą wektorów lentiwirusowych oraz przygotowanie produktu do infuzji do autologicznego gospodarza. Łączna długość protokołu wynosi około 48 godzin.

Przygotowanie i modyfikacja genów hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych naczelnych

Tutaj prezentujemy protokół precyzyjnego tworzenia hemogennego śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w stanie wolnym od karmów i kseno. Metoda ta będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

Ten protokół demonstruje indukcję programu hemogennego w ludzkich fibroblastach skóry poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych GATA2, GFI1B i FOS w celu wytworzenia hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Hemogenne przeprogramowanie ludzkich fibroblastów poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych

Ten protokół umożliwia utrzymanie w stanie spoczynku ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych in vitro poprzez naśladowanie mikrośrodowiska szpiku kostnego przy użyciu obfitych kwasów tłuszczowych, cholesterolu, niższych stężeń cytokin i niedotlenienia.

Metoda hodowli w celu utrzymania w stanie spoczynku ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną procedurę hodowli hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w celu solidnego wszczepienia komórek z edytowanymi genami in vivo.

Edycja genów CRISPR/Cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej

Przedstawiamy krok po kroku protokół izolacji długoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych (LT-HSC) i krótkoterminowych komórek macierzystych (ST-HSC) za pomocą systemu reporterowego Hoxb5.

Metoda izolacji długotrwałych i krótkoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych

Przedstawiono tutaj protokół do inicjowania, utrzymywania i analizowania hodowli mysich hematopoetycznych komórek macierzystych za pomocą ekspansji ex vivo na bazie alkoholu poliwinylowego, a także metody genetycznej manipulacji nimi za pomocą transdukcji lentiwirusowej i elektroporacji.

<em>Ex vivo</em> Ekspansja i manipulacja genetyczna krwionośnych komórek macierzystych myszy w kulturach na bazie alkoholu poliwinylowego

Tutaj ustanowiliśmy in vivo osteo-organoidy uruchamiane przez morfogenetyczne rusztowania żelatynowe z białkiem 2 w celu pobrania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych w celu odbudowy uszkodzonego układu krwiotwórczego i odpornościowego. Ogólnie rzecz biorąc, takie podejście może stanowić obiecujące źródło komórek w terapiach komórkowych.

Podejście osteoorganoidowe in vivo do pozyskiwania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych

Tutaj prezentujemy protokoły, które umożliwiają izolację komórek zrębu z mysich kości, szpiku kostnego, grasicy i ludzkiej tkanki grasicy, kompatybilne z monokomórkową multiomiką.

Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Zastrzyki doudowe pozwalają na wszczepienie niewielkiej liczby hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC), poprzez umieszczenie komórek bezpośrednio w jamie szpiku kostnego. Tutaj opisujemy eksperymentalny protokół wstrzykiwania do kości udowej ludzkich HSPC myszom z niedoborem odporności.

Wstrzyknięcie doudowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych myszom z obniżoną odpornością

Poznaj metodę izolacji i przeszczepienia hematopoetycznych komórek macierzystych u myszy. Technika obejmuje sterylizację, preparację kości i sortowanie komórek, co umożliwia badanie regeneracji krwi in vivo.

Izolacja i transplantacja hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC)

Przeglądaj więcej filmów