Name: Przechwytywanie rozszerzenia startera: celowe pobieranie sekwencji z silnie zdegradowanych źródeł DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-03T11:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: Poznaj technikę PECA do celowego pobierania sekwencji DNA z silnie zdegradowanych źródeł. Metoda umożliwia rekonstrukcję kompletnych genomów mitochondrialnych neandertalczyków i analizę ich różnorodności genetycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy M. Meyer za rady; Chorwackiej Akademii Nauk i Sztuk oraz Akademii Nauk Berlin-Brandenburgia za wsparcie logistyczne i naukowe; oraz Prezydencki Fundusz Innowacji Towarzystwa Maxa Plancka za wsparcie finansowe. J.M.G. otrzymał wsparcie w ramach międzynarodowego stypendium podoktorskiego NSF (OISE-0754461). Sekwencje zostały zdeponowane w bazie danych nukleotydowych EBI pod numerami dostępu: Neandertal 1 (Feldhofer 1) FM865407, Neandertal 2 (Feldhofer 2) FM865408, Sidron 1253 FM865409, Vindija 33.25 FM865410, Mezmaiskaya 1 FM865411

Metoda ta została wykorzystana w badaniach opisanych w pracy <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/325/5938/318">Briggs et al., Science 325 (5938). 318-321 (2009)</a>.
Wymagane odczynniki:
<ul>
 <li>Polimeraza DNA AmpliTaq Gold </li>
 <li>10x bufor PCR GeneAmp PCR Buffer II </li>
 <li>MgCl2 25mM</li>
 <li>mieszanina dNTP, każde 25 mM</li>
 <li>BSA, 10 mg ml-1 w wodzie </li>
 <li>Woda klasy biologii molekularnej</li>
 <li>bufor EB (dołączony do zestawu MinElute PCR Purification); 10 mM Tris HCl, pH 8.5</li>
 <li>Zestaw MinElute PCR Purification Kit</li>
 <li>Kuleczki streptawidynowe Dynabeads M-270</li>
 <li>2x bufor do wiązania i przemywania (BW) (2 M NaCl, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.2% Tween 20)</li>
 <li>1x bufor do wiązania i przemywania (BW) (bufor 2x BindWash rozcieńczony 2X w wodzie)</li>
 <li>bufor do gorącego przemywania (HW) (2.5mM MgCl, 1X bufor Taq Gold, 0.1% Tween 20)</li>
</ul>
Informacje o producentach niestandardowych odczynników i sprzętu znajdują się w poniższej tabeli.
1) Amplifikacja biblioteki
<ol>
<li>Matryca DNA użyta w tym przypadku to biblioteka 454 przygotowana z próbki DNA o niskiej liczbie kopii, zgodnie z opisem w (Rohland and Hofreiter, 2007a, 2007b) oraz (Maricic and Pääbo, 2009). Aby amplifikować całą bibliotekę, należy przygotować następującą mieszaninę PCR:
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>Odczynnik</td>
 <td>μl na reakcję</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Woda</td>
 <td>45</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>bufor do PCR 10X Gene Amp PCR buffer II</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl22 (25 mM)</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA (10 mg/ml) </td>
 <td>2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTP (po 25 mM każdy)</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>454 emPCR starter bezpośredni/10uM</td>
 <td>3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>454 emPCR primer rvs/10uM</td>
 <td>3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>polimeraza DNA AmpliTaq Gold (5 U / μl)</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>matryca biblioteki DNA 454 </td>
 <td>25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Suma</td>
 <td>100</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
</li>
<li>W termocyklerze należy zastosować następujący program PCR dla 14 cykli amplifikacja
<ol>
<li>95°C 12 min</li>
<li>95°C 30 s</li> 
<li>60°C (lub pożądana temperatura przyłączania) 1 min</li>
<li>72°C 1 min</li>
<li>Przejdź do 2 (x 13)</li>
<li>72°C 5 min</li>
<li>10°C ∞</li>
</ol>
</li>
<li>Oczyść produkt reakcji przy użyciu kolumny wirówkowej Qiagen MinElute zgodnie z instrukcjami producenta. Eluuj w 50 μl buforu EB.</li>
<li>Ilość oczyszczonego produktu amplifikacji oraz alikwot nieamplifikowanej biblioteki należy określić za pomocą qPCR (Meyer et al., 2007). Jeśli produkt amplifikacji ma więcej niż 1 X 1012 kopii na µl, zmniejszyć ilość matrycy w następnym kroku wydłużania starterów, aby upewnić się, że nie przekroczy ona 2 x 1012 kopie dodaje się do reakcji wydłużania startera.</li>
</ol>
2 ) Wydłużanie startera
<ol>
<li>Przygotować mieszankę główną (master mix) dla wymaganej liczby reakcji.
<table border="0" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>Odczynnik</td>
 <td>μl na reakcję</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Woda</td>
 <td>45</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X Gene Amp PCR buffer II</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2 (25mM)</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA (10 mg / ml) </td>
 <td>2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTPs (po 25 mM każdy)</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>454 emPCR fwd primer/10uM</td>
 <td>3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>454 emPCR rvs primer/10uM</td>
 <td>3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>AmpliTaq Gold DNA polymerase (5 U / μl)</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Matryca biblioteki DNA 454 </td>
 <td>25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Suma</td>
 <td>100</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
</li>
<li>Przeprowadzić w termocyklerze następujący program dla reakcji podłużania pojedynczego primera:
<ol>
<li>95°C 12min</li>
<li>60°C (lub temperatura przyłączania primera PEC, jeśli jest inna) 1 min</li>
<li>72°C 5 min</li>
<li>72°C stale! 
KROK KRYTYCZNY Utrzymać reakcję po podłużaniu w temperaturze 72 °C. Następnie, przed wyjęciem z bloku grzewczego, bezpośrednio pipetować 150ul buforu PBI lub PB do oczyszczania QIAGEN MinElute do probówek. Jest to istotne, aby uniknąć niespecyficznego przyłączania i wychwytywania primerów podczas ochładzania mieszaniny.
</li>
</ol>
</li>
<li>Oczyścić produkt reakcji za pomocą kolumny wirnikowej Qiagen MinElute zgodnie z instrukcją producenta. Eluować w 50 μl EB.</li>
</ol>
3) Wychwytywanie produktu elongacji
<ol>
<li>Resuspendować roztwór stokowy kulek M-270 za pomocą wortexa. Odpiąć 25 μl zawiesiny kulek na każdą próbkę. Przemyć kulki dwukrotnie 500 μl buforem 2x BW i resuspendować w 25 μl buforze 2xBW na próbkę.</li>
<li>Do 25 μl zawiesiny kulek z kroku 3.1 dodać 25 μl eluatu z kroku 2.3. Wymieszać, a następnie inkubować w rotatorze przez 15 min w temperaturze pokojowej. 
 Zalecane: zachować pozostałe 5 μl eluatu z kroku 2.3 do ilościowego oznaczenia metodą qPCR. </li>
<li>Przenieść całą mieszaninę do nowej probówki 1,5 ml (pomaga to ograniczyć przeniesienie fragmentów biblioteki niebędących celem). Odwirować osad z supernatantu za pomocą magnetycznego kolektora cząsteczek (MPC) i usunąć supernatant.</li>
<li>Przemyć 5 razy 500 μl buforem 1xBW (wielokrotne przemywanie pomaga usunąć jak największą ilość tła). Po ostatnim etapie przemywania krótko odwirować i usunąć ostatnie ślady supernatantu.</li>
<li>Dodać 500 μl buforu 1x Hot Wash (HW). Mieszać przez 2 min w 65 °C (lub 5 °C powyżej Tm primera PEC) na bloku termicznym. Szybko usunąć supernatant po tej operacji, aby zminimalizować schładzanie. (Krok ten służy do usunięcia fragmentów tła, które wciąż wiążą się z primerami PEC, ale nie zostały faktycznie przedłużone podczas etapu elongacji). Usunąć ostatnie ślady supernatantu.</li>
<li>Resuspendować osad kulek w 30 μl buforze EB. Przenieść całą mieszaninę do nowej probówki 1,5 ml (pomaga to ograniczyć przeniesienie fragmentów biblioteki niebędących celem). Inkubować w 95 °C przez 3 minuty w termocyklerze w celu elucji. Umieścić w MPC i usunąć supernatant, dbając o to, aby nie usunąć kulek.</li>
</ol>
4) Amplifikacja produktu wychwytu
<ol>
<li>Przygotować mieszaninę PCR (master mix) dla wymaganej liczby próbek.
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>Odczynnik</td>
 <td>μl na reakcję</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Woda</td>
 <td>45</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X Gene Amp PCR buffer II</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2 (25mM)</td>
 <td>10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA (10 mg / ml) </td>
 <td>2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTPs (po 25 mM każdy)</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>454 emPCR fwd primer/10uM</td>
 <td>3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>454 emPCR rvs primer/10uM</td>
 <td>3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>AmpliTaq Gold DNA polymerase (5 U / μl)</td>
 <td>1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eluowany produkt wychwytu</td>
 <td>25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Suma</td>
 <td>100</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
</li>
<li>W termocyklerze zastosować następujący program PCR dla 14 cykli amplifikacji:
<ol>
<li>95°C 12min</li>
<li>95°C 30s</li>
<li>60°C (lub wybrana temperatura przyłączania) 1 min</li>
<li>72°C 1 min</li>
<li>Powrót do punktu 2 (x 13)</li> 
<li>72°C 5min</li>
<li>10°C ∞</li>
</ol>
</li>
<li>Oczyścić produkt reakcji za pomocą kolumny żelowej Qiagen MinElute silica spin zgodnie z instrukcją producenta. Eluować w 50 μl buforu EB. Produkt można teraz wykorzystać albo do drugiej rundy wychwytu, zaczynając od kroku 2.1, albo wprowadzić bezpośrednio do protokołu 454 emulsion PCR w celu sekwencjonowania.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Przy rozpoczynaniu pracy z protokołem PEC zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie najpierw reakcji wychwytu, w której niewielka ilość „sekwencji docelowej kontroli pozytywnej” (np. produktu PCR o długości ~100bp – 1 picogram jest w zupełności wystarczający) zostaje zmieszana z normalnie zalecaną ilością matrycy z amplifikowanej biblioteki 454 (patrz krok 2.1), a wychwyt jest przeprowadzany przy użyciu pojedynczego primera PEC zaprojektowanego do wychwycenia produktu kontroli pozytywnej. Jeśli przeprowadzono tę reakcję kontrolną, qPCR z zastosowaniem par primerów specyficznych zarówno dla kontroli pozytywnej, jak i dla adapterów 454 może zostać wykorzystany do ilościowego oznaczenia zawartości „celu kontrolnego” w stosunku do tła w oczyszczonej reakcji wydłużania primera (1.3), produkcie wydłużania primera (2.3) oraz eluowanym produkcie wychwytu na kulekach (3.6). W ten sposób w danych warunkach eksperymentalnych można bezpośrednio zmierzyć zarówno skuteczność usuwania tła („specyficzność”), jak i wydajność odzyskiwania celu („czułość”).
Prawidłowo przeprowadzony protokół PEC zazwyczaj charakteryzuje się następującymi cechami –
Czułość (mierzona ilością docelowego kontrolera zachowanego w trakcie protokołu): 
Całkowita ilość docelowego kontrolera w eluatach z kulek (3.6) =~ 1-20% całkowitej ilości w oczyszczonej reakcji wydłużania starterów (2.3).
Tło (mierzone za pomocą pary starterów emPCR 454): 
 Całkowita ilość tła w produkcie wychwytanym na kuleczkach po elucji (3.6) &lt; 0,01% całkowitej ilości w oczyszczonej reakcji wydłużania starterów (2.3).
Jeśli w produkcie końcowym pozostaje mniej niż 1% celu, etap wydłużania startera mógł zakończyć się niepowodzeniem i wymaga zbadania.
Jeśli w produktach końcowych pozostaje znacznie więcej niż 0,01% tła, kroki płukania mogły zostać wykonane nieprawidłowo i należy je sprawdzić.

<ol><li>Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., Lalueza-Fox, C., Rudan, P., Brajkovic, D., Kucan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+retrieval+and+analysis+of+five+Neandertal+mtDNA+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted retrieval and analysis of five Neandertal mtDNA genomes.</a> Science. 325 (5938), 318-321 (2009).</li>
<li>Rohland, N., Hofreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+optimization+of+ancient+DNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Comparison and optimization of ancient DNA extraction.</a> Biotechniques. 42 (3), 343-352 (2007).</li>
<li>Rohland, N., Hofreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+DNA+extraction+from+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ancient DNA extraction from bones and teeth.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1756-1762 (2007).</li>
<li>Maricic, T., Pääbo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+454+sequencing+library+preparation+from+small+amounts+of+DNA+permits+sequence+determination+of+both+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Optimization of 454 sequencing library preparation from small amounts of DNA permits sequence determination of both DNA strands.</a> Biotechniques. 46 (1), 51-57 (2009).</li>
<li>Meyer, M., AW, B. riggs, Maricic, T., Hober, B., Hoffner, B., Krause, J., Weihmann, A., Paabo, S., Hofreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+micrograms+to+picograms%3A+quantitative+PCR+reduces+the+material+demands+of+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">From micrograms to picograms: quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 36 (1), e5-e5 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda PEC jest prosta, szybka, czuła i specyficzna. W związku z tym autorzy przewidują liczne zastosowania poza analizami ancient DNA, takie jak wychwyt małych fragmentów RNA z biblioteki RNA, badanie zmienności strukturalnej w próbce pulowanej lub wychwyt różnorodności 16S (lub innych locus) z próbki metagenomicznej. Należy wspomnieć, że czułość wychwytu maleje wraz ze wzrostem liczby starterów PEC w reakcji wychwytu multipleksowego. PEC nie jest zatem idealnie dostosowany do wychwytu bardzo dużych regionów (np. megabazy lub więcej), ale doskonale sprawdza się w szybkim wychwycie małych regionów docelowych, a nawet pozycji SNP u wielu osobników.

<table><tbody><tr><td>Polimeraza AmpliTaq Gold z buforem GeneAmp PCR buffer II i MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8080241</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR QIAGEN MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki streptawidynowe M-270</td><td>Invitrogen</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Separator cząstek magnetycznych DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>120.02D</td><td></td></tr></tbody></table>

wychwyt poprzez elongację starterów: celowane odzyskiwanie sekwencji z silnie zdegradowanych źródeł dna

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

Przedstawiamy metodę ukierunkowanego odzyskiwania sekwencji DNA z materiałów DNA, które są silnie zdegradowane i zanieczyszczone DNA drobnoustrojów, co jest typowe dla kości starożytnych. Metoda ta znacząco ogranicza niszczenie próbek oraz zapotrzebowanie na sekwencjonowanie w porównaniu do podejść opartych na bezpośredniej reakcji PCR lub sekwencjonowaniu typu shotgun. Wykorzystaliśmy tę metodę do rekonstrukcji pełnych genomów mitochondrialnego DNA (mtDNA) pięciu neandertalczyków z całego ich zasięgu geograficznego. Różnorodność genetyczna mtDNA późnych neandertalczyków była około trzy razy niższa niż współczesnych ludzi. Dane te, wraz z analizami ewolucji białek mtDNA, sugerują, że długoterminowa efektywna wielkość populacji neandertalczyków była mniejsza niż u ludzi współczesnych oraz żyjących obecnie wielkich małp.

Przedstawiamy metodę ukierunkowanego odzyskiwania sekwencji starożytnego DNA, którą wykorzystaliśmy do rekonstrukcji kompletnych genomów mitochondrialnych pięciu osobników neandertalczyków. Porównanie tych sekwencji z genomami współczesnych ludzi sugeruje, że neandertalczycy przez długi czas charakteryzowali się niską efektywną wielkością populacji.

Wychwyt poprzez elongację starterów: celowane odzyskiwanie sekwencji z silnie zdegradowanych źródeł DNA

Przedstawiamy metodę ukierunkowanego odzyskiwania sekwencji DNA z próbek DNA, które są silnie zdegradowane i zanieczyszczone mikrobiologicznym DNA, co jest typowe dla...

Niniejszy film wyjaśnia technikę PECA (primer extension capture), która umożliwia celowe wyodrębnianie sekwencji DNA z wysoce pofragmentowanych źródeł DNA o ekstremalnie niskiej liczbie kopii. Wykorzystaliśmy tę technikę do sekwencjonowania kompletnych genomów mitochondrialnych z kości neandertalczyków sprzed ponad 40 000 lat; metoda ta może być stosowana do przechwytywania dowolnych małych regionów docelowych lub polimorfizmów pojedynczego nukleotydu u wielu osobników. Główne etapy tej procedury to: amplifikacja PCR pierwotnej biblioteki DNA, ilościowe oznaczenie amplifikowanej biblioteki za pomocą ilościowego PCR (qPCR), docelowa elongacja primerów w amplifikowanej bibliotece, wychwyt produktów elongacji na kulekach w celu usunięcia fragmentów niedocelowych oraz elucja i sekwencjonowanie przechwyconych i przemytych celów.Witajcie, jestem Adrian Briggs z laboratorium Shanti Payable w Zakładzie Genetyki w Instytucie Maxa Plancka ds. Antropologii Ewolucyjnej w Lipsku. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji specyficznych, interesujących sekwencji DNA ze złożonego, silnie zdegradowanego źródła DNA, takiego jak starożytne kości. Wykorzystaliśmy tę procedurę do badania mitochondrialnej różnorodności genetycznej Homo neanderthalensis, czyli człowieka neandertalczyka.Zacznijmy. DNA wykorzystane w naszym eksperymencie pochodzi z kości neandertalczyków w wieku od 40 000 do 70 000 lat, które znaleziono w czterech miejscach w obrębie zasięgu geograficznego neandertalczyków. Najpierw kość jest poddawana działaniu światła UV przez całą noc, aby odkazić jej powierzchnię z wszelkich obcych cząsteczek DNA.Do wytworzenia od 100 do 500 miligramów proszku kostnego używa się wiertła precyzyjnego. DNA jest ekstrahowane z proszku kostnego zgodnie z procedurą opisaną w artykule z 2007 roku pt. „Comparison and optimization of ancient DNA extraction” autorstwa Nadine Rockland i Michaela Hofa. Następnie ekstrakt DNA jest przekształcany w bibliotekę sekwencyjną poprzez dodanie uniwersalnych miejsc primowania adapterów do końców wszystkich fragmentów DNA, ponieważ biblioteka 4 5 4 wygenerowana z kości neandertalczyka zawiera jedynie śladowe ilości DNA, niekiedy zaledwie kilka pikogramów. Ta pierwotna biblioteka DNA jest najpierw amplyfikowana za pomocą PCR z wykorzystaniem primerów do emulsyjnego PCR odpowiadających uniwersalnym primerom bibliotecznym.Aby przygotować mieszaninę PCR do amplifikacji biblioteki, połączyć następujące odczynniki w probówce do PCR: 10 µL buforu GAMP PCR 10 X, 2 µL chlorku magnezu, 2 µL BSA, 1 µL mieszaniny dNTP, po 3 µL starterów PCR forward i reverse 4 54, 1 µL polimerazy DNA amply gold oraz 25 µL matrycy biblioteki. Na koniec dodać 45 µL wody klasy PCR, aby uzyskać całkowitą objętość 100 µL. Polimeraza DNA amply gold jest stabilna w temperaturze pokojowej, więc praca na lodzie nie jest konieczna.Po przygotowaniu reakcji PCR, umieść probówkę PCR w termocyklerze, rozpoczynając od etapu denaturacji w temperaturze 95°C przez 12 minut, a następnie przeprowadź 14 cykli: 95°C przez 30 sekund, 60°C przez jedną minutę oraz 72°C przez jedną minutę. Po zakończeniu tych 14 cykli ustaw końcowy etap w temperaturze 72°C przez pięć minut, po czym probówkę PCR można przechowywać w temperaturze 10°C do momentu rozpoczęcia dalszych prac po zakończeniu amplifikacji PCR. Następnie przeprowadź oczyszczanie produktu PCR przy użyciu kolumny wirowej Kyogen MinLu zgodnie z instrukcjami producenta, a DNA wypłucz z kolumny za pomocą 50 µL buforu EB dostarczonego w zestawie MinLu przed wstępną elongacją i wychwytywaniem produktu.Ilościową PCR należy przeprowadzić na alikwotach bibliotek nieamplifikowanych i amplifikowanych w celu ilościowego określenia i sprawdzenia jakości produktu amplifikowanej biblioteki. Biblioteka amplifikowana w 14 cyklach powinna zawierać kilka tysięcy razy więcej DNA niż biblioteka pierwotna. Jeśli tak nie jest, należy sprawdzić i powtórzyć warunki amplifikacji.Pierwotne primery przechwytujące do elongacji, które posłużą do wyodrębnienia interesujących sekwencji z amplifikowanej biblioteki, powinny zostać zaprojektowane jak standardowe primery PCR, tak aby odpowiadały pożądanemu regionowi docelowemu z optymalną temperaturą topnienia 60 °C na końcu 5' każdej z tych sekwencji docelowych, posiadały 12-nukleotydowy ogon oraz zawierały resztę biotyny na końcu 5'. W jednej mieszaninie multipleksowej przygotowanej z zapasów o stężeniu 200 µM można zastosować do 150 primerów PEC. W celu przeprowadzenia reakcji pierwotnej elongacji przygotować mieszaninę PCR w odpowiedniej probówce PCR, dodając 5 µL buforu GAMP PCR 10X, 2,5 µL chlorku magnezu, 1 µL BSA oraz 0,5 µL dNTP. Wymieszać 5 µL mieszaniny pierwotnych primerów przechwytujących do elongacji, 0,5 µL polimerazy Taq Gold, 2 µL DNA z biblioteki amplifikowanej w 14 cyklach, a na koniec 31 µL wody jakości PCR, aby uzyskać objętość końcową 50 µL.Jeśli namnożona matryca biblioteki zawiera więcej niż 1×10¹² kopii na µL, należy ją najpierw rozcieńczyć buforem EB w taki sposób, aby do mieszaniny reakcyjnej dodano nie więcej niż 2×10¹² kopii. Po przygotowaniu probówki do PCR należy umieścić ją w termocyklerze i ustawić pojedynczy cykl reakcji. Proces rozpoczyna się od denaturacji przez 12 minut w 95 °C, następnie 60 °C przez jedną minutę, a następnie 72 °C przez pięć minut w celu pierwotnej elongacji.Po zakończeniu pojedynczego cyklu, temperaturę 72 °C utrzymuje się, aby zachować produkt PCR do następnego etapu. Aby uniknąć niespecyficznego przyłączania starterów, należy bezpośrednio pipetować 150 µL buforu PBI lub PB z zestawu do oczyszczania Kyogen do probówek z reakcją PCR, podczas gdy mieszanina reakcyjna pozostaje w termocyklerze w temperaturze 72 °C. Takie postępowanie dezaktywuje polimerazę, a temperatura jest zbyt wysoka dla niespecyficznej elongacji starterów docelowych; należy zamknąć probówki, krótko wymieszać w wstrząsaczu Vortex, a następnie odwirować ciecz w wirówce laboratoryjnej.W tym kroku należy stosować wyłącznie bufor PBI lub PB, ponieważ inne bufory wiążące, takie jak bufor PM firmy Qiagen, mogą zakłócać późniejszy proces wychwytu. Następnie należy wyjąć mieszaninę z probówki do PCR i przenieść ją do kolumny wirowej Rogen MinLu w celu oczyszczenia zgodnie z instrukcjami producenta, tak jak zrobiono to wcześniej, a następnie eluować DNA z kolumny za pomocą 30 µL buforu EB dostarczonego w zestawie MinLu. Aby usunąć wszystkie fragmenty, które nie przyłączyły się do starterów PEC, przeprowadza się etap wychwytu z użyciem kulek magnetycznych.Najpierw resuspender roztwór zapasu kulek M 270 strip divide poprzez wirowanie w wortexie i pobrać ilość kulek odpowiadającą 25 µL na próbkę. Przemyć kulki dwukrotnie 500 µL dwukrotnego buforu BW i resuspender w objętości dwukrotnego buforu BW równej objętości pierwotnie pobranych kulek. Przygotować 25 µL zawiesiny.Do każdej próbki dodaj 25 µL oczyszczonego eluowanego DNA do 25 µL zawiesiny kulek, zachowując pozostałe 5 µL do późniejszej kwantyfikacji. Wymieszaj DNA i zawiesinę kulek poprzez pipetowanie w górę i w dół oraz mieszanie końcówką pipety, a następnie inkubuj w powolnym obrocie na rotatorze laboratoryjnym przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po wymieszaniu przenieś zawartość do nowej probówki PCR o pojemności 1,5 ml.Podczas poprzedniego etapu inkubacji z rotacją część niecelowego DNA mogła przykleić się do ścianki probówki. Przeniesienie zawiesiny kulek do nowej probówki pozwala uniknąć możliwości uwolnienia tego niecelowego DNA do produktów końcowych. Podczas etapu elucji termicznej, używając magnetycznego kolektora cząstek do pelletowania kulek, po 10 do 20 sekundach wszystkie kulki przemieścą się do ścianki, pozostawiając klarowny supernatant, który należy usunąć w celu przemycia kulek; należy dodać do probówki 500 µL buforu 1× BW i mieszać w wortexie przez około trzy sekundy przy niskiej prędkości.Zarówno przy pozycji pionowej, jak i odwróconej probówki, żadne kuleczki nie powinny pozostać przyklejone do jej ścianek. Używając wirówki stołowej, odwiruj zawiesinę przez jedną do trzech sekund, wystarczająco długo, aby ściągnąć cały płyn ze ścianek probówki. Włóż probówkę z powrotem do MPC i odczekaj od 10 do 20 sekund, aż wszystkie kuleczki zbiorą się przy ściance probówki.Następnie usuń nadsącz z SUP. Pierwsze płukanie jest teraz zakończone. Powtórz tę procedurę jeszcze cztery razy, po ostatnim jednokrotnym płukaniu BW i usunięciu nadsączu.Dodaj 500 µL buforu do gorącego przemywania (1×). Wymieszaj zawiesinę, krótko wirując w wortexie i odwirowując tak jak poprzednio, a następnie inkubuj probówkę przez dwie minuty w temperaturze 65 °C na termicznym shakerze blokowym przy 1000 RPM; po zdjęciu z bloku termicznego w ciągu jednej minuty krótko odwiruj, aby usunąć pozostałości supernatantu. Ten etap pozwoli na usunięcie fragmentów, które mogły wiązać się z primerami PEC, ale nie zostały przedłużone w etapie elongacji primerów; zawiesić osad w 30 µL buforu EB i przenieść mieszaninę do nowej probówki PCR o pojemności 1,5 ml.Inkubuj probówkę w termocyklerze w temperaturze 95°C przez trzy minuty. Osadź kuleczki w kolektorze cząstek magnetycznych. Proces całkowitego oczyszczenia nadsączu powinien zająć od 10 do 20 sekund; następnie przenieś nadsącz S do nowej, opisanej probówki.Należy uważać, aby nie przenieść żadnych kulek. Zachować nadfiltr zawierający wyizolowany produkt fragmentów DNA. Kuleczki można na tym etapie odrzucić.Aby namnożyć wychwycony produkt, przygotować mieszaninę PCR do całkowitej objętości 100 µL w sposób opisany w części drugiej i zastosować te same warunki cykliczności PCR. Ponownie, po zakończeniu amplifikacji PCR produktu, przeprowadzić oczyszczanie przy użyciu kolumny wirowej Qiagen Ute, tak jak zrobiono to wcześniej w sekcji drugiej; eluować DNA z kolumny za pomocą 50 µL buforu Eeb. Produkt jest teraz gotowy do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. Zaprojektowaliśmy 574 primery PEC, aby pokryły one cały genom mitochondrialny neandertalczyka.Podzieliliśmy je na cztery mieszaniny multipleksowe i przeprowadziliśmy dwie seryjne rundy wychwytu poprzez pierwotną elongację (PEC) w bibliotekach z pięciu skamieniałości neandertalczyka z czterech stanowisk w całej Eurazji, datowanych na okres od 40 000 do 70 000 lat, generując od 170 000 do 500 000 sekwencji na osobnik i dopasowując wyniki do mitochondrialnej sekwencji referencyjnej. Stwierdziliśmy, że procedura PEC doprowadziła do znacznego wzbogacenia mtDNA, osiągając pełne pokrycie mitochondrialnego DNA dla każdego osobnika przy średnim pokryciu od 18 do 56,3 krotności. Dzięki tym wynikom mogliśmy wygenerować wysokiej jakości pełną sekwencję genomu mitochondrialnego dla każdego osobnika.Następnie przeprowadziliśmy porównanie filogenetyczne tych sekwencji z globalną próbką współczesnych ludzi oraz naszych najbliższych żyjących krewnych, szympansa i bonobo. Potwierdziło to wcześniejsze ustalenia, że mitochondrialne DNA neandertalczyków jest blisko spokrewnione, ale wyraźnie odmienne od mitochondrialnego DNA współczesnych ludzi. Co więcej, porównanie samych sekwencji neandertalskich ujawniło niezwykle niską różnorodność genetyczną neandertalczyków – niższą niż obecnie wśród ludzi na całym świecie i podobną do tej u współczesnych Europejczyków.Dowody te, w połączeniu z analizą ewolucji białek w sekwencjach neandertalczyków, sugerują, że neandertalczycy charakteryzowali się długoterminowo niewielką liczebnością populacji, co jest zgodne z dowodami archeologicznymi wskazującymi, że gęstość zaludnienia neandertalczyków nigdy nie osiągnęła poziomów odnotowanych u ludzi współczesnych. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić przechwytywanie rozszerzeń naczelnych w celu amplifikacji i wyodrębnienia sekwencji docelowych w przygotowaniu do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. Podczas stosowania tej procedury ważne jest przestrzeganie wszystkich specyfikacji temperatury w termocyklerze, jednak należy pamiętać, że primery mogą mieć różne temperatury topnienia, dlatego może być konieczne dostosowanie temperatury topnienia do konkretnych primerów oraz zachowanie szczególnej ostrożności podczas wszystkich etapów płukania, aby usunąć jak największą ilość cieczy.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

primer-extension-capture-targeted-sequence-retrieval-from-heavily

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przechwytywanie rozszerzenia startera: ukierunkowane odzyskiwanie sekwencji z mocno zdegradowanych źródeł DNA

Wzbogacanie gDNA do sekwencjonowania NGS jest łatwym i potężnym narzędziem do badania mutacji konstytucyjnych. W tym artykule przedstawiamy procedurę analizy w prosty sposób pełnej sekwencji 11 genów biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA.

Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA

Opisujemy protokół amplifikacji miejsc integracji retrowirusowej z genomowego DNA zakażonych komórek, sekwencjonowania amplifikowanych połączeń wirus-gospodarz, a następnie mapowania tych sekwencji do genomu referencyjnego. Opisujemy również techniki ilościowego określania rozmieszczenia miejsc integracji w odniesieniu do różnych adnotacji genomowych za pomocą BEDTools.

Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

W tym miejscu przedstawiamy protokół badania metylacji DNA w całym genomie w klinicznych badaniach przesiewowych pacjentów na dużą skalę przy użyciu technologii sekwencjonowania Methyl-Binding DNA Capture (MBDCap-seq lub MBD-seq) i późniejszej analizy bioinformatycznej.

Wychwytywanie DNA wiążącego metyl Sekwencjonowanie tkanek pacjenta

Opisujemy technikę łączenia cytometrii przepływowej i sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji późno replikujących się regionów genomu.

G2-seq: Wysokoprzepustowa technika oparta na sekwencjonowaniu do identyfikacji późno replikujących się regionów genomu

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

Identyfikacja fizycznych interakcji między genami a elementami regulatorowymi jest trudna, ale została ułatwiona dzięki metodom wychwytywania konformacji chromosomów. Ta modyfikacja protokołu 4C-seq łagodzi stronniczość PCR, minimalizując nadmierną amplifikację matryc PCR i maksymalizując mapowalność odczytów poprzez włączenie etapu trawienia enzymu ograniczającego dodawanie.

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

Ta metoda opisuje kroki mające na celu poprawę jakości i ilości danych sekwencyjnych, które można uzyskać z próbek RNA zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Opisujemy metodologię dokładniejszej oceny jakości próbek FFPE-RNA, przygotowania bibliotek sekwencjonowania i analizy danych z próbek FFPE-RNA.

Optymalizacja sekwencjonowania i analizy zdegradowanych próbek FFPE-RNA

Hi-C 3.0 to ulepszony protokół Hi-C, który łączy sieciujące formaldehyd i glutaran disuccinimidylu z koktajlem enzymów restrykcyjnych DpnII i DdeI, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu i rozdzielczość wykrywania interakcji chromatyny.

Rejestrowanie konformacji chromosomów w różnych skalach długości

Protokół zawiera instrukcję modyfikacji RNA za pomocą siarczanu dimetylu do eksperymentów z profilowaniem mutacji. Obejmuje ona sondowanie in vitro i in vivo z dwiema alternatywnymi metodami przygotowania biblioteki.

Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

Istotną przeszkodą dla technologii takich jak CRISPR są zdarzenia niezgodne z celem, które mogą zakłócić działanie ważnych genów. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) jest techniką opracowaną w celu identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia. Metoda ta mapuje aktywność CRISPR-Cas9 w całym genomie z wysoką czułością i bez uprzedzeń.

CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem

Poznaj technikę PECA do celowego pobierania sekwencji DNA z silnie zdegradowanych źródeł. Metoda umożliwia rekonstrukcję kompletnych genomów mitochondrialnych neandertalczyków i analizę ich różnorodności genetycznej.

Wychwyt poprzez elongację starterów: celowane odzyskiwanie sekwencji z silnie zdegradowanych źródeł DNA

Przeglądaj więcej filmów