Wychwyt poprzez elongację starterów: celowane odzyskiwanie sekwencji z silnie zdegradowanych źródeł DNA

Ten film wyjaśnia technikę przechwytywania poprzez wydłużanie starterów (primer extension capture, PECA), która umożliwia ukierunkowane odzyskiwanie sekwencji DNA z wysoce pofragmentowanych źródeł DNA o ekstremalnie niskiej liczbie kopii. Wykorzystaliśmy tę technikę do sekwencjonowania kompletnych genomów mitochondrialnych z kości neandertalczyka sprzed ponad 40 000 lat; metoda ta może być stosowana do przechwytywania dowolnych małych regionów docelowych lub polimorfizmów pojedynczego nukleotydu od wielu osobników. Główne etapy tej procedury obejmują amplifikację PCR pierwotnej biblioteki DNA, kwantyfikację amplifikowanej biblioteki za pomocą ilościowego PCR, docelowe wydłużanie pierwotnej biblioteki, przechwytywanie produktów wydłużania na kulek magnetycznych w celu usunięcia fragmentów niedocelowych oraz elucję i sekwencjonowanie przechwyconych i przemytych celów.

Witam, nazywam się Adrian Briggs i reprezentuję laboratorium Shanti Payable w Katedrze Genetyki w Instytucie Antropologii Ewolucyjnej Maxa Plancka w Lipsku. Dzisiaj przedstawimy procedurę izolacji specyficznych, interesujących nas sekwencji DNA z kompleksowego, silnie zdegradowanego źródła DNA, jakim są np. starożytne kości. Wykorzystaliśmy tę procedurę do badania mitochondrialnej różnorodności genetycznej Homo neanderthalensis, czyli neandertalczyka.

Zacznijmy. DNA wykorzystane w naszym eksperymencie pochodzi z kości neandertalczyków w wieku od 40 000 do 70 000 lat, które znaleziono w czterech miejscach w zasięgu geograficznym neandertalczyków. Najpierw kość jest przez noc poddawana działaniu światła UV, aby odkazić powierzchnię z wszelkich obcych cząsteczek DNA.

Do uzyskania od 100 do 500 miligramów proszku kostnego używa się precyzyjnego wiertła. DNA jest ekstrahowane z proszku kostnego zgodnie z procedurą opisaną w artykule z 2007 roku zatytułowanym „comparison and optimization of ancient DNA extraction” autorstwa Nadine Rockland i Michaela Hofa. Następnie ekstrakt DNA jest przekształcany w bibliotekę sekwencjonowania poprzez dodanie uniwersalnych miejsc primingu adapterowego do końców wszystkich fragmentów DNA, ponieważ biblioteka 4 5 4 wygenerowana z kości neandertalczyka zawiera jedynie śladowe ilości DNA, niekiedy zaledwie kilka pikogramów. Ta pierwotna biblioteka DNA jest najpierw amplyfikowana metodą PCR przy użyciu starterów do emulsyjnego PCR odpowiadających uniwersalnym starterom bibliotecznym.

Aby przygotować mieszaninę PCR do amplifikacji biblioteki, należy połączyć w probówce PCR następujące odczynniki: 10 µL buforu 10 X GAMP PCR, 2 µL chlorku magnezu, 2 µL BSA, 1 µL mieszaniny dNTP, po 3 µL starterów forward i reverse 4 54 MPCR, 1 µL polimerazy DNA AmplyGold oraz 25 µL matrycy biblioteki. Na koniec dodać 45 µL wody jakości PCR, aby uzyskać całkowitą objętość 100 µL. Polimeraza DNA AmplyTech Gold jest stabilna w temperaturze pokojowej, dlatego praca na lodzie nie jest konieczna.

Po przygotowaniu reakcji PCR, umieść probówkę z reakcją w termocyklerze, rozpoczynając od etapu denaturacji w temperaturze 95 °C przez 12 minut, a następnie przeprowadź 14 cykli obejmujących: 95 °C przez 30 sekund, 60 °C przez jedną minutę oraz 72 °C przez jedną minutę. Po zakończeniu tych 14 cykli ustaw końcowy etap w temperaturze 72 °C przez pięć minut, po czym probówkę PCR można przechowywać w temperaturze 10 °C do momentu dalszego użycia po zakończeniu amplifikacji PCR. Następnie przeprowadź oczyszczanie produktu PCR przy użyciu kolumny wirowej Kyogen MinLu zgodnie z instrukcją producenta i eluuj DNA z kolumny 50 µL buforu EB dostarczonego w zestawie MinLu przed przystąpieniem do pierwotnej elongacji i wychwytywania produktu.

Ilościową reakcję PCR należy przeprowadzić na alikwotach bibliotek nieamplifikowanych i amplifikowanych w celu ilościowego oznaczenia oraz sprawdzenia jakości produktu amplifikowanej biblioteki. Biblioteka amplifikowana w 14 cyklach powinna zawierać DNA w ilości kilkanaście tysięcy razy większej niż biblioteka pierwotna. W przeciwnym razie należy sprawdzić i powtórzyć warunki amplifikacji.

Startery do wychwytu pierwotnego przedłużania, które posłużą do wychwycenia interesujących sekwencji z amplifikowanej biblioteki, należy zaprojektować jak standardowe startery PCR, tak aby odpowiadały pożądanemu regionowi docelowemu z optymalną temperaturą topnienia 60 °C na końcu 5' każdej z tych sekwencji docelowych, zawierając 12-nukleotydowy ogon oraz resztę biotyny na końcu 5'. Do jednej mieszaniny multipleksowej przygotowanej z roztworów stokowych o stężeniu 200 µM można użyć do 150 starterów PEC. Do reakcji pierwotnego przedłużania należy przygotować mieszaninę PCR w odpowiedniej probówce PCR, dodając 5 µL buforu PCR 10 X GAMP, 2,5 µL chlorku magnezu, 1 µL BSA oraz 0,5 µL dNTP. Następnie należy wymieszać 5 µL mieszaniny starterów do wychwytu pierwotnego przedłużania, 0,5 µL polimerazy Taq gold, 2 µL DNA z biblioteki amplifikowanej w 14 cyklach oraz na koniec 31 µL wody klasy PCR, aby uzyskać objętość całkowitą 50 µL.

Jeśli matryca namnożonej biblioteki zawiera więcej niż 1 × 10¹² kopii na mikrolitr, należy ją najpierw rozcieńczyć buforem EB tak, aby do mieszaniny reakcyjnej dodano nie więcej niż 2 × 10¹² kopii. Po przygotowaniu probówki do PCR należy umieścić ją w termocyklerze i ustawić program dla pojedynczego cyklu reakcji. Rozpocznij od 12-minutowej denaturacji w 95 °C, następnie 1 minuty w 60 °C oraz 5 minut w 72 °C w celu przeprowadzenia pierwotnej elongacji.

Po zakończeniu pojedynczego cyklu, temperaturę 72 °C utrzymuje się, aby zachować produkt PCR do następnego etapu. Aby uniknąć nieswoistego przyłączania starterów, pipetuje się bezpośrednio 150 µL buforu PBI lub PB z zestawu do oczyszczania Kyogen do probówek z reakcją PCR, podczas gdy mieszanina reakcyjna pozostaje w termocyklerze w temperaturze 72 °C. Takie postępowanie inaktywuje polimerazę, a temperatura jest zbyt wysoka dla nieswoistej elongacji starterów docelowych; należy zamknąć probówki, krótko wymieszać w wstrząsarze typu vortex, a następnie odwirować ciecz w wirówce laboratoryjnej.

W tym kroku należy stosować wyłącznie bufor PBI lub PB, ponieważ inne bufory wiążące, takie jak bufor Qiagen PM, mogą zakłócać późniejszy proces wychwytu. Następnie należy wyjąć mieszaninę z probówki do PCR i przenieść ją do kolumny wirowej Rogen MinLu w celu oczyszczenia zgodnie z instrukcjami producenta, tak jak robiono to wcześniej, a następnie eluować DNA z kolumny za pomocą 30 µL buforu EB dostarczonego w zestawie MinLu. W celu usunięcia wszystkich fragmentów, które nie przyłączyły się do starterów PEC, przeprowadza się etap wychwytu z użyciem kulek magnetycznych.

W pierwszej kolejności resuspendować roztwór stokowy kulek M 270 strip poprzez wirowanie w wortexie i pobrać ilość kulek odpowiadającą 25 µL na próbkę. Przemyć kulki dwukrotnie 500 µL dwukrotnego buforu BW, a następnie resuspendować w objętości dwukrotnego buforu BW równej objętości pierwotnie pobranych kulek. Przygotować 25 µL zawiesiny.

Do każdej próbki dodaj 25 µL oczyszczonego eluowanego DNA do 25 µL zawiesiny kulek, zachowując pozostałe 5 µL do późniejszej kwantyfikacji. Wymieszaj DNA i zawiesinę kulek poprzez pipetowanie w górę i w dół oraz mieszanie końcówką perpet, a następnie inkubuj na rotatorze laboratoryjnym przez 15 minut w temperaturze pokojowej, powoli obracając próbki. Po wymieszaniu przenieś zawartość do nowej probówki PCR o pojemności 1,5 ml.

Podczas poprzedniego etapu inkubacji z rotacją część niezadanego DNA mogła przykleić się do ścianki probówki. Przeniesienie zawiesiny kulek do nowej probówki pozwala uniknąć możliwości przedostania się tego niezadanego DNA do produktów końcowych. Podczas etapu elucji termicznej, przy użyciu kolektora cząstek magnetycznych, należy zebrać kulki w pellet; po 10 do 20 sekundach wszystkie kulki przemieścą się do ścianki, pozostawiając klarowny supernatant, który należy usunąć w celu przemycia kulek. Następnie do probówki należy dodać 500 µL buforu BW 1× i mieszać w wortexie przez około trzy sekundy przy niskiej prędkości.

Zarówno przy probówce ustawionej pionowo, jak i odwróconej do góry dnem, żadne kuleczki nie powinny pozostać przyścienne. W wirówce stołowej odwiruj zawiesinę przez jedną do trzech sekund, aby całkowicie ściągnąć ciecz ze ścianek probówki. Włóż probówkę z powrotem do MPC i odczekaj od 10 do 20 sekund, aż wszystkie kuleczki zbiorą się przy ściance probówki.

Następnie usuń nadpływ (natant) z SUP. Pierwsze przemywanie jest teraz zakończone. Powtórz tę procedurę jeszcze cztery razy, po ostatnim przemywaniu raz objętością BW i usunięciu nadpływu.

Dodaj 500 µL buforu do gorącego przemywania (1x). Wymieszaj zawiesinę, krótko wirując w wstrząsarku typu vortex i odwirowując osad jak poprzednio, a następnie inkubuj probówkę przez dwie minuty w temperaturze 65 °C w termicznym wstrząsarzu blokowym przy 1000 RPM, po czym krótko odwiruj, aby usunąć pozostałości nadsączu w ciągu jednej minuty od wyjęcia z bloku termicznego. Ten krok usunie fragmenty, które mogą wiązać się z primerami PEC, ale nie zostały wydłużone w etapie wydłużania primerów. Resuspenduj osad w 30 µL buforu EB i przenieś mieszaninę do nowej probówki PCR o pojemności 1,5 ml.

Inkubuj probówkę w termocyklerze w temperaturze 95 °C przez trzy minuty. Odwiruj kuleczki w kolektorze cząstek magnetycznych. Proces całkowitego oczyszczenia nadfiltratu powinien zająć od 10 do 20 sekund, a następnie przenieś nadfiltrat S do nowej, opisanej probówki.

Należy uważać, aby nie przenieść żadnych kulek. Należy zachować nadfiltr, który zawiera wyizolowany produkt fragmentów DNA. Kulek można na tym etapie usunąć.

Aby przeprowadzić amplifikację przechwyconego produktu, należy przygotować mieszaninę PCR o całkowitej objętości 100 microliters, analogicznie do procedury opisanej w części drugiej, i zastosować te same warunki cykli PCR. Ponownie, po zakończeniu amplifikacji PCR produktu, należy przeprowadzić oczyszczanie za pomocą kolumny wirówkowej Qiagen Ute, tak jak zrobiono to wcześniej w sekcji drugiej, a następnie eluować DNA z kolumny przy użyciu 50 microliters buforu Eeb; produkt jest teraz gotowy do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. Zaprojektowaliśmy 574 primery PEC, aby pokryły one cały mitochondrialny genom neandertalczyka.

Podzieliliśmy je na cztery mieszaniny multipleksowe i przeprowadziliśmy dwie seryjne rundy pierwotnego wychwytu przez elongację (PEC) w bibliotekach z pięciu skamieniałości neandertalczyka z czterech stanowisk w Eurazji, datowanych na okres od 40 000 do 70 000 lat, generując od 170 000 do 500 000 sekwencji na osobnika i dopasowując wyniki do referencyjnej sekwencji mitochondrialnej. Stwierdzono, że procedura PEC doprowadziła do masowego wzbogacenia mitochondrialnego DNA, osiągając pełne pokrycie mtDNA dla każdego osobnika przy średnim stopniu pokrycia od 18 do 56,3 krotności. Dzięki tym wynikom mogliśmy wygenerować wysokiej jakości pełną sekwencję genomu mitochondrialnego dla każdego osobnika.

Następnie przeprowadziliśmy analizę porównawczą filogenetyczną tych sekwencji z globalną próbką współczesnych ludzi oraz naszych najbliższych żyjących krewnych – szympansa i bonobo. Potwierdziło to wcześniejsze odkrycia, zgodnie z którymi mitochondrialne DNA neandertalczyków jest blisko spokrewnione, lecz wyraźnie odmienne od mtDNA współczesnych ludzi. Co więcej, porównanie samych sekwencji neandertalskich ujawniło ekstremalnie niską różnorodność genetyczną u neandertalczyków – niższą niż obecnie wśród ludzi na całym świecie i zbliżoną do tej występującej u współczesnych Europejczyków.

Dowody te w połączeniu z analizą ewolucji białek w sekwencjach neandertalskich sugerują, że populacje neandertalczyków przez długi czas były nieliczne, co jest spójne z dowodami archeologicznymi wskazującymi na to, że zagęszczenie populacji neandertalczyków nigdy nie osiągnęło poziomów właściwych dla współczesnych ludzi. Przedstawiliśmy właśnie sposób przeprowadzenia wychwytu z rozszerzeniem dla naczelnych w celu amplifikacji i wyizolowania sekwencji docelowych w przygotowaniu do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest przestrzeganie wszystkich specyfikacji temperatury w termocyklerze, jednak należy pamiętać, że startery mogą mieć różne temperatury odlygania, dlatego konieczne może być dostosowanie temperatury odlygania do konkretnych starterów oraz zachowanie szczególnej staranności podczas wszystkich etapów płukania, aby usunąć jak największą ilość cieczy.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.