Przechwytywanie metodą wydłużania starterów: ukierunkowane odzyskiwanie sekwencji z silnie zdegradowanych źródeł DNA

Niniejszy film wyjaśnia technikę przechwytywania poprzez elongację starterów (PECA), która umożliwia ukierunkowane odzyskiwanie sekwencji DNA z wysoce sfragmentowanych źródeł DNA o ekstremalnie niskiej liczbie kopii. Wykorzystaliśmy tę technikę do sekwencjonowania kompletnych genomów mitochondrialnych z kości neandertalczyka sprzed ponad 40 000 lat; metoda ta może być stosowana do przechwytywania dowolnych małych regionów docelowych lub polimorfizmów pojedynczego nukleotydu u wielu osobników. Głównymi etapami tej procedury są: amplifikacja PCR pierwotnej biblioteki DNA, ilościowe oznaczenie amplifikowanej biblioteki za pomocą ilościowego PCR, docelowa elongacja pierwotna w amplifikowanej bibliotece, przechwytywanie produktów elongacji pierwotnej za pomocą kulek w celu usunięcia fragmentów niedocelowych oraz elucja i sekwencjonowanie przechwyconych i przemytych celów.

Witam, jestem Adrian Briggs z laboratorium Shanti Payable w Departamencie Genetyki w Instytucie Antropologii Ewolucyjnej Maxa Plancka w Lipsku. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji specyficznych, interesujących nas sekwencji DNA z kompleksowego, silnie zdegradowanego źródła DNA, takiego jak starożytne kości. Procedurę tę wykorzystaliśmy do badania różnorodności genetycznej mitochondriów Homo neanderthalensis, czyli człowieka neandertalczyka.

Zacznijmy. DNA wykorzystane w naszym doświadczeniu pochodzi z kości neandertalczyków w wieku od 40 000 do 70 000 lat, które znaleziono w czterech miejscach w obrębie zasięgu geograficznego neandertalczyka. Kość jest najpierw poddawana całonocnej ekspozycji na światło UV w celu odkażenia powierzchni z wszelkich zanieczyszczeń obcym DNA.

Do uzyskania od 100 do 500 miligramów proszku kostnego używa się precyzyjnego wiertła. DNA jest ekstrahowane z proszku kostnego zgodnie z procedurą opisaną w artykule z 2007 roku pt. „Comparison and optimization of ancient DNA extraction” autorstwa Nadine Rockland i Michaela Hofa. Następnie ekstrakt DNA jest przekształcany w bibliotekę sekwencjonowania poprzez dodanie uniwersalnych miejsc primingu adapterów do końców wszystkich fragmentów DNA, ponieważ biblioteka 4 5 4 wygenerowana z kości neandertalczyka zawiera jedynie śladowe ilości DNA, niekiedy zaledwie kilka pikogramów. Ta pierwotna biblioteka DNA jest najpierw amplifikowana za pomocą PCR, wykorzystując primery do emulsion PCR odpowiadające uniwersalnym primerom bibliotecznym.

Aby przygotować mieszaninę PCR do amplifikacji biblioteki, połączyć w probówce do PCR następujące odczynniki: 10 µL buforu PCR 10X GAMP, 2 µL chlorku magnezu, 2 µL BSA, 1 µL mieszaniny dNTP, po 3 µL starterów PCR forward i reverse 4 54, 1 µL polimerazy DNA AmpliGold oraz 25 µL matrycy biblioteki. Na koniec dodać 45 µL wody klasy PCR, aby uzyskać całkowitą objętość 100 µL. Polimeraza DNA AmpliTech Gold jest stabilna w temperaturze pokojowej, więc praca na lodzie nie jest konieczna.

Po przygotowaniu reakcji PCR umieść probówkę w termocyklerze, rozpoczynając od etapu denaturacji w temperaturze 95 °C przez 12 minut, a następnie przeprowadź 14 cykli obejmujących 95 °C przez 30 sekund, 60 °C przez jedną minutę oraz 72 °C przez jedną minutę. Po zakończeniu tych 14 cykli ustaw końcowy etap w temperaturze 72 °C przez pięć minut, po czym probówkę PCR można przechowywać w temperaturze 10 °C do momentu użycia po zakończeniu amplifikacji PCR. Następnie przeprowadź puryfikację produktu PCR za pomocą kolumny wirowej Kyogen MinLu zgodnie z instrukcją producenta, elując DNA z kolumny 50 µl buforu EB dostarczonego w zestawie MinLu przed pierwotną elongacją i wychwytywaniem produktu.

Ilościowy PCR należy przeprowadzić na alikwotach bibliotek nieamplifikowanych i amplifikowanych, aby określić ilość i sprawdzić jakość produktu amplifikowanej biblioteki. Biblioteka amplifikowana przez 14 cykli powinna zawierać ilość DNA kilkanaście tysięcy razy większą niż biblioteka pierwotna. W przeciwnym razie należy sprawdzić i powtórzyć warunki amplifikacji.

Podstawowe primery przechwytujące do elongacji, które posłużą do wyizolowania sekwencji zainteresowania z amplifikowanej biblioteki, powinny zostać zaprojektowane jak standardowe primery PCR tak, aby odpowiadały pożądanemu regionowi docelowemu z optymalną temperaturą topnienia 60 °C na końcu 5' każdej z tych sekwencji docelowych, posiadać 12-nukleotydowy ogon oraz resztę biotyny na końcu 5'. W jednej mieszaninie multipleksowej przygotowanej z roztworów stokowych o stężeniu 200 µM można zastosować do 150 primerów PEC. Do reakcji podstawowej elongacji należy przygotować mieszaninę PCR w odpowiedniej probówce PCR, dodając 5 µL 10 X buforu GAMP PCR, 2,5 µL chlorku magnezu, 1 µL BSA oraz 0,5 µL dNTP. Następnie należy dodać 5 µL mieszaniny podstawowych primerów przechwytujących do elongacji, 0,5 µL polimerazy Taq Gold DNA, 2 µL DNA z biblioteki amplifikowanej w 14 cyklach i na koniec 31 µL wody klasy PCR, aby uzyskać objętość całkowitą 50 µL.

Jeśli wzornik namnożonej biblioteki zawiera więcej niż 1×10¹² kopii na mikrolitr, należy go najpierw rozcieńczyć buforem EB w taki sposób, aby do mieszaniny reakcyjnej dodano nie więcej niż 2×10¹² kopii. Po przygotowaniu probówki do PCR należy umieścić ją w termocyklerze i zaprogramować pojedynczy cykl reakcji. Proces rozpoczyna się od 12-minutowej denaturacji w temperaturze 95°C, po której następuje etap w temperaturze 60°C przez jedną minutę oraz pięć minut w temperaturze 72°C w celu przeprowadzenia pierwotnej elongacji.

Po zakończeniu pojedynczego cyklu w temperaturze 72 °C produkt PCR należy utrzymywać do następnego etapu. Aby uniknąć niespecyficznego przyłączania się starterów, należy bezpośrednio pipetować 150 µL buforu PBI lub PB z zestawu do oczyszczania Kyogen do probówek z reakcją PCR, podczas gdy mieszanina reakcyjna pozostaje w termocyklerze w temperaturze 72 °C. Czynność ta dezaktywuje polimerazę, a temperatura jest jednocześnie zbyt wysoka dla niespecyficznej elongacji starterów docelowych. Następnie należy zamknąć probówki, krótko wymieszać je w wstrząsarze typu vortex, a następnie odwirować ciecz w wirówce stołowej.

W tym kroku należy używać wyłącznie buforu PBI lub PB, ponieważ inne bufory wiążące, takie jak bufor Qiagen PM, mogą zakłócać późniejszy proces wychwytu. Następnie należy przenieść mieszaninę z probówki PCR do kolumny wirówkowej Rogen MinLu i przeprowadzić puryfikację zgodnie z instrukcjami producenta, tak jak robiono to wcześniej; DNA należy eluować z kolumny za pomocą 30 µL buforu EB dostarczonego w zestawie MinLu. W celu usunięcia wszystkich fragmentów, które nie przyłączyły się do starterów PEC, wykonuje się etap wychwytu z użyciem kulek magnetycznych.

Najpierw resuspendować roztwór zapasowy kulek M 270 strip divide poprzez wirowanie w wortexie i odmierzyć ilość kulek odpowiadającą 25 µL na próbkę. Przemyć kulki dwukrotnie 500 µL dwukrotnego buforu BW, a następnie resuspendować w objętości dwukrotnego buforu BW równej objętości pierwotnie pobranych kulek. Przygotować 25 µL zawiesiny.

Do każdej próbki dodaj 25 µL oczyszczonego elutowanego DNA do 25 µL zawiesiny kulek, zachowując pozostałe 5 µL do późniejszej kwantyfikacji. Wymieszaj DNA z zawiesiną kulek, pipetując w górę i w dół oraz mieszając końcówką typu perpet, a następnie inkubuj na rotatorze laboratoryjnym przez 15 minut w temperaturze pokojowej przy powolnym obrocie. Po wymieszaniu przenieś zawartość do nowej probówki PCR o pojemności 1,5 mL.

Podczas poprzedniego etapu inkubacji z rotacją część niezswoistego DNA mogła przykleić się do ścianki probówki. Przeniesienie zawiesiny kulek do nowej probówki pozwala uniknąć możliwości przedostania się tego niezswoistego DNA do produktów końcowych. Podczas etapu elucji termicznej, używając magnetycznego kolektora cząstek do zagregowania kulek, po 10 do 20 sekundach wszystkie kulki przemieszczą się do ścianki, pozostawiając klarowny nadsącz, który należy usunąć w celu przemycia kulek; należy dodać do probówki 500 µL 1x buforu BW i wirować w wortexie przez około trzy sekundy z niską prędkością.

Zarówno przy probówce ustawionej pionowo, jak i odwróconej, żadne kuleczki nie powinny przylegać do ścianek probówki. Używając wirówki laboratoryjnej, odwiruj zawiesinę przez jedną do trzech sekund, na tyle krótko, aby ściągnąć cały płyn ze ścianek probówki. Umieść probówkę z powrotem w MPC i odczekaj od 10 do 20 sekund, aż wszystkie kuleczki zbiorą się przy ściance probówki.

Następnie usunąć nadsącz (natant) SUP. Pierwsze płukanie jest zakończone. Powtórzyć tę procedurę jeszcze cztery razy, po ostatnim jednokrotnym płukaniu BW i usunięciu nadsączu.

Dodaj 500 µL jednokrotnego buforu do gorącego przemywania. Wymieszaj zawiesinę, krótko wirując w wortexie i odwirowując, tak jak wcześniej, a następnie inkubuj probówkę przez dwie minuty w temperaturze 65 °C na termobloku z wytrząsarką przy 1000 RPM; po krótkim odwirowaniu usuń ślady supernatantu w ciągu jednej minuty od zdjęcia z termobloku. Ten etap pozwoli usunąć fragmenty, które mogą wiązać się z primerami PEC, ale nie zostały wydłużone podczas etapu elongacji primerów. Resuspenduj osad w 30 µL buforu EB i przenieś mieszaninę do nowej probówki PCR o pojemności 1,5 mL.

Inkubuj probówkę w termocyklerze w temperaturze 95°C przez trzy minuty. Odwiruj kuleczki w kolektorze cząstek magnetycznych. Proces całkowitego klarowania się supernatantu powinien zająć od 10 do 20 sekund; następnie przenieś supernatant S do nowej, oznakowanej probówki.

Należy uważać, aby nie przenieść żadnych kulek. Przechowuje się supernatant, który zawiera wychwycone fragmenty DNA. Kulek można w tym etapie usunąć.

Aby przeprowadzić amplifikację wychwyconego produktu, należy przygotować mieszaninę PCR o całkowitej objętości 100 µL zgodnie z procedurą opisaną w części drugiej i zastosować te same warunki cykliczne PCR. Ponownie, po zakończeniu amplifikacji PCR produktu, należy przeprowadzić oczyszczanie przy użyciu kolumny wirowej Qiagen Ute, tak jak zrobiono to wcześniej w sekcji drugiej; DNA należy eluować z kolumny 50 µL buforu Eeb. Produkt jest teraz gotowy do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. Zaprojektowaliśmy 574 primery PEC, aby pokryły one całe mitochondrialne genom neandertalczyka.

Podzieliliśmy je na cztery mieszaniny multipleksowe i przeprowadziliśmy dwie seryjne rundy wychwytu poprzez pierwotną elongację (PEC) w bibliotekach pochodzących od pięciu skamieniałości neandertalczyków z czterech stanowisk w Eurazji, datowanych na okres od 40 000 do 70 000 lat, generując od 170 000 do 500 000 sekwencji na osobnik i dopasowując wyniki do referencyjnej sekwencji mitochondrialnej. Stwierdzono, że procedura PEC doprowadziła do ogromnego wzbogacenia mtDNA, osiągając pełne pokrycie mitochondrialnego DNA dla każdego osobnika przy średnim pokryciu od 18 do 56,3 krotności. Dzięki tym wynikom mogliśmy wygenerować wysokiej jakości pełną sekwencję genomu mitochondrialnego dla każdego osobnika.

Następnie przeprowadziliśmy porównanie filogenetyczne tych sekwencji z globalną próbką współczesnych ludzi oraz naszych najbliższych żyjących krewnych, szympansa i bonobo. Potwierdziło to wcześniejsze ustalenia, że mitochondrialne DNA neandertalczyków jest blisko spokrewnione, lecz wyraźnie odmienne od DNA współczesnych ludzi. Co więcej, porównanie samych sekwencji neandertalskich ujawniło niezwykle niską różnorodność genetyczną u neandertalczyków – niższą niż u współczesnych ludzi na całym świecie i podobną do tej u dzisiejszych Europejczyków.

Dowody te, w połączeniu z analizą ewolucji białek w sekwencjach neandertalczyków, sugerują, że populacje neandertalczyków utrzymywały się na niskim poziomie przez długi czas, co jest zgodne z dowodami archeologicznymi wskazującymi, że gęstość zaludnienia neandertalczyków nigdy nie osiągnęła poziomów charakterystycznych dla ludzi współczesnych. Przedstawiliśmy właśnie sposób przeprowadzenia przechwytywania z rozszerzeniem u naczelnych w celu amplifikacji i wyizolowania sekwencji docelowych w ramach przygotowania do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. Podczas stosowania tej procedury ważne jest przestrzeganie wszystkich specyfikacji temperatury w termocyklerze, jednak należy pamiętać, że startery mogą mieć różne temperatury topnienia, dlatego konieczne może być dostosowanie temperatury topnienia do konkretnych starterów oraz zachowanie ostrożności podczas wszystkich etapów płukania, aby usunąć jak najwięcej cieczy.

Dziękujemy za obejrzenie materiału i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.