Enkapsulacja komórek w trójwymiarowych hydrożelach w inżynierii tkankowej

Stopniowy proces enkapsulacji komórek rozpoczyna się od przygotowania i sterylizacji form hydrożelowych oraz innych materiałów, a następnie od izolacji komórek w oddzielne populacje, do probówek przeznaczonych dla każdego zestawu żelu. Następnie przeprowadza się żelowanie w obecności komórek, po czym następuje okres inkubacji in vitro lub in vivo. Dalsza analiza zachowania komórek może obejmować testy żywotności, morfologii, proliferacji oraz różnicowania.

Witajcie, jestem Amidio Kahan z laboratorium dr. Jasona Burdicka z Katedry Bioinżynierii na Uniwersytecie Pensylwanii. Dzisiaj przedstawimy procedurę enkapsulacji komórek w trójwymiarowych hydrożelach do zastosowań w inżynierii tkankowej. Procedury tej używamy do badania wpływu składu i struktury hydrożelu na zachowanie enkapsulowanych komórek.

Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować 0,5% wagowy roztwór fotoinicjatora Irgacure 2959 w PBS. Wymieszać i inkubować przez dwa do trzech dni w ciemności w temperaturze 37 °C.

Po przygotowaniu przefiltruj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego w celu jego sterylizacji, a następnie przechowuj w temperaturze pokojowej. Następnie wykorzystaj program arkusza kalkulacyjnego, taki jak Microsoft Excel, aby obliczyć wymaganą ilość polimeru i sieciującego w sposób przedstawiony w instrukcji. Poniżej znajduje się kwas hialuronowy funkcjonalizowany reaktywnymi grupami akrylowymi.

Należy również obliczyć ilość peptydu zawieszonego zawierającego funkcjonalną domenę adhezyjną z aminokwasami cysteiną, argininą, glicyną i asparaginianem. Cysteina służy do przytwierdzenia do polimeru. Po określeniu wymaganych ilości sieciującego polimeru oraz peptydu, należy je odważyć i umieścić każdy z nich w osobnej probówce typu Eppendorf.

Odpowiednio dostosuj arkusz obliczeniowy. Po uzyskaniu rzeczywistej masy polimeru przejdź do sekcji Przygotowanie form żelowych. Użyj żyletki, aby odciąć końcówki sterylnych opakowań indywidualnych.

Jednorazowe strzykawki o pojemności jednego mililitra. Należy upewnić się, że cięcie jest płaskie, aby formy mogły zostać wykorzystane do przenoszenia wzorów fotograficznych na żele. Na koniec wysterylizować formy ze strzykawek, probówki EOR z otwartymi zakrętkami oraz wszelkie inne niezbędne materiały, umieszczając je pod wbudowaną w komorę bezpieczeństwa biologicznego lampą bakteriobójczą na 30 minut.

Po zakończeniu sterylizacji przystąp do przygotowania komórek, po uprzednim wysterylizowaniu sprzętu eksperymentalnego. Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, dodaj sterylne TEA do polimeru wykorzystywanego w sieciowaniu typu mikalnego oraz sterylny PBS do polimeru stosowanego w sieciowaniu rodnikowym. Dodaj odpowiedni bufor do probówek z grupami bocznymi i wymieszaj na wortexie.

Aby rozpuścić grupę boczną, która wiąże się z alkilowanym kwasem hialuronowym poprzez grupę tiolową pochodzącą z grupy INE w peptydzie, umożliwiając przyłączenie grupy bocznej do polimeru, należy dodać ją do roztworu polimeru i zamknąć za pomocą param. W skrócie: wymieszać w wortexie i inkubować w temperaturze 37°C przy ciągłym mieszaniu. Podczas gdy grupa boczna się przyłącza, należy przygotować komórki do enkapsulacji – mogą to być ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (HMCs) – poprzez ich przemycie PBS.

Następnie inkubować z trypsyną przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, usunąć trypsynę i inkubować przez kolejne pięć minut w temperaturze 37°C. Następnie dodać pożywkę do hodowli HMSC, aby zneutralizować trypsynę i uwolnić komórki z powierzchni płytki. Policzyć komórki za pomocą komory countingowej (hemocytometru).

Rozdziel policzone komórki na porcje zawierające odpowiednią liczbę dla każdego zestawu żeli. Dla zestawu trzech żeli o objętości 50 µL przy gęstości 10 milionów komórek na ml, odseparuj 1,5 miliona komórek do oddzielnej probówki stożkowej. Nie przygotowuj więcej niż czterech żeli w jednym zestawie ze względu na czas trwania procedury.

Następnie odwiruj komórki przy 500 RCF przez sześć minut. W temperaturze pokojowej, podczas wirowania komórek, przygotuj mieszaninę polimeryzacyjną do sieciowania edycji mikalnej. Dodaj bufor do sieciownika, aby uzyskać odpowiednie stężenie.

W celu przeprowadzenia światłowzbudzanego sieciowania rodnikowego, dodać wcześniej przygotowany roztwór I 2 9 5 9 do roztworu polimeru. Należy dodać go w ilości stanowiącej 10% całkowitej objętości żelu, aby uzyskać końcowe stężenie inicjatora wynoszące 0,05% wagowo. W ten sposób komórki oraz mieszanina polimeryzacyjna są gotowe do enkapsulacji w hydrożelu.

Zacznij od odessania nadsączu z odwirowanych komórek. Po wstępnym odessaniu odczekaj, aż ciecz opadnie, a następnie odessaj ponownie, aby usunąć jak najwięcej pożywki, nie naruszając osadu komórkowego. Resuspenduj osad komórkowy przy użyciu roztworu polimeru, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza.

Powoli pipetuj roztwór w górę i w dół około 10 razy, co powinno być wystarczające do równomiernego rozprzestrzenienia komórek. W przypadku reakcji addycyjnej typu mical użyj końcówki do pipety o szerokim otworze, aby dodać odpowiednią objętość roztworu sieciującego do komórki polimerowej. Wymieszaj. Ustaw pipetę na pożądaną objętość pojedynczego żelu.

Pipetuj roztwór w górę i w dół, aby go uhomogenizować, a następnie przenieś go do form w końcówkach strzykawek. Wykonaj ten krok szybko, aby zapewnić równomierny rozkład komórek, i inkubuj przez 10 do 30 minut w dygestorze w celu sieciowania. W przypadku sieciowania wolnorodnikowego inicjowanego światłem.

Odpowiednią objętość rozdzielić do form w postaci końcówek strzykawki. Strzykawki naświetlać światłem UV w celu sieciowania rodnikowego przez 10 minut przy długości fali 365 nanometrów. Dla polimerów funkcjonalizowanych ACRL powszechnie stosuje się światło UV o natężeniu 4 miliwatów na centymetr kwadratowy.

Wykonaj ten krok szybko, aby zminimalizować osiadanie komórek przed ekspozycją na światło UV. Po sieciowaniu zanurz żele w dołkach płytki do hodowli tkanek zawierających pożywkę do inkubacji i analizy. Sieciowanie hydrożelu można również przeprowadzić sekwencyjnie.

W pierwszej kolejności należy dodać funkcjonalizowany barwnik, zmetylowaną rumine, do stężenia końcowego 20 nanomolar w żelu. Barwnik ułatwia wizualizację wzoru, ponieważ wbudowuje się on preferencyjnie w regiony żelu sieciowane rodnikowo. Następnie należy rozpocząć reakcję polimeryzacji typu mic, która dla poniższych etapów daje frakcję teoretycznych sieciowań.

W przypadku sieciowania rodnikowego należy użyć maski zaprojektowanej w programie takim jak Adobe Photoshop lub Illustrator, wydrukowanej bezpośrednio na folii przezroczystej. Wymiary maski muszą być dopasowane do okrągłej górnej części strzykawki. Za pomocą wysterylizowanej pęsety należy nałożyć sterylną maskę bezpośrednio na powierzchnię żelu, a następnie naświetlić go w celu przeprowadzenia sieciowania.

Poniżej przedstawiono HMC w hydrożelach na bazie HA godzinę po enkapsulacji. Ponieważ syntetyzowane hydrożele są zazwyczaj przezroczyste, morfologię komórek można wizualizować za pomocą mikroskopii świetlnej. Żywotność tych samych komórek wizualizowano 24 godziny po enkapsulacji przy użyciu fluorescencyjnego zestawu do barwienia żywe/martwe.

Do wykrywania żywych komórek wykorzystaliśmy calcium M, a do martwych komórek atherium homodimer; zaobserwowano żywotność powyżej 95%. Zastosowano również test alamar blue w celu określenia poziomu proliferacji komórek, mierzony na podstawie sprawności metabolizowania odczynnika testowego przez komórki, co prowadzi do zmiany koloru. Barwienie komórek przeprowadzono na H HMCs siedem dni po enkapsulacji w biodegradowalnym i adhezyjnym hydrożelu na bazie HA, stosując standardowe procedury fiksacji i permeabilizacji.

Aktyna komórkowa jest widoczna dzięki zastosowaniu falloidyny znakowanej fluoresceiną, a jądra komórkowe zostały zabarwione DPI. Do wizualizacji adhezji ogniskowych w obrębie macierzy hydrożelu zastosowano immunostaining przeciwko kulinie. Barwienie histologiczne przeprowadzono po odwodnieniu, zatopieniu w parafinie i skrawaniu hydrożeli zgodnie ze standardowymi protokołami dla sieciowanych radykalnie hydrożeli HA z enkapsulowanymi HMSC.

Po jednym tygodniu hodowli przeprowadzono barwienie hematoksyliną w celu zaznaczenia jąder komórkowych oraz ASIN w celu zaznaczenia tkanki łącznej, a barwniki niebieskie zastosowano do wykrycia glikozaminoglikanów. Do kwantyfikacji różnicowania zamkniętych w kapsułkach komórek macierzystych wykorzystano Real-time PCR. Po odjęciu tła poziom ekspresji badanego genu wyznacza się na podstawie liczby cykli, w których osiągnięto próg fluorescencji, w porównaniu z pasywnym sygnałem referencyjnym, którym jest konstytutywnie aktywny gen housekeepingowy. W ten sposób zaprezentowaliśmy metodę enkapsulacji komórek w trójwymiarowych hydrożelach oraz sposób badania zachowania komórek w żelach.

Podczas stosowania tych procedur ważne jest zapewnienie pełnej sterylności materiałów, poprzez długoterminowe przechowywanie sterylnych roztworów buforowych i odczynników lub sterylizację za pomocą bakteriobójczej lampy UV. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w eksperymentach.