Enkapsulacja komórkowa w hydrożelach 3D dla inżynierii tkankowej
October 26th, 2009
Przedstawiamy protokoły do trójwymiarowej (3D) enkapsulacji komórek w syntetycznych hydrożelach. Procedura enkapsulacji jest opisana dla dwóch powszechnie stosowanych metod sieciowania (addycja typu michaela i mechanizmy wolnych rodników inicjowanych światłem), a także szereg technik oceny zachowania komórek otoczonych kapsułkami.
Stopniowy proces kapsułkowania komórek rozpoczyna się od przygotowania i sterylizacji form hydrożelowych i innych materiałów, a następnie izolacji komórek do poszczególnych populacji, do probówek dla każdego zestawu żelu. Następnie przeprowadza się inkubację w obecności komórek, po której następuje okres inkubacji in vitro lub in vivo. Dalsza analiza zachowania komórek może obejmować testy żywotności, morfologii, proliferacji i różnicowania.
Cześć Amidio Kahan z laboratorium dr Jasona Burdicka na Wydziale Bioinżynierii Uniwersytetu Pensylwanii. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę enkapsulacji komórkowej w hydrożelach 3D do inżynierii tkankowej. Używamy tej procedury do badania wpływu składu i struktury hydrożelu na zachowanie zamkniętych komórek.
Więc zacznijmy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować 0,5% wagowy roztwór fotoinicjatora utwardzania powietrzem 2 9 5 9 lub I 2 9 5 9 w PBS. Mieszaj i inkubuj przez dwa do trzech dni w ciemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Gdy będzie gotowy, użyj filtra strzykawkowego, aby wysterylizować roztwór i przechowywać go w temperaturze pokojowej. Następnie użyj programu arkusza kalkulacyjnego, takiego jak Microsoft Excel, aby obliczyć ilość polimeru i środka sieciującego, które należy zademonstrować. Oto kwas hialuronowy funkcjonalizowany grupami reaktywnymi akrylanów.
Oblicz również ilość peptydu penanta zawierającego funkcjonalną domenę adhezyjną z aminokwasem cystyną, argininą, glicyną i asparaginianem. Cystyna służy do wiązania się z polimerem. Teraz, gdy określono wymagane ilości polimerowego środka sieciującego i pent, zważ je i umieść w probówce einor.
Dostosuj odpowiednio arkusz kalkulacyjny obliczeń. Dla rzeczywistej masy uzyskanego polimeru przystąp do przygotowania form żelowych. Użyj żyletki, aby odciąć końcówki pojedynczo zapakowanego sterylnego.
Jednorazowe strzykawki o pojemności jednego mililitra. Upewnij się, że wykonane jest płaskie cięcie dla form, które mają być używane do fotowzorów do żeli. Na koniec wysterylizuj formy strzykawkowe, probówki EOR z otwartymi nakrętkami i wszelkie inne niezbędne materiały, umieszczając je pod bakteriobójczym źródłem światła wbudowanym w komorę bezpieczeństwa biologicznego na 30 minut.
Po zakończeniu sterylizacji przystąp do przygotowania komórek po sterylizacji sprzętu doświadczalnego. Pracuj w kapturze i dodaj sterylną herbatę do polimeru używanego w sieciowaniu typu mical i sterylny PBS do polimeru używanego do sieciowania wolnych rodników. DODAJ pasujący bufor do probówek ugrupowania wisiorka i wiru.
Aby rozpuścić ugrupowanie wisiorka, wiąże się z alkilowanym kwasem hialuronowym za pośrednictwem tiolu z grupy INE na peptydzie, aby przyłączyć ugrupowanie wisiorka do polimeru, dodać go do roztworu polimeru i uszczelnić paramem. Krótko wirować i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem. Podczas przygotowywania komórek, podczas gdy ugrupowanie wisiorka jest przyczepiane, należy przygotować komórki do kapsułkowania tryis, ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych lub HMC, myjąc je PBS.
Następnie inkubować z trypsyną przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, usunąć trypsynę, inkubować jeszcze pięć minut w temperaturze 37 stopni. Następnie dodaj pożywkę wzrostową HMSC, aby zneutralizować trypsynę i uwolnić komórki z powierzchni płytki. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
Podziel zliczone komórki na porcje zawierające odpowiednią liczbę dla każdego zestawu żeli. W przypadku zestawu trzech żeli o pojemności 50 mikrolitrów o gęstości 10 milionów komórek na mililitr należy oddzielić 1,5 miliona komórek w pojedynczą stożkową probówkę. Nie należy przygotowywać więcej niż czterech żeli w pojedynczym zestawie ze względu na czas spożycia.
Następnie odwirować komórki w temperaturze 500 RCF przez sześć minut. W temperaturze pokojowej, gdy komórki wirują, przygotuj mieszankę polimeryzacyjną do sieciowania edycji micznej. Dodaj bufor do środka sieciującego, aby uzyskać odpowiednie stężenie.
W celu sieciowania wolnorodnikowego inicjowanego światłem należy dodać wcześniej przygotowany roztwór I 2 9 5 9 do roztworu polimeru. Przy 10% całkowitej objętości zestawu żelu dla końcowego stężenia inicjatora 0,05% wagowych. Teraz komórki i mieszanina polimeryzacyjna są gotowe do enkapsulacji w hydrożelu.
Zacznij od zassania snatu z komórek wirówki. Poczekaj, aż ciecz opadnie po początkowej aspiracji i ponownie zaaspiruj, aby usunąć jak najwięcej pożywki bez naruszania osadu komórkowego Resus. Zawiesić osad komórkowy z roztworem polimeru, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza.
Powoli pipetować roztwór w górę i w dół około 10 razy, co powinno wystarczyć do równomiernego rozprowadzenia komórek. W przypadku reakcji dodawania typu mical należy użyć końcówki pipety z szerokim otworem, aby dodać odpowiednią objętość roztworu sieciującego do ogniwa polimerowego. Wymieszać. Ustawić pipetę na żądaną indywidualną objętość żelu.
Pipetować roztwór w górę i w dół do homogenizacji i umieścić produkt Eloqua w foremkach na końcówkach strzykawek. Wykonaj ten krok szybko, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek i pozwól na 10 do 30 minut inkubacji w kapturze hodowlanym w celu usieciowania. Dla światła zainicjowane sieciowanie wolnorodnikowe.
Porcjować odpowiednią objętość do foremek na końcówki strzykawek. Wystaw strzykawki na działanie światła UV w celu radykalnego sieciowania 10-minutowej ekspozycji na 365 nanometrów. Światło UV o mocy czterech miliwatów na centymetr kwadratowy jest powszechne w przypadku polimerów funkcjonalizowanych ACRL.
Wykonaj ten krok szybko, aby zminimalizować osiadanie komórek przed ekspozycją na światło UV. Po usieciowaniu zanurz żele w dołkach płytki do hodowli tkankowej zawierającej pożywki do inkubacji i analizy. Sieciowanie hydrożelu można również wykonać sekwencyjnie.
Najpierw dodaj funkcjonalizowany barwnik medolowany żwacz do końcowego stężenia 20 nanomolowców w żelu. Barwnik pomaga uwidocznić wzór, ponieważ preferencyjnie łączy się z radykalnie usieciowanymi obszarami żelu. Następnie zacznij od reakcji polimeryzacji typu mic, dającej ułamek teoretycznych wiązań krzyżowych dla poniższych.
Sieciowanie wolnorodnikowe będzie wymagało użycia maski zaprojektowanej w programie takim jak Adobe Photoshop lub Illustrator i wydrukowanej bezpośrednio na maskach przezroczystości. Wymiary maski muszą pasować do okrągłej nakrętki strzykawki. Użyj wysterylizowanej pęsety, aby nałożyć sterylną maskę bezpośrednio na powierzchnię żelu i wystawić na działanie światła, aby usieciować żel.
Dalej pokazano tutaj HMC w hydrożelach na bazie HA godzinę po enkapsulacji. Ponieważ syntetyzowane hydrożele są zazwyczaj przezroczyste, komórki można uwidocznić pod kątem morfologii za pomocą mikroskopii świetlnej. Te same komórki zostały zwizualizowane pod kątem żywotności 24 godziny po enkapsulacji przy użyciu fluorescencyjnego zestawu do barwienia żywych martwych komórek.
Użyliśmy wapnia M do wykrycia żywych komórek i homodimeru atherium dla martwych komórek i zaobserwowaliśmy ponad 95% żywotności. Użyliśmy również testu błękitu alamar, aby określić poziom proliferacji komórek mierzony tym, jak dobrze komórki metabolizują odczynnik testowy, co powoduje zmianę koloru. Barwienie komórek przeprowadzono na HMC H siedem dni po enkapsulacji w degradowalnym i adhezyjnym hydrożelu na bazie HA oraz przy użyciu standardowych procedur utrwalania i przepuszczalności.
Akton komórkowy jest widoczny za pomocą phin znakowanego fluoresceiną i jąder ograniczonych dpi. Barwienie immunologiczne przeciwko cullinie służy do wizualizacji ogniskowych zrostów w matrycy hydrożelowej. Barwienie histologiczne przeprowadza się po odwodnieniu, zatopieniu parafiny i podziale hydrożeli przy użyciu standardowych protokołów radykalnie spolimeryzowanych hydrożeli HA w kapsułkach HMSC.
Po tygodniu w hodowli wybarwiono je hemat toiną oznaczającą jądra i ASIN oznaczającym tkankę łączną A oraz niebieskimi barwnikami dla glikozaminoglikanów. W czasie rzeczywistym. PCR służy do ilościowego określenia różnicowania otoczkowanych komórek macierzystych Po odjęciu tła, poziom ekspresji interesującego genu jest określany na podstawie numeru cyklu, w którym osiągnięto fluorescencję progową, w porównaniu z pasywnym sygnałem referencyjnym, który jest konstytutywnie aktywnym genem porządkowym. Właśnie pokazaliśmy, jak kapsułkować komórki w hydrożelach 3D i badać zachowanie komórek w żelach.
Podczas korzystania z tych procedur ważne jest, aby zapewnić pełną sterylność materiałów, albo poprzez długotrwałe utrzymywanie sterylnych roztworów buforowych i odczynników, albo sterylizację za pomocą bakteriobójczej lampy UV. Więc to wszystko. Dzięki za umycie i powodzenia w eksperymentach.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokoły dotyczące 3D enkapsulacji komórek w syntetycznych hydrożelach, szczegółowo opisujące metody sieciowania i oceny zachowania komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Bioinżynieria
- Inżynieria tkankowa
Tło
- 3D enkapsulacja komórek jest kluczowa dla zastosowań w inżynierii tkankowej.
- Hydrożele zapewniają wspierające środowisko dla wzrostu i różnicowania komórek.
- Różne metody sieciowania mogą wpływać na zachowanie komórek.
- Zrozumienie tych metod może poprawić strategie inżynierii tkankowej.
Cel badania
- Określenie procedur enkapsulacji komórek w hydrożelach.
- Porównanie różnych technik sieciowania.
- Ocena zachowania enkapsulowanych komórek w różnych warunkach.
Stosowane metody
- Przygotowanie i sterylizacja form hydrożelowych.
- Izolacja i przygotowanie populacji komórek.
- Sieciowanie za pomocą dodatku typu Michaela i mechanizmów inicjowanych światłem wolnych rodników.
- Analiza dalsza dotycząca żywotności, morfologii, proliferacji i różnicowania komórek.
Główne wyniki
- Udało się enkapsulować komórki w hydrożelach.
- Różne metody sieciowania wpłynęły na zachowanie komórek.
- Oceniono żywotność i morfologię enkapsulowanych komórek.
- Wykazano, że skład i struktura hydrożelu wpływają na wyniki.
Wnioski
- Ustanowione protokoły mogą być wykorzystywane w różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej.
- Zrozumienie efektów sieciowania jest kluczowe dla optymalizacji zachowania komórek.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych odkryciach, aby poprawić techniki inżynierii tkankowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
3D hydrogel encapsulation enables physiologically relevant cell culture models that improve predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking. By mimicking native tissue microenvironments, this approach supports more translatable assessments of stem cell behavior, differentiation, and response to bioactive cues. It addresses a key discovery-stage challenge: reducing biological ambiguity when evaluating therapeutic candidates in preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a tissue-like 3D context that better reflects in vivo conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation by allowing observation of cellular phenotype, viability, and differentiation under controlled matrix properties.
- Predictive Value: Improves confidence in lead identification by linking hydrogel composition to stem cell behavior and lineage specification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible platform for preparing validated biological systems suitable for downstream compound screening.
- Operational Value: Enables quantitative readouts such as proliferation (via Alamar Blue), viability (live/dead staining), and morphology, supporting assay reproducibility.
- Platform Utility: Compatible with multiple crosslinking mechanisms (Michael-type addition, free radical) and polymer types (e.g., hyaluronic acid, PEG), allowing assay adaptation across target classes.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains biological relevance from discovery through preclinical validation by preserving stem cell multipotency and differentiation capacity in degradable, adhesive hydrogels.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of cellular behavior over time (e.g., one-week culture) to inform go/no-go decisions based on matrix-mediated effects on proliferation and lineage commitment.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development through immunostaining of focal adhesions (e.g., vinculin) and histological analysis of glycosaminoglycan deposition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for modalities requiring assessment of cell-matrix interactions and differentiation potential.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled study of how hydrogel structure influences stem cell fate and mechanotransduction.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible 3D cultures with quantifiable outputs for viability, proliferation, and morphological analysis.
- Analytics: Generates measurable readouts including gene expression (via qPCR), protein localization (immunostaining), and metabolic activity, facilitating comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work through degradation-adaptive hydrogels and extracellular matrix-like cues that model tissue remodeling.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, modular capability applicable across multiple projects in regenerative medicine, disease modeling, and mechanistic screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in stem cell responses to biomaterial cues.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined sterilization, crosslinking, and cell encapsulation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by providing earlier, more physiologically relevant functional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on their performance in tissue-mimetic environments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique, hydrogel chemistry, and stem cell culture.
- Depends on access to UV light sources for photoinitiated crosslinking and standard tissue culture equipment.
- Necessitates cross-team standardization of hydrogel formulation and cell preparation protocols.
- Involves adaptation considerations when transferring across different stem cell types or polymer backbones.
- Includes practical limitations such as gel settling timing constraints and the need for rapid processing to ensure uniform crosslinking.
