Name: Enkapsulacja komórkowa w hydrożelach 3D dla inżynierii tkankowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-26T07:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Poznaj metody enkapsulacji komórek w syntetycznych hydrożelach 3D dla inżynierii tkankowej. Protokoły obejmują różne techniki usieciowania i analizę zachowania komórek w biomateriałach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z funduszy National Science Foundation Graduate Research Fellowship dla SK oraz z grantu National Institutes of Health R01EB008722.

A. Przygotowanie i sterylizacja materiałów
 <ol>
 <li>Przed przygotowaniem materiałów do enkapsulacji przygotować 0,5 wt% roztwór fotoinicjatora Irgacure 2959 (I2959) w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), mieszając i inkubując przez kilka dni w 37°C. Roztwór można następnie przefiltrować za pomocą strzykawki w celu sterylizacji i przechowywać w temperaturze pokojowej do długotrwałego użytku.</li>
 <li>Na podstawie pożądanego składu syntetyzowanych żeli obliczyć (za pomocą programu do arkuszy kalkulacyjnych, np. Microsoft Excel) masę potrzebnego polimeru i sieciowania. Ponieważ określona masa polimeru musi zostać rozpuszczona w zdefiniowanej objętości całkowitej, aby uzyskać pożądane stężenie w hydrożelach, za pomocą arkusza kalkulacyjnego należy również wyznaczyć udziały sieciowania oraz roztworu polimeru w całkowitej objętości żelu. Podobne obliczenia należy przeprowadzić, jeśli przed sieciowaniem mają zostać włączone jakiekolwiek grupy boczne (np. adhezyjny oligopeptyd zawierający RGD lub YGSR).</li>
 <li>Odważyć wymaganą ilość polimeru i sieciowania i umieścić w probówkach Eppendorf. Odpowiednio dostosować arkusz obliczeń do faktycznie uzyskanej masy polimeru. (Uwaga: objętości można zmienić, aby skompensować faktyczną masę uzyskanego polimeru i sieciowania).</li>
 <li>Przygotować formy do żelu, odcinając żyletką końcówki sterylnych jednorazowych strzykawek o pojemności 1 mL w indywidualnych opakowaniach. W przypadku form przeznaczonych do żeli fotowzorowanych należy upewnić się, że cięcie jest płaskie.</li>
 <li>Umieścić formy ze strzykawek, probówki Eppendorf (z otwartymi nakrętkami) oraz wszelkie inne niezbędne materiały pod bakteriobójczym źródłem światła (zazwyczaj wbudowanym w komory bezpieczeństwa biologicznego) i sterylizować przez 30 minut.</li>
</ol>
B. Przygotowanie komórek
 <ol>
 <li>Po sterylizacji do probówki Eppendorf z polimerem należy dodać odpowiednią objętość sterylnego buforu (zgodnie z obliczeniami w arkuszu; choć wybór buforu może się różnić, do sieciowania wolnorodnikowego zazwyczaj stosuje się PBS, a do sieciowania typu Michaela bufor słabo zasadowy, np. trietanoloaminę) oraz (opcjonalnie) grupę boczną, która ma zostać włączona (np. peptyd adhezyjny), a następnie wymieszać w wstrząsarku w celu rozpuszczenia (jeśli wstrząsanie odbywa się poza komorą sterylną, probówkę Eppendorf należy owinąć parafilmem).</li>
 <li>Do roztworu polimeru należy dodać odpowiednią objętość roztworu grupy bocznej i zabezpieczyć zamknięcie parafilmem. Krótko wymieszać w wstrząsarku i inkubować w 37°C w celu przeprowadzenia reakcji (jeżeli to możliwe, na mieszadle obrotowym) podczas przygotowywania komórek. Proces ten obejmuje reakcję tiolu w peptydzie (poprzez grupę cysteiny) z akrylanem lub metakrylanem, tak aby peptyd został włączony jako grupa boczna w końcowym hydrożelu.</li>
 <li>Komórki należy poddać trypsynizacji, policzyć i rozdzielić na porcje zawierające odpowiednią liczbę dla każdego zestawu żeli. Na przykład dla zestawu trzech żeli o objętości 50 μL przy gęstości 10 milionów komórek/mL, należy odseparować 1,5 miliona komórek do oddzielnej probówki stożkowej. Ze względu na czas żelowania zaleca się, aby w jednym zestawie przygotowywać nie więcej niż 4 żele (uwaga: w przypadku syntezy wielu zestawów żeli można przygotować jedną probówkę Eppendorf zawierającą odpowiednią objętość roztworu polimeru dla wszystkich zestawów).</li>
 <li>Komórki należy odwirować.</li>
 <li>Podczas wirowania komórek:
	 <ol class="lalpha">
	 <li>Sieciowanie wolnorodnikowe inicjowane światłem: do roztworu polimeru dodać roztwór I2959 o stężeniu 0,5 wt% w ilości odpowiadającej 10% całkowitej objętości zestawu żeli (aby uzyskać końcowe stężenie inicjatora 0,05 wt%).</li>
	 <li>Sieciowanie typu Michaela (addycyjne): do sieciowania dodać bufor w celu uzyskania odpowiedniego stężenia roztworu.</li>
 	<li>W przypadku sieciowania sekwencyjnego: żele te obejmują oba typy sieciowania i wymagają wykonania obu poprzednich kroków.</li>
 		</ol>
 </li>
</ol>
C. Tworzenie hydrożelu
<ol>
 <li>Odssać nadsącz z odwirowanej frakcji komórek. Odczekać, aż ciecz opadnie po wstępnym odsysaniu, a następnie odessać ponownie, aby usunąć jak najwięcej pożywki bez naruszenia osadu komórkowego.</li>
 <li>Resuspender osad komórkowy w roztworze polimeru aż do równomiernego rozprzestrzenienia komórek. Zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza poprzez powolne pipetowanie roztworu w górę i w dół (około 10 cykli powinno być wystarczających do rozprzestrzenienia komórek).</li>
 <li>Sieciowanie hydrożeli
 <ol>
 <li>Sieciowanie wolnorodnikowe inicjowane światłem: Odmierzyć odpowiednią objętość do form z końcówek strzykawki. Naświetlić strzykawki światłem UV w celu sieciowania wolnorodnikowego (np. 10-minutowa ekspozycja na światło UV o długości fali 365 nm i mocy 4 mW/cm2 jest powszechna dla polimerów funkcjonalizowanych akrylanem). Krok ten należy wykonać szybko, aby zminimalizować osiadanie komórek przed ekspozycją na światło UV.</li>
 <li>Sieciowanie typu Michaela (addycyjne): Używając końcówki pipety o szerokim otworze, dodać odpowiednią objętość roztworu sieciującego do roztworu polimeru/komórek, ustawić pipetę na pożądaną objętość pojedynczego żelu, pipetować roztwór w górę i w dół w celu homogenizacji, a następnie rozdzielić do form z końcówek strzykawki. Krok ten należy wykonać szybko, aby zapewnić równomierny rozkład komórek. Pozostawić na 10-30 minut (w zależności od konkretnego systemu) w dygestorium do inkubacji w celu sieciowania.</li>
 <li>Sieciowanie sekwencyjne: Proces ten obejmuje najpierw reakcję addycji typu Michaela, a następnie naświetlanie w celu drugiego sieciowania. Podczas pierwszego sieciowania powinna zajść reakcja tylko części teoretycznych wiązań sieciujących, a następnie przed naświetlaniem należy za pomocą wysterylizowanej pęsety nałożyć sterylną maskę bezpośrednio na powierzchnię żelu. Do początkowego roztworu można dodać funkcjonalizowany barwnik (np. metakrylowaną rodaminę (MeRho) w końcowym stężeniu w żelu 20 nM) w celu wizualizacji wzoru, ponieważ będzie on wbudowywać się preferencyjnie w regionach żelu sieciowanych wolnorodnikowo (Rysunek 2).</li>
 </ol>
	</li>
</ol>
D. Hodowla i analiza komórek
<ol>
 <li>Po sieciowaniu umieść żele w dołkach płytki do hodowli tkankowej zawierającej pożywkę do inkubacji i analizy (patrz następne kroki).</li>
 <li>Morfologię komórek można wizualizować za pomocą mikroskopii świetlnej (Rysunek 3; zazwyczaj syntetyzowane hydrożele są przezroczyste), a żywotność za pomocą fluorescencyjnego zestawu do barwienia żywe/martwe (Rysunki 3 i 4). Barwienie aktyny komórkowej (np. faloidyną znakowaną rodaminą lub fluoresceiną) oraz jąder komórkowych (np. 4’-6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI)) można przeprowadzić przy użyciu standardowych procedur fiksacji i permeabilizacji (Rysunek 4) zgodnie z poniższą procedurą.
 <ol class="laplha">
 <li>Płucz konstrukty 3 razy przez 5 min w PBS.</li>
 <li>Utrwal żele poprzez inkubację w 1 mL 4% formaldehydu przez 30 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Płucz konstrukty 3 razy roztworem blokującym zawierającym 3% (w/v) BSA i 0,5% (w/v) Tween w PBS.</li>
 <li>Przeprowadź permeabilizację błony za pomocą 0,25% (w/v) Triton X w roztworze blokującym przez 20 min.</li>
 <li>Płucz konstrukty 3 razy roztworem blokującym.</li>
 <li>Barw F-aktynę za pomocą 0,66 μg/mL faloidyny z FITC lub rodaminą w roztworze blokującym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Płucz 3 razy roztworem blokującym.</li>
 <li>Barw jądra komórkowe za pomocą 0,4 μL/mL DAPI w PBS przez 20 min.</li>
 <li>Płucz 3 razy w PBS.</li>
 <li>Wizualizuj komórki za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Proliferację komórek w żelach zazwyczaj ocenia się przy użyciu dostępnych komercyjnie testów (np. całkowitej zawartości DNA lub zawartości biochemicznej). PicoGreen jest powszechnie stosowanym i czułym fluorescencyjnym barwnikiem kwasów nukleinowych do kwantyfikacji dwuniciowego DNA (Singer et al.). Komórki można również policzyć i znormalizować do początkowej liczby kontrolnej, korzystając z metod wizualizacji opisanych w kroku 2.</li>
 <li>Do wizualizacji komórek i utworzonej macierzy można również zastosować cięcie histologiczne i barwienie. Poniższy protokół odwodnienia i cięcia hydrożeli 3D może zostać wykorzystany do uzyskania przekrojów poprzecznych na szkiełkach przedmiotowych:
	 <ol class="lalpha">
 		 <li>Fiksacja i odwodnienie	
			 <ol class="lroman">
 <li>Płucz preparat 3 razy w PBS.</li>
 <li>Utrwal przez 5–30 minut w 4% paraformaldehydzie.</li>
 <li>Płucz preparat 3 razy w PBS.</li>
 <li>Inkubuj próbkę w EtOH w 25°C przez 1 godzinę dla każdego z następujących stężeń EtOH (v/v) w wodzie (w podanej kolejności): 50%, 70%, 95%, 95%, 100% (na tym etapie próbki można przechowywać przez noc w 25°C).</li>
 </ol>
		 </li>
 		 <li>Przezroczystość i infiltracja
 			<ol class="lroman">
 <li>Przenieś do 100% Citrisolv na 1 h w 25°C, a następnie na jedną godzinę w 65°C.</li>
 <li>Przetnij próbki na pół żyletką w szalce Petriego tak, aby odsłonić przekrój poprzeczny próbki.</li>
 <li>Przenieś do mieszaniny Citrisolv/Micro-cut Paraffin w stosunku 1:1 na 1 h w 65°C.</li>
 <li>Przenieś do 100% Micro-cut Paraffin na 1 h w 65°C.</li>
 <li>Przenieś do 100% Micro-cut Paraffin na noc w 65°C.</li>
 <li>Przenieś do 100% Micro-cut Paraffin na 1–2 godziny w 65°C.</li>
 </ol>
 </li>
	 <li>Zatapianie
 			<ol class="lroman">
					 <li>Umieść preparat w formie odrywanej z 100% parafiną.</li>
 						<li>Nałóż niewielką ilość wosku do dna formy i włóż dwie połowy próbki przekrojem poprzecznym do dołu.</li>
 						<li>Nałóż górny element filtra
 							<ol>
 								<li>Dodaj dodatkowy wosk, aby zanurzyć górną część, i pozostaw do stwardnienia przez ok. 10 minut.</li>
 									</ol>
 						</li>
						 <li>Przenieś wkłady do lodówki w 4°C, aby preparat stwardniał przez noc.</li>
 							<li>Preparat można pociąć następnego dnia, zazwyczaj z grubością plastra 5–10 μm, używając dostępnych komercyjnie mikrotomów. Zazwyczaj forma odrywana jest montowana pionowo względem stołu mikrotomu, a do ustawienia grubości cięcia, noża i wyrównania próbki z ostrzem używa się sterowania ręcznego.</li>
 				</ol>
 		</li>
 	<li>Ekstrakcja RNA Ekspresję genów można również ocenić ilościowo (np. za pomocą reakcji polimerazy łańcuchowej w czasie rzeczywistym (RT-PCR)). Protokół ekstrakcji RNA z hydrożeli 3D, którego przykład podano poniżej, różni się znacząco od znacznie prostszego przypadku 2D.
 	 <ol class="lroman">
 		 <li>Oznacz certyfikowaną probówkę Eppendorf wolną od RNazy dla każdego hydrożelu 3D i dodaj do każdej probówki 500 μL odczynnika Trizol®. </li>
 	<li>Użyj tłuczka (homogenizatora tkanek), aby ręcznie rozetrzeć hydrożele, aż do uzyskania przejrzystego roztworu. Upewnij się, że dla każdego wariantu badania używane są oddzielne homogenizatory.</li>
 	<li>Wymieszaj każdą probówkę Eppendorf w wortexie przez 20 sekund w celu homogenizacji próbek.</li>
 	<li>Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby umożliwić całkowitą dysocjację kompleksów nukleoproteinowych.</li>
 	<li>Schładzaj próbki na lodzie przez 20 min.</li>
 	<li>Dodaj 200 μL (na mL Trizolu) chloroformu do każdej próbki i wymieszaj w wortexie.</li>
 	<li>Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez pięć min.</li>
 	<li>Wiruj próbki z prędkością 12 000 ×g w 4°C przez 15 min.</li>
 	<li>Przenieś fazę wodną (przejrzysta górna warstwa) do nowych probówek Eppendorf (unikając regionu międzyfazowego i dolnej czerwonej fazy fenolowo-chloroformowej). RNA pozostaje w przejrzystej fazie wodnej.</li>
 	 <li>Można teraz zastosować standardowe techniki izolacji i przechowywania RNA.</li>
 	 <li>Po ekstrakcji RNA często stosuje się dostępne komercyjnie zestawy do odwrotnej transkrypcji i RT-PCR z pewnymi modyfikacjami (Elisseff et al., Strehin et al.).</li>
 </ol>
 </li>
 </ol>
 </li>
 </ol>
Reprezentatywne wyniki:
Wyniki reprezentatywne dla wizualizacji fotowzorowanych hydrożeli oraz enkapsulacji komórek w żelach przedstawiono na Rysunkach 2-4 (zgodnie z odniesieniami w powyższych protokołach).
<img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig1_2.jpg" alt="Schemat procesu przygotowania komórek, przedstawiający przygotowanie materiałów, tworzenie sieci i metody analizy." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Przegląd procedury enkapsulacji 3D. Kroki na schemacie odpowiadają tytułom sekcji w protokołach krok po kroku.
<img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig2.jpg" alt="Fotochemiczna synteza hydrożelu z użyciem światła UV, fotomasek i barwnika; obrazy mikroskopowe pokazują wzory." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Fotolitograficzny wzór hydrożelu otrzymanego poprzez sekwencyjną addycję typu Michaela, a następnie polimeryzację rodnikową. (A) Schemat fotolitografii częściowo sieciowanego hydrożelu z włączeniem fotoreaktywnego barwnika. Hydrożele z kwasu hialuronowego wzorowane za pomocą (B) kołowej lub (C) prążkowanej maski z folii przezroczystej. Metakrylowana rodamina (MeRho) została wbudowana tylko w obszarach żelu, które były wystawione na działanie światła. Paski skali = 100 μm.
<img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig3.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii obserwacyjnej komórek; kontrast fazowy (A), znakowanie fluorescencyjne (B) do analizy komórkowej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Wizualizacja komórek w hydrożelach 3D. Komórki macierzyste wizualizowane za pomocą (a) mikroskopii świetlnej lub (b) barwienia żywych (zielony, Calcein AM) i martwych (czerwony, Ethidium homodimer-1) komórek 24 godziny po enkapsulacji w stężeniu 1 milion cells/mL w hydrożelu z kwasu hialuronowego sieciowanym poprzez mechanizm wolnorodnikowy inicjowany światłem. Paski skali = 100 μm.
<img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig4.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej cytozyglowitu komórkowego; włókna aktynowe (A), barwienia łączone (B)." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4. Wizualizacja komórek w hydrożelach 3D. hMSC barwione na (a) żywe komórki (Calcein AM) lub (b) aktynę komórkową (rodamina falloidyna) i jądra komórkowe (DAPI) pięć dni po enkapsulacji w zagęszczeniu 1 milion cells/mL w hydrożelu z kwasu hialuronowego sieciowanym poprzez mechanizm typu Michaela (z użyciem wiszących peptydów adhezyjnych i bifunkcyjnych proteolitycznie degradowalnych peptydów sieciujących). Paski skali = 100 μm.

<ol><li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).</li>
<li>Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Responsive+Synthetic+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Cell-Responsive Synthetic Hydrogels.</a> Adv Mater. 15, 888-892 (2003).</li>
<li>Elisseeff, J. H., Ruffner, M., Kim, T. G., Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Photoencapsulation+in+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Culture+of+Cells+for+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cellular Photoencapsulation in Hydrogels.</a> Culture of Cells for Tissue Engineering. , (2006).</li>
<li>Chung, C., Mesa, J., Miller, G. J., Randolph, M. A., Gill, T. J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+auricular+chondrocyte+expansion+on+neocartilage+formation+in+photocrosslinked+hyaluronic+acid+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Effects of auricular chondrocyte expansion on neocartilage formation in photocrosslinked hyaluronic acid networks.</a> Tissue Eng. 12, 2665-2773 (2006).</li>
<li>Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+microenvironments+for+controlled+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 205-219 (2008).</li>
<li>Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+Mode+Thiol-Acrylate+Photopolymerization+for+the+Synthesis+of+PEG-Peptide+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Mixed Mode Thiol-Acrylate Photopolymerization for the Synthesis of PEG-Peptide Hydrogels.</a> Macromolecules. 41, 6019-6026 (2008).</li>
<li>Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., Zammaretti, P., Hubbell, J. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-responsive+hydrogel+for+encapsulation+of+vascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell-responsive hydrogel for encapsulation of vascular cells.</a> Biomaterials. 30, 4318-4324 (2009).</li>
<li>Strehin, I. A., Elisseeff, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+ECM+Production+by+Cells+Encapsulated+in+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterizing ECM Production by Cells Encapsulated in Hydrogels.</a> Methods Mol Biol. 522, 1-14 (2009).</li>
<li>Khetan, S., Katz, J. S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+crosslinking+to+control+cellular+spreading+in+3-dimensional+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Sequential crosslinking to control cellular spreading in 3-dimensional hydrogels.</a> Soft Matter. 5, 1601-1606 (2009).</li>
</ol>

Opisane protokoły stanowią prostą i skuteczną metodę enkapsulacji komórek w rusztowaniach hydrożelowych w sposób cytokompatybilny. Techniki te są szczególnie istotne, ponieważ komórki macierzyste oraz komórki terminalnie zróżnicowane mogą wykazywać wyraźnie odmienne zachowanie w mikrośrodowiskach 2D w porównaniu do 3D. Nawet w przypadku podejść terapeutycznych obejmujących implantację materiałów (np. polimeryzację rodnikową in situ), enkapsulacja komórek oraz analiza ich żywotności i różnicowania mogą pomóc w procesie opracowywania materiału. Opisany proces sekwencyjny może być wykorzystany do przestrzennej manipulacji środowiskiem hydrożelowym, a w konsekwencji do sterowania zachowaniem komórek (patrz Khetan et al.).
Ogólnie rzecz biorąc, najistotniejszym elementem opisanych protokołów jest jednorodność wszystkich stosowanych roztworów. W szczególności należy zadbać o to, aby komórki były równomiernie rozmieszczone w roztworze prepolimeru, a sam roztwór został dobrze wymieszany poprzez resuspensję pipetą po dodaniu roztworu sieciującego. Brak zapewnienia tych warunków może prowadzić do agregacji komórek lub lokalnych różnic w strukturze i pęcznieniu żelu.
Choć zaprezentowane tutaj protokoły koncentrują się przede wszystkim na procedurze enkapsulacji komórek, należy również zauważyć, że enkapsulacja może wymagać pewnych korekt w protokołach analizy, które są zazwyczaj opracowywane dla wysiewu 2D. Przedstawiono kilka przykładów wizualizacji i oceny komórek w hydrożelach.

<table><tbody><tr><td>I2959</td><td>Odczynnik</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor trietanolaminowy 0,2 M</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0449</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>14040-117</td><td>1x, sterylny płyn</td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia Live/Dead</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>Zawiera sondy dla komórek żywych (Calcein AM) i martwych (etydium homodimer-1)</td></tr><tr><td>Faloidyna-FITC</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5282</td><td></td></tr><tr><td>Faloidyna rodamina</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Metakryloiloetylotiokarbamoilorodamina B (MeRho)</td><td>Odczynnik</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23591</td><td></td></tr><tr><td>Albuminy surowicy bydlęcej</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Citrisolv</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-143975</td><td></td></tr><tr><td>Parafina Micro-cut</td><td>Odczynnik</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>24202</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Trizol</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Nylonowe filtry strzykawkowe o rozmiarze porów 0,22 &amp;mu;m</td><td>Sprzęt</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe strzykawki 1 mL</td><td>Sprzęt</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td>Odciąć strzykawki na jednakowej wysokości do naświetlania UV</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z szerokim otworem</td><td>Sprzęt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6800</td><td></td></tr><tr><td>System punktowego utwardzania UV Omnicure z filtrem 365 nm</td><td>Sprzęt</td><td>EXFO</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>Germicydowe źródło światła UV 254 nm</td><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td>Wbudowane w większość komór bezpieczeństwa biologicznego</td></tr></tbody></table>

enkapsulacja komórkowa w trójwymiarowych hydrożelach w inżynierii tkankowej

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

Trójwymiarowa enkapsulacja komórek w hydrożelach stanowi coraz ważniejszą i popularniejszą technikę hodowli komórkowej oraz rozwoju konstruktów do inżynierii tkankowej. Środowisko to, dzięki właściwościom przypominającym tkankę i strukturze 3D, lepiej naśladuje warunki, w jakich komórki znajdują się in vivo, w porównaniu do standardowych hodowli tkankowych. Syntetyczne hydrożele polimerowe to pęczniące w wodzie sieci, które mogą być zaprojektowane tak, aby były stabilne lub ulegały degradacji poprzez hydrolizę lub proteolizę w miarę odkładania nowej tkanki przez enkapsulowane komórki. W tych zastosowaniach zbadano szeroką gamę polimerów, takich jak poli(glikol etylenowy) i kwas hialuronowy. Najczęściej polimer jest funkcjonalizowany grupami reaktywnymi, takimi jak metakrylany lub akrylany, zdolnymi do sieciowania poprzez różne mechanizmy. W ciągu ostatniej dekady poczyniono znaczne postępy w inżynierii tych mikrośrodowisk – np. poprzez fizyczne lub kowalencyjne wprowadzenie sygnałów biochemicznych – w celu poprawy żywotności i kierowania fenotypem komórkowym, w tym różnicowaniem enkapsulowanych komórek macierzystych (Burdick et al.).
Poniższe metody trójwymiarowej enkapsulacji komórek zostały zoptymalizowane w naszym oraz innych laboratoriach w celu maksymalizacji cytokompatybilności i zminimalizowania liczby etapów przetwarzania hydrożelu. W następujących protokołach (ilustracja procedury znajduje się na Rysunku 1) przyjmuje się, że funkcjonalizowane polimery zdolne do sieciowania zostały już przygotowane; doskonałe przeglądy chemii polimerów w zastosowaniu do inżynierii tkankowej można znaleźć w innych publikacjach (Burdick et al.), a opisane metody są kompatybilne z szeroką gamą typów polimerów. Ponadto, omówione tutaj mechanizmy, takie jak addycja typu Michaela (patrz. Lutolf et al.) oraz wolnorodnikowe sieciowanie inicjowane światłem (patrz. Elisseeff et al.), stanowią jedynie niewielką część opisanych technik sieciowania. Sieciowanie mieszane, w którym część grup reaktywnych jest najpierw zużywana w procesie sieciowania addycyjnego, a następnie następuje mechanizm rodnikowy, to kolejny powszechnie stosowany i skuteczny paradygmat służący do kierowania fenotypem enkapsulowanych komórek (Khetan et al., Salinas et al.).

Prezentujemy protokoły trójwymiarowej (3D) enkapsulacji komórek w syntetycznych hydrożelach. Procedura enkapsulacji została opisana dla dwóch powszechnie stosowanych metod sieciowania (addycji typu Michaela oraz mechanizmów wolnorodnikowych inicjowanych światłem), a także dla szeregu technik oceny zachowania enkapsulowanych komórek.

Enkapsulacja komórkowa w trójwymiarowych hydrożelach w inżynierii tkankowej

Trójwymiarowa enkapsulacja komórek w hydrożelach stanowi coraz ważniejszą i popularniejszą technikę hodowli komórek oraz rozwoju...

Krok po kroku proces enkapsulacji komórek rozpoczyna się od przygotowania i sterylizacji form do hydrożelu oraz innych materiałów, a następnie od izolacji komórek do poszczególnych populacji w probówkach dla każdego zestawu żelu. Następnie przeprowadza się żelowanie w obecności komórek, po czym następuje okres inkubacji in vitro lub in vivo. Dalsza analiza zachowania komórek może obejmować testy żywotności, morfologii, proliferacji i różnicowania.Witam, jestem Amidio Kahan z laboratorium dr. Jasona Burdicka w Katedrze Bioinżynierii na Uniwersytecie Pensylwanii. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę enkapsulacji komórek w trójwymiarowych hydrożelach do inżynierii tkankowej. Procedury tej używamy do badania wpływu składu i struktury hydrożelu na zachowanie enkapsulowanych komórek.Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować 0,5% wagowy roztwór fotoinicjatora air cure 2 9 5 9 lub I 2 9 5 9 w PBS. Wymieszać i inkubować przez dwa do trzech dni w ciemności w temperaturze 37 °C.Po przygotowaniu należy użyć filtra strzykawkowego, aby wysterylizować roztwór, a następnie przechowywać go w temperaturze pokojowej. Następnie należy użyć programu arkusza kalkulacyjnego, takiego jak Microsoft Excel, aby obliczyć wykazaną potrzebną ilość polimeru i sieciującego. Oto kwas hialuronowy funkcjonalizowany reaktywnymi grupami akrylowymi.Należy również obliczyć ilość peptydu zawieszonego zawierającego funkcjonalną domenę adhezyjną z aminokwasami cysteiną, argininą, glicyną i asparaginianem. Cysteina służy do przywiązania do polimeru. Po wyznaczeniu wymaganych ilości sieciującego polimeru oraz peptydu, należy je odważyć i umieścić każdy z nich w osobnej probówce typu Eppendorf.Odpowiednio dostosuj arkusz kalkulacyjny. W celu określenia rzeczywistej masy otrzymanego polimeru przejdź do sekcji Przygotowanie form żelowych. Użyj żyletki, aby odciąć końcówki pojedynczo zapakowanych sterylnych.Jednorazowe strzykawki o pojemności 1 ml. Należy upewnić się, że wykonano płaskie cięcie w celu przygotowania form, które będą wykorzystane do przenoszenia wzorów fotograficznych na żele. Na koniec należy wysterylizować formy ze strzykawek, probówki EOR z otwartymi zakrętkami oraz wszelkie inne niezbędne materiały, umieszczając je pod wbudowanym w komorę z laminarnym przepływem powietrza źródłem światła bakteriobójczego przez 30 minut.Po zakończeniu sterylizacji należy przystąpić do przygotowania komórek, po uprzedniej sterylizacji sprzętu eksperymentalnego. Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy dodać sterylny TEA do polimeru stosowanego w sieciowaniu typu mical oraz sterylny PBS do polimeru stosowanego w sieciowaniu wolnorodnikowym. NADAĆ pasujący bufor do probówek z grupami bocznymi i wymieszać w wibratorze Vortex.Aby rozpuścić grupę boczną, należy związać ją z alkilowanym kwasem hialuronowym za pomocą grupy tiolowej z grupy INE w peptydzie, co pozwoli przyłączyć grupę boczną do polimeru; należy dodać ją do roztworu polimeru i szczelnie zamknąć. Następnie krótko wymieszać w wstrząsarze wortexowym i inkubować w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu. W czasie, gdy grupa boczna jest przyłączana, należy przygotować komórki do enkapsulacji – mogą to być ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSCs) – poprzez przemycie ich PBS.Następnie inkubować z trypsyną przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, usunąć trypsynę i inkubować przez kolejne pięć minut w 37°C. Następnie dodać pożywkę do wzrostu HMSC, aby zneutralizować trypsynę i odczepić komórki z powierzchni płytki. Policzyć komórki za pomocą hematocytometru.Rozdziel policzone komórki na porcje zawierające odpowiednią liczbę dla każdego zestawu żeli. Dla zestawu trzech żeli o objętości 50 µL przy gęstości 10 milionów komórek na mL, odseparuj 1,5 miliona komórek do oddzielnej probówki stożkowej. Nie przygotowuj więcej niż czterech żeli w jednym zestawie ze względu na czas trwania procesu.Następnie odwiruj komórki z prędkością 500 RCF przez sześć minut. W temperaturze pokojowej, podczas wirowania komórek, przygotuj mieszaninę polimeryzacyjną do sieciowania metodą mical edition. Dodaj bufor do sieciującego, aby uzyskać odpowiednie stężenie.W celu przeprowadzenia fotopolimeryzacji rodnikowej dodaj wcześniej przygotowany roztwór I 2 9 5 9 do roztworu polimeru. Dodaj go w ilości stanowiącej 10% całkowitej objętości żelu, aby uzyskać końcowe stężenie inicjatora na poziomie 0,05% masy. W ten sposób komórki oraz mieszanina polimeryzacyjna są gotowe do enkapsulacji w hydrożelu.Zacznij od odessania naddatku z wirowanych komórek. Odczekaj, aż ciecz opadnie po wstępnym odessaniu, a następnie odessaj ponownie, aby usunąć jak największą ilość pożywki, nie naruszając osadu komórkowego. Resuspenduj osad komórkowy w roztworze polimeru, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza.Powoli pipetuj roztwór w górę i w dół około 10 razy, co powinno wystarczyć do równomiernego rozprzestrzenienia komórek. W przypadku reakcji addycji typu mical, użyj końcówki do pipety z szerokim otworem, aby dodać odpowiednią objętość roztworu sieciującego do komórki polimerowej. Wymieszaj. Ustaw pipetę na pożądaną objętość pojedynczego żelu.Pipetuj roztwór w górę i w dół w celu homogenizacji, a następnie wprowadź go do form w końcówkach strzykawkowych. Wykonaj ten krok szybko, aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek, i inkubuj przez 10 do 30 minut w komorze laminarnej w celu sieciowania. W przypadku sieciowania rodnikowego inicjowanego światłem.Przenieś odpowiednią objętość do form w postaci końcówek strzykawki. Naświetlaj strzykawki światłem UV w celu sieciowania rodnikowego przez 10 minut przy długości fali 365 nanometrów. Dla polimerów funkcjonalizowanych ACRL powszechnie stosuje się światło UV o natężeniu 4 miliwatów na centymetr kwadratowy.Należy wykonać ten krok szybko, aby zminimalizować osiadanie komórek przed ekspozycją na światło UV. Po sieciowaniu należy zanurzyć żele w dołkach płytki do hodowli tkankowej zawierających pożywkę do inkubacji i analizy. Sieciowanie hydrożelu można również przeprowadzać sekwencyjnie.Najpierw dodaj funkcjonalizowany barwnik, metylowaną ruminę, do stężenia końcowego 20 nanomolar w żelu. Barwnik pomaga w wizualizacji wzoru, ponieważ wbudowuje się preferencyjnie w obszary żelu o radykalnym sieciowaniu. Następnie rozpocznij reakcję polimeryzacji typu mic, która daje ułamek teoretycznych wiązań sieciujących dla następujących etapów.W przypadku sieciowania rodnikowego należy użyć maski zaprojektowanej w programie takim jak Adobe Photoshop lub Illustrator i wydrukowanej bezpośrednio na folii transparentnej. Wymiary maski muszą być dopasowane do okrągłej górnej części strzykawki. Za pomocą wysterylizowanej pęsety należy nałożyć sterylną maskę bezpośrednio na powierzchnię żelu, a następnie naświetlić go w celu przeprowadzenia sieciowania żelu.Poniżej przedstawiono HMC w hydrożelach na bazie HA godzinę po enkapsulacji. Ponieważ syntetyzowane hydrożele są zazwyczaj przezroczyste, morfologię komórek można wizualizować za pomocą mikroskopii świetlnej. Te same komórki poddano ocenie żywotności 24 godziny po enkapsulacji, wykorzystując fluorescencyjny zestaw do barwienia komórek żywych i martwych.Do detekcji żywych komórek wykorzystaliśmy calcium M, a do martwych komórek atherium homodimer, obserwując żywotność przekraczającą 95%. Użyliśmy również testu alamar blue w celu określenia poziomu proliferacji komórek, mierzonego na podstawie stopnia metabolizowania odczynnika testowego przez komórki, co skutkuje zmianą barwy. Barwienie komórek przeprowadzono na H HMCs siedem dni po enkapsulacji w degradowalnym i adhezyjnym hydrożelu na bazie HA, stosując standardowe procedury fiksacji i permeabilizacji.Aktyna komórkowa jest widoczna przy użyciu phalloidyny znakowanej fluoresceiną, a jądra komórkowe wybarwiono DAPI. Immunobarwienie przeciwko kulinie stosuje się do wizualizacji adhezji ogniskowych w obrębie macierzy hydrożelowej. Barwienie histologiczne wykonuje się po odwodnieniu, zatopieniu w parafinie i cięciu hydrożeli zgodnie ze standardowymi protokołami w przypadku polimeryzowanych radykalnie hydrożeli HA zawierających enkapsulowane HMSC.Po jednym tygodniu hodowli wykonano barwienie hematoksyliną w celu zaznaczenia jąder komórkowych oraz ASIN w celu zaznaczenia tkanki łącznej A, a barwniki niebieskie zastosowano do wybarwienia glikozaminoglikanów. Do ilościowego oznaczenia różnicowania enkapsulowanych komórek macierzystych wykorzystano Realtime PCR. Po odjęciu tła poziom ekspresji badanego genu określa się na podstawie liczby cykli, w których osiągnięto próg fluorescencji, w porównaniu z pasywnym sygnałem referencyjnym, którym jest konstytutywnie aktywny gen housekeepingowy. W ten sposób zaprezentowaliśmy metodę enkapsulacji komórek w hydrożelach 3D oraz badanie zachowania komórek w żelach.Podczas stosowania tych procedur ważne jest zapewnienie pełnej sterylności materiałów, zarówno poprzez długoterminowe przechowywanie sterylnych roztworów buforowych i odczynników, jak i sterylizację za pomocą bakteriobójczej lampy UV. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

cellular-encapsulation-in-3d-hydrogels-for-tissue-engineering

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Enkapsulacja komórkowa w 3D hydrożelach do inżynierii tkankowej

Opisujemy izolację kardiomiocytów noworodkowych oraz przygotowanie komórek do enkapsulacji w konstrukcjach z hydrożelu fibrynowego na potrzeby inżynierii tkankowej. Przedstawiamy metody analizy zmodyfikowanego w sposób tkankowo-inżynieryjny mięśnia sercowego po okresie hodowli, w tym pomiar aktywnej siły generowanej podczas stymulacji elektrycznej, ocenę żywotności komórek oraz barwienie immunohistologiczne.

Enkapsulacja kardiomiocytów w hydrożelu fibrynowym w inżynierii tkanki serca

Ten film demonstruje technikę immunologicznego barwienia komórek zamkniętych w hydrożelu 3D. Kultura hydrożelowa zawierająca nerwowe komórki progenitorowe jest utrwalana, przepuszczalna i traktowana roztworem blokującym, aby zapobiec nieswoistemu barwieniu immunologicznemu. Dodaje się koktajl przeciwciał pierwszorzędowych w celu związania określonych białek, a następnie znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe i barwienie jądrowe. Próbka jest następnie umieszczana na szkiełku...

Barwienie immunologiczne komórek zamkniętych w układzie hydrożelowym 3D

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

A kartezjańska biodrukarka została zaprojektowana i wyprodukowana, aby umożliwić osadzanie wielu materiałów w precyzyjnych, powtarzalnych geometriach, jednocześnie umożliwiając kontrolę czynników środowiskowych. Korzystając z trójwymiarowej biodrukarki, można drukować i łatwo odtwarzać złożone i żywotne konstrukcje.

Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami

Opisujemy wytwarzanie arkuszy hydrożelowych z mikrowzorzystymi elementami za pomocą prostego procesu, który może być składany i manipulowany w formie wolnostojącej. Korzystając z tych modułowych arkuszy hydrożelowych, można wygenerować prosty system hodowli komórkowych 3D w skali makro z kontrolowanym mikrośrodowiskiem komórkowym.

Budowa modułowych arkuszy hydrożelowych dla mikrowzorzystej architektury komórkowej 3D w skali makro

To jest metoda tworzenia trójwymiarowego rusztowania do hodowli komórkowych z zewnątrzkomórkowej macierzy płucnej. Nienaruszone płuca są przetwarzane na hydrożele, które mogą wspierać wzrost komórek w trzech wymiarach.

Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D

Różne metody manipulowania trójwymiarową architekturą w hydrożelach na bazie białek są tutaj oceniane pod kątem właściwości materiałów. Sieci makroporowate są funkcjonalizowane peptydem adhezyjnym, a ich wykonalność w hodowli komórkowej jest oceniana przy użyciu dwóch różnych modelowych linii komórkowych.

Łatwa manipulacja architekturą w hydrożelach na bazie białek do zastosowań w hodowlach komórkowych

Ten protokół opisuje wytwarzanie elastycznych makroporowatych mikrokriożeli 3D poprzez integrację mikrofabrykacji z technologią kriożelacji. Po załadowaniu komórkami generowane są mikrotkanki 3D, które można łatwo wstrzyknąć in vivo w celu ułatwienia terapii regeneracyjnej lub złożyć w matryce do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków in vitro.

Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

Tutaj opisujemy łatwe przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu przy użyciu dynamicznej chemii iminowej. Przedstawiono metody regulacji wytrzymałości mechanicznej hydrożelu i jego zastosowania w hodowli komórkowej 3D.

Przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu i jego zastosowanie w hodowli komórkowej 3D

Rekombinowane hydrożele modyfikowane białkami są korzystne dla hodowli komórkowych 3D, ponieważ pozwalają na pełne dostrojenie szkieletu polimerowego, a tym samym mikrośrodowiska komórki. W tym miejscu opisujemy proces oczyszczania rekombinowanego białka podobnego do elastyny i jego zastosowanie w enkapsulacji komórek hydrożelowych 3D.

Produkcja elastynopodobnych hydrożeli białkowych do enkapsulacji i barwienia immunologicznego komórek w 3D

Tutaj prezentujemy protokół demonstrujący użycie hydrożelu jako trójwymiarowego (3D) szkieletu hodowli komórek do hodowli komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) i wprowadzający fotobiomodulację (PBM) w celu zwiększenia proliferacji ADSC w warunkach hodowli 3D.

Trójwymiarowa hodowla komórkowa komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w hydrożelu z augmentacją fotobiomodulacyjną

Poznaj metody enkapsulacji komórek w syntetycznych hydrożelach 3D dla inżynierii tkankowej. Protokoły obejmują różne techniki usieciowania i analizę zachowania komórek w biomateriałach.

Enkapsulacja komórkowa w trójwymiarowych hydrożelach w inżynierii tkankowej

Przeglądaj więcej filmów