Nieinwazyjne in vivo MRI i MRS małych zwierząt: Podstawowe procedury eksperymentalne

Aby rozpocząć ten eksperyment, znieczuloną mysz umieszcza się na uchwycie dla zwierząt, który następnie wprowadza się do cewki częstotliwości radiowej (RF). Przed rozpoczęciem badania MRI lub MRS cewkę RF dostraja się do częstotliwości rezonansowej i dopasowuje do charakterystycznej impedancji 50 ohm. Następnie, po optymalizacji sekwencji impulsów, przeprowadza się akwizycję MRI lub MRS, a na koniec analizuje się obrazy lub widma przy użyciu programów analitycznych.

Cześć, jestem Dawn Lee z R Research Lab w Departamencie Radiologii na Uniwersytecie Waszyngtońskim. A ja jestem David Senek, również z R Research Lab oraz z departamentów radiologii i bioinżynierii na Uniwersytecie Waszyngtońskim. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę obrazowania metodą rezonansu magnetycznego oraz spektroskopię rezonansu magnetycznego u myszy.

W naszym laboratorium stosujemy te procedury do badania modeli nowotworowych u myszy, dystrofii mięśniowej oraz metabolizmu mięśni. Zatem zacznijmy. Niniejszy protokół nie ma na celu omówienia każdego aspektu obrazowania MRI u małych zwierząt, lecz wprowadzenie do podstawowych procedur przeprowadzania eksperymentów MRI na myszach.

Celem jest zapewnienie lepszego zrozumienia podstawowych procedur przeprowadzania eksperymentów MR in vivo na małych zwierzętach, aby badacze rozpoczynający pracę w dziedzinie MR mogli lepiej zaplanować komponenty swoich badań niezwiązane z MR. W efekcie procedury MR i procedury niezwiązane z MR będą mogły zostać płynnie zintegrowane. Aby rozpocząć przygotowania do eksperymentu obrazowania rezonansu magnetycznego lub MRI, umieść mysz znieczuloną izofluranem w uchwycie dla zwierząt, wkładając jej nos do stożka nosowego.

Do obrazowania głowy można użyć stabilizatora głowy, a do obrazowania ciała – stabilizatora ciała. Należy utrzymać wilgotność oczu zwierzęcia, stosując sterylną maść nawilżającą do oczu.

Zwierzę powinno być utrzymywane w temperaturze od 35 do 37 °C podczas eksperymentu w systemie cyrkulacji ciepłej wody. System monitorowania zwierząt jest wykorzystywany zarówno do monitorowania temperatury ciała, oddychania i cyklu serca, jak i do synchronizacji bramkowania oddechowego i kardiologicznego z akwizycją obrazów. Następnie należy umieścić standardową próbkę agarową obok zwierzęcia w celu monitorowania nagłych zmian sygnału.

Ta standardowa próbka rolnicza jest szczególnie użyteczna w obrazowaniu wielowarstwowym i wielopunktowym czasowo. W przypadku wykrycia nieoczekiwianej zmiany sygnału w warstwie z pozyskanych obrazów, można ją wyeliminować. Po unieruchomieniu zwierzęcia i zainstalowaniu wszystkich komponentów monitorujących, należy umieścić uchwyt do zwierzęcia w centrum cewki częstotliwości radiowej (RF).

Przenieś cewkę RF do pomieszczenia z magnesem i umieść ją w systemie cyrkulacji ciepłej wody znajdującym się wewnątrz magnesu. Następnie rozpocznij akwizycję danych MRI. Podczas obrazowania ustaw przepływomierz na wartość od 0,4 do 0,8 mililitrów na minutę i zmniejsz stężenie w parowniku izofluranu do poziomu 1,2–1,5%. Gaz wydychany z maski nosowej myszy jest odprowadzany do wewnętrznego systemu próżniowego.

Aby zoptymalizować odbiór sygnału, nastroić cewkę RF do częstotliwości rezonansowej protonu H1 i dopasować impedancję charakterystyczną cewki do 50 ohm. Korzystając z panelu strojenia w skanerze MR, większość skanerów MRI dla ludzi nie wymaga oddzielnego procesu dopasowania, z wyjątkiem procedur MRS. Rozpocząć shimming, korzystając z pojedynczej sekwencji impulsów.

Proces shimowania optymalizuje jednorodność pola magnetycznego w obszarze zainteresowania. Każdy skaner posiada własną metodę przeprowadzania procesu shimowania, w tym automatyczne procesy szybkiego shimowania, takie jak fast map oraz shimowanie gradientowe. Po zakończeniu shimowania należy zoptymalizować impuls RF.

Poprzez maksymalizację jednowymiarowego profilu obrazu. Moce impulsów RF mogą być szeregowane przy zachowaniu stałej długości impulsu i utrzymaniu wystarczająco długiego czasu przerwy między powtórzeniami. TR powinno wynosić około od trzech do pięciu razy T1 tkanki; należy pozyskać obrazy orientacyjne w trzech ortogonalnych płaszczyznach, aby utworzyć obrazy osiowe, czołowe i strzałkowe.

Do pozyskiwania obrazów lokalizacyjnych można zastosować szybką sekwencję akwizycji obrazu. Pozyskane obrazy posłużą do zaplanowania właściwego obrazowania wraz z wyznaczeniem płaszczyzn obrazowania. Podczas właściwego obrazowania stosowana jest sekwencja spin-echo.

Pomiary T można przeprowadzić, stosując obrazowanie wieloechowe lub obrazowanie jednoechowe z wieloma wartościami T. Aby zakończyć eksperyment MRI, przyjrzyjmy się spektroskopii rezonansu magnetycznego in vivo (MRS) mięśni szkieletowych kończyny tylnej myszy, w celu oceny spoczynkowej i maksymalnej wydajności mitochondriów. Produkcja ATP może zostać określona za pomocą MRS poprzez pomiar zmian poziomu fosfokreatyny podczas niedokrwienia oraz bezpośrednio po jego ustąpieniu.

Rozpocznij od wykonania mankietu do indukowania odwracalnego niedokrwienia. Wykorzystaj odcinek rury PVC o szerokości około 5-7 mm i średnicy wewnętrznej od 12 do 15 mm. Wywierć mały otwór w ściance, a następnie wytnij fragment balonu tak, aby był on otwarty z obu stron.

Najlepiej sprawdzają się balony jakości helowej. Wsuń ten element przez fragment PVC i owiń go z powrotem. Przymocuj końce do siebie taśmą na zewnętrznej ściance elementu PVC.

Następnie użyj koszulki termokurczliwej, aby uszczelnić końce balonu wokół rurki. Powstanie mankiet z litej ścianą zewnętrzną i nadmuchiwaną ścianą wewnętrzną. Wytnij fragment koszulki termokurczliwej i balonu wokół otworu z gwintem.

Dbając o to, aby pomiędzy otworem a krawędzią elementu z PVC pozostało wystarczająco dużo materiału, wprowadź 1,5 centymetra kawałka metalu niemagnetycznego do otworu w PVC. Pozwoli to na napompowanie mankietu. Uszczelnij ten obszar epoksydową żywicą pięciominutową.

Następnie przymocuj mankiet obok cewki RF w sondzie MRS i podłącz go do zewnętrznego manometru sygnałowego. Teraz umieść znieczuloną mysz w sondzie MRS, kładąc ją na plecach na podkładce dla myszy.

Umieść wypełniony płynem balon na brzusznej stronie myszy i przymocuj go za pomocą pasów stabilizujących mysz. Włóż mysz wraz z podparciem ciała do cewki MRS. Przeciągnij jedną tylną kończynę przez mankiet niedokrwienny i cewkę MRS.

Kończynę należy umieścić w cewce tak, aby była ona jak najbardziej wycentrowana. Taki układ pozwala na poziome ułożenie ciała zwierzęcia. W magnesie z pionowym otworem należy umieścić korpus sondy, a następnie przeprowadzić strojenie, dopasowanie i shimowanie w celu optymalizacji stosunku sygnału do szumu w MRS, zgodnie z opisem dla MRI, z wyjątkiem tego, że w MRS impuls RF jest optymalizowany poprzez maksymalizację amplitudy widma.

Następnie należy zastosować P 31 MRS w celu zarejestrowania widm o wysokim stosunku sygnału do szumu w stanie pełnego rozluźnienia lub FRS do oznaczenia stosunków fosforanu nieorganicznego i fosfokreatyny do TP w warunkach pełnego rozluźnienia. Aby przeprowadzić eksperyment niedokrwienny, należy najpierw zarejestrować widma spoczynkowe przez około pięć minut. Następnie należy wywołać niedokrwienie poprzez napompowanie mankietu do poziomu od 270 do 300 mmHg na 10 do 12 minut.

Zwolnij mankiet i zbierz widma regeneracji przez pięć minut. Eksperymenty można powtórzyć w kolejnych dniach. Teraz przedstawimy reprezentatywne wyniki MRI i MRS in vivo.

Mysz naga posiada ksenoprzeszczep guza mózgu D 2 82 na grzbiecie i została poddana obrazowaniu z wykorzystaniem konwencjonalnej sekwencji spin-echo z różnymi efektami relaksacji. Na obrazie zależnym od T1 guz wykazuje intensywność zbliżoną do intensywności sąsiadującej tkanki. Natomiast na odpowiadającym mu obrazie T2 guz jest wyraźnie widoczny jako obszar hiperintensywny.

Akwizycja wieloechowa umożliwia obliczenie mapy T2 zawierającej ilościowe informacje o zmienności T2 w organizmie zwierzęcia. Regionalne zmiany T2 w obszarze guza mogą być monitorowane wzdłużnie na obrazie nałożonym. Przedstawiono tutaj w pełni zrelaksowane widmo P 31 MRS z tylnej kończyny myszy.

To widmo reprezentuje 16 zsumowanych FID. Kolejność pików od lewej do prawej odpowiada następującym metabolitom mięśniowym: fosforanowi nieorganicznemu pi, fosfokreatynie, PCr oraz fosforanom ATP gamma, alpha i beta. Widma 31P MRS zebrane podczas dynamicznego eksperymentu niedokrwienia i reperfuzji pokazują, że podczas niedokrwienia poziom PCr spada, a poziom Pi rośnie. Tempo spadku PCr podczas niedokrwienia jest równe spoczynkowej produkcji mitochondrialnej ATP.

Odzyskiwanie PCR po niedokrwieniu może być wykorzystane do obliczenia maksymalnej produkcji ATP mitochondrialnego. Przedstawiliśmy sposób pozyskiwania obrazów myszy in vivo oraz pomiaru metabolizmu mięśni myszy in vivo z wykorzystaniem spektroskopii rezonansu magnetycznego i obrazowania rezonansu magnetycznego. Do badań MRS zbudowaliśmy specjalistyczną cewkę RF, która umożliwia utrzymanie ciała myszy w pozycji poziomej w magnesie z pionowym otworem.

W związku z tym eksperymenty te można przeprowadzić w dowolnym pionowym systemie z szerokim otworem. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zapewnieniu optymalnych warunków, takich jak lepsze strojenie i dopasowanie cewki RF oraz poprawa jednorodności pola magnetycznego. Ważne jest również monitorowanie stanu zwierzęcia za pomocą systemu monitorowania, aby utrzymać stabilny stan fizjologiczny organizmu i zapobiec wystąpieniu potencjalnych pomiarów artefaktowych.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.