Name: Monitorowanie czynności serca u larw Drosophila melanogaster do badań fizjologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-16T17:02:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Poznaj metody monitorowania czynności serca u larw Drosophila melanogaster w preparatach całych i rozciętych. Techniki obejmują rejestrację potencjałów zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych oraz badanie funkcji kanałów jonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zapewnione przez stypendia G. Ribble Fellowships w Departamencie Biologii oraz Biuro Edukacji Młodych Badaczy i Studentów – eUreKa! (Univ. of KY).

<ol><li>Ashton, K., Wagoner, A. P., Carrillo, R., Gibson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+for+the+monoamine-related+traits+heart+rate+and+headless+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci for the monoamine-related traits heart rate and headless behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 157, 283-294 (2001).</li>
<li>Azpiazu, N., Frasch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinman+and+Bagpipe%3A+Two+homeo+box+genes+that+determine+cell+fates+in+the+dorsal+mesoderm+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Tinman and Bagpipe: Two homeo box genes that determine cell fates in the dorsal mesoderm of Drosophila.</a> Genes & Development. 7, 1325-1340 (1993).</li>
<li>Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiological+and+behavioral+effects+of+carbon+dioxide+on+Drosophila+melanogaster+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+A+Mol+Integr+Physiol%22%5BJournal%5D)">The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 140, 363-376 (2005).</li>
<li>Baker, J. D., McNabb, S. L., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hormonal+coordination+of+behavior+and+physiology+at+adult+ecdysis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The hormonal coordination of behavior and physiology at adult ecdysis in Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 202, 3037-3048 (1999).</li>
<li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+an+emerging+model+for+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342, 1-11 (2004).</li>
<li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+tinman+is+required+for+specification+of+the+heart+and+visceral+muscles+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila.</a> Development. 118, 719-729 (1993).</li>
<li>Bodmer, R., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+homeobox-containing+gene%2C+msh-2%2C+is+transiently+expressed+early+during+mesoderm+formation+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A new homeobox-containing gene, msh-2, is transiently expressed early during mesoderm formation of Drosophila.</a> Development. 110, 661-669 (1990).</li>
<li>Cooper, A. S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+activity+of+Drosophila+larvae%3A+Impedance+%26+video+microscopy+measures%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Information+Service%22%5BJournal%5D)">Monitoring activity of Drosophila larvae: Impedance & video microscopy measures.</a> Drosophila Information Service. 87, 85-87 (2004).</li>
<li>Dasari, S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+influence+of+serotonin+on+the+larval+heart+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+B%22%5BJournal%5D)">Direct influence of serotonin on the larval heart of Drosophila melanogaster.</a> J. Comp. Physiol. B. 176, 349-357 (2006).</li>
<li>Dasari, S., Viele, K., Turner, A. C., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+p-CPA+and+MDMA+on+physiology%2C+development+and+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22European+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Influence of p-CPA and MDMA on physiology, development and behavior in Drosophila melanogaster.</a> European J. Neurosci. 26, 424-438 (2007).</li>
<li>Dowse, H., Ringo, J., Power, J., Johnson, E., Kinney, K., White, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+congenital+heart+defect+in+Drosophila+caused+by+an+action-potential+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A congenital heart defect in Drosophila caused by an action-potential mutation.</a> J. Neurogenetics. 10, 153-168 (1995).</li>
<li>Dulcis, D., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+innervation+of+the+heart+initiates+retrograde+contractions+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster.</a> J. Neurosci. 25, 271-280 (2005).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J. Neurogenetics. 18, 377-402 (2004).</li>
<li>Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+ion+channel+dysfunction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of ion channel dysfunction in Drosophila.</a> Kidney International. 3, 766-771 (2000).</li>
<li>GG, G. u <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+analysis+of+heartbeat+in%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila.+J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological analysis of heartbeat in.</a> Drosophila. J. Neurobiol. 28, 269-280 (1995).</li>
<li>He, B., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+in+the+development+of+the+Drosophila+arista%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms in the development of the Drosophila arista.</a> Mechanisms of Development. 104, 69-78 (2001).</li>
<li>Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Drosophila+heartbeat+by+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+B%22%5BJournal%5D)">Modulation of Drosophila heartbeat by neurotransmitters.</a> J. Comp. Physiol. B. 167, 89-97 (1997).</li>
<li>Johnson, E., Ringo, J., Bray, N., Dowse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+pharmacological+identification+of+ion+channels+central+to+the+Drosophila+cardiac+pacemaker%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Genetic and pharmacological identification of ion channels central to the Drosophila cardiac pacemaker.</a> J. Neurogenetics. 12, 1-24 (1998).</li>
<li>Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+and+heterologous+neuropeptides+are+cardioactive+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Native and heterologous neuropeptides are cardioactive in Drosophila melanogaster.</a> J. Insect Physiol. 1, 1229-1236 (2000).</li>
<li>Johnson, E., Sherry, T., Ringo, J., Dowse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+cardiac+pacemaker+of+Drosophila%3A+cellular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+B%2C+Biochem.%2C+Systemic%2C+Environmental+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of the cardiac pacemaker of Drosophila: cellular mechanisms.</a> J. Comp. Physiol. B, Biochem., Systemic, Environmental Physiol. 172, 227-236 (2002).</li>
<li>Lewis, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+standard+food+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Inform.+Serv%22%5BJournal%5D)">A new standard food medium.</a> Drosophila Inform. Serv. 34, 117-117 (1960).</li>
<li>Miller, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+circulation+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22General+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Control of circulation in insects.</a> General Pharmacol. 29, 23-38 (1997).</li>
<li>Molina, M. R., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ostia%2C+the+inflow+tracts+of+the+Drosophila+heart%2C+develop+from+a+genetically+distinct+subset+of+cardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells.</a> Mechanisms of Development. 118, 51-59 (2001).</li>
<li>Muller, K. J., Nicholls, J. G., Stent, G. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMuller%2C+KJ+%22Neurobiology+of+the+Leech%22">Neurobiology of the Leech</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. 254-254 (1981).</li>
<li>Nichols, R., Kaminski, S., Walling, E., Zornik, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+the+activity+of+a+cardioacceleratory+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Regulating the activity of a cardioacceleratory peptide.</a> Peptides. 20, 1153-1158 (1999).</li>
<li>Ocorr, K., Akasaka, T., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+cardiac+disease+model+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Age-related cardiac disease model of Drosophila.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 128, 112-116 (2007a).</li>
<li>Ocorr, K. A., Crawley, T., Gibson, G., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+for+cardiac+dysfunction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genetic variation for cardiac dysfunction in Drosophila.</a> PLoS ONE. 2, e601-e601 (2007).</li>
<li>Papaefthmiou, C., Theophilidis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+method+for+recording+the+electrical+activity+of+the+isolated+heart+of+the+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biol.+Animal%22%5BJournal%5D)">An in vitro method for recording the electrical activity of the isolated heart of the adult Drosophila melanogaster.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biol. Animal. 37, 445-449 (2001).</li>
<li>Peron, S., Zordan, M. A., Magnabosco, A., Reggiani, C., Megighian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+action+potential+to+contraction%3A+Neural+control+and+excitation-contraction+coupling+in+larval+muscles+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.Physiol.+A%3A+Molecular+%26+Integrative+Physiol%22%5BJournal%5D)">From action potential to contraction: Neural control and excitation-contraction coupling in larval muscles of Drosophila.</a> Comp. Biochem.Physiol. A: Molecular & Integrative Physiol. 154, 173-183 (2009).</li>
<li>Ponzielli, R., Astier, M., Chartier, A., Gallet, A., Therond, P., Semeriva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+tube+patterning+in+Drosophila+requires+integration+of+axial+and+segmental+information+provided+by+the+Bithorax+Complex+genes+and+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Develop%22%5BJournal%5D)">Heart tube patterning in Drosophila requires integration of axial and segmental information provided by the Bithorax Complex genes and hedgehog signaling.</a> Develop. 129, 4509-4521 (2002).</li>
<li>Sl ma, K., Farkas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heartbeat+patterns+during+the+postembryonic+development+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heartbeat patterns during the postembryonic development of Drosophila melanogaster.</a> J. Insect Physiol. 51, 489-503 (2005).</li>
<li>St hmer, W., Roberts, W. S., Almers, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSt+hmer%2C+W+%22Single+channel+recordings%22">Single channel recordings</a>. Sakmann, B., Neher, E. The loose patch clamp, Plenum Press. New York. 123-132 (1983).</li>
<li>Wessells, R. J., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+assays+for+heart+function+mutants+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Screening assays for heart function mutants in Drosophila.</a> Biotechniques. 37, 58-66 (2004).</li>
<li>Zornik, E., Paisley, K., Nichols, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+transmitters+and+a+peptide+modulate+Drosophila+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Neural transmitters and a peptide modulate Drosophila heart rate.</a> Peptides. 20, 45-51 (1999).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;Narzędzia do sekcji: Precyzyjne pęsety nr 5 i precyzyjne nożyczki (wszystkie zakupione w Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Mikroskop sekcyjny z funkcją zoom do sekcji i pomiaru tętna. Jest on również niezbędny do ogniskowej stymulacji serca.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Do rejestracji zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej stosuje się mikroskop złożony z obiektywami pionowymi (4x i 20X).&lt;br/&gt;Standardowy wzmacniacz wewnątrzkomórkowy i karta A/D do rejestracji online w komputerze. Sygnały elektryczne są rejestrowane online za pomocą &lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/pl3504#overview&quot; target=&quot;_blank">interfejsu PowerLab/4s&lt;/a&gt; (ADInstruments, Australia). Stosujemy standardowe &lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/&quot; target=&quot;_blank">oprogramowanie firmy ADInstruments o nazwie Chart lub Scope&lt;/a&gt;.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Odczynniki chemiczne: Wszystkie odczynniki do roztworów soli fizjologicznych pochodzą z firmy chemicznej Sigma (St. Louis, MO).&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Do rejestracji wewnątrzkomórkowej stosujemy szklane rurki kapilarne (nr katalogowy 30-31-0 z FHC, Brunswick, ME, 04011, USA), a do ogniskowej rejestracji macropatch oraz jako elektrody stymulujące stosujemy Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0,8-1,1 mm, długość 100 mm. Elektroda wewnątrzkomórkowa powinna mieć rezystancję od 20 do 30 mOhm. Elektrodę macropatch wykonuje się poprzez odłamanie końcówki szkła po uformowaniu cienkiego wierzchołka za pomocą wyciągarki do elektrod. Odłamana końcówka musi stanowić czyste, prostopadłe pęknięcie o średnicy około 20&amp;mu;M. Następnie końcówkę poleruje się termicznie do średnicy wewnętrznej około 10&amp;mu;M w celu ogniskowej rejestracji zewnątrzkomórkowej. W przypadku elektrody stymulującej do pobudzania serca stosujemy końcówkę o średnicy około 20-50 &amp;mu;M. Trzon elektrody przesuwa się nad elementem grzejnym, aby wygiąć go łagodnie pod kątem około 45 stopni. Powoduje to uzyskanie płaskiego lub prostopadłego światła elektrody nad rurką serca, ponieważ kąt ustawienia mikromanipulatora stworzy kolejne około 45 stopni względem preparatu.&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

monitorowanie funkcji serca u larw drosophila melanogaster w badaniach fizjologicznych

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Prezentujemy różne metody rejestracji funkcji serca u larwDrosophilaPodejścia te pozwalają na pomiar tętna u nieunieruchomionych i unieruchomionych larw w całości. W celu bezpośredniej kontroli środowiska wokół serca inne podejście wykorzystuje rozcierane larwy i usunięcie organów wewnętrznych, aby móc kąpać serce w wybranych związkach. Odsłonięte serce pozwala również na monitorowanie potencjałów błonowych, co może dostarczyć informacji o prądach jonowych generowanych przez miocyty oraz o przewodnictwie elektrycznym wzdłuż rurki serca. Omówiono różnorodne zalety i wady tych podejść w kontekście przyszłych eksperymentów. Preparat serca larwalnego stanowi dodatkowy model obokDrosophilaszkieletowe NMJ w celu zbadania roli wewnątrzkomórkowej regulacji wapnia w funkcji komórkowej. Dzięki pogłębieniu wiedzy na temat podstawowych prądów jonowych kształtujących potencjały czynnościowe w miocytach różnych gatunków, można dążyć do zrozumienia znanych dysfunkcji jonowych związanych z konkretnymi genami odpowiedzialnymi za różne choroby u ssaków.

Przedstawiamy różne metody monitorowania funkcji serca u larw Drosophila w celu analizy kwestii dotyczących funkcji złączy szczelinowych, mutacji kanałów jonowych, modulacji aktywności rozrusznika oraz w badaniach farmakologicznych.

Monitorowanie funkcji serca u larw Drosophila melanogaster w badaniach fizjologicznych

Prezentujemy różne metody rejestracji funkcji serca u larw Drosophila. Podejścia te pozwalają na pomiar częstotliwości akcji serca u osobników nieunieruchomionych oraz...

Muszki *Drosophila* są genetycznie atrakcyjnym modelem do badań nad rozwojem i funkcją serca oraz leżącą u podstawy jego pracy aktywności rozrusznika. Niniejsza procedura przedstawia sposób przygotowania larw w stanie nienaruszonym oraz po sekcji, a także metodę monitorowania częstości akcji serca. Preparat po sekcji umożliwia również rejestrację potencjałów zewnątrzkomórkowych lub wewnątrzkomórkowych w celu dalszej analizy funkcji kanałów jonowych.Witajcie, jestem Robin Cooper, pracownikiem naukowym w Katedrze Biologii na Uniwersytecie Kentucky. Dzisiaj moi studenci, Ann Cooper, Kyla Ryman, Matt Ward i Easter Boku, zaprezentują Państwu różne procedury monitorowania częstotliwości uderzeń serca u larw Drosophila. Poniższa metoda bez ograniczeń ruchu nazywana jest metodą „farmy mrówek”, ponieważ larwy są obserwowane w jednej płaszczyźnie ogniskowania.Aby uzyskać najlepszą wizualizację larw, należy użyć mikroskopu stereoskopowego z obiektywem bazowym 2x i okularem 0,5x, co zapewni optymalną rozdzielczość przestrzenną i powiększenie w obszarze prostokąta o wymiarach 1 cm na 0,5 cm. Fotografie i filmy można rejestrować za pomocą kamery zamontowanej na okularze. Aby rozpocząć tę procedurę, należy umieścić larwę wraz z cienką warstwą pożywienia pomiędzy dwoma szkiełkami przedmiotowymi.Preparaty są rozdzielone dystansem od 1 do 1,5 milimetra za pomocą plastikowych przekładek z czterech stron. Przechyl preparat pod kątem od 20 do 45 stopni na kilka minut, aby zachęcić larwę do utrzymywania głowy skierowanej w dół. Wyreguluj lustro mikroskopu, aby uzyskać najlepszy kontrast serca lub dwóch tchawic, w celu obserwacji bicia serca.Metoda klejenia to sposób trwałego mocowania służący do unieruchomienia larw na szkiełku przedmiotowym. Aby rozpocząć procedurę, należy położyć czyste szkiełko nakrywkowe na szkiełku przedmiotowym. Na jeden z narożników szkiełka nakrywkowego należy nanieść małą kroplę superglue.Następnie opłucz larwy wodą. Aby usunąć nadmiar pokarmu, wchłoń ciecz za pomocą chusteczki lub rogu ręcznika papierowego. Po dokładnym opłukaniu larwy, ostrożnie chwyć ją czystą pęsetą i umieść na szkiełku w odległości od szkiełka nakrywkowego pod mikroskopem, orientując larwę brzuchem do dołu.Na żołądku widoczne będą słabe poziome bruzdy biegnące wzdłuż niego z drobnymi czarnymi włoskami. Grzbiet larw powinien być skierowany do góry i posiadać dwa równoległe pasy, które stanowią tchawki. Używając drugiej pary pęset przeznaczonej wyłącznie do nakładania kleju, pobierz niewielką ilość z kropli znajdującej się na końcu szkiełka i nanieś ją w róg po przeciwnej stronie.Należy użyć niewielkiej ilości kleju, wystarczającej jedynie do pokrycia końcówki pęsety. Chwycić zwierzę i umieścić je na kleju, dbając o to, aby pozostało ono brzuchem do dołu w czarnym otworze.Haczyki powinny znajdować się na krawędzi lub w pobliżu krawędzi szkiełka podstawowego, podobnie jak haczyki gębowe i brązowa spirala. Nie powinny one dotykać kleju. Delikatnie dociśnij larwę, aby ją spłaszczyć.Aby podać substancję testową, najlepiej nanieść za pomocą strzykawki małe krople w pobliżu głowy larwy. Częstotliwość akcji serca obserwuje się, licząc liczbę pulsacji spiral w ciągu jednej minuty. W przypadku dłuższych obserwacji larwy można karmić w miejscu i nawilżać, aby zapobiec odwodnieniu. Aby wykonać płytkę do sekcji nadającą się do użytku pod mikroskopem, należy skalpelem wyciąć w centrum kawałka taśmy magnetycznej otwór o średnicy dwóch centymetrów, a następnie przykleić go do szkiełka przedmiotowego.Użyj szpilek sekcyjnych, które zostały zgięte i przyklejone do spinaczy biurowych, aby ułatwić przypinanie. Podczas sekcji umieść nienaruszone larwy trzeciego stadium gwiazdy na płytce sekcyjnej. Stroną grzbietową do góry, tak aby tchawka była widoczna przez kutykulę.Umieść dwa piny w larwie po obu stronach haków gębowych oraz kolejne dwa piny po obu stronach spirali. Następnie dodaj soli fizjologicznej, aby utrzymać wilgotność larwy. Po tym wykonaj nacięcie poziome przy końcu coddle, a następnie cięcie podłużne, które powinno przebiegać wzdłuż spirali w kierunku głowy zwierzęcia.Podnieś jedną szpilkę grzbietową i zahacz ją pod kutykulą. Użyj szpilki do rozszerzenia otworu. Otwórz jamę ciała.Powtórz czynność z pozostałymi trzema szpilkami. Po rozpięciu zwierzęcia usuń wnętrzności, uważając, aby nie uszkodzić tchawicy ani serca. Niektóre struktury, w tym mózg i niektóre ciała tłuszczowe, są przytwierdzone do serca i ich usuwanie może doprowadzić do jego uszkodzenia.Pozostaw preparat w kąpieli z soli fizjologicznej HL3 na trzy do pięciu minut po sekcji; w tym preparacie przeprowadza się rejestracje wewnątrzkomórkowe i potencjałów polowych, podczas gdy środki farmakologiczne aplikuje się bezpośrednio do serca. Całkowity czas tego etapu sekcji wynosi od trzech do sześciu minut. Aby przeprowadzić stymulację elektryczną, należy najpierw przygotować elektrody punktowe: w celu wykonania elektrody punktowej należy przesunąć elektrodę szklaną nad elementem grzejnym, aby ją wypolerować ogniowo, a następnie wykonać stopniowe zgięcie pod kątem około 45 stopni; zamocuj elektrodę punktową wypełnioną solą fizjologiczną HL3 o temperaturze pokojowej w manipulatorze, kierując jej końcówkę w dół.Upewnij się, że przewód stymulatora styka się z solą fizjologiczną wewnątrz elektrody oraz że stymulator jest wyłączony. Umieść świeży preparat wypreparowanego serca pod mikroskopem. Wprowadź przewód uziemiający do soli fizjologicznej.Należy uważać, aby nie dotknąć pinów ani nie zakłócić preparatu. Podczas używania manipulatora do przesuwania elektrody w dół do soli fizjologicznej należy utrzymywać ją w polu widzenia. Po wprowadzeniu do soli fizjologicznej należy ustawić końcówkę elektrody tak, aby światło znajdowało się płasko przy sercu i lekko go dotykało.Po umieszczeniu elektrody ustaw częstotliwość stymulatora na 2 Hz, a napięcie na najniższą wartość. Włącz stymulator. Dostrój częstotliwość do około 3 Hz i powoli zwiększaj napięcie, aż tętno przyspieszy i zrówna się z rytmem stymulatora.Rytm można teraz manipulować za pomocą stymulatora. Można dodawać związki, aby sprawdzić, czy wpływają one na skurcz lub przewodnictwo elektryczne. Aby przeprowadzić rejestrację potencjałów polowych, należy napełnić elektrodę do rejestracji typu macro patch medium kąpielowym i zamontować ją w manipulatorze na mikroskopie złożonym.Podłącz elektrodę do wzmacniacza i zestawu rejestrującego. Za pomocą manipulatora opuść światło elektrody nad sercem preparatu sekcyjnego przymocowanego do mikroskopu. Bardzo delikatnie dotknij serca końcówką elektrody.Można teraz przeprowadzić rejestrację potencjałów polowych z innego obszaru serca. Delikatnie unieś końcówkę elektrody i za pomocą manipulatora przesuń ją w nowy obszar, a następnie ponownie wykonaj pomiary potencjałów polowych. Precyzyjne monitorowanie częstotliwości i czasu trwania sygnałów elektrycznych w sercu pozwala na pomiar potencjałów błonowych miocytów larwalnych.Najpierw należy upewnić się, że światło ostrej elektrody wypełnionej trzymolowym roztworem chlorku potasu przylega płasko do serca pod kątem około 45 stopni względem pionu. Po prawidłowym ustawieniu należy delikatnie dotknąć serca końcówką elektrody i wprowadzić ją do komórki. Elektrodę można wykorzystać ponownie, o ile nie uległa ona złamaniu.Rejestracje wewnątrzkomórkowe pozwalają na pomiar jonowej podstawy potencjału czynnościowego oraz charakterystycznych kształtów potencjałów w celu zbadania wpływu mutacji kanałów jonowych lub modulatorów kanałów. Przedstawiliśmy zatem sposób wykonywania pomiarów serca, a także sposób rejestracji potencjałów wewnątrzkomórkowych i potencjałów polowych. Techniki te można wykorzystać do badania zmian w sercu, a także manipulacji farmakologicznych i zmian genetycznych.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie ciągnąć za strukturę powiązaną, która jest przymocowana do serca, oraz nie naciskać zbyt mocno elektrodą ogniskową. Ponadto, stosując metodę klejenia, należy uważać, aby nie zakleić otworu lub sfery. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

monitoring-heart-function-larval-drosophila-melanogaster-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Monitorowanie czynności serca larw Drosophila melanogaster w badaniach fizjologicznych

Badanie złożonych zachowań lokomocyjnych u Drosophila melanogaster zależy od możliwości ilościowego określenia zmian w ruchu danej muchy. Niniejszy artykuł demonstruje, jak przeprowadzić ten proces przy użyciu wysokorozdzielczego systemu śledzenia.

Wysokorozdzielcze śledzenie wideo lokomocji u dorosłych osobników Drosophila melanogaster

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

Przedstawiono technikę niezbędną do wizualizacji bijącego serca w larwalnym i dorosłym stadium rozwoju Drosophila. Każdy etap cyklu życiowego wymaga zastosowania odmiennej metodologii.

Wizualizacja bijącego serca u Drosophila

Opracowaliśmy półautomatyczną metodę optycznej analizy bicia serca (SOHA) do analizy szybkich nagrań optycznych z serc Drosophila, rybek danio oraz embrionów myszy. Prezentujemy zastosowanie naszej metodologii w analizie funkcji serca muszki owocowej oraz embrionów myszy.

Półautomatyczna optyczna analiza rytmu serca w przypadku małych serc

Ten raport opisuje metodę pomiaru aktywności larw Drosophila za pomocą TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Urządzenie wykorzystuje wiązki podczerwieni do wykrywania ruchów do 16 pojedynczych zwierząt. Dane mogą być analizowane w celu przedstawienia parametrów ruchu, w tym szybkości i pozycji zwierząt w komorach testowych.

Pomiar aktywności larw w monitorze aktywności Drosophila

Tutaj opisane są eksperymentalne protokoły przygotowania Drosophila na różnych etapach rozwoju i wykonywania podłużnego optycznego obrazowania uderzeń serca Drosophila za pomocą niestandardowego systemu optycznej mikroskopii koherentnej (OCM). Zmiany morfologiczne i dynamiczne serca można scharakteryzować ilościowo, analizując parametry strukturalne i funkcjonalne serca na podstawie obrazów OCM.

Drosophila Przygotowanie i obrazowanie podłużne funkcji serca in vivo przy użyciu optycznej mikroskopii koherentnej (OCM)

Protokół opisuje prosty test do identyfikacji larw Drosophila melanogaster, które doświadczają niedotlenienia przy normalnym poziomie tlenu w atmosferze. Protokół ten pozwala odróżnić niedotlenione larwy od innych mutantów, które wykazują nakładające się fenotypy, takie jak powolność lub powolny wzrost.

Test kopania/tunelowania w celu wykrycia niedotlenienia u larw Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Obecny protokół opisuje wytwarzanie opsyn Drosophila melanogaster wykazujących ekspresję opsyn eNpHR2.0 lub ReaChR w sercu do obrazowania OCT i optogenetycznej stymulacji serca. Podano szczegółowe instrukcje dotyczące obrazowania OCT Drosophila i modulacji bicia serca, w tym symulacji możliwego do przywrócenia zatrzymania akcji serca, bradykardii i tachykardii u żywych zwierząt na różnych etapach rozwoju.

Opracowanie modeli Drosophila melanogaster do obrazowania i optogenetycznej kontroli funkcji serca

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Ten protokół zapewnia ramy do oceny zmian zachowania wywołanych stresem u Drosophila melanogaster. Łączenie uzupełniających się testów umożliwia ilościową ocenę aktywności, eksploracji i podejmowania decyzji dla poszczególnych much. Podejście to jest elastyczne i może być dostosowane do szerokiej gamy badań dotyczących biologii stresu, metabolizmu i funkcji neurobehawioralnych.

Multimodalowe fenotypowanie behawioralne stanów przypominających depresję indukowanych stresem u Drosophila melanogaster

Poznaj metody monitorowania czynności serca u larw Drosophila melanogaster w preparatach całych i rozciętych. Techniki obejmują rejestrację potencjałów zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych oraz badanie funkcji kanałów jonowych.

Monitorowanie funkcji serca u larw Drosophila melanogaster w badaniach fizjologicznych

Przeglądaj więcej filmów