Monitorowanie funkcji serca u larw Drosophila melanogaster w badaniach fizjologicznych
16 listopada 2009
Przedstawiamy różne metody monitorowania funkcji serca u larw Drosophila w celu analizy kwestii związanych z funkcjonowaniem złączy szczelinowych, mutacjami kanałów jonowych, modulacją aktywności rozrusznika oraz w badaniach farmakologicznych.
Muszki *Drosophila* są genetycznie atrakcyjnym modelem do badań nad rozwojem i funkcją serca oraz leżącą u jego podstaw aktywności rozrusznika. Niniejsza procedura pokazuje, jak przygotować preparaty z larw w stanie nienaruszonym oraz po sekcji, a także jak monitorować częstość akcji serca. Preparat po sekcji umożliwia również rejestrację potencjałów zewnątrzkomórkowych lub wewnątrzkomórkowych w celu dalszej analizy funkcji kanałów jonowych.
Witajcie, jestem Robin Cooper, pracownikiem naukowym Katedry Biologii na Uniwersytecie Kentucky. Dzisiaj moi studenci, Ann Cooper, Kyla Ryman, Matt Ward i Easter Boku, zaprezentują Państwu różne procedury monitorowania częstotliwości akcji serca u larw Drosophila. Poniższa metoda bez ograniczeń ruchu nazywana jest „farmą mrówek”, ponieważ larwy są wizualizowane w jednej płaszczyźnie ogniskowania.
Aby uzyskać najlepszą wizualizację larw, należy użyć mikroskopu stereoskopowego z obiektywem bazowym 2x oraz okularem 0,5x, co zapewni optymalną rozdzielczość przestrzenną i powiększenie w obszarze prostokąta o wymiarach 1 cm na 0,5 cm. Zdjęcia i filmy można rejestrować za pomocą kamery zamontowanej w okularze. Aby rozpocząć tę metodę, należy umieścić larwę wraz z cienką warstwą pożywki pomiędzy dwoma szkiełkami przedmiotowymi.
Laminaty są rozdzielone odległością od 1 do 1,5 milimetra za pomocą plastikowych dystansów zamocowanych z każdej z czterech stron. Przechyl preparat pod kątem od 20 do 45 stopni na kilka minut, aby zachęcić larwę do utrzymywania głowy skierowanej w dół. Wyreguluj lustro mikroskopu, aby uzyskać najlepszy kontrast serca lub dwóch tchawic w celu obserwacji bicia serca.
Metoda klejenia jest sposobem trwałego montażu służącym do unieruchomienia larw na szkiełku przedmiotowym. Aby rozpocząć metodę klejenia, należy położyć czyste szkiełko nakrywkowe na szkiełku przedmiotowym. Na jeden róg szkiełka nakrywkowego nanosi się małą kroplę superglue.
Następnie opłucz larwy wodą. Aby usunąć nadmiar pokarmu, wchłoń ciecz za pomocą chusteczki lub rogu ręcznika papierowego. Po dokładnym opłukaniu larwy, ostrożnie chwyć ją czystą pęsetą i umieść na szkiełku w odległości od szkiełka nakrywkowego pod mikroskopem, orientując larwę brzuchem do dołu.
Na żołądku widoczne będą słabe poziome bruzdy z drobnymi czarnymi włoskami. Grzbiet larw powinien być skierowany do góry i posiadać dwa pasy, które stanowią tchawki. Używając drugiej pary pęset przeznaczonej wyłącznie do nakładania kleju, pobierz niewielką ilość z kropli znajdującej się na końcu szkiełka i nanieś ją w róg po przeciwnej stronie.
Nanieś niewielką ilość kleju, wystarczającą jedynie do pokrycia końcówki pęsety. Chwyć zwierzę i umieść je na kleju, upewniając się, że pozostaje ono stroną brzuszną skierowaną w dół otworu.
Haczyki powinny znajdować się na krawędzi lub w pobliżu krawędzi szkiełka podstawowego, podobnie jak haczyki gębowe i brązowa spirala. Nie powinny one dotykać kleju. Delikatnie dociśnij larwę, aby ją spłaszczyć.
Aby podać substancję testową, najlepiej nanieść za pomocą strzykawki małe krople w pobliżu głowy larwy. Częstość akcji serca obserwuje się, licząc liczbę tętnień spiral w ciągu jednej minuty. Podczas dłuższych obserwacji larwy można karmić w miejscu i nawilżać, aby zapobiec odwodnieniu. Aby przygotować płytkę do sekcji nadającą się do użytku pod mikroskopem, należy za pomocą skalpela wyciąć otwór o średnicy dwóch centymetrów w środku kawałka taśmy magnetycznej, a następnie przykleić go do szkiełka przedmiotowego.
Do przypinania należy użyć szpilek sekcyjnych, które zostały zgięte i przyklejone do spinaczy biurowych, aby ułatwić manipulację. Podczas sekcji na płytce sekcyjnej należy umieścić nienaruszoną larwę trzeciego stadium w kształcie gwiazdy. Przy ułożeniu grzbietową stroną do góry tchawka powinna być widoczna przez kutykulę.
Umieść dwie szpilki w larwach po obu stronach haków gębowych oraz kolejne dwie szpilki po obu stronach spirali. Następnie dodaj sól fizjologiczną, aby utrzymać wilgotność larw. Wykonaj cięcie poziome przy końcu coddle, a następnie cięcie podłużne, które powinno przebiegać wzdłuż spirali w kierunku głowy zwierzęcia.
Podnieś jedną szpilkę grzbietową i zahacz ją pod kutykulą. Użyj szpilki do rozszerzenia otworu. Otwórz jamę ciała.
Powtórz czynności z pozostałymi trzema szpilkami. Po rozpięciu ciała zwierzęcia usuń wnętrzności, uważając, aby nie uszkodzić tchawicy ani serca. Niektóre struktury, w tym mózg i niektóre ciała tłuszczowe, są przytwierdzone do serca i mogą je uszkodzić podczas usuwania.
Pozostaw preparat w kąpieli z soli fizjologicznej HL3 w celu relaksacji przez trzy do pięciu minut po sekcji; w tym preparacie przeprowadza się rejestracje wewnątrzkomórkowe i potencjałów polowych, podczas gdy środki farmakologiczne aplikuje się bezpośrednio do serca. Całkowity czas tego etapu sekcji wynosi od trzech do sześciu minut. Aby przeprowadzić stymulację elektryczną, w pierwszej kolejności należy przygotować elektrody ogniskowe; w celu wykonania elektrody ogniskowej należy przesunąć elektrodę szklaną nad elementem grzejnym, aby ją wypalić, a następnie wykonać stopniowe zgięcie pod kątem około 45 stopni. Zamocuj elektrodę ogniskową wypełnioną solą fizjologiczną HL3 o temperaturze pokojowej w manipulatorze, kierując końcówkę w dół.
Upewnij się, że drut stymulatora dotyka soli fizjologicznej wewnątrz elektrody i że stymulator jest wyłączony. Przymocuj świeży preparat sekcji serca do mikroskopu. Umieść drut uziemiający w soli fizjologicznej.
Należy zachować ostrożność, aby nie dotknąć pinów ani nie naruszyć preparatu. Podczas używania manipulatora do przesuwania elektrody w dół, w stronę soli fizjologicznej, należy utrzymać ją w polu widzenia. Po wprowadzeniu do soli fizjologicznej, należy ustawić końcówkę elektrody tak, aby światło znajdowało się płasko przy sercu i lekko go dotykało.
Po umieszczeniu elektrody ustaw częstotliwość stymulatora na 2 Hz, a napięcie na najniższą wartość. Włącz stymulator. Dostrój częstotliwość do około 3 Hz i powoli zwiększaj napięcie, aż tętno przyspieszy i zsynchronizuje się z rytmem stymulatora.
Rytm można teraz manipulować za pomocą stymulatora. Można dodawać związki, aby sprawdzić, czy wpływają one na skurcz lub przewodnictwo elektryczne. Aby przeprowadzić rejestrację potencjałów polowych, należy napełnić elektrodę do rejestracji makropłata medium kąpielowym i zamontować ją w manipulatorze w mikroskopie złożonym.
Podłącz elektrodę do wzmacniacza i układu rejestrującego. Za pomocą manipulatora opuść światło elektrody nad sercem preparatu sekcyjnego zamocowanego do mikroskopu. Bardzo delikatnie dotknij serca końcówką elektrody.
Można teraz wykonać rejestracje polowe w celu zapisu potencjałów polowych z innego obszaru serca. Ostrożnie unieś końcówkę elektrody i przesuń ją za pomocą manipulatora do nowego obszaru, a następnie ponownie rozpocznij rejestrację potencjałów polowych. Precyzyjne monitorowanie częstotliwości i czasu trwania sygnałów elektrycznych w sercu pozwala na pomiar potencjałów błonowych miocytów larwalnych.
Najpierw należy upewnić się, że światło ostrej elektrody wypełnionej 3 M chlorkiem potasu przylega płasko do serca pod kątem około 45 stopni względem pionu. Po prawidłowym ustawieniu należy delikatnie dotknąć serca końcówką elektrody i wprowadzić ją do komórki. Elektrodę można wykorzystać ponownie, jeśli nie uległa ona złamaniu.
Rejestracje wewnątrzkomórkowe pozwalają na pomiar jonowych podstaw potencjału czynnościowego oraz charakterystycznych kształtów potencjałów w celu zbadania efektów mutacji kanałów jonowych lub modulatorów kanałów. Przedstawiliśmy zatem sposób wykonywania rejestracji z serca, a także sposób pomiaru potencjałów wewnątrzkomórkowych i polowych. Techniki te można wykorzystać do badania zmian w sercu, a także manipulacji farmakologicznych i zmian genetycznych.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie pociągać za struktury powiązane, które są przymocowane do serca, oraz nie naciskać zbyt mocno elektrodą ogniskową. Stosując metodę z użyciem kleju, należy również uważać, aby nie zakleić otworu lub sfery. To wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metody monitorowania funkcji serca u larw Drosophila, koncentrując się na ocenie połączeń szczelinowych, mutacji kanałów jonowych oraz aktywności rozrusznika. Techniki obejmują zarówno preparaty nienaruszone, jak i wypreparowane w celu przeprowadzenia szczegółowej analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- fizjologia
- genetyka
Wstęp
- Muszki *Drosophila* są cenne w badaniach nad rozwojem i funkcją serca.
- Zrozumienie aktywności rozrusznika jest kluczowe dla poznania fizjologii serca.
- Funkcję kanałów jonowych można ocenić za pomocą różnych układów eksperymentalnych.
- Badania farmakologiczne mogą ujawnić wpływ różnych związków na funkcję serca.
Cel badania
- Zaprezentowanie technik monitorowania częstości akcji serca u larw Drosophila.
- Zbadanie wpływu środków farmakologicznych na funkcję serca.
- Przedstawienie szczegółowej metodologii dla preparatów nienaruszonych oraz wypreparowanych.
Zastosowane metody
- Metoda wizualizacji bez unieruchamiania z wykorzystaniem mikroskopu stereoskopowego.
- Metoda klejenia w celu trwałego montażu larw na szkiełkach przedmiotowych.
- Techniki sekcji w celu uzyskania dostępu do serca i tchawicy.
- Stymulacja elektryczna i rejestracja potencjałów polowych do oceny aktywności serca.
Główne wyniki
- Skuteczny monitoring częstotliwości akcji serca w różnych preparatach larwalnych.
- Wykazanie wpływu środków farmakologicznych na skurcze serca.
- Opracowanie przejrzystego protokołu sekcji i rozmieszczenia elektrod.
- Wykazanie możliwości wykorzystania Drosophila w badaniach kardiologicznych.
Wnioski
- Larwy Drosophila stanowią efektywne modele do badania funkcji serca.
- Opisane metody można dostosować do różnych potrzeb eksperymentalnych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych technikach, aby dalej zgłębiać fizjologię serca.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modele serca larw Drosophila umożliwiają mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniach nad funkcją kanałów jonowych i rozrusznika w początkowej fazie odkrywania leków, wspierając walidację celów dla szlaków związanych z chorobami serca. Przygotowanie to zapewnia ilościowe i powtarzalne odczyty częstości akcji serca oraz aktywności elektrycznej, co ułatwia opracowanie testów do screeningu związków. System ten oferuje genetycznie modyfikowalny, istotny w kontekście chorób model do oceny potencjału translacyjnego biomarkerów oraz pewności predykcyjnej w identyfikacji związków wiodących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych związanych z funkcją kanałów jonowych i aktywnością rozrusznikową w systemie dostępnym genetycznie.
- Wartość operacyjna: Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez umożliwienie bezpośredniego zastosowania środków farmakologicznych na odsłonięte serce.
- Wartość prognostyczna: Zapewnia ilościowe pomiary częstości akcji serca i potencjałów błonowych w celu oceny stopnia zaangażowania celu i modulacji szlaków.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje ustandaryzowane, mierzalne wyniki (częstość akcji serca, potencjały polowe, rejestracje wewnątrzkomórkowe) w celu rzetelnej oceny związków.
- Wartość operacyjna: Umożliwia powtarzalność testów dzięki zastosowaniu preparatów wypreparowanych, które pozwalają na kontrolowaną ekspozycję na związki oraz kontrolę środowiskową.
- Skalowalność: Wypreparowane preparaty serca mogą być wykorzystane w adaptacjach do formatów wielodołkowych, co wspiera przesiewy o średniej przepustowości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie translacyjne: Preparat serca larwalnego służy jako istotny w kontekście chorób system do modelowania dysfunkcji jonowych związanych z konkretnymi genami powiązanymi z chorobami serca u ssaków.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia badanie jonowych podstaw potencjałów czynnościowych oraz efektów mutacji lub modulatorów kanałów jonowych, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Ciągłość predykcyjna: Wspiera dopasowanie translacyjnych biomarkerów poprzez powiązanie elektrofizjologii larwalnej ze znanymi mechanizmami jonowymi u organizmów wyższych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, dostarczając wglądu w mechanizmy, które stanowią podstawę przedklinicznej oceny ryzyka.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wpływu kanałów jonowych i rozruszników na funkcję serca poprzez bezpośrednie odczyty elektrofizjologiczne.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych i powtarzalnych pomiarów częstości akcji serca oraz potencjałów, co umożliwia porównania pomiędzy różnymi związkami lub warunkami genetycznymi.
- Analityka: Generuje dane elektrofizjologiczne (częstość akcji serca, potencjały błonowe, potencjały polowe), które pomagają zespołom ocenić wpływ związków na przewodnictwo elektryczne i kurczliwość.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez modelowanie prądów jonowych leżących u podstaw potencjałów czynnościowych, istotnych dla patofizjologii serca ssaków.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do fenotypowania serca w wielu projektach obejmujących cele w postaci kanałów jonowych lub modele chorób genetycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów terapeutycznych poprzez powiązanie zaburzeń genetycznych lub farmakologicznych z funkcjonalnymi odczytami kardiologicznymi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne preparaty, które redukują zmienność i wspierają spójność działań między zespołami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go dzięki dostarczaniu wczesnych danych mechanistycznych na temat kardiologicznych ryzyk związanych z kanałami jonowymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o profile bezpieczeństwa kardiologicznego oraz stopień zaangażowania celu.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obchodzenia się z Drosophila, technik sekcyjnych oraz metod rejestracji elektrofizjologicznej.
- Metoda jest zależna od mikroskopii, manipulacji elektrodami oraz sprzętu stymulacyjnego do rejestracji potencjałów wewnątrzkomórkowych i polowych.
- Konieczna jest standaryzacja czasu sekcji, składu soli fizjologicznej oraz rozmieszczenia elektrod pomiędzy użytkownikami i laboratoriami.
- Przy rozszerzaniu metody na inne modele owadów lub bezkręgowców należy uwzględnić specyficzną dla gatunku anatomię serca oraz skład jonowy.
- Ograniczenia praktyczne obejmują stabilność preparatu w czasie oraz potencjalne uszkodzenia tkanek podczas sekcji, co może wpływać na jakość rejestracji.
