Oznaczanie stężenia białek w mikroobjętościach za pomocą spektrofotometru NanoDrop 2000c
November 4th, 2009
Próbki mikroobjętościowe są oznaczane ilościowo przez system spektrofotometru, który wykorzystuje naturalne napięcie powierzchniowe do zatrzymywania próbek bez użycia kuwet czy kapilarni. Dzięki tej metodzie znacznie zwiększa się dynamiczny zakres stężeń białek i szybkość, z jaką można je zmierzyć.
Technologia NanoDrop łączy światłowody i napięcie powierzchniowe w celu przechowywania i pomiaru niewielkich ilości próbek, takich jak kwasy nukleinowe i białka. Mała kropla próbki jest pipetowana bezpośrednio na dolny cokół. Następnie górny cokół optyczny łączy próbkę w kolumnę.
Cokół przesuwa się automatycznie, aby dostosować się do optymalnej długości ścieżki. Skrócenie długości ścieżki eliminuje konieczność wykonywania rozcieńczeń dla większości próbek białek, pomiar odbywa się w ciągu kilku sekund, a wyniki widma vis są wyświetlane. Cześć, nazywam się Lynn Kalhorn i pracuję w laboratoriach NanoDrop firmy Thermo Fisher Scientific.
Dziś pokażemy procedurę oznaczania stężenia białek za pomocą innowacyjnego spektrofotometru mikroobjętościowego. Spektrofotometr NanoDrop 2000 C wykorzystuje innowacyjny system zatrzymywania próbek, który opiera się na napięciu powierzchniowym cieczy do przechowywania i pomiaru próbek o mikroobjętości między dwoma postumentami optycznymi bez użycia kuwet lub kapilarn. Próbkę mikros umieszcza się bezpośrednio na powierzchni detekcji, a między końcami światłowodów tworzy się kolumna cieczy pod wpływem napięcia powierzchniowego.
Ta kolumna cieczy tworzy pionową ścieżkę optyczną. Źródłem światła jest ksenonowa lampa błyskowa, a spektrometr wykorzystujący liniowy układ CCD służy do analizy światła przechodzącego przez próbkę. Usunięcie z systemu tradycyjnych urządzeń zabezpieczających, takich jak kuwety, ma kilka zalet.
Do pomiaru potrzebne są bardzo małe ilości próbki. Czyszczenie od jednego do dwóch mikrolitrów wymaga po prostu przetarcia powierzchni optycznych chusteczką laboratoryjną, a długość ścieżki automatycznie zmienia się w czasie rzeczywistym podczas pomiaru. Ponadto skrócenie długości ścieżki umożliwia pomiar wyższych stężeń, co skutecznie eliminuje konieczność wykonywania rozcieńczania dla większości próbek białek.
W przypadkach, w których wizyta weterynarza jest uzasadniona, takich jak badania kinetyczne, NanoDrop 2000 C zapewnia opcję vete w tym samym spektrofotometrze. W tym protokole użyjemy opcji cokołu mikroobjętości w celu określenia stężenia białka. Metoda białka A dwa 80 ma zastosowanie do oczyszczonych białek, które zawierają reszty tryptofanu, tyrozyny i fenyloalaniny lub wiązania siarczkowe cysteiny-cysteiny i wykazują chłonność przy 280 nanometrach.
Aby rozpocząć tę procedurę, wybierz aplikację białko A two 80 z menu głównego. Jeśli pojawi się okno weryfikacji długości fali, upewnij się, że ramię jest opuszczone, wybierz typ próbki do pomiaru z listy rozwijanej. Ustawienie domyślne jest zalecane dla większości nieznanych mieszanek białkowych, w których jedna CHŁONNOŚĆ równa się jednemu miligramowi na mililitr.
W przypadku pomiaru wcześniej scharakteryzowanego oczyszczonego białka można wprowadzić albo współczynnik ekstynkcji masowej, albo współczynnik ekstynkcji molowej. Aby dokładniej określić stężenie białka, wybierz jednostki stężenia z listy rozwijanej znajdującej się obok pola oznaczonego kolorem. Następnie ustal puste miejsce.
Stosując odpowiedni bufor, ważne jest, aby użyć bufora, w którym białko jest zawieszone. Zastosowany bufor powinien mieć takie samo pH i podobną siłę jonową jak roztwór próbki. Ze względu na zmienność napięcia powierzchniowego między różnymi białkami zalecamy załadowanie dwóch mikrolitrów próbek, aby zapewnić prawidłowe uformowanie kolumny.
Aby załadować, przyłóż końcówkę pipety o niskiej retencji do dolnej powierzchni cokołu, jednocześnie wypychając roztwór, aby zapobiec przywieraniu roztworu na zewnątrz końcówki pipety, usuń mniej niż pełną ilość próbki, aby zapobiec wydmuchiwaniu i wprowadzaniu pęcherzyków do próbki. Po załadowaniu próbki opuść ramię, kliknij puste. Po zakończeniu wygaszania wytrzyj roztwór ślepej próby z dolnego i górnego cokołu.
Używając suchej chusteczki laboratoryjnej przed pobraniem podwielokrotności do pomiaru, ważne jest, aby upewnić się, że próbka jest jednorodna. Wymieszaj próbkę delikatnie, ale dokładnie, delikatnie wirując przy średnich prędkościach obrotowych, aby uniknąć wprowadzenia mikropęcherzyków do płynu. Wprowadź identyfikator próbki w odpowiednim polu.
Załaduj dwa mikrolitry pierwszej próbki, jak pokazano wcześniej dla ślepej próby, opuść ramię i kliknij miarkę Po zakończeniu pomiaru wytrzyj próbkę z dolnego i górnego cokołu. Używając suchej chusteczki laboratoryjnej, zmierz wszystkie pozostałe próbki w ten sam sposób, używając świeżej podwielokrotności próbki o objętości dwóch mikrolitrów do każdego pomiaru. Zwykła, niestrzępiąca się chusteczka laboratoryjna jest często wystarczająca do czyszczenia cokołów optycznych między pomiarami.
Jedynym rozpuszczalnikiem, który jest niezgodny i nie może być używany, są roztwory kwasu fluorowodorowego, a odczynniki zawierające środki powierzchniowo czynne mogą z czasem zdekondycjonować powierzchnie cokołu pomiarowego, zapobiegając tworzeniu się kolumny cieczy próbki. Spłaszczenie kropli na dolnym cokole wskazuje na to, że powierzchnia optyczna staje się niezdatna do regeneracji. Powierzchnie cokołów należy je energicznie wypolerować chusteczką laboratoryjną lub preferowaną metodą jest użycie środka do regeneracji cokołów NanoDrop PR zgodnie z zaleceniami.
Jeśli próbka jest niescharakteryzowanym roztworem białkowym, lizatem komórkowym lub surowym ekstraktem białkowym, zalecamy użycie jednej ze wstępnie skonfigurowanych metod kolorymetrycznych dostępnych w NanoDrop 2000 C. Te metody kolorymetryczne obejmują sześć testów BCAP 60 Bradforda i Lowy'ego. Test BCA zostanie zademonstrowany tutaj. Odczynniki wymagane do testu BCA znajdują się w zestawie kompatybilnym z termosem scientific do redukcji przekłucia BCA, odczynnikiem A, B, C, A, odczynnikiem B i wzorcami albuminy surowicy bydlęcej.
Będziemy używać zestawu wstępnie rozcieńczonych albumin Pierce'a, ponieważ nasze standardy odnoszą się do literatury dotyczącej BCA w celu określenia, które standardy testów są odpowiednie dla Twojej sytuacji. Aby przygotować odczynniki, najpierw zrównoważ wszystkie nieznane białka i wzorce białek do temperatury pokojowej i dokładnie wymieszaj przez delikatne wirowanie. Użyj średniej prędkości obrotowej, aby uniknąć wprowadzania mikropęcherzyków do płynu.
Ponieważ bąbelki mogą negatywnie wpływać na odczyty. Przygotuj wystarczającą ilość świeżego odczynnika roboczego do wzorców i próbek, które mają być mierzone przy użyciu stosunku 50 do jednego odczynnika A do B.In tym przykładzie przygotujemy trzy mililitry odczynnika roboczego, aby pokryć pięć wzorców odniesienia i sześć próbek. Zwykły test BCA obejmuje szerszy zakres dynamiki i wykorzystuje stosunek odczynnika do białka 20 do jednego, podczas gdy test mikro BCA jest bardziej czuły i ma węższy zakres dynamiki przy użyciu stosunku odczynnika do białka jeden do jednego.
Ponieważ wykonujemy regularny test BCA, przygotujemy stosunek 20 do jednego odczynnika roboczego do próbki. Dodaj 190 mikrolitrów odczynnika roboczego do każdej probówki z wystarczającą ilością probówek, aby pokryć wszystkie próbki i wzorce. Następnie dodaj 10 mikrolitrów wzorca lub próbki do każdej z probówek zawierających odczynnik.
Dobrze wymieszaj, delikatnie wirując. Inkubować probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji pozwól, aby reakcje zrównoważyły się do temperatury pokojowej przez około 10 minut.
W przeciwieństwie do metody białka A dwa 80, metoda BCA białka wymaga wygenerowania krzywej standardowej przed pomiarem stężenia białka w próbce. Aby wygenerować krzywą standardową, zacznij od wybrania metody BCA białka z menu głównego. Jeśli pojawi się okno weryfikacji długości fali, upewnij się, że ramię jest opuszczone.
Wprowadź wartości dla każdego standardowego stężenia w tabeli w prawym okienku. Oprogramowanie pozwala na odniesienie i do siedmiu dodatkowych standardów. Wzorce odniesienia i/lub wzorce mogą być mierzone w kontrpróbach.
Ustanów ślepą próbę, korzystając z odpowiedniego bufora. Ślepa próba do testów metrycznych kolorów jest na ogół dejonizowana. Odpipetuj dwa mikrolitry wody na dolny cokół i opuść ramię.
Kliknij puste. Tylko jedna ślepa próba jest potrzebna do pokrycia wszystkich kolejnych pomiarów odniesienia i wzorców. Ustalić odniesienie, odpipetowując dwulitrową dawkę Eloqua zawierającą tylko działający odczynnik i bufor bez białka na dolny cokół.
Opuść ramię i kliknij miarę. W zakładce wzorce zaznacz żądany wzorzec i odpipetuj dwa mikrolitry żądanego wzorca na dolny cokół. Opuść ramię i kliknij miarę.
Powtórz ten proces dla wszystkich standardów. Aby wyświetlić krzywą standardową, kliknij przycisk Wyświetl krzywą standardową. Po zmierzeniu wszystkich wzorców kliknij przycisk próbek.
Wprowadź identyfikator próbki, załaduj dwa mikrolitry próbki na dolny cokół i kliknij przycisk zmierz. Do każdego pomiaru należy użyć świeżej podwielokrotności próbki o pojemności dwóch mikrolitrów. Po zakończeniu pomiaru wytrzyj próbkę z dolnego i górnego cokołu za pomocą suchej chusteczki laboratoryjnej.
Wynik jest następnie uzyskiwany, ponieważ końcowe stężenie próbki jest automatycznie obliczane przy użyciu krzywej standardowej. Właśnie pokazaliśmy dwa sposoby określania stężenia białka, albo przez bezpośredni pomiar dwóch 80, albo za pomocą pośredniej metody metrycznej koloru, z których każdy wykorzystuje spektrofotometr NanoDrop 2000 C o mikroobjętości. To wszystko.
Dzięki za oglądanie.
Przegląd
Spektrofotometr NanoDrop 2000 C wykorzystuje innowacyjną technologię do pomiaru mikrowolumenowych próbek białek i kwasów nukleinowych bez użycia tradycyjnych kubetek. Ta metoda poprawia szybkość pomiaru i zakres dynamiczny, umożliwiając efektywne określenie stężenia białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Chemia analityczna
- Analiza białek
Tło
- Technologia NanoDrop wykorzystuje światłowody i siłę skupienia powierzchniowego do zatrzymania próbki.
- Umożliwia bezpośrednie pomiary małych objętości próbek (1-2 µL).
- Wyeliminowanie kubetek zmniejsza wymagania dotyczące próbek i czas czyszczenia.
- System może mierzyć wysokie stężenia bez konieczności rozcieńczania.
Cel badania
- Zademonstrowanie procedury określania stężenia białek za pomocą NanoDrop 2000 C.
- Podkreślenie zalet spektrofotometrii mikrowolumenowej.
- Dostarczenie wskazówek dotyczących efektywnego używania urządzenia.
Stosowane metody
- Pipetowanie próbki bezpośrednio na podstawę optyczną.
- Użycie próbki blankowej do kalibracji z odpowiednim buforem.
- Pomiar absorpcji przy 280 nm dla określenia stężenia białka.
- Wykorzystanie testów kolorymetrycznych takich jak BCA dla niezidentyfikowanych białek.
Główne wyniki
- NanoDrop 2000 C zapewnia szybkie i dokładne pomiary stężenia białek.
- Siła skupienia powierzchniowego skutecznie zatrzymuję mikrowolumenowe próbki do analizy.
- Dostosowywanie długości ścieżki w czasie rzeczywistym poprawia dokładność pomiarów.
- Wymagany jest minimalny czas czyszczenia próbek między pomiarami.
Wnioski
- NanoDrop 2000 C jest cennym narzędziem do analizy białek w środowisku badawczym.
- Jego konstrukcja upraszcza proces pomiaru i zmniejsza marnowanie próbek.
- Metody kolorymetryczne rozszerzają jego zastosowanie na różne próbki białek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Microvolume protein quantification addresses the challenge of limited sample availability in early-stage discovery, enabling precise target validation with minimal material. The NanoDrop 2000c enhances predictive confidence by delivering rapid, reproducible concentration data without dilution, supporting go/no-go decisions in lead identification. Its real-time path length adjustment and broad dynamic range improve assay standardization across discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of purified protein samples using A280 absorbance for rapid assessment of expression and purity.
- Operational Value: Reduces sample consumption to 1-2 µL, preserving precious material for downstream assays.
- Predictive Value: Supports functional target validation by providing accurate concentration inputs for activity and binding studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of standardized protein inputs for biochemical and cell-based assays via precise quantification.
- Operational Value: Eliminates cuvette use and dilution steps, accelerating assay setup and improving reproducibility.
- Scalability: Enables high-throughput readiness through rapid measurement and simple wipe-clean protocol between samples.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment by enabling quantification of protein standards and samples in BCA-based assays.
- Preclinical Model Relevance: Ensures accurate dosing in functional studies by providing reliable concentration data for lysates and extracts.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces mechanistic ambiguity in target engagement studies through precise protein normalization.
Pipeline & Workflow Integration
The NanoDrop 2000c fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical evaluation, supporting consistent protein quantification across stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling accurate normalization of protein samples in pathway and interaction studies.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible protein inputs for enzyme, binding, and functional screens.
- Analytics: Provides quantitative A280 and colorimetric readouts that allow comparison across conditions and samples.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work via reliable quantification in BCA assays for standard curves and sample analysis.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared, reusable platform for protein quantification across multiple projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing variability in protein input quantification.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through automated path length adjustment and minimal sample handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing sample waste and accelerating measurement timelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through reliable concentration data for go/no-go decisions in lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires basic laboratory training in pipetting and sample handling for microvolume techniques.
- Depends on access to a NanoDrop 2000c spectrophotometer and compatible laboratory wipes for surface maintenance.
- Necessitates cross-team standardization on blanking procedures and buffer matching for accurate results.
- Involves adaptation considerations for viscous or surfactant-containing samples that may affect surface tension-dependent column formation.
- Includes practical limitations such as incompatibility with hydrofluoric acid and surfactant-rich reagents that can degrade optical surfaces over time.
