Name: Wyprowadzenie hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 6 s
Description: Poznaj metodę wyprowadzania hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych. Protokół obejmuje różnicowanie w ciałach zarodkowych, ekspansję na warstwach OP9 oraz przeszczepianie do napromieniowanych myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych
<ol>
<li>Zebrać niemal zrastne komórki macierzyste zarodkowe (ESC) z kolby poprzez traktowanie trypsyną do ESC.</li>
<li>Resuspendować komórki w 5 mL pożywki różnicującej i przenieść do naczynia T25 bez powłoki żelatynowej. Inkubować w temperaturze 37°C przez 45 minut. Odzyskać nadosad i zebrać komórki poprzez wirowanie. Uwaga: Fibroblasty zarodkowe myszy (MEF) z kultur ESC łatwo przywierają do naczynia T25 bez powłoki żelatynowej, dzięki czemu zostają usunięte z kultury podczas tego etapu wysiewania. Jeśli ESC nie są hodowane na MEF, można pominąć ten etap wstępnego wysiewania. </li>
<li>Resuspendować ESC pozbawione MEF w pożywce różnicującej w stężeniu 333 333 komórek/50 mL. Stężenie to pozwala uzyskać 100 ESC/15 µL.</li>
<li>Używając pipety wielokanałowej, wysiać ESC w ilości 100 komórek/15 µL kropli na szalkach Petriego o powierzchni 15 cm2. Przy użyciu pipety 8-kanałowej powinno być możliwe rozmieszczenie około 18-22 rzędów kropli na szalkę (około 5 mL na szalkę). Uwaga: Dla tego protokołu 2-5 szalek o powierzchni 15 cm2 z kroplami będzie w zupełności wystarczające i powinno pozwolić na uzyskanie 2-5 x 106 komórek pochodzących z ciał embroidalnych (EB) w szóstym dniu. </li>
<li>Delikatnie odwrócić szalki, aby odwrócić krople. Inkubować w 37°C i 5% CO2 przez 48 godzin.</li>
<li>Zebrać krople poprzez delikatne zamieszanie szalek i przenieść do stożkowej probówki 15 mL. Przepłukać szalki 4-6 mL PBS i dodać do tej samej probówki 15 mL. Uwaga: Można połączyć zawartość do pięciu szalek z kroplami wiszącymi. EB będą rosnąć w miarę dalszego różnicowania i jeśli będą zbyt skoncentrowane, mogą tworzyć duże skupiska. </li>
<li>Pozostawić połączone EB do osadzenia pod wpływem grawitacji (około 10 minut). Odessać nadosad, nie niepokojąc EB. Delikatnie resuspendować w 10 mL pożywki różnicującej i przenieść na nieadhezyjną szalkę Petriego o średnicy 10 cm.</li>
<li>Umieścić szalkę Petriego na wytrząsarce w tempie 50 rpm i inkubować w 37°C i 5% CO2.</li>
<li>Po 24 godzinach (czwarty dzień różnicowania) zamieszać szalki, aby skoncentrować EB w centrum szalki Petriego. Ostrożnie wymienić 50% pożywki (5 mL) na 5 mL świeżej pożywki różnicującej. Wrócić szalkę do inkubatora na kolejne dwa dni.</li>
</ol>
Dysocjacja ciałek zarodkowych (EB) i infekcja wektorem MSCV-HoxB4-IRES-GFP
<ol>
<li>Szóstego dnia różnicowania przenieść ciała emboidalne (EBs) do probówki stożkowej o pojemności 15 mL. Pozostawić do osadzenia grawitacyjnego.</li>
<li>Odssać medium i resuspender w 10 mL PBS. Pozostawić EBs do ponownego osadzenia grawitacyjnego. Odssać PBS.</li>
<li>Dodać 250 µL mieszaniny enzymów dysocjujących i 1 mL PBS. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 20 minut, sporadycznie obracając probówkę w celu wymieszania enzymów i EBs.</li>
<li>Dodać 8 mL buforu do dysocjacji wolnego od enzymów.</li>
<li>Triturować mieszaninę za pomocą pipety 5 mL, aż EBs zostaną całkowicie zdysocjowane (około 10 razy; nadmierne pipetowanie zwiększy śmiertelność w preparacie komórek pochodzących z EBs). <ol>
<li>W miarę dysocjacji EBs mieszanina stanie się mętna od komórek.</li>
<li>Przystawienie końcówki pipety do dna probówki stożkowej podczas triturowania wytworzy siłę ścinającą, która znacznie ułatwi dysocjację.</li>
</ol></li>
<li>Zebrać komórki poprzez wirowanie.</li>
<li>Resuspender komórki pochodzące z EBs w 5 mL 10% IMDM i policzyć je metodą wykluczania błękitu trypanu. Uwaga: Między czwartym a szóstym dniem różnicowania w EBs tworzą się jamistości, co prowadzi do znacznej apoptozy i śmierci komórek. W związku z tym w szóstym dniu nawet do 30% komórek pochodzących z EBs może barwić się błękitem trypanu. </li>
<li>Resuspender komórki pochodzące z EBs w zagęszczeniu 100 000 komórek/2 mL 10% IMDM + supernatant wirusowy, tak aby uzyskać MOI na poziomie 5-10. Dodać siarczan protaminy do stężenia końcowego 8 mg/mL. Uwaga: Przygotować odpowiednią ilość mieszaniny EBs/supernatantu wirusowego, aby wypełnić cztery płytki 6-dołkowe (zakładając 2 mL/dołek). </li>
<li>Wyasiać 2 mL mieszaniny EBs/supernatantu wirusowego na każdy dołek czterech płytek 6-dołkowych uprzednio wysianych z komórkami stromy OP9 (patrz poniżej).</li>
<li>Wirować płytki przy 2500 rpm w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Przenieść płytki do inkubatora w 37°C, 5% CO2.</li>
<li>Po 4-6 godzinach zebrać supernatant z płytek i odzyskać ewentualne komórki pozostające w zawiesinie poprzez wirowanie.</li>
<li>Resuspender osad (może być niewielki) w 48 mL 10% IMDM + cytokiny. Rozlać 2 mL/dołek resuspensji do pierwotnych czterech płytek 6-dołkowych, w których przeprowadzono infekcję i zebrano supernatant. Uwaga: 10% IMDM + cytokiny należy zawsze przygotowywać świeżo przed użyciem. </li>
<li>Inkubować płytki w 37°C, 5% CO2 przez siedem dni. Kolonie powinny być widoczne do czwartego dnia po infekcji, a do siódmego dnia powinny być duże i dobrze uformowane. Intensywna ekspansja powinna dać 40-60 kolonii/dołek w siódmym dniu.</li>
<li>Siódmego dnia po infekcji zebrać i połączyć wszystkie komórki (w tym stromę OP9) ze wszystkich dołków poprzez traktowanie trypsyną. Uwaga: NIE wylewać supernatantu ani płukanek z PBS stosowanych podczas traktowania trypsyną. Na tym etapie hodowli niektóre kolonie mogą być tylko słabo przylegające, a wiele komórek może unosić się w zawiesinie. Należy zebrać i połączyć wszystkie płukanki oraz supernatant, aby upewnić się, że żadne potencjalnie cenne komórki nie zostały utracone. </li>
<li>Resuspender komórki w 8 mL świeżego 10% IMDM + cytokiny. Rozdzielić 2 mL/kolbę do czterech kolb T75. Do każdej kolby dodać dodatkowe 13 mL 10% IMDM + cytokiny. Inkubować w 37°C, 5% CO2 przez trzy dni (łącznie dziesięć dni po infekcji).</li>
</ol>
&nbsp;
Kultywowanie i wysiewanie stromy OP9
<ol>
<li>Utrzymuj podłoże stromalne OP9 zgodnie ze standardowymi protokołami w 20% a-MEM. Komórki OP9 zmieniają swoje właściwości po osiągnięciu pełnej konfluencji. Zawsze pasażuj komórki przy 80% konfluencji, stosując rozcieńczenie nie większe niż 1:3.</li>
<li>Na 24 godziny przed infekcją komórek pochodzących z EB szóstego dnia wektorem MSCV-HoxB4-IRES-GFP, wysiej 25 000 komórek OP9/dołek do czterech płytek 6-dołkowych w 20% a-MEM.</li>
</ol>
Pozyskiwanie, frakcjonowanie i transplantacja
<ol>
<li>Zebrać komórki namnażane na stromie OP9 przez dziesięć dni, stosując trypsynizację. Policzyć komórki. Uwaga: NIE należy wylewać nadsączu ani płukanek z PBS stosowanych podczas traktowania trypsyną. Na tym etapie hodowli niektóre kolonie mogą być słabo przylegające, a w zawiesinie może znajdować się wiele komórek. Należy zebrać i połączyć wszystkie płukanki oraz nadsącz, aby upewnić się, że żadne potencjalnie cenne komórki nie zostały utracone. Uwaga: Prawidłowa ekspansja powinna dać od 40-50 x 106 komórek z jednej oryginalnej płytki 6-dołkowej poddanej infekcji, co daje łącznie 160-200 x 106 komórek. </li>
<li>Na tym etapie protokołu komórki można frakcjonować za pomocą selekcji kulkami magnetycznymi lub FACS zgodnie ze standardowymi technikami.</li>
<li>W celu transplantacji podać komórki drogą zakroczną (retro-orbitalną) lub do żyły ogonowej biorcom z niedoborem Rag-2/gc (o masie od 15-22 gramów), którzy zostali poddani podzielonej dawce naświetlania 9.25 gy w odstępach 2.5 h. Uwaga: KLUCZOWE jest, aby masa zwierząt w momencie naświetlania mieściła się w przedziale 15-22 gramów. Jeśli zwierzęta ważą więcej niż 22 gramy, dawka 9.25 gy nie będzie wystarczająca, aby zapewnić odpowiednią ablację, a komórki mogą nie doprowadzić do uratowania przed letalnym naświetlaniem i/lub nie zasiedlić przedziału krwiotwórczego. W przypadku transplantacji do większych zwierząt odpowiednią dawkę naświetlania należy wyznaczyć eksperymentalnie. </li>
<li>Aby zagwarantować przeżycie po letalnym naświetlaniu, wymagana jest minimalna dawka 2-5 x 106 komórek na zwierzę. W przypadku frakcjonowania komórek, należy wstrzyknąć równowartość 2-5 x 106 komórek (np. jeśli interesująca populacja stanowi 10% niefrakcjonowanej puli komórek, należy wstrzyknąć 2-5 x 105 komórek na zwierzę). Uwaga: W przypadku wstrzykiwania &gt;2 x 106 komórek, ZAWSZE należy stosować iniekcję do żyły ogonowej, aby uniknąć tworzenia się teratoma w oczodole, co może wystąpić przy podaniu dużej liczby komórek drogą zakroczną. </li>
<li>Biorców z niedoborem Rag-2-/-/gc-/- utrzymywać w autoklawowanych klatkach. W zależności od „czystości” zwierzęciaca, zwierzęta po transplantacji mogą wymagać podawania zakwaszonej wody lub trimetoprymu z sulfasoksazolem (Septra) przez 5 tygodni po letalnym naświetlaniu. </li>
<li>W 3. tygodniu po transplantacji w krwi obwodowej należy spodziewać się &gt;90% leukocytów pochodzących z komórek ES z ekspresją GFP (GFP+). Zasiedlenie powinno być wieloliniowe, choć wiadomo, że limfocyty wyciszają retrowirusowy HoxB4-IRES-GFP. </li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Myszy C57Bl/6 z niedoborem Rag-2/gamma-c</td><td>Zwierzę</td><td>Taconic Farm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wstrząsarka do płytek</td><td>Narzędzie</td><td>VWR international</td><td>33998-360</td><td>Wstrząsarka orbitalna firmy Ikaworks</td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa</td><td>Narzędzie</td><td>VWR international</td><td>15000-174</td><td>ePet firmy BioHit</td></tr><tr><td>Trypsyna ES</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td>0.25% Trypsyna w PBS</td></tr><tr><td>Standardowa trypsyna</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td>0.05% Trypsyna-EDTA</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Bufor</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do dysocjacji bez enzymów</td><td>Bufor</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina enzymów do dysocjacji</td><td>Bufor</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>500 mg Kolagenazy IV</td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2126</td><td>zamrozić w aliquotach 500 &amp;mu;L i unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.</td></tr><tr><td>DNAza</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>10-017CV</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan protaminy</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3369</td><td>8 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>Pożywka do różnicowania EB</td><td>pożywka</td><td></td><td></td><td>Proszę zapoznać się z recepturą w załączonym pliku Protocol.doc</td></tr><tr><td>10% IMDM</td><td>pożywka</td><td></td><td></td><td>Proszę zapoznać się z recepturą w załączonym pliku Protocol.doc</td></tr><tr><td>10% IMDM+cytokiny</td><td>pożywka</td><td></td><td></td><td>Proszę zapoznać się z recepturą w załączonym pliku Protocol.doc</td></tr><tr><td>20% anti-MEM</td><td></td><td></td><td></td><td>Proszę zapoznać się z recepturą w załączonym pliku Protocol.doc</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Komórkę macierzystą definiuje się jako komórkę zdolną zarówno do samoodnawiania, jak i do generowania wielu zróżnicowanych potomków. Embrionalne komórki macierzyste (ESC) pochodzą z blastocysty wczesnego zarodka i charakteryzują się pluripotencją w zakresie zdolności do różnicowania. Ich ogromny potencjał różnicowania sprawił, że stały się one przedmiotem licznych badań skoncentrowanych na opracowaniu metod skłaniania ich do generowania klinicznie użytecznych typów komórek. Niedawno udało się pomyślnie wydzielić krwiotwórcze komórki macierzyste (HSC) z mysich ESC, co zostało zaprezentowane w niniejszym protokole wideo. HSC, będące prawdopodobnie najszerzej wykorzystywaną klinicznie populacją komórek, są stosowane w leczeniu wielu nowotworów i schorzeń układu krwiotwórczego. Jednakże wielu pacjentów, którzy mogliby odnieść korzyść z terapii HSC, nie ma dostępu do odpowiednich dawców. ESC mogłyby stanowić alternatywne źródło HSC dla takich pacjentów. Poniższy protokół ustanawia podstawę, dzięki której można badać ESC-HSC i wspierać wysiłki zmierzające do izolacji HSC z ludzkich ESC. W tym protokole ESC są różnicowane w formie ciał embrionalnych (EB) przez 6 dni w dostępnej komercyjnie surowicy, wstępnie przeselekcjonowanej pod kątem optymalnego różnicowania krwiotwórczego. Następnie EB są dysocjowane i zarażane retrowirusowym genem HoxB4. Zainfekowane komórki pochodzące z EB są wysiewane na podłoże z komórkami stromy OP9 (linia komórek stromy szpiku kostnego pochodząca z czaszki myszy M-CSF-/-) i współhodowane przez dziesięć dni w obecności cytokin promujących hematopoezę. Podczas tej współhodowli zainfekowane komórki ulegają znacznej ekspansji, co prowadzi do wytworzenia heterogenicznej puli setek milionów komórek. Komórki te mogą być następnie wykorzystane do ratowania i rekonstytucji układu krwiotwórczego u myszy poddanych dawce letalnej napromieniowania.

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje proces otrzymywania transplantowalnych hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) oraz ich późniejszą iniekcję do letalnie napromieniowanych myszy biorców. W skrócie, ESC są różnicowane do postaci ciał embroidalnych, które następnie są infekowane retrowirusem HoxB4 i współhodowane z komórkami zrębowymi OP9 oraz cytokinami hematopoetycznymi.

Wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

Komórkę macierzystą definiuje się jako komórkę posiadającą zdolność zarówno do samoodnawiania, jak i do generowania wielu zróżnicowanych potomków. Embrionalne komórki macierzyste (ESC) są ...

W pierwszej kolejności pobieramy konfluencyjną hodowlę umsl w kolbie T 25. Przemywam ją PBS, a następnie dodaję kilka kropli trypsyny i pozostawiam na kilka minut. Widzę, że komórki odrywają się od płytki, więc jest to już właściwy moment.W porządku, teraz zbiorę komórki po trypsynizacji; warto jest krótko potrząsnąć probką z komórkami, aby rozbić skupiska komórek przed ich przeniesieniem na płytkę hodowlaną. Płytka pozostanie w inkubatorze przez około 30 do 45 minut. Teraz odwiruję te komórki, aby je zebrać, a następnie wykonam aspirację.Za kilka minut przeprowadzę resuspensję, aby móc odliczyć komórki. Po resuspensji i dokonaniu odliczenia pobiorę alikwot i rozcieńczę go do 50 ml, co pozwoli uzyskać odpowiednie stężenie wynoszące 100 komórek na kroplę, aby upewnić się, że komórki są w dobrym stanie. Obecnie mamy zbiornik.Wystarczy je ponownie lekko wymieszać, a następnie przelejemy je do zbiornika. Dobrze, to jest już zaprogramowane. Gotowe.Teraz jest w miarę prosto. Odwróć płytkę i odstaw ją na bok. Co kilka płytek lekko ją przechylam, aby roztwór nieco się przemiezał.Dobrze, to już pięć płytek. Teraz umieszczę je w inkubatorze. Są to nasze krople wiszące, które przygotowaliśmy dwa dni temu.Aby zatem zebrać materiał, wystarczy potrząsnąć płytkami, by zebrać krople. Zbiorę teraz całość, starając się robić to delikatnie, aby nie uszkodzić nadmiernie EV, używając pięciu lub sześciu ml PBS do przemycia płytek. Następnie pozostawiamy je na co najmniej 10 minut, aby EV osadziły się pod wpływem grawitacji.Po wizualnym potwierdzeniu, że ciała embroidalne (EBS) osiągnęły stabilność, usuwa się większość pożywki, ale nie całkowicie, aby nie zakłócić ich struktury. Dobrze. Teraz wstrząsamy je aż do szóstego dnia. Są to ciała embroidalne przygotowane sześć dni temu z pluripotencjalnych komórek macierzystych zarodkowych; zazwyczaj zbieramy je, lekko zakręcając płytkami.Podczas obracania płytek, komórki EDS ściągają się do centrum naczynia, co ułatwia ich korygowanie. Teraz należy pozwolić, aby komórki EDS osiadły grawitacyjnie na dnie probówki, po czym usuwa się medium i przeprowadza jednokrotne płukanie 10 ml, od 10 do 12 ml PBS. Dobrze, teraz odczekamy minutę.Teraz po prostu usunę P. Dodajemy 250 µL naszej mieszaniny enzymów oraz 1 ml [płynu], a następnie umieszczamy je w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Co jakiś czas, może kilka razy, podejdę i lekko nimi potrząsnę, aby je wymieszać, ponieważ EDTA opadło na dno. Obecnie dysponujemy tym bezenzymowym buforem do dysocjacji komórek, który otrzymujemy z gpro.Do każdej probówki dodamy około 8 ml tego roztworu. Następnie będziemy pipetować go za pomocą pipety 5 ml, aby zdysocjować komórki; w miarę powtarzania tej czynności zawiesina stanie się bardzo mętna. Jest to wizualna wskazówka świadcząca o tym, że komórki uległy rozproszeniu w medium. Teraz policzę komórki za pomocą wykluczenia trypanu; jeśli planujecie przeprowadzić infekcję lub obliczyć MOI, dokładne policzenie komórek jest bardzo ważne.Przygotuję więc dużą partię wirusa wraz z pożywką, komórkami o odpowiednim stężeniu oraz siarczanem białka. Następnie upewnię się, co do stanu komórek – ponownie powtórzę, że obawiam się ich wypadnięcia z zawiesiny. Dlatego zawsze staram się unikać nadmiernego rozpryskiwania i wiruję próbkę przy 2 500 rpm.Zbieram nasze komórki z 10. dnia, zachowując wszystkie roztwory z płukania. Wcześniej stosowaam jodek propidyny (PI), ale siedem nie jest tak jasne. Dzięki temu nie przenika ono w tak wiele kanałów, co daje znacznie czystszy obraz.Teraz po prostu pobieramy zmienną; jest to skuteczny sposób zapobiegania stratom objętości w igle. Nazywam się Shannon McKinney Freeman i jestem pracownikiem naukowym na etapie postdoc w George Families Life Attorney w Children's Hospital Boston.Dzisiaj omówimy sposób uzyskania populacji komórek zdolnych do transplantacji z embrionalnych komórek macierzystych myszy, w kontekście układu krwiotwórczego. Dlaczego przeprowadzamy ten eksperyment? Wiemy, że korzystając z tego systemu możemy uzyskać – a pierwotny protokół został opracowany w celu pozyskania z embrionalnych komórek macierzystych populacji komórek o aktywności hematopoetycznych komórek macierzystych, co oznacza, że były one zdolne do ratowania myszy po dawce promieniowania letalnego poprzez długotrwałą rekonstrukcję ich układu krwiotwórczego, trwającą przez całe życie organizmu i obejmującą wszystkie linie komórkowe krwi obwodowej.Właśnie dlatego opracowano ten protokół. Obecnie przeprowadzamy dalsze eksperymenty, aby zrozumieć fenotyp populacji komórek w obrębie tej otrzymanej, powiększonej populacji, które faktycznie pośredniczą w aktywności krwiotwórczych komórek macierzystych. Nie wiemy tego, wiemy jedynie, że populacja jest bardzo heterogenna i że komórki, które faktycznie ratują myszy, są niezwykle rzadkie w tej populacji komórek.W związku z tym staramy się w zasadzie zdefiniować jego fenotyp, aby móc go wyizolować z tych bardzo heterogennych komórek. Następnie najbardziej interesuje nas zrozumienie, jak pod względem funkcjonalnym wypada on w porównaniu z pełnowartościową hematopoietic stem cell, jaką można by uzyskać z całego szpiku kostnego. Czy posiada on taką samą zdolność do rekonstrukcji pod względem rozwojowym, czy wydaje się odzwierciedlać HSC z dorosłego szpiku kostnego?A może jest to bardziej podobne do komórki macierzystej krwiotwórczej. Można by ją znaleźć we wczesnym rozwoju, na przykład w ciele żółtkowym lub w wątrobie płodowej. To jest właśnie to, co ostatecznie staramy się zrozumieć; chcemy uzyskać odpowiedzi na te pytania, ponieważ docelowo chcielibyśmy, aby ten protokół posłużył za podstawę do podobnych badań, które planujemy przeprowadzić z ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi.Uważamy, że informacje, które pozyskamy dzięki systemowi matematycznemu, znacząco pomogą w przyszłych eksperymentach. Sądzę, że kluczowe są dwie kwestie. Po pierwsze, jest to dobry model in vitro, a po drugie, dobry model rozwoju in feature.Przede wszystkim staramy się zrozumieć rozwój hematopoetycznych komórek macierzystych. Jest to zatem bardzo prosty system, pozwalający na ektopową ekspresję genów i badanie wpływu tych procesów na rozwój hematopoetycznych komórek macierzystych. Jest to niezwykle użyteczne z punktu widzenia podstawowych badań naukowych.Ostatecznie jednak chcielibyśmy opracować pewien rodzaj terapii komórkowej, która mogłaby być stosowana klinicznie do pozyskiwania, jak wiadomo, transplantowalnych metabolicznych komórek macierzystych z ludzkich komórek. Jednak prawdopodobnie jest to perspektywa odległej przyszłości. W rzeczywistości odkryliśmy, że najtrudniejszą częścią nie jest samo pozyskiwanie komórek, lecz w toku starannych eksperymentów zauważyliśmy, że istniał pewien okres, w którym mieliśmy trudności z doprowadzeniem do tego, aby komórki te zrekonstytuowały organizmy zwierząt biorców.Ostatecznie odkryliśmy, że musimy bardzo uważnie podejść do ablacji biorców, ponieważ komórki te nie posiadają odpowiednich zdolności. Zazwyczaj podczas przeszczepu u myszy z wykorzystaniem komórek macierzystych szpiku kostnego podaje się od 10 do 11 Gy promieniowania w celu ablacji myszy, a komórki macierzyste szpiku kostnego są w stanie uratować zwierzęta po takim zabiegu. Okazało się jednak, że ta populacja komórek, którą namnażamy, nie jest w stanie uratować zwierząt po tak wysokiej dawce promieniowania jonizującego.W związku z tym musieliśmy bardzo starannie dostosować dawkę napromieniowania, zwracając uwagę na wielkość zwierząt, ponieważ odkryliśmy, że w przypadku zbyt dużych osobników przy zastosowaniu tej samej dawki ablacja nie była przeprowadzona efektywnie. Z drugiej strony, jeśli zwierzęta nie zostaną wystarczająco napromieniowane, komórki nie będą w stanie konkurować z bardziej odpornymi gospodarzami.Zatem gdy uświadomiliśmy sobie, że była to kluczowa zmienna utrudniająca nam obserwację aktywności tych komórek i w zasadzie miareczkowaliśmy dawkę napromieniowania, zauważyliśmy również, że wiek i masa ciała zwierzęcia mają bardzo istotne znaczenie; dopiero wtedy nasze eksperymenty zaczęły być bardzo powtarzalne. Odkryliśmy zatem, że jeśli wykorzysta się zwierzęta o masie około 20 g, od 15 do 20 g, i podda się je ablacji dawką 9,25 Gy, wydaje się to być dawką optymalną, która daje tym komórkom niezbędną przewagę do rekonstytucji myszy. Tak, uważam, że była to jedna z najważniejszych zmiennych.Kolejną istotną kwestią jest liczba wstrzykiwanych komórek. Wyznaczyliśmy również miano, stosując te konkretne warunki napromieniowania naszego organizmu modelowego. Określiliśmy także miano dla tej niefrakcjonowanej, heterogenicznej puli komórek, które wstrzykiwaliśmy myszom.Ustaliliśmy w zasadzie, że do uratowania zwierząt wymagana jest minimalna dawka wynosząca od około 2 milionów do 5 milionów komórek. Jeśli wstrzyknie się mniej, zwierzęta nie zostaną uratowane. Sądzę, że świadczy to o tym, iż prawdopodobnie tylko rzadka populacja komórek w tej heterogenicznej frakcji pośredniczy w procesie ratowania.Sądzę więc, że najważniejszymi zmiennymi są liczba wstrzykiwanych komórek oraz upewnienie się, że w każdym zastosowanym modelu transplantacji poddano komórki naświetlaniu w stopniu wystarczającym, aby zapewnić im przewagę niezbędną do rekonstytucji, ale nie tak silnym, by nie były one zdolne do ratowania organizmu. Czynniki te stanowiły główne zmienne.

derivation-hematopoietic-stem-cells-from-murine-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wyprowadzenie hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych

Zdolność ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do samoodnawiania oraz różnicowania się we wszystkie typy komórek organizmu sprawia, że stanowią one ogromną obietnicę zarówno w zastosowaniach medycznych, jak i jako narzędzie badawcze służące do odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące rozwoju i chorób. W niniejszym materiale przedstawiamy zwięzły, szczegółowy protokół izolacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z embrionów poprzez immunosurgicalną izolację masy komórkowej...

Wytwarzanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych metodą immunochirurgii

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Manipulowanie czasową ekspresją genów w różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) można osiągnąć za pomocą indukowalnych systemów genetycznych. Jednak wytwarzanie tych linii komórkowych jest kosztowne i czasochłonne. Protokół ten zapewnia szybką ekspresję transgenu w różnicujących się komórkach pochodzących z ES, a następnie analizę dalszego różnicowania układu krwiotwórczego.

Zakażenie retrowirusowe mysich embrionalnych komórek ciała zarodkowego pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do analizy różnicowania układu krwiotwórczego

W tym protokole zostanie zilustrowane pochodzenie komórek progenitorowych serca zarówno z mysich, jak i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Główną strategią w tym protokole jest wzbogacenie komórek progenitorowych serca za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu fluorescencyjnych reporterów zmodyfikowanych w embrionalnych liniach komórek macierzystych.

Wyprowadzenie komórek progenitorowych serca z embrionalnych komórek macierzystych

Mysie embrionalne komórki macierzyste mogą być różnicowane do limfocytów T in vitro za pomocą systemu kohodowli OP9-DL1. Powodzenie tej procedury wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na konserwację odczynnika/ogniwa oraz kluczowych kroków wrażliwych na technikę. W tym miejscu omawiamy te krytyczne parametry i przedstawiamy szczegółowy protokół, aby zachęcić do przyjęcia tej technologii.

Wyprowadzanie limfocytów T in vitro z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje indukcję programu hemogennego w mysich fibroblastach embrionalnych poprzez nadekspresję minimalnego zestawu czynników transkrypcyjnych. Technologia ta może zostać przełożona na system ludzki, aby zapewnić platformy do przyszłych badań nad hematopoezą, chorobami hematologicznymi i przeszczepem krwiotwórczych komórek macierzystych.

Przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy za pomocą czynników transkrypcyjnych w celu wywołania programu hemogennego

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), używane do różnicowania hPSC na hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+. Metoda ta wykorzystuje specyficzną dla etapu manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT w celu określenia komórek wyłącznie do ostatecznego lub pierwotnego programu krwiotwórczego.

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten artykuł opisuje protokół efektywnego pozyskiwania i hodowli pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z embrionów myszy w stadium blastocysty.

Pozyskiwanie linii komórek macierzystych z zarodków myszy przed implantacją

Tutaj prezentujemy metodologię analizy klonalnej prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych podczas rozwoju embrionalnego u myszy. Łączymy sortowanie indeksowe pojedynczych komórek z zarodkowego regionu aorta-gonad-śródnercze z kohodowlą i przeszczepem komórek śródbłonka, aby scharakteryzować właściwości fenotypowe i potencjał wszczepienia pojedynczych prekursorów krwiotwórczych.

Analiza klonalna embrionalnych prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu sortowania indeksu pojedynczej komórki w połączeniu z kohodowlą niszy komórek śródbłonka

Prezentowany tutaj jest prosty protokół do bezpośredniego różnicowania hemogennych komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia.

Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę wyprowadzania hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych. Protokół obejmuje różnicowanie w ciałach zarodkowych, ekspansję na warstwach OP9 oraz przeszczepianie do napromieniowanych myszy.

Wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów