Wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

W pierwszej kolejności pobieramy konfluencyjną hodowlę umsl w kolbie T 25. Przemywam ją PBS, a następnie dodaję kilka kropli trypsyny i pozostawiam na kilka minut. Widzę, że komórki odrywają się od płytki, więc jest to już właściwy moment.

W porządku, teraz zbiorę komórki po trypsynizacji; warto jest krótko potrząsnąć probką z komórkami, aby rozbić skupiska komórek przed ich przeniesieniem na płytkę hodowlaną. Płytka pozostanie w inkubatorze przez około 30 do 45 minut. Teraz odwiruję te komórki, aby je zebrać, a następnie wykonam aspirację.

Za kilka minut przeprowadzę resuspensję, aby móc odliczyć komórki. Po resuspensji i dokonaniu odliczenia pobiorę alikwot i rozcieńczę go do 50 ml, co pozwoli uzyskać odpowiednie stężenie wynoszące 100 komórek na kroplę, aby upewnić się, że komórki są w dobrym stanie. Obecnie mamy zbiornik.

Wystarczy je ponownie lekko wymieszać, a następnie przelejemy je do zbiornika. Dobrze, to jest już zaprogramowane. Gotowe.

Teraz jest w miarę prosto. Odwróć płytkę i odstaw ją na bok. Co kilka płytek lekko ją przechylam, aby roztwór nieco się przemiezał.

Dobrze, to już pięć płytek. Teraz umieszczę je w inkubatorze. Są to nasze krople wiszące, które przygotowaliśmy dwa dni temu.

Aby zatem zebrać materiał, wystarczy potrząsnąć płytkami, by zebrać krople. Zbiorę teraz całość, starając się robić to delikatnie, aby nie uszkodzić nadmiernie EV, używając pięciu lub sześciu ml PBS do przemycia płytek. Następnie pozostawiamy je na co najmniej 10 minut, aby EV osadziły się pod wpływem grawitacji.

Po wizualnym potwierdzeniu, że ciała embroidalne (EBS) osiągnęły stabilność, usuwa się większość pożywki, ale nie całkowicie, aby nie zakłócić ich struktury. Dobrze. Teraz wstrząsamy je aż do szóstego dnia. Są to ciała embroidalne przygotowane sześć dni temu z pluripotencjalnych komórek macierzystych zarodkowych; zazwyczaj zbieramy je, lekko zakręcając płytkami.

Podczas obracania płytek, komórki EDS ściągają się do centrum naczynia, co ułatwia ich korygowanie. Teraz należy pozwolić, aby komórki EDS osiadły grawitacyjnie na dnie probówki, po czym usuwa się medium i przeprowadza jednokrotne płukanie 10 ml, od 10 do 12 ml PBS. Dobrze, teraz odczekamy minutę.

Teraz po prostu usunę P. Dodajemy 250 µL naszej mieszaniny enzymów oraz 1 ml [płynu], a następnie umieszczamy je w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Co jakiś czas, może kilka razy, podejdę i lekko nimi potrząsnę, aby je wymieszać, ponieważ EDTA opadło na dno. Obecnie dysponujemy tym bezenzymowym buforem do dysocjacji komórek, który otrzymujemy z gpro.

Do każdej probówki dodamy około 8 ml tego roztworu. Następnie będziemy pipetować go za pomocą pipety 5 ml, aby zdysocjować komórki; w miarę powtarzania tej czynności zawiesina stanie się bardzo mętna. Jest to wizualna wskazówka świadcząca o tym, że komórki uległy rozproszeniu w medium. Teraz policzę komórki za pomocą wykluczenia trypanu; jeśli planujecie przeprowadzić infekcję lub obliczyć MOI, dokładne policzenie komórek jest bardzo ważne.

Przygotuję więc dużą partię wirusa wraz z pożywką, komórkami o odpowiednim stężeniu oraz siarczanem białka. Następnie upewnię się, co do stanu komórek – ponownie powtórzę, że obawiam się ich wypadnięcia z zawiesiny. Dlatego zawsze staram się unikać nadmiernego rozpryskiwania i wiruję próbkę przy 2 500 rpm.

Zbieram nasze komórki z 10. dnia, zachowując wszystkie roztwory z płukania. Wcześniej stosowaam jodek propidyny (PI), ale siedem nie jest tak jasne. Dzięki temu nie przenika ono w tak wiele kanałów, co daje znacznie czystszy obraz.

Teraz po prostu pobieramy zmienną; jest to skuteczny sposób zapobiegania stratom objętości w igle. Nazywam się Shannon McKinney Freeman i jestem pracownikiem naukowym na etapie postdoc w George Families Life Attorney w Children's Hospital Boston.

Dzisiaj omówimy sposób uzyskania populacji komórek zdolnych do transplantacji z embrionalnych komórek macierzystych myszy, w kontekście układu krwiotwórczego. Dlaczego przeprowadzamy ten eksperyment? Wiemy, że korzystając z tego systemu możemy uzyskać – a pierwotny protokół został opracowany w celu pozyskania z embrionalnych komórek macierzystych populacji komórek o aktywności hematopoetycznych komórek macierzystych, co oznacza, że były one zdolne do ratowania myszy po dawce promieniowania letalnego poprzez długotrwałą rekonstrukcję ich układu krwiotwórczego, trwającą przez całe życie organizmu i obejmującą wszystkie linie komórkowe krwi obwodowej.

Właśnie dlatego opracowano ten protokół. Obecnie przeprowadzamy dalsze eksperymenty, aby zrozumieć fenotyp populacji komórek w obrębie tej otrzymanej, powiększonej populacji, które faktycznie pośredniczą w aktywności krwiotwórczych komórek macierzystych. Nie wiemy tego, wiemy jedynie, że populacja jest bardzo heterogenna i że komórki, które faktycznie ratują myszy, są niezwykle rzadkie w tej populacji komórek.

W związku z tym staramy się w zasadzie zdefiniować jego fenotyp, aby móc go wyizolować z tych bardzo heterogennych komórek. Następnie najbardziej interesuje nas zrozumienie, jak pod względem funkcjonalnym wypada on w porównaniu z pełnowartościową hematopoietic stem cell, jaką można by uzyskać z całego szpiku kostnego. Czy posiada on taką samą zdolność do rekonstrukcji pod względem rozwojowym, czy wydaje się odzwierciedlać HSC z dorosłego szpiku kostnego?

A może jest to bardziej podobne do komórki macierzystej krwiotwórczej. Można by ją znaleźć we wczesnym rozwoju, na przykład w ciele żółtkowym lub w wątrobie płodowej. To jest właśnie to, co ostatecznie staramy się zrozumieć; chcemy uzyskać odpowiedzi na te pytania, ponieważ docelowo chcielibyśmy, aby ten protokół posłużył za podstawę do podobnych badań, które planujemy przeprowadzić z ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi.

Uważamy, że informacje, które pozyskamy dzięki systemowi matematycznemu, znacząco pomogą w przyszłych eksperymentach. Sądzę, że kluczowe są dwie kwestie. Po pierwsze, jest to dobry model in vitro, a po drugie, dobry model rozwoju in feature.

Przede wszystkim staramy się zrozumieć rozwój hematopoetycznych komórek macierzystych. Jest to zatem bardzo prosty system, pozwalający na ektopową ekspresję genów i badanie wpływu tych procesów na rozwój hematopoetycznych komórek macierzystych. Jest to niezwykle użyteczne z punktu widzenia podstawowych badań naukowych.

Ostatecznie jednak chcielibyśmy opracować pewien rodzaj terapii komórkowej, która mogłaby być stosowana klinicznie do pozyskiwania, jak wiadomo, transplantowalnych metabolicznych komórek macierzystych z ludzkich komórek. Jednak prawdopodobnie jest to perspektywa odległej przyszłości. W rzeczywistości odkryliśmy, że najtrudniejszą częścią nie jest samo pozyskiwanie komórek, lecz w toku starannych eksperymentów zauważyliśmy, że istniał pewien okres, w którym mieliśmy trudności z doprowadzeniem do tego, aby komórki te zrekonstytuowały organizmy zwierząt biorców.

Ostatecznie odkryliśmy, że musimy bardzo uważnie podejść do ablacji biorców, ponieważ komórki te nie posiadają odpowiednich zdolności. Zazwyczaj podczas przeszczepu u myszy z wykorzystaniem komórek macierzystych szpiku kostnego podaje się od 10 do 11 Gy promieniowania w celu ablacji myszy, a komórki macierzyste szpiku kostnego są w stanie uratować zwierzęta po takim zabiegu. Okazało się jednak, że ta populacja komórek, którą namnażamy, nie jest w stanie uratować zwierząt po tak wysokiej dawce promieniowania jonizującego.

W związku z tym musieliśmy bardzo starannie dostosować dawkę napromieniowania, zwracając uwagę na wielkość zwierząt, ponieważ odkryliśmy, że w przypadku zbyt dużych osobników przy zastosowaniu tej samej dawki ablacja nie była przeprowadzona efektywnie. Z drugiej strony, jeśli zwierzęta nie zostaną wystarczająco napromieniowane, komórki nie będą w stanie konkurować z bardziej odpornymi gospodarzami.

Zatem gdy uświadomiliśmy sobie, że była to kluczowa zmienna utrudniająca nam obserwację aktywności tych komórek i w zasadzie miareczkowaliśmy dawkę napromieniowania, zauważyliśmy również, że wiek i masa ciała zwierzęcia mają bardzo istotne znaczenie; dopiero wtedy nasze eksperymenty zaczęły być bardzo powtarzalne. Odkryliśmy zatem, że jeśli wykorzysta się zwierzęta o masie około 20 g, od 15 do 20 g, i podda się je ablacji dawką 9,25 Gy, wydaje się to być dawką optymalną, która daje tym komórkom niezbędną przewagę do rekonstytucji myszy. Tak, uważam, że była to jedna z najważniejszych zmiennych.

Kolejną istotną kwestią jest liczba wstrzykiwanych komórek. Wyznaczyliśmy również miano, stosując te konkretne warunki napromieniowania naszego organizmu modelowego. Określiliśmy także miano dla tej niefrakcjonowanej, heterogenicznej puli komórek, które wstrzykiwaliśmy myszom.

Ustaliliśmy w zasadzie, że do uratowania zwierząt wymagana jest minimalna dawka wynosząca od około 2 milionów do 5 milionów komórek. Jeśli wstrzyknie się mniej, zwierzęta nie zostaną uratowane. Sądzę, że świadczy to o tym, iż prawdopodobnie tylko rzadka populacja komórek w tej heterogenicznej frakcji pośredniczy w procesie ratowania.

Sądzę więc, że najważniejszymi zmiennymi są liczba wstrzykiwanych komórek oraz upewnienie się, że w każdym zastosowanym modelu transplantacji poddano komórki naświetlaniu w stopniu wystarczającym, aby zapewnić im przewagę niezbędną do rekonstytucji, ale nie tak silnym, by nie były one zdolne do ratowania organizmu. Czynniki te stanowiły główne zmienne.