Hodowla piskląt ex ovo i test CAM ex ovo: jak to naprawdę działa

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) jest unikalnym, naturalnie pozbawionym odporności środowiskiem wspomagającym hodowlę do badania angiogenezy i nowotworzenia. Ten artykuł wideo przedstawia różne etapy hodowli piskląt ex ovo, zastosowanie substancji potencjalnie angiogennych i udaną inokulację komórek i tkanek nowotworowych na powierzchni CAM.

Cześć, nazywam się Susan Paa. Pochodzę z Instytutu Chemii Fizjologicznej, wydziału endokrynologii biochemicznej na Uniwersytecie w Burg Esen w Niemczech. Cześć, nazywam się Daniel ze Basian Dole.

Pochodzę z tej samej instytucji co Susan. Cześć, jestem Mann i pracuję w Instytucie Anatomii na Wydziale Neurologii Uniwersytetu w Burgu. Pokażemy Ci, jak naprawdę działa kultura CH X i esej o membranie CO.

Chodźmy więc do laboratorium. W większości ostatnich badań eksperymentalnych krzywka, jaką jest błona Chico, została odsłonięta poprzez przecięcie okienka przez skorupkę jajka, a eksperymenty przeprowadzono in ovo, co skutkowało znacznymi ograniczeniami w dostępności CAM oraz w możliwościach obserwacji i dokumentacji fotograficznej efektów. Hodowle x ovo zarodków piskląt znacznie ułatwiają dostęp do zarodka pisklęcia.

Proszę zobaczyć bijące serce, co umożliwia łatwą dokumentację efektów in vivo i eksperymentalną manipulację zarodkiem. W naszym artykule wideo przedstawimy krok po kroku demonstrację udanego zastosowania kultury X ovo w przypadku dużej liczby pytań naukowych. Jaja inkubuje się w inkubatorze z ruchomą tacą.

Tutaj możesz zobaczyć, jak element grzejny i wózek do tacek obracają jajka 12 razy dziennie w sposób ciągły. Wilgotność jest utrzymywana na poziomie 60% poprzez dodawanie wody do plastikowych pojemników na dnie inkubatora, a temperatura inkubacji jest ustawiana na 37,5 stopnia Celsjusza przed rozpoczęciem inkubacji. Brud, pióra i odchody są ostrożnie usuwane ze skorupek jaj, mechanicznie przecierając jaja etanolem lub środkiem dezynfekującym, jednak znacznie zmniejszają przeżywalność zarodków.

Jaja są umieszczane poziomo na ruchomej tacy inkubatora. Upewnij się, że zachowałeś wystarczającą odległość między poszczególnymi jajami, aby umożliwić swobodny obrót. Po inkubacji Przez 72 godziny jaja wyjmuje się z inkubatora, a górną stronę jaj, w której znajduje się zarodek, zaznacza się ołówkiem.

Ponieważ zarodek jest do pewnego stopnia odporny na rotację i pozostaje tutaj zlokalizowany Dla lepszego samopoczucia nie należy używać rękawiczek do rozbijania jaj, ale ręce należy zdezynfekować 70% etanolem. Jajko trzyma się poziomo ze śladem ołówka na górze i rozbija na krawędzi trójkątnego mieszadła magnetycznego Aby zapewnić maksymalną kontrolę siły podczas zabiegów pękania, łokcie nie powinny spoczywać na blacie stołu. Ważne jest, aby skorupka jajka, a także błona jaja były otwarte podczas pękania, wyciek białka jaja jest bezpiecznym znakiem, że błona jaja została perforowana.

Jajko trzyma się blisko dna naczynia patriotycznego. Aby uniknąć dalszego wycieku białka jaja podczas tej wstępnej procedury otwierania, ważne jest, aby białko jajka na dnie naczynia patriotycznego było nadal połączone z resztą wewnątrz jajka. Ponieważ powoduje to powstanie próżni wewnątrz jaja, która utrzymuje żółtko na miejscu poprzez delikatne wywieranie nacisku na meridian biegnący przez szczelinę i równik jaja kciukiem i środkowymi palcami, możliwe jest regulowanie podciśnienia i ekstruzji zawartości jaja.

Zawartość jaja można następnie przenieść na szalkę Petriego z nieuszkodzonym żółtkiem. Jeśli jajo zostanie delikatnie podniesione, a obie połówki skorupy zostaną ostrożnie oddzielone, Kultury ex ovo Następnie umieszcza się na tacy, wraca do inkubatora i utrzymuje w temperaturze od 37,5 do 38,2 stopni Celsjusza i wilgotności 70%. Dopływ dwutlenku węgla lub tlenu nie jest konieczny.

W przypadku stosowania specjalnych naczyń patriot z przekładkami między pokrywą a naczyniem oraz inkubatorów z kratką wentylacyjną, kratka wentylacyjna powinna być otwarta do połowy. Bibuły filtracyjne do autoklawu są używane jako materiał nośny dla płynnych substancji nakładanych na krzywkę, ponieważ wydają się powodować najmniejsze podrażnienie krzywki. Miejsce aplikacji powinno znajdować się w połowie odległości między zarodkiem a granicą krzywki, ponieważ w przeciwnym razie zarodek utrudnia mikroskopową obserwację efektów w świetle przechodzącym.

Płyn w tym przypadku atropina należy nałożyć natychmiast po umieszczeniu filtra na krzywce, aby uniknąć wysuszenia. Dodatkowe dawki lub bufor należy stosować ponownie każdego dnia. Gdy krzywka jest w pełni rozwinięta, można zastosować do sześciu różnych próbek, a efekty można porównać na Pojedyncze pierścienie krzywkowe wycięte Z jednego mililitra końcówka pipety powinna być cięta tak cienko, jak to możliwe, aby zminimalizować wagę i uniknąć wgnieceń krzywki.

Pierścień jest następnie nakładany na krzywkę, a komórki są pipetowane do pierścienia. Strzykawkę Hamilton Microlitr przepłukuje się kilkakrotnie 70% etanolem, a na koniec sterylną solą fizjologiczną buforowaną fosforanem lub PBS, Mikrostrzykawkę napełnia się ostrożnie przygotowaną zawiesiną komórkową, ale szybko penetruj krzywkę i warstwy oczu za pomocą igły strzykawki i w sposób ciągły wstrzykuj zawiesinę komórek. Igła powinna pozostać w oku przez kilka sekund, aby uniknąć utraty wstrzykniętej zawiesiny komórek Poprzez kontrolę szczelności X Ovo.

Kultury jaj inkubowanych przez trzy dni są wykorzystywane jako dawcy zawiązków kończyn. Zarodek jest wycinany z połączonych naczyń żółtkowych. Przecinając okrąg, zarodek przenosi się na szalkę Petriego wypełnioną zimnym sterylnym PBS za pomocą małej łyżki do drenażu i myje przez mieszanie.

Zarodek jest następnie przenoszony na świeżą szalkę Petriego wypełnioną sterylnym PBS i uwalniany od otaczających błon, ostrożnie rozrywając je cienkimi kleszkami. Zawiązki kończyn są odłączane kleszczami jak najbliżej ciała, chwytane i przenoszone do krzywki ośmio- do 10-dniowego kurczaka żywiciela. W pożądanym miejscu aplikacji krzywka jest selektywnie uszkadzana przez delikatne skrobanie jednym kawałkiem kleszczy.

Następnie przeszczep jest chwytany i nakładany na krzywkę z drugim kawałkiem kleszczy. Ofiara samicy myszy jest umocowana na planszy. Ściana brzucha jest zwilżona 70% etanolem ciętym wzdłuż linii środkowej, a płaty skóry są mocowane bocznie za pomocą szpilek.

Macicę usuwa się z brzucha, odłącza i przenosi do zlewki. Z zimnym PBS. Błony embrionalne są ostrożnie usuwane za pomocą kleszczy w celach demonstracyjnych.

Pokazano tutaj 16-dniowy zarodek myszy dla lepszej widoczności zawiązków kończyn. Uzyskuje się tylko optymalne wyniki szczepienia. Jeśli jednak używa się zawiązków kończyn z zarodków w wieku od 10 do 13 dni, zawiązki kończyn są odcinane lub używa się cienkich kleszczy jak najbliżej ciała.

W pożądanym miejscu aplikacji CAM jest selektywnie uszkadzany przez delikatne skrobanie kleszczami. Następnie pąki kończyn są chwytane i przenoszone do CAM ośmio- do 10-dniowego kurczaka żywiciela. Przeszczep umieszcza się raz lub dwa razy po tej stronie krzywki, gdzie nie ma na celu końcowego szczepienia w celu usunięcia nadmiaru PBS.

Przeszczepy są idealnie umieszczone na krzywce w pobliżu rozwidlenia Y guza naczynia krwionośnego. Biopsje są cięte na jeden do dwóch milimetrowych kawałków za pomocą sterylnych skalpeli. Pobranie materiału z powierzchni biopsji zwiększa ryzyko zanieczyszczenia mięśni lub tkanki łącznej.

W pożądanym miejscu aplikacji CAM jest selektywnie uszkadzany przez delikatne skrobanie. Fragment rdzenia próbki biopsji jest szczepiony na CAM kurczaka żywiciela w wieku od 8 do 10 dni. Przeszczepy są idealnie umieszczone na krzywce w pobliżu rozwidlenia Y naczynia krwionośnego.

Przeszczep jest następnie przenoszony do CAM z dołączonym minimalnym PBS. Można zastosować lekki nacisk, aby wmanewrować przeszczep w powstałe wgłębienie krzywki. Zarodek pisklęcia gospodarza jest zabijany przez ścięcie.

CAM z dołączonym przeszczepem jest usuwany przez okrągłe cięcie i przenoszony na szalkę Petriego wypełnioną PBS. Nadmiar CAM jest wycinany z przeszczepu, z wyjątkiem poprzedniego miejsca przyczepu. Ponownie w żądanym miejscu aplikacji.

Krzywka nowego zarodka pisklęcia gospodarza jest selektywnie traumatyzowana przez delikatne skrobanie, a przeszczep jest przenoszony do krzywki drugiego gospodarza z minimalnym dołączonym PBS. Właśnie pokazaliśmy, jak naprawdę działa CH X lub kultura. Pokazałem Wam zalety w porównaniu z eksperymentami Orval i podałem kilka przykładów jego zastosowania.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.