Szybka, wysokoprzepustowa metoda mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Aby zmapować miejsca wiązania białek jądrowych rybo na pre mRNA, zacznij od ułożenia płytek w wyznaczonym regionie interesującego nas prem NNA w 30 oknach nukleotydowych i zsyntetyzuj kafelkowate oligonukleotydy na tablicy. Oligonukleotydy są gotowane z matrycy i wytrącane za pomocą RNP będącego przedmiotem zainteresowania. Łączna pula początkowa jest oznaczona jako SCI trzy, a powiązana pula jest oznaczona jako SCI pięć i obie są stosowane do tablicy wykrywania.

Macierz jest następnie skanowana, a oprogramowanie do wyodrębniania cech jest używane do interpretacji wyników. Sole. Cześć, nazywam się Kate Watkins i pracuję w laboratorium brata Willa Faira na Wydziale MCB Uniwersytetu Browna. Dzisiaj pokażę Ci szybką i niedrogą procedurę określania dokładnej lokalizacji kompleksu białkowego RNA na prem RA w laboratorium, rere syntetyzować prem A jako pulę nakładających się oligonukleotydów.

Pula ta może być następnie rozdzielona na frakcję związaną i niezwiązaną przez koimmunoprecypitację, a następnie analizowana za pomocą mikromacierzy. Chociaż ta procedura ma wiele zastosowań, używamy jej do badania wielu czynników splicingu i ich roli oraz alternatywnego splicingu. Więc zacznijmy.

Aby rozpocząć tę procedurę, użyj przeglądarki genomu uc SC, aby pobrać określone geny, połączenia splicingowe lub inne obszary zainteresowania, na podstawie których zaprojektować pulę prem A. Wybierz interesujące Cię okna, a następnie kafelkuj je obliczeniowo z długością odczytu 30 nukleotydów i nakładaniem się 20 nukleotydów, tak aby każdy oligonotyd był przesunięty o 10 nukleotydów od poprzedniego. Teraz, gdy zdefiniowano 30 długich oligonukleotydów, każdy z nich otacza uniwersalne sekwencje starterów.

Prześlij oligonukleotydy do firmy Agilent w celu wydrukowania na niestandardowej mikromacierzy oligonukleotydowej. Po przybyciu mikromacierzy zacznij odzyskiwać oligonukleotydy DNA z jej powierzchni, umieszczając szkiełko pokrywowe macierzy w komorze hybrydyzacji macierzy i delikatnie pipetując 500 mikrolitrów dejonizowanej wody na szkiełko. Umieść szkiełko z mikromacierzą stroną zadrukowaną do dołu na szkiełku okładkowym, tak aby etykiety na każdym szkiełku były skierowane do siebie i uważaj, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, które mogą zakłócić proces odzyskiwania oligonugo.

Zamknij komorę hybrydyzacyjną i obróć ją przez noc w temperaturze 99 stopni Celsjusza w piecu do hybrydyzacji Następnego dnia ostrożnie wyjmij matrycę z komory i odciągnij wodę, która teraz zawiera oligonukleotydy uwolnione z powierzchni matrycy. Umieść kałużę uwolnionego oligo w 1,5-mililitrowej probówce einor i poddaj sonikacji, aby rozbić potencjalne grudki o amplitudzie 50% trzy razy przez trzy do pięciu sekundowych impulsów za każdym razem. Następnie amplifikuj pulę przez PCR o niskim cyklu przy użyciu uniwersalnych starterów z promotorem T dołączonym na ich końcu.

Liczba wymaganych cykli może się różnić w zależności od wydajności odzysku oligo. Unikaj nadmiernego wzmacniania, które jest widoczne jako rozmazana opaska na żelu akrylowym. Na koniec użyj zestawu mega krótkich skryptów od Amon do transkrypcji RNA.

Zakończ reakcję transkrypcji przez ekstrakcję RNA chloroformem fenylu, a następnie wytrącanie etanolu przy użyciu octanu sodu, a także błękitu glikologicznego jako nośnika. Resus zawiesić osad RNA w 105 mikrolitrach buforu TE. Aby dokładnie określić stężenie RNA.

Użyj zieleni rybo, aby wygenerować krzywą standardową. Następnie zmierz za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Pula RNA jest teraz gotowa do koimmunoprecypitacji, aby rozpocząć ściąganie.

Najpierw przygotuj kulki magnetyczne, łącząc kulki dyna białka A i białka G w stosunku jeden do jednego do końcowej objętości 50 mikrolitrów na reakcję. Skoncentruj kulki w jednym miejscu za pomocą magnetycznego stojaka separacyjnego w celu usunięcia supernatantu. Następnie umyj dwa razy równą objętością zimnego XPBS po drugim praniu.

Resus, zawieś kulki w równej objętości zimnego XPBS i dodaj dwa nanogramy perionu przeciwciała. Ilość ta może się różnić w zależności od przeciwciała, więc konieczne mogą być eksperymenty, aby znaleźć optymalne warunki do związania przeciwciała z kulkami. Inkubuj mieszaninę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na obrotowej platformie.

Rano dodaj dwa mikrogramy na reakcję sonikowanego całkowitego RNA drożdży, aby zablokować niespecyficzne wiązanie i obracać przez dodatkowe 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu etapu blokowania ponownie użyj stojaka magnetycznego, aby usunąć supernatant. Następnie umyj kulki dwukrotnie zimnym jednym XPBS, pozostawiając PBS z drugiego prania w probówce, podajcie 50 mikrolitrów mieszanki kulek do nowych probówek.

Jedna probówka na każdą reakcję co IP. Koraliki są teraz gotowe do współdziałania. Następnie przygotuj mieszankę główną, łącząc pulę oligonów RNA z ekstraktem z komórek jądrowych.

Jako źródło RNP weź 50 mikrolitrów podwielokrotności mieszanki głównej jako całkowitą ochronę próbki Startery, które są wersjami RNA uniwersalnych starterów, można dodawać, aby zapobiec wiązaniu się białka z sekwencją startera lub wprowadzeniu struktury drugorzędowej do RNA. Aby rozpocząć koimmunoprecypitację, należy usunąć supernatant z podwielokrotności kulek i ponownie zawiesić kulki w 120 mikrolitrach pozostałej mieszanki wzorcowej. Kołysz reakcjami w czterech stopniach Celsjusza przez jedną do dwóch godzin.

Pod koniec inkubacji mała Eloqua, łącznie z koralikami, może zostać usunięta z każdego składnika. W celu przeprowadzenia dodatkowych testów skuteczności wiązania lub swoistości, należy umieścić pozostałą część reakcji na magnesie i usunąć supernatant. Następnie wykonaj jedno lub dwa prania z zimnym XPDS.

RNA związany z przeciwciałem na kulkach przez RNP jest próbką IP. Ponownie zawiesić kulki IP w 50 mikrolitrach 1% SDS w buforze 0,1 XTE i podgrzewać próbki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 minut. Aby wymyć RNA, usuń supernatant, który teraz zawiera RNA, który był wcześniej związany z kulkami i wyczyść przez ekstrakcję chloroformem fenylu, a następnie wytrącić etanol, ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach buforu 0,1 XT.

Następnie dokonaj odwrotnej transkrypcji próbek za pomocą odwróconych uniwersalnych starterów. Następnie PCR amplifikować próbki uniwersalnymi starterami, z których jeden powinien zawierać promotor T 7. Liczba cykli wymaganych do wzmocnienia puli będzie zależeć od wydajności co ip.

Korzystając z zestawu skryptów mega shorts firmy ambion, ponownie przepisz próbki, ale tym razem dodaj dwa mikrolitry UTP allelu aminowego zamiast T seven UTP, który jest dołączony do zestawu. Allel aminowy UTP zostanie później wykorzystany do znakowania RNA bocznymi oczami. Po zakończeniu transkrypcji.

Ekstrakt chloroformu fenylowego i etanol wytrącają próbki. Nie należy stosować błękitu glikologicznego ani octanu amonu, które mogą zakłócać hybrydyzację próbek z matrycą. Resus zawiesić osad w 4,5 mikrolitrze 0,1 molowego węglanu sodu.

Aby najpierw oznaczyć próbki, dodaj 2,5 mikrolitra wody wolnej od nukleaz do całej próbki. Dodać trzy mikrolitry S3 i do próbki IP na trzy mikrolitry SCI pięć. Inkubuj w ciemności przez godzinę.

W temperaturze pokojowej zakończyć reakcję, dodając sześć mikrolitrów czterech molowych chlorowodorkowoloaminy HCL do każdej próbki, dokładnie wymieszać i odwirować. Krótko inkubować przez 15 minut W temperaturze pokojowej oczyścić oznakowane próbki przez ekstrakcję chloroformem fenylowym, a następnie wytrącić etanol. Większość koloru jest ściągana do fazy organicznej z wolnymi nukleotydami, więc granulki mogą nie być widocznie zabarwione.

Resus zawiesić każdą pelety w 50 mikrolitrach 0,1 XTE. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu do hybrydyzacji macierzy Agilent, aby przygotować próbkę mikromacierzy z następującym wyjątkiem. Nie fragmentuj RNA Po dodaniu buforu fragmentacyjnego natychmiast dodaj bufor hybrydyzacyjny w celu zatrzymania fragmentacji.

Umieść próbki na matrycy i hybrydyzuj w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez trzy godziny, podczas gdy matryca się obraca. Przygotuj następujące 50-mililitrowe roztwory w 50-mililitrowych stożkowych probówkach. Jedna probówka z dwoma nadmiarowymi SC, dwie probówki z jednym nadmiarem buforu morskiego i jedna probówka z wodą dejonizowaną.

Po trzygodzinnej inkubacji ostrożnie odblokować kanapkę z szkiełkiem macierzowym i umieścić w dwóch XSSC. Za pomocą pęsety. Delikatnie oddziel matrycę od szkiełka pokrywy.

Delikatnie zdejmij suwak pokrywy, uważając, aby nie dotknąć matrycy. Po wysunięciu szkiełka zamknij stożek i delikatnie odwróć przez 60 sekund. Za pomocą pęsety przenieś macierz do jednego roztworu XSSC.

Zakręć tubkę i delikatnie odwróć przez minutę. Następnie przenieś tablicę do drugiego roztworu XSSC i ponownie delikatnie odwróć przez kolejną minutę. Na koniec przenieś matrycę do probówki z wodą dejonizowaną i delikatnie odwróć przez 30 sekund.

Osusz matrycę, umieszczając krawędzie szkiełka na chusteczce kim. Kontynuuj obracanie matrycy na wycieraczce, uważając, aby nie naruszyć strony zawierającej oligonukleotydów. Umieść matrycę w pustej stożkowej tubie i przystąp do skanowania tablicy.

Kontynuuj skanowanie tablicy. Oto tablica reprezentatywna. Każda cecha lub oligo jest pokolorowana na zielono dla całkowitej puli niewzbogaconej lub na czerwono dla puli wzbogaconej o adresy IP.

Sygnał w każdej funkcji jest znormalizowany do całkowitego natężenia na tym kanale. Końcowym wynikiem jest stosunek logarytmiczny kanału czerwonego do kanału zielonego. Dla każdej cechy w macierzy średni wynik dla każdej współrzędnej genomowej jest odwzorowywany na daną lokalizację.

Ilustracja tego etapu uśredniania jest podana dla trzech nakładających się na siebie oligonukleotydów po 30 z wynikami dwóch, czterech i 0,5, gdzie pokazano średni wynik wzbogacenia dla każdego okna nukleotydowego. Oto przykład schematu wiązania dla białka wiążącego PTB śledzonego poliperyną w genie CLTA, cechy genu są podane wzdłuż dołu, a średnie wyniki wzbogacenia logarytmu dla S związanego z PTP są reprezentowane przez ciemnoczerwone pionowe paski. Jasnoczerwone paski pokazują obszary, które nie są wzbogacone dla powiązania PTP.

Właśnie pokazałem, jak szybko i skutecznie stworzyć pulę oligonukleotydów, która układa się w różne obszary zainteresowania, takie jak alternatywnie pokrojone aksony. Analizujemy nasze pule za pomocą mikromacierzy, ale możliwe jest również ich sekwencjonowanie za pomocą sekwencjonowania świetlnego, Lexi lub bardziej tradycyjnego sekwencjonowania Sangera. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, że tworzenie puli jest otwarte na modyfikację zarówno na poziomie RNA, jak i białka.

Na poziomie RNA możemy wprowadzić do sekwencji oligonukleotydów regiony autologiczne, mutacje chorobowe, polimorfizmy lub mutacje losowe. Na poziomie białka czynnik wiążący RNA może być modyfikowany przez fosforylację lub inne modyfikacje potranslacyjne. Ponadto można manipulować środowiskiem wiązania w celu zwiększenia lub zmniejszenia poziomu dodatkowych czynników, które konkurują lub oddziałują z białkiem wiążącym RNA, które jest przedmiotem zainteresowania.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.