Name: Szybka, wysokoprzepustowa metoda mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-02T15:46:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Poznaj szybką metodę mapowania miejsc wiązania rybonukleoprotein na ludzkim pre-mRNA z wykorzystaniem niestandardowych pul oligonukleotydów. Technika umożliwia precyzyjną analizę interakcji RNA-białko bez stronniczości tradycyjnych metod.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że tworzenie puli jest elastyczne i dopuszcza modyfikacje zarówno na poziomie RNA, jak i białka. Na poziomie RNA w sekwencji oligonukleotydowej można wprowadzić regiony ortologiczne, mutacje chorobowe, polimorfizmy lub mutacje losowe. Na poziomie białka czynnik wiążący RNA może zostać zmodyfikowany poprzez fosforylację lub inne modyfikacje potranslacyjne. Ponadto można manipulować środowiskiem wiązania, aby zwiększyć lub zmniejszyć poziom dodatkowych czynników, które odd...

szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (rnp) na ludzkim pre-mrna

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sekwencjonowanie RNA współwytrącanych immunochemicznie (co-IP) z białkami wiążącymi RNA zwiększyło naszą wiedzę na temat splicingu, wykazując, że miejsce wiązania często wpływa na funkcję czynnika splicingu. Jednakże, jak w przypadku każdej strategii próbkowania, prawdopodobieństwo zidentyfikowania RNA związanego z czynnikiem splicingu jest proporcjonalne do jego obfitości komórkowej. Opracowaliśmy nowatorskie podejście in vitro do badania specyficzności wiązania w przypadku przejściowego pre-mRNA. Podejście to wykorzystuje specjalnie zaprojektowaną pulę oligonukleotydów, które pokrywają w sposób kafelkowy introny, eksony, miejsca złączeń splicingu lub inne fragmenty pre-mRNA. Pula ta jest poddawana określonej selekcji molekularnej. W niniejszej pracy demonstrujemy tę metodę poprzez rozdzielenie oligonukleotydów na frakcję związaną i niezwiązaną, a następnie wykorzystujemy strategię matrycy dwukolorowej do rejestracji wzbogacenia każdego oligonukleotydu we frakcji związanej. Dane z matrycy pozwalają na wygenerowanie map wysokiej rozdzielczości z możliwością identyfikacji sekwencyjnych i strukturalnych determinant wiązania rybonukleoprotein (RNP) na pre-mRNA. Wyjątkową zaletą tej metody jest możliwość uniknięcia błędu próbkowania w kierunku mRNA, który występuje w aktualnych technikach IP i SELEX, ponieważ pula jest specjalnie projektowana i syntetyzowana na podstawie sekwencji pre-mRNA. Kolejną zaletą jest elastyczność puli oligonukleotydów, ponieważ badacz sam wybiera regiony do analizy i pokrycia, dostosowując pulę do indywidualnych potrzeb. Wykorzystując tę technikę, można na dużą skalę badać wpływ polimorfizmów lub mutacji na wiązanie lub klonować bibliotekę do funkcjonalnego reporteru splicingu i identyfikować oligonukleotydy wzbogacone we frakcji włączonej. Ten nowatorski schemat mapowania wysokiej rozdzielczości in vitro stanowi unikalny sposób badania oddziaływań RNP z przejściowymi cząsteczkami pre-mRNA, których niska obfitość utrudnia badanie przy użyciu obecnych technik in vivo.

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Sekwencjonowanie cząsteczek RNA współwytrąconych immunologicznie (co-IP) z białkami wiążącymi RNA poszerzyło naszą wiedzę na temat splicingu, wykazując, że wiązanie...

Aby zmapować miejsca wiązania rybonukleoprotein na pre-mRNA, należy rozpocząć od pokrycia wyznaczonego regionu interesującego pre-mRNA oknami o szerokości 30 nukleotydów i zsyntetyzować te kafelkowane oligonukleotydy na matrycy. Oligonukleotydy są uwalniane z matrycy poprzez gotowanie, a następnie współstrącane z interesującą RNP. Całkowita pula początkowa jest znakowana SCI 3, a pula związana jest znakowana SCI 5, po czym obie są naniesione na matrycę detekcyjną.Następnie macierz jest skanowana, a oprogramowanie do ekstrakcji cech służy do interpretacji wyników. Sole. Cześć, jestem Kate Watkins z laboratorium Willa Fairbrothera w Departamencie MCB na Uniwersytecie Brown. Dzisiaj zaprezentuję szybką i niedrogą procedurę określania dokładnej lokalizacji kompleksu białko-RNA na prem RNA w laboratorium, syntetyzując prem A jako pulę nakładających się oligonukleotydów.Pulę tę można następnie podzielić na frakcję związaną i niezwiązaną za pomocą koimmunoprecypitacji, a następnie poddać analizie za pomocą mikromacierzy. Choć procedura ta ma wiele zastosowań, wykorzystujemy ją do badania wielu czynników splicingowych oraz ich roli w alternatywnym splicingu. Zatem zacznijmy.Aby rozpocząć tę procedurę, należy skorzystać z przeglądarki genomu uc SC w celu pobrania konkretnych genów, złączy splicingowych lub innych obszarów zainteresowania, na podstawie których zostanie zaprojektowana pula prem A. Wybierz interesujące okna, a następnie przeprowadź ich komputerowe kafelkowanie z długością odczytu 30 nukleotydów i nakładką 20 nukleotydów, tak aby każdy oligonukleotyd był przesunięty o 10 nukleotydów względem poprzedniego. Po zdefiniowaniu oligonukleotydów o długości 30 nukleotydów, należy flankować każdy z nich uniwersalnymi sekwencjami starterów.Przekaż oligonukleotydy do firmy Agilent w celu ich naniesienia na niestandardową macierz oligonukleotydową. Po otrzymaniu macierzy rozpocznij odzyskiwanie oligonukleotydów DNA z jej powierzchni, umieszczając szkiełko przykrywcze macierzy w komorze do hybrydyzacji macierzy i delikatnie n nanosząc pipetą 500 µL wody dejonizowanej na szkiełko. Połóż szkiełko z macierzą stroną roboczą do dołu na szkiełku przykrywczym w taki sposób, aby etykiety na obu szkiełkach były skierowane ku sobie, dbając o to, by nie powstały pęcherzyki powietrza, które mogłyby zakłócić proces odzyskiwania oligonukleotydów.Zamknąć komorę hybrydyzacyjną i inkubować ją przez noc w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 99 °C, obracając komorę. Następnego dnia ostrożnie wyjąć macierz z komory i odessać wodę, która zawiera teraz oligosy uwolnione z powierzchni macierzy. Przenieść pulę uwolnionych oligosów do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml i poddać sonikacji w celu rozbicia potencjalnych agregatów, stosując amplitudę 50% podczas trzech serii impulsów trwających od trzech do pięciu sekund każda. Następnie przeprowadzić amplifikację puli za pomocą PCR o niskiej liczbie cykli, wykorzystując primery uniwersalne z przyłączonym do końca promotorem T.Liczba wymaganych cykli może się różnić w zależności od wydajności odzyskiwania oligonukleotydów. Należy unikać nadmiernej amplifikacji, która objawia się jako rozmyta prążek na żelu akrylamidowym. Na koniec należy użyć zestawu mega short script z firmy Amon do transkrypcji RNA.Reakcję transkrypcji należy przerwać poprzez ekstrakcję RNA fenolem i chloroformem, a następnie przeprowadzić precypitację etanolem z użyciem octanu sodu oraz glyco blue jako nośnika. Osad RNA należy ponownie zawiesić w 105 µL buforu TE, aby dokładnie określić stężenie RNA.Użyj barwnika ribo green do przygotowania krzywej wzorcowej. Następnie wykonaj pomiar za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek. Pula RNA jest teraz gotowa do rozpoczęcia procesu wyciągania (pull down) w ramach koimmunoprecypitacji.W pierwszej kolejności należy przygotować kuleczki magnetyczne, łącząc kuleczki dyna białka A i białka G w stosunku jeden do jednego do końcowej objętości 50 µL na jedną reakcję. Kuleczki należy skoncentrować w jednym miejscu za pomocą statywu do separacji magnetycznej w celu usunięcia nadsączu. Następnie należy przeprowadzić dwa przemycia równą objętością zimnego 1x PBS; drugie przemycie jest etapem końcowym.Resuspenduj kulki w równym objętości zimnego 1x PBS i dodaj 2 ng przeciwciała perion. Ilość ta może się różnić w zależności od przeciwciała, dlatego może być konieczne przeprowadzenie eksperymentów w celu znalezienia optymalnych warunków wiązania przeciwciała z kulkami. Inkubuj mieszaninę przez noc w temperaturze 4 °C na platformie rotacyjnej.Rano, aby zablokować niespecyficzne wiązanie, dodaj do każdej reakcji 2 µg sonikowanego całkowitego RNA drożdży i inkubuj w rotacji przez kolejne 30 minut w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu etapu blokowania ponownie użyj statywu magnetycznego, aby usunąć nadsącz. Następnie przemyj kulek dwukrotnie zimnym 1x PBS; po drugim przemyciu pozostaw PBS w probówce, a następnie odmień 50 µl zawiesiny kulek do nowych probówek.Jedna probówka dla każdej reakcji ko-immunoprecypitacji (co IP). Kuleczki są teraz gotowe do co IP. Następnie należy przygotować mieszaninę główną (master mix), łącząc pulę oligonukleotydów RNA z ekstraktem jądrowym komórek.Jako źródło RNP pobierz 50 µL aliquoty master mixu jako próbę całkowitą. W celu ochrony można dodać Primery, które są wersjami RNA starterów uniwersalnych, aby zapobiec wiązaniu białek do sekwencji startera lub wprowadzeniu struktur drugorzędowych do RNA. Aby rozpocząć ko-immunoprecypitację, oddziel supernatant od aliquotów kulek i resuspenduj kulki w 120 µL pozostałego master mixu. Inkubuj reakcje w wytrząsalniku w temperaturze 4 °C przez jedną do dwóch godzin.Po zakończeniu inkubacji z każdej probówki można usunąć niewielką ilość eluatu, wliczając w to kuleczki. W celu przeprowadzenia dodatkowych testów wydajności lub specyficzności wiązania, umieść pozostałe reakcje na magnesie i usuń nadsącz. Następnie wykonaj jeden lub dwa przemycia zimnym 1x PBS.RNA związane z przeciwciałem na koralikach poprzez kompleks RNP stanowi próbkę IP. Zawiesić ponownie koraliki IP w 50 µl 1% SDS w buforze 0,1 XTE i podgrzać próbki w temperaturze 65 °C przez 15 minut. Aby wyeluować RNA, usunąć supernatant, który zawiera teraz RNA uprzednio związane z koralikami; oczyścić go poprzez ekstrakcję fenolowo-chloroformową, a następnie przeprowadzić wytrącanie etanolem i zawiesić ponownie osad w 50 µl buforu 0,1 XT.Następnie przeprowadź odwrotną transkrypcję próbek z użyciem uniwersalnych starterów odwrotnych. Następnie przeprowadź amplifikację próbek metodą PCR przy użyciu starterów uniwersalnych, jeden z których powinien zawierać promotor T7. Liczba cykli wymaganych do amplifikacji puli będzie zależeć od wydajności współimmunoprecypitacji.Używając zestawu do skryptu mega shorts firmy Ambion, przeprowadź ponowną transkrypcję próbek, ale tym razem dodaj 2 µL amino-allylowego UTP zamiast T7 UTP dołączonego do zestawu. Amino-allylowe UTP zostanie wykorzystane w późniejszym etapie do znakowania RNA za pomocą side eyes. Po zakończeniu transkrypcji.Ekstrakt fenylchloroformowy i etanol powodują wytrącenie próbek. Nie należy używać gliko-niebieskiego ani octanu amonu, ponieważ mogą one zakłócać hybrydyzację próbek z macierzą. Osad należy ponownie zawiesić w 4,5 µL 0,1 M węglanu sodu.Aby najpierw oznakować próbki, dodaj 2,5 µL wody wolnej od nukleaz do całkowitej objętości próbki. Dodaj 3 µL S3, a do próbki IP dodaj 3 µL SCI pięć. Inkubuj w ciemności przez jedną godzinę.W temperaturze pokojowej przerwać reakcję, dodając sześć µL 4 M HCl hydroksyloaminy do każdej próbki, dokładnie wymieszać i odwirować. Inkubować krótko przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie oczyścić znakowane próbki poprzez ekstrakcję chloroformem fenolowym, a następnie wytrącenie etanolem. Większość barwnika zostaje przeniesiona do fazy organicznej wraz z wolnymi nukleotydami, dlatego osady mogą nie być widocznie zabarwione.Resuspender każdy pellet w 50 µL 0,1 XTE. Postępować zgodnie z instrukcją zestawu do hybrydyzacji macierzy Agilent w celu przygotowania próbki do mikroarray, z następującym wyjątkiem: nie fragmentować RNA. Po dodaniu buforu do fragmentacji należy niezwłocznie dodać bufor do hybrydyzacji, aby przerwać proces fragmentacji.Nanieś próbki na matrycę i przeprowadzaj hybrydyzację w temperaturze 50 °C przez trzy godziny podczas obracania matrycy. Przygotuj następujące roztwory o objętości 50 ml w stożkowatych probówkach o pojemności 50 ml: jedną probówkę z dwukrotnym nadmiarem buforu SC, dwie probówki z jednokrotnym nadmiarem buforu SC oraz jedną probówkę z wodą zdejonizowaną.Po trzechgodzinnej inkubacji ostrożnie rozepnij zaciski kanapki z preparatem na szkiełku i umieść go w buforze 2X SSC. Używając pęsety, delikatnie oddziel matrycę od szkiełka nakrywki.Ostrożnie zdejmij szkiełko zakrywające, uważając, aby nie dotknąć matrycy. Po wyjęciu szkiełka zamknij probówkę stożkową i delikatnie odwracaj ją przez 60 sekund. Za pomocą pęsety przenieś matrycę do roztworu 1X SSC.Zamknąć probówkę i delikatnie odwracać przez jedną minutę. Następnie przenieść matrycę do drugiego roztworu XSSC i ponownie delikatnie odwracać przez kolejną minutę. Na koniec przenieść matrycę do probówki z wodą dejonizowaną i delikatnie odwracać przez 30 sekund.Osusz macierz, opierając krawędzie szkiełka o chusteczkę Kimwipe. Kontynuuj obracanie macierzy na chusteczce, uważając, aby nie uszkodzić strony zawierającej oligos. Umieść macierz w pustej probówce stożkowej i przystąp do skanowania macierzy.Następnie przystąp do skanowania macierzy. Oto reprezentatywna macierza. Każda cecha lub oligo jest zabarwiona na kolor zielony w przypadku całkowitej, niewzbogaconej puli lub na czerwony w przypadku puli wzbogaconej metodą IP.Sygnał dla każdej cechy jest normalizowany do całkowitej intensywności w danym kanale. Wynikiem końcowym jest logarytmiczny stosunek intensywności kanału czerwonego do kanału zielonego. Dla każdej cechy na matrycy średnia wartość dla każdej współrzędnej genomowej jest przypisana do określonej lokalizacji.Ilustracja tego etapu uśredniania została przedstawiona dla trzech nakładających się oligonukleotydów o długości 30 nukleotydów z wynikami wynoszącymi odpowiednio dwa, cztery i 0,5, gdzie pokazano średni wynik wzbogacenia dla każdego okna o długości 10 nukleotydów. Oto przykład schematu wiązania białka wiążącego polipirymidyny PTB w genie CLTA; cechy genu są podane na dole, a logarytmiczne średnie wyniki wzbogacenia dla wiązań PTP są reprezentowane przez ciemnoczerwone pionowe paski. Jasnoczerwone paski wskazują obszary niewzbogacone pod kątem wiązania PTP.Właśnie zaprezentowałem, jak szybko i efektywnie stworzyć pulę oligonukleotydów pokrywającą regiony zainteresowania, takie jak alternatywnie splicingowane aksony. Analizujemy nasze pule za pomocą mikromacierzy, ale możliwe jest również ich sekwencjonowanie metodą Illumina, sekwencjonowaniem Lexi lub tradycyjnym sekwencjonowaniem metodą Sangera. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie, że proces tworzenia puli może być modyfikowany zarówno na poziomie RNA, jak i białek.Na poziomie RNA do sekwencji oligonukleotydowej możemy wprowadzić regiony autologiczne, mutacje chorobowe, polimorfizmy lub mutacje losowe. Na poziomie białka czynnik wiążący RNA może zostać zmodyfikowany poprzez fosforylację lub inne modyfikacje potranslacyjne. Można również manipulować środowiskiem wiązania, aby zwiększyć lub zmniejszyć poziom dodatkowych czynników, które konkurują z badanym białkiem wiążącym RNA lub wchodzą z nim w interakcje.To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

a-rapid-high-throughput-method-for-mapping-ribonucleoproteins-rnps-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szybka metoda wysokowydajnego mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkiej pre-mRNA

Protokół krok po kroku dotyczący izolacji i identyfikacji kompleksów związanych z RNA za pomocą metody RIP-Chip.

Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, mikroRNA oraz komponentów białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych z wykorzystaniem techniki RIP-Chip

Zdolność komórek do adaptacji do stresu jest kluczowa dla ich przetrwania. Regulacja translacji mRNA jest jedną z takich strategii adaptacyjnych, zapewniającą szybką regulację proteomu. W tym miejscu zapewniamy ustandaryzowany protokół profilowania polisomów w celu identyfikacji określonych mRNA, które ulegają selektywnej translacji w warunkach stresu.

Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Tutaj opisujemy metodę umożliwiającą jednoczesne ilościowe oznaczanie i mapowanie całego genomu rybonukleotydów w wysoce nienaruszonym DNA w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu, łącząc enzymatyczne rozszczepienie genomowego DNA z jego alkaliczną hydrolizą i późniejszym sekwencjonowaniem 5'-końca.

Jednoczesne mapowanie i oznaczanie ilościowe rybonukleotydów w ludzkim mitochondrialnym DNA

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Przedstawiono szczegółowy protokół stosowania strategii CARIC (ang. click chemistry-assisted RNA-interactome capture) do identyfikacji białek wiążących się zarówno z kodującymi, jak i niekodującymi RNA.

Wychwytywanie i identyfikacja białek wiążących RNA za pomocą strategii wychwytywania interaktomu RNA wspomaganej chemią kliknięcia (CARIC)

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych miejsc wiązania RNA lub "śladów" kompleksów RNA:białko (RNP) z komórek ssaków. Podejście to obejmuje dwie immunoprecypitacje podjednostek RNP i dlatego nazywa się immunoprecypitacją RNA w tandemie (RIPiT).

Identyfikacja śladów RNA:Kompleksy białkowe poprzez immunoprecypitację RNA w tandemie, a następnie sekwencjonowanie (RIPiT-Seq)

Białka fuzyjne z GFP są powszechnie wykorzystywane do wizualizacji organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak przesiewanie mutacji wpływających na morfologię organelli zazwyczaj wymaga indywidualnej mutogenezy i jest czasochłonne. W niniejszej pracy prezentujemy metodę jednoczesnego wprowadzenia markerów organelle-GFP do prawie 5 000 genów nieessentialnych u drożdży.

Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w *S. cerevisiae*

Poznaj szybką metodę mapowania miejsc wiązania rybonukleoprotein na ludzkim pre-mRNA z wykorzystaniem niestandardowych pul oligonukleotydów. Technika umożliwia precyzyjną analizę interakcji RNA-białko bez stronniczości tradycyjnych metod.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Przeglądaj więcej filmów