Optyczny zapis aktywności elektrycznej w sieciach jelitowych świnki morskiej z użyciem barwników napięcioczułych

W niniejszym filmie zaprezentowano dyssekcję oraz późniejszą wizualizację elektrycznie stymulowanych preparatów jelitowego układu nerwowego z wykorzystaniem barwnika wrażliwego na napięcie D-4-ANEPPDHQ. Od pobranej od eutanazowanej świnki morskiej niewielkiej części jelita wykonuje się dyssekcję, aby najpierw odsłonić błonę podśluzową, a ostatecznie sploty mienteryczne w celu przeprowadzenia pomiarów optycznych. Po wykonaniu początkowego obrazu o wysokiej rozdzielczości, na zamocowaną i zabarwioną D-4-ANEPPDHQ tkankę umieszcza się elektrody.

Zmiany optyczne wskazujące na aktywność elektryczną są rejestrowane za pomocą kamery wysokiej prędkości. Podczas akwizycji wysokiej prędkości stosowana jest stymulacja elektryczna. Obraz o wysokiej rozdzielczości jest następnie nakładany na mapę pikseli kamery wysokiej prędkości w celu analizy przy użyciu oprogramowania neuro plex.

Witajcie, jestem Brian Salzberg, dyrektor Laboratorium Optyki Komórkowej (Laboratory of Cellular Optics), lub w skrócie LOCO, jak lubimy je nazywać, w Departamencie Neuronauk na Uniwersytecie Pensylwanii. Nazywam się Analia Obide i również jestem członkinią Laboratorium Optyki Komórkowej.

Dzisiaj przedstawimy procedurę rejestracji aktywności elektrycznej z nienaruszonych sieci neuronalnych ssaków przy użyciu barwników napięciowo-wrażliwych. Wykorzystujemy tę metodę do badania łączności neuronalnej w obrębie i pomiędzy dwiema sieciami tworzącymi układ nerwowy jelit, nazywany również drugim mózgiem lub mózgiem jelitowym. Zatem zacznijmy.

Przygotowanie preparatów podśluzówkowych i splotów jelitowych rozpoczyna się od wycięcia jelita cienkiego świnki morskiej rasy Hartley o masie od 150 do 200 g lub wieku od dwóch do trzech tygodni, która została poddana znieczuleniu inhalacyjnemu izofluranem, a następnie pozbawiona głowy. Następnie należy usunąć zawartość jelita poprzez przepłukanie światła jelita ciepłym, natlenionym roztworem M1 99 DM. Wyciąć fragment jelita o długości od 8 do 10 cm, dbając o zachowanie polarności.

Przenieś go do szalki szklanej o średnicy 10 centymetrów powleczonej sardem, zawierającej M1 99 DM o temperaturze pokojowej. Umieść szalkę pod mikroskopem sekcyjnym z oświetleniem w ciemnym polu. Następnie, używając nożyczek, otwórz brzeg krezkowy i za pomocą pincet do owadów przymocuj segment jelita stroną śluzową do góry.

Niezwykle ważne jest utrzymanie równomiernego napięcia, aby po przypięciu tkanka miała kształt prostokąta z regularnie wyrównanymi rzędami vii śluzówki, trzymając precyzyjną pęsetę dumont z prostymi końcówkami w pozycji niemal poziomej. Oddziel śluzówkę, chwytając VII na jednym końcu odcinka jelita i ciągnąc wzdłuż osi podłużnej tkanki. Kontynuuj oddzielanie pasm śluzówki, aby odsłonić błonę podśluzową zawierającą zwoje podśluzowe i naczynia krwionośne błony podśluzowej.

Następnie, używając bardzo cienkich nożyczek, wykonaj nacięcie w warstwie podśluzowej zgodnie z orientacją okrężnych włókien mięśniowych. Następnie bardzo delikatnie unieś podśluzową za pomocą cienkiej pęsety, jednocześnie odpychając mięśnie okrężne. Przesuń nożyczki głębiej i przetnij wzdłuż krawędzi podłużnych.

W miarę postępu separacji oddzielaj błonę podśluzową od pozostałej części preparatu. Następnie wykonaj drugie cięcie zgodnie z orientacją okrężnych włókien mięśniowych, w odległości od 1,5 do 3 cm od pierwszego cięcia, aby określić ostateczny rozmiar preparatu podśluzowego; otrzymany segment podśluzowy ma grubość od 30 do 50 µm i ma wygląd delikatnej błonki. Przenieś go do innego naczynia typu syl guard zawierającego świeżą pożywkę M1 99 DM i delikatnie przypnij go, nie napinając tkanki.

Następnie należy umieścić płytkę w komorze z dostępem do tlenu w temperaturze pokojowej do późniejszego wykorzystania. Pierwotny odcinek jelita powinien być teraz pozbawiony błony śluzowej i podśluzowej, a mięśnie okrężne powinny być odsłonięte. Odcinek ten służy teraz do przygotowania splotu miękkostróżowego w celu odsłonięcia splotu miękkostróżowego.

Usuń jak najwięcej warstwy mięśni okrężnych, używając pęsety z prostymi końcówkami do odciągania pęczków włókien z każdej strony preparatu. Odsłonięty sploty mięśniowy nie może zostać oddzielony od podłużnej warstwy mięśni oraz leżącej poniżej CI. Przenieś preparat splotu mięśniowego do nowej szalki powlekanej sardem zawierającej natleniony roztwór M1 99 M. Następnie luźno przypnij próbkę zawierającą żywą tkankę mięśniową. Na kilka minut przed eksperymentem optycznym przenieś preparat do nowej, mniejszej szalki powlekanej sylgardem, wypełnionej roztworem M1 99 DM zawierającym 2 µM nefe w celu zapobieżenia skurczom mięśni, i zamocuj go stabilnie, ostrożnie umieszczając wiele bardzo cienkich szpilek wokół obwodu.

Należy upewnić się, że napięcie jest rozłożone równomiernie, a tkanka przylega całkowicie płasko do dna sil guard. Preparat tkankowy jest teraz gotowy do eksperymentów fizjologicznych. W szklanej fiolce należy przygotować roztwór roboczy DAI four A-N-E-P-P-D HQ w stężeniu od 5 do 50 µg/mL w M1 99 M z dodatkiem 2 µM nifedipiny, a następnie osłonić go folią aluminiową.

Etanol z roztworu zapasowego powinien stanowić mniej niż 0,5% roztworu M1 99 DM z nifedypiną, który pokrywał preparat; należy go zastąpić przygotowanym roztworem barwnika. Używając objętości markerów wystarczającej do całkowitego pokrycia tkanki, inkubować w temperaturze pokojowej od 10 do 30 minut po zakończeniu inkubacji. Przepłukać preparat utlenionym M1 99 M z NEFE, wymieniając całą zawartość komory.

Optyczna rejestracja aktywności neuronalnej w preparatach stymulowanych elektrycznie jest przeprowadzana przy użyciu układu składającego się z pionowego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w dzielnik obrazu, precyzyjnej szybkiej kamery o niskiej rozdzielczości, czarno-białej kamery o wysokiej rozdzielczości, sterowanego komputerowo generatora bodźców oraz mikromanipulatora. Całe urządzenie jest zamontowane na aktywnym stole wibroizolacyjnym i otoczone ciężkimi zasłonami akustycznymi oraz dachem z Mylaru w celu zminimalizowania drgań przenoszonych przez powietrze. Chociaż akwizycja obrazów z obu kamer może być przeprowadzana za pomocą jednego komputera uruchamiającego jednocześnie programy Neuro Plex i Global Lab Image Two lub dowolne inne oprogramowanie do akwizycji obrazu, przedstawiona tutaj konfiguracja wykorzystuje dwa komputery, z których każdy steruje osobną kamerą, aby rozpocząć eksperymenty optyczne.

Umieść komorę zawierającą barwioną próbkę na stoliku mikroskopu. Ponieważ D four A i EPPD HQ są barwnikami nieprzenikającymi przez błonę, które fluorescują tylko w środowisku lipidowym, zdrowe neurony z barwionego preparatu jelitowego przy jakimkolwiek powiększeniu powyżej 20 x powinny wyglądać jak puste balony. Użyj filtrów HQ 5 35 50 do wzbudzenia, HQ 5 72 LP do emisji oraz lustra dichroicznego 5 65 nanometr.

Następnie, korzystając z elementów sterujących mikromanipulatora, należy ustawić wielkanałową liniową macierz elektrod na końcu jamnym tkanki, upewniając się, że elektroda nie dotyka obiektywu mikroskopu. Liniowa macierz zawierająca 10 elektrod wolframowych rozmieszczonych na odcinku jednego centymetra pozwala na pobudzenie kilku niezależnych szlaków neuronalnych i jest odpowiednia do badania wzajemnie połączonych obwodów zwojowych. Do uzyskania reprezentatywnych danych zastosowano jednak wykonaną samodzielnie elektrodę stymulującą dwuprzewodową.

Przed przystąpieniem do rejestracji funkcjonalnej, należy przymocować elektrodę masy do przeciwległego końca komory za pomocą wosku klejącego, a następnie wykonać wysokorozdzielcze czarno-białe zdjęcie obszaru, z którego rejestrowana będzie aktywność elektryczna, aby ułatwić wizualizację. Skalę szarości można odwrócić tak, aby fluorescencja była ciemna. Aby zastosować stymulację prądową przy użyciu sterowanego komputerowo generatora impulsów, należy najpierw zaprogramować urządzenie, wybierając odpowiednią intensywność, czas trwania, częstotliwość i liczbę impulsów, a także opóźnienie względem rozpoczęcia akwizycji danych optycznych.

Aby upewnić się, że stymulacja odbywa się w granicach akwizycji danych optycznych, skonfiguruj generator stymulacji jako urządzenie sterowane przez neuro plex. Następnie ustaw parametry akwizycji w programie neuro plex, określając częstotliwość klatek, liczbę klatek oraz wzmocnienie kamery. Aby uzyskać pełną rozdzielczość potencjału czynnościowego, częstotliwość klatek powinna zostać ustawiona na minimum 1 kHz.

Ponieważ D four A oraz E-P-P-G-H-Q wykazują spadek fluorescencji podczas depolaryzacji, który jest liniowo powiązany ze zmianą napięcia, należy odwrócić wyświetlanie sygnałów optycznych w programie neuro plex, aby potencjały czynnościowe nie były wyświetlane do góry nogami. Rozpocznij akwizycję. Pamiętaj, aby przed każdym z zapisów funkcjonalnych wykonać nowy czarno-biały obraz każdego pola widzenia w wysokiej rozdzielczości.

Po zakończeniu akwizycji należy użyć oprogramowania Neuroplex do analizy wyników w trybie offline. Obszar ekranu o nazwie „page display” pokazuje surowy obraz preparatu zarejestrowany przez szybką kamerę 80 na 80 jako pojedynczą klatkę. Gdy tryb strony jest ustawiony na „absolute frame”, obraz o wysokiej rozdzielczości nabyty drugą kamerą zostaje nałożony na mapę pikseli surowego obrazu przy użyciu poleceń wyświetlania Neuroplex.

Wymaga to zmiany trybu strony z pojedynczego śladu (absolute trace) na wiele śladów (traces) oraz wyboru nałożonego obrazu w ramach polecenia wyświetlania. Za pomocą myszy należy wybrać pojedyncze piksele lub grupy pikseli z obrazu widocznego na stronie. Wyjścia z tych obszarów zainteresowania pojawią się jako ślady w oknie wyświetlania śladów, ukazując wartości zmian optycznych rejestrowanych przez te piksele w funkcji czasu.

Odwrócenie skali szarości w obrazie o wysokiej rozdzielczości poprawia wizualizację na wyświetlaczu strony w trybie śladu i zdecydowanie zaleca się wyświetlanie analogowego wyjścia ze stymulatora. Wybierz kanał wyjścia analogowego, aby został uwzględniony w oknie wyświetlania śladu. Wyjście to wskazuje precyzyjny czas podania stymulacji podczas eksperymentu.

Aby wyświetlić dane w formie filmu, należy użyć poleceń filmowych w programie neuro plex, aby zaprezentować kolejne klatki w zbiorze danych z wykorzystaniem skal pseudokolorów dostosowanych do maksymalnej i minimalnej zmiany intensywności fluorescencji. Zobrazowano zwoj splotu miękkopełnikowego z preparatu barwionego DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q, używając kamery o wysokiej rozdzielczości i obiektywu 60 x. Podczas akwizycji danych preparat był stymulowany serią pięciu impulsów o częstotliwości 40 hertz.

Przy amplitudzie każdego impulsu wynoszącej 15 mA i czasie trwania 0,5 ms, zidentyfikowano cztery obszary zainteresowania (ROI), a następnie wygenerowano wykresy obrazujące średnie dane optyczne z wybranych obszarów w sekwencji klatek w pseudokolorach; pierwsze obszary odpowiedzi optycznej depolaryzacji błonowej, wskazujące na aktywność neuronów, pojawiają się w kolorach od żółtego do czerwonego. Dane te wskazują, że aktywność wywołana stymulacją występuje w odrębnych regionach każdego zwoju, przenoszona głównie przez aksony przechodzące. ROI 2, 3 i 4 identyfikują poszczególne neurony w różnych odległościach od ROI 1.

Rysunek dwa przedstawia przy 10-krotnym powiększeniu ścieżki anatomiczne, którymi może rozprzestrzeniać się informacja; strzałki wskazują kierunek, w którym podąża bodziec w celu aktywacji zidentyfikowanego zwoju mięszyczkowego. Przedstawiliśmy właśnie elementy układu optycznego do rejestracji aktywności elektrycznej za pomocą barwników wrażliwych na napięcie oraz to, jak zastosowanie tej technologii w układzie nerwowym otwiera możliwość badania łączności funkcjonalnej w obrębie i pomiędzy dwiema nienaruszonymi sieciami ssaków pod mikroskopem. Podczas korzystania z technologii rejestracji optycznej niezwykle ważna jest dbałość o szczegóły.

Źródła szumów – optyczne, mechaniczne i elektryczne – muszą być starannie kontrolowane, a stan preparatu musi być skrupulatnie zachowany. Zatem opanowanie wszystkich poszczególnych kroków niniejszego protokołu jest niezbędne dla osiągnięcia sukcesu w rejestracji optycznej. To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.