Badania genetyczne białek naprawczych ludzkiego DNA z wykorzystaniem drożdży jako systemu modelowego

Plazmidy WRN są trawione za pomocą endonukleazy restrykcyjnej komórki pierwszej i MLU, a fragmenty są oczyszczane z żelu. Te wektory ekspresyjne trawione z komórką pierwszą do MLU jeden fragmentami WN są następnie ligowane w komórkę pierwszą do MLU w jednym miejscu wektora drożdży. Plazmid wielokopiczny zawiera również TRP jeden marker do wyboru.

Konstrukty W Rrn są przekształcane w drożdże zgodnie ze standardowymi protokołami, a transformanty są wybierane na syntetycznych kompletnych pożywkach glukozowych bez tryptofanu. Poszczególne transformanty są następnie rozmazywane na syntetycznych kompletnych pożywkach glukozowych pozbawionych tryptofanu, a płytki są inkubowane z płytki wzorcowej. Aby przeanalizować przywracanie fenotypu powolnego wzrostu w SGS przekształconym WRN, jeden z trzech podwójnie zmutowanych transformantów szczepów jest naniesiony na płytki zawierające glukozę lub galaktozę.

Aby przeanalizować wpływ ekspresji WRN na HU i MMS, wykrywanie wrażliwości przeprowadza się w celu określenia rozkładu cyklu komórkowego komórek drożdży wykazujących ekspresję WRN. Wykonuje się barwienie DAPI. Ekspresja WRN w heterologicznym gospodarzu jest analizowana za pomocą Western Blood Analysis.

Cześć, nazywam się Robert Broch i pracuję w sekcji dotyczącej przypadków hela DNA w laboratorium gerontologii molekularnej w National Institute on Aging, jednym z instytutów National Institutes of Health. Cześć, nazywam się Monica Agarwal i również pracuję w dziale badań nad przypadkami DNA Heli w laboratorium genetyki molekularnej w National Institutes on Aging. Zrozumienie roli ludzkich białek naprawczych DNA i szlaków genetycznych jest wyzwaniem dla wielu badaczy.

Badania genetyczne w systemach ssaków były ograniczone ze względu na brak łatwo dostępnych narzędzi, w tym zmutowanych genetycznych linii komórkowych, regulacyjnych systemów ekspresji i odpowiednich markerów selekcjonowanych. Dzisiaj pokażemy Państwu procedury z udziałem drożdży jako systemu modelowego do badania molekularnych i komórkowych funkcji enzymu odwijającego DNA, znanego jako helikaza, w zapobieganiu przedwczesnemu starzeniu się. Stosujemy te procedury w naszym laboratorium, aby genetycznie scharakteryzować rolę ludzkiego produktu genowego spalacza, który jest wadliwy w naprawie DNA i utrzymaniu stabilności genomu w zaburzeniu przedwczesnego starzenia.

Zespół Wernera Werner jest jednym z pięciu przypadków śluzowców w rodzinie ludzi na wschodzie. Jest tylko jeden o nazwie sgs one, który bada rolę ludzkiego Wernera w odpowiedzi na stres replikacyjny. Zbadaliśmy wpływ ekspresji Wernera w tle wschodnich mutantów na różne biologiczne punkty końcowe.

Więc chodźmy, zacznijmy. Ponieważ będziemy używać drożdży jako heterologicznego gospodarza, naszym pierwszym krokiem będzie sklonowanie ludzkiego genu Wernera lub jego wariancji do wektora drożdży. Plazmidy Wernera trawiono za pomocą restrykcji Endonukleaza Sal jeden i MLU jeden i należy oczyścić fragmenty w środku, a następnie podligować do Sal one MLU jedno miejsce wektora ekspresji drożdży, który jest pod regulacją promotora indukowanego galonami.

Plazmid wielokopiczny zawiera również TRP jeden marker do wyboru. Te plazmidy ekspresyjne Wernera są następnie przekształcane w odpowiednie tropikalne szczepy drożdży tryptofanu użyte w tym badaniu. Transformanty są wybierane przez posiewanie zawiesiny na syntetycznym kompletnym podłożu glukozowym.

Z powodu braku tryptofanu inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni, aż pojawią się kolonie. Gdy kolonie wyrosną ze smugi, poszczególne transformanty na syntetycznych kompletnych pożywkach glukozowych i inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni. Zmutowane szczepy wykazujące ekspresję ludzkiego genu weer i jego wariantów są następnie badane pod kątem fenotypów komórkowych za pomocą technik pokazanych w poniższych sekcjach.

Trzy pierwsze mutacje wykazują poważną wadę wzrostu. Jednak mutacja w genie SGS One hamuje fenotyp powolnego wzrostu trzech pierwszych mutantów, aby zbadać wpływ ekspresji Wernera na wzrost dzikich szczepów typu S, Gs jeden lub S Gs, jeden trzy górne, przeskakuje odpowiednie szczepy z wektorem lub plazmidem ekspresji Wernera na syntetyczne kompletne płytki pożywki pozbawione tryptofanu, ale zawierające 2% glukozy lub 2% laktozy gala jako kontrolę pozytywną. Efekt jednego ekspresji SGS określono w inkubacji płytek w temperaturze 30 stopni przez dwa dni.

Szczep zmutowany typu dzikiego i SGS z jednym mutacją przekształcony za pomocą wektora lub Wernera nie wykazuje żadnej różnicy w swoim wzorcu wzrostu. Jednak przekształcony przez Wernera szczep SGS jeden z trzech podwójnie zmutowanych rósł znacznie wolniej niż S GS jeden z trzech podwójnie zmutowanych mutacji przekształconych za pomocą wektora, aby ocenić wymagania funkcjonalne Warnera w celu przywrócenia fenotypu powolnego wzrostu. W sgs jeden top three background streak sgs jeden top three szczepy przekształcone z mutantami domeny katalitycznej Warnera na syntetyczne kompletne płytki pozbawione tryptofanu zawierającego 2% glukozy lub 2% galaktozy po dwóch dniach.

Inkubacja Mutant egzonukleazy Wernera oznaczony jako E 84 A przywraca fenotyp powolnego wzrostu, taki jak Werner, pokazując w ten sposób, że aktywność egzonukleazy nie jest wymagana do przywrócenia fenotypu trzech pierwszych lat powolnego wzrostu. Mutant Werner Helikaza dobrze rośnie, co pokazuje, że aktywność helikazy Wernera jest wymagana do przywrócenia fenotypu trzech pierwszych powolnych wzrostów. Określenie zdolności Wernera do wpływania na tempo wzrostu sgs.

Jeden trzy najlepsze szczepy na niższych poziomach ekspresji białka pasmo sgs jeden trzy najlepsze szczepy przekształcone wektorem Werner lub sgs jeden na syntetyczne kompletne płytki pozbawione tryptofanu, ale zawierające rosnące stężenia galaktozy. Inkubuj wszystkie płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa dni. Mutant egzonukleazy Warnera i Warnera przywraca trzy górne nachylenie fenotypem na wszystkich poziomach galaktozy.

Jednak mutanty Helikazy Warnera tego nie robią. Wykazano, że podwójny mutant SGS jest mniej wrażliwy niż trzy pierwsze pojedyncze mutanty na czynnik alkilujący DNA, sulfonian metylu metanu lub MMS lub inhibitor replikacji hydroksymocznik lub HU, w celu określenia wpływu ekspresji Warnera na wrażliwość MMS i HE SGS jeden lub S GS jeden trzy najlepsze szczepy. Hoduj szczepy drożdży przekształcone za pomocą wektora lub Wernera w syntetycznym kompletnym pożywce rafinozowej pozbawionej tryptofanu w temperaturze 30 stopni Celsjusza jako kontroli.

Użyj szczepu rodzicielskiego typu dzikiego przekształconego za pomocą wektora, ponownie zaszczep wszystkie kultury w syntetycznym, kompletnym pożywce rafinozowej pozbawionej trytofanu i hoduj w temperaturze 30 stopni Celsjusza do wczesnej fazy logarytmicznej. Gdy kultury są we wczesnej fazie logarytmicznej, przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie do 10 000 razy tych szczepów przy użyciu syntetycznych kompletnych pożywek pozbawionych trytofanu, umieścić cztery mikrolitry każdego rozcieńczenia na syntetycznych kompletnych pożywkach GAL bez płytek tryptofanu zawierających 10 milimolowych HU lub 0,0025% MMS, inkubować płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez cztery dni. Podwójny mutant SGS z pierwszej trójki, który jest przekształcany za pomocą sgs typu dzikiego.

Jeden z nich jest opóźniony w późnej drugiej fazie cyklu komórkowego SG, co skutkuje morfologią w kształcie hantli. W przeciwieństwie do tego, drożdże typu dzikiego kończą podział komórek, pozostawiając mniej komórek w kształcie hantli do zbadania rozkładu cyklu komórkowego przekształconego przez Wernera szczepu sgs one top three. Najpierw hoduj logarytmicznie rosnące kultury następujących szczepów w syntetycznych, kompletnych pożywkach RAF pozbawionych tryptofanu w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc.

SGS jeden top three przekształcony wektorem Werner lub SGS jeden, a wektor przekształcony szczep rodzicielski Wildtype ponownie zaszczepia kultury przy OD 0,05. Po ponownym zaszczepieniu hoduje kultury do OD 0,5 i zbiera się przez wirowanie, ekspresja Wernera jest następnie indukowana przez dodanie laktozy gala w stężeniu 2%. Pozwól kulturom rosnąć w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez sześć godzin.

Po sześciu godzinach zbierz kultury, zbierz komórki przez odwirowanie. Po odwirowaniu przenieś kultury do mikroprobówek wirówkowych, raz umyj komórki PBS. Następnie utrwal ogniwa w 70% etanolu przez 20 minut w temperaturze pokojowej po dwukrotnym umyciu stałych ogniw za pomocą ogniw ponownego zawieszenia PBS w jednym XPBS.

Umieść zawieszenie komórki na szkiełku i dodaj osłonę wektorową. Podłoże montażowe z DAPI w stężeniu jednego mikrograma na mililitr. Zbadaj szkiełka pod mikroskopem XI Saxo vert w poszukiwaniu komórek z jądrami w kształcie hantli, co jest charakterystyczne dla komórek drożdży w SG dwie fazy cyklu komórkowego.

Aby określić ekspresję białka Wernera lub jego wariancję w przekształconych SGS jeden lub SGS jeden trzy pierwsze szczepy drożdży. Zacznij od hodowli szczepów przez sześć godzin w pożywkach zawierających galaktozę, aby indukować ekspresję białka Wernera. Po zebraniu komórek przez odwirowanie umyj je PBS i ponownie zawiesić.

Alkaliczny bufor do lizy. Gotuj komórki przez pięć minut, a następnie sklaruj przez odwirowanie i zneutralizuj jednym molowym kwasem solnym. Lizaty te są teraz gotowe do elektroforezy w żelach SDS z poliakryloamidu od ośmiu do 16% w celu określenia poziomu ekspresji białka Warnera pod wpływem różnych stężeń galaktozy.

Najpierw indukuj kultury o różnych stężeniach galaktozy przez sześć godzin. Następnie zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zamieszaj je w rozdymce zawierającej inhibitory proteazy. Dodaj szklane kulki o wielkości od 425 do 600 mikronów do mieszaniny i rozbij komórki, wirując wir z dużą prędkością przez minutę, a następnie oblodzenie przez minutę.

Powtórz w sumie osiem razy. Następnie odwirować powstały homogenat przez pięć minut w temperaturze 15 000 G i zebrać frakcję supernatantu. Po zmierzeniu ilości białka we frakcjach lizatu metodą Bradforda, rozpuścić równe stężenia białka na ośmiu do 16% żelach z poliakrylamidu SDS, ekspresja Wernera jest następnie określana przez Western blot Werner expression w sgs.

Jedna pierwsza trójka przywraca fenotyp powolnego wzrostu pierwszej trójki, jak pokazano na tych zdjęciach. Gdy sgs jeden górny trzy szczepy przekształcone wektorem Wernera lub sgs jedna smuga na płytce tryptofanu SC zawierającej 2% glukozy lub 2% galaktozy. Indukowana galaktozą ekspresja Wernera powoduje, że jeden z trzech najlepszych szczepów SGS rośnie wolniej.

W przeciwieństwie do tego, szczep rodzicielski typu dzikiego lub szczep SGS jeden przekształcony za pomocą Wernera nie ma wpływu na swój wzrost, co wskazuje, że powolny wzrost zapewniony przez Wernera jest specyficzny dla sgs. Jedno tło trzech najlepszych. Gdy SGS, trzy najlepsze szczepy przekształcone wariantami Wernera zostały naniesione na płytki tryptofanu SC zawierające tylko 2% glukozy lub 2% galaktozy.

Martwy egzonukleaza Werner był jeszcze w stanie przywrócić fenotyp powolnego wzrostu. Pokazuje to, że helikaza ATPazy Wernera, ale nie aktywność egzonukleazy, jest wymagana do przywrócenia fenotypu powolnego wzrostu trzech pierwszych. W rankingu SGS "jedna z trzech najlepszych" Werner przywrócił fenotyp powolnego wzrostu SGS w pierwszej trójce w całym zakresie stężeń GAL.

Wyniki te wskazują, że przywrócenie fenotypu powolnego wzrostu w zmutowanym tle sgs one top three zachodzi przy niskich poziomach ekspresji białka Wernera. Podczas logarytmicznie rosnących kultur sgs, jeden z trzech głównych szczepów przekształconych za pomocą Wernera lub jego wariantów został zauważony w dziesięciokrotnym seryjnym rozcieńczeniu na płytkach trytofanu SC zawierających glukozę lub galaktozę i MMS lub HU. Zaobserwowaliśmy, że ekspresja Wernera zwiększyła MMS i dwie czułości szczepu SGS jeden top three. Co więcej, ten wpływ na czułość MMS i HU w tle SGS jeden z trzech najlepszych wymaga helikazy ATP Wernera, ale nie aktywności eksonów.

Wreszcie, ekspresja Wernera przywraca również charakterystyczne opóźnienie SG dwa w górnej trójce, na co wskazuje podwyższona populacja dużych cieniowanych komórek. W sgs jedna górna trzy zmutowane komórki eksprymujące Wernera. W porównaniu z sgs, jedna z trzech górnych komórek przekształconych komórkami wektorowymi została wybarwiona Dabi.

Aby uwidocznić jądra i strzałki wskazują niepodzielone jądra ekspresji Wernera. W przekształconym sgs jedna z trzech górnych komórek została indukowana przez dodanie wskazanych stężeń galaktozy, a komórki zebrano sześć godzin po indukcji. Równe ilości całkowitego lizatu komórkowego załadowano na osiem do 16% żeli SDS z poliakryloamidu, a następnie wykryto zachodnią krew za pomocą przeciwciała anty Warnera.

Pokazaliśmy, jak badać fenotypy komórkowe związane ze zdefiniowanymi zmutowanymi tłami drożdży, aby wyjaśnić komórkowe i molekularne funkcje ludzkiego genu uczącego się, w których pośredniczą jego działania katalityczne i interakcje białkowe. Drożdże mogą być wykorzystywane jako organizm modelowy do badania funkcji genu w określonych szlakach. Podczas wykonywania tych procedur ważne jest, aby wybrać odpowiednie tło mutantów drożdży, aby dostrzec rolę badanego genu w zdefiniowanych szlakach.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.