Badania genetyczne białek naprawy DNA u ludzi z wykorzystaniem drożdży jako systemu modelowego

Plazmidy WRN są trawione endonukleazami restrykcyjnymi Cel I oraz Mlu I, a następnie fragmenty są oczyszczane z żelu. Te wektory ekspresyjne z fragmentami WRN trawionymi Cel I i Mlu I są następnie ligowane w miejsca Cel I i Mlu I wektora drożdżowego. Plazmid wielokopiowy zawiera również marker selekcyjny TRP 1.

Konstrukty W Rrn transformuje się do drożdży zgodnie ze standardowymi protokołami, a transformanty selekcjonuje się na syntetycznej pożywce kompletnej z glukozą z pominięciem tryptofanu. Pojedyncze transformanty wykreśla się następnie na syntetyczną pożywkę kompletną z glukozą z pominięciem tryptofanu, a płytki inkubuje się z płyty matki. Aby przeanalizować przywrócenie fenotypu powolnego wzrostu w transformantach SGS one top three double mutant z W Rrn, wykreśla się je na płytki zawierające glukozę lub galaktozę.

Aby przeanalizować wpływ ekspresji WRN na wrażliwość na HU i MMS, wykonuje się spotting w celu określenia rozkładu cyklu komórkowego komórek drożdży eksponujących WRN. Przeprowadza się barwienie DAPI. Ekspresję WRN w gospodarzu heterologicznym analizuje się metodą Western blot.

Witajcie, jestem Robert Broch z sekcji zajmującej się przypadkami DNA hela w laboratorium gerontologii molekularnej w Narodowym Instytucie Starzenia (National Institute on Aging), jednym z instytutów Narodowych Instytutów Zdrowia (National Institutes of Health). Witajcie, jestem Monica Agarwal, również z sekcji zajmującej się przypadkami DNA Heli w laboratorium gerontologii molekularnej w Narodowym Instytucie Starzenia. Zrozumienie roli ludzkich białek naprawy DNA i szlaków genetycznych jest istotnym wyzwaniem dla wielu badaczy.

Badania genetyczne w układach ssaków były ograniczone ze względu na brak łatwo dostępnych narzędzi, w tym mutantów linii komórkowych, systemów regulacji ekspresji oraz odpowiednich markerów selekcyjnych. Dzisiaj przedstawimy procedury z wykorzystaniem drożdży jako systemu modelowego do badania funkcji molekularnych i komórkowych enzymu rozplatającego DNA, znanego jako helikaza, w zapobieganiu przedwczesnemu starzeniu. Stosujemy te procedury w naszym laboratorium do genetycznej charakterystyki roli produktu ludzkiego genu burner, który jest wadliwy w zakresie naprawy DNA i utrzymania stabilności genomu w zaburzeniu przedwczesnego starzenia.

Zespół Wernera — białko Werner jest jednym z pięciu ludzkich białek z rodziny RecQ u drożdży. Istnieje tylko jeden nazwany homolog sgs1, który służy do badania roli ludzkiego białka Werner w odpowiedzi na stres replikacyjny. Zbadaliśmy wpływ ekspresji białka Werner w mutantowym tle drożdży na różne punkty końcowe analizy biologicznej.

Zacznijmy zatem. Ponieważ jako heterologicznego gospodarza wykorzystamy drożdże, pierwszym krokiem będzie klonowanie ludzkiego genu Wernera lub jego wariantu do wektora drożdżowego. Plazmidy Wernera poddano trawieniu za pomocą endonukleaz restrykcyjnych SalI i MluI, a następnie oczyszczone fragmenty ligowano w miejsca SalI i MluI wektora ekspresyjnego dla drożdży, który znajduje się pod regulacją galaktozowo-indukowalnego promotora.

Plazmid wielokopiowy zawiera również marker selekcyjny TRP1. Te ekspresyjne plazmidy Wernera są następnie transformowane do odpowiednich szczepów drożdży z troficznością do tryptofanu, użytych w niniejszym badaniu. Transformanty są selekcjonowane poprzez wysiewanie zawiesiny na syntetyczne pożywki kompletne z glukozą.

W przypadku braku tryptofanu inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez trzy do czterech dni, aż pojawią się kolonie. Po wzroście kolonii wypreparować pojedyncze transformanty na syntetyczną pożywkę kompletna z glukozą i inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez dwa do trzech dni. Następnie zbadano fenotypy komórkowe mutantów szczepów drożdży wykazujących ekspresję ludzkiego genu weer oraz jego wariantów, stosując techniki przedstawione w następnych sekcjach.

Trzy pierwsze mutanty wykazują silny defekt wzrostu. Jednakże mutacja w genie SGS1 znosi fenotyp powolnego wzrostu u tych mutantów. Aby zbadać wpływ ekspresji białka Wernera na wzrost szczepów typu dzikiego SGS1 lub szczepów top three SGS1, należy wysiać odpowiednie szczepy z wektorem lub plazmidem ekspresyjnym Wernera na płytki z syntetyczną pożywką kompletną pozbawioną tryptofanu, ale zawierającą 2% glucose lub 2% galactose w ramach kontroli pozytywnej. Wpływ ekspresji SGS1 określono poprzez inkubację płytek w temperaturze 30 °C przez dwa dni.

Szczepy typu dzikiego oraz mutanty sgs1 przetransformowane wektorem lub białkiem Wernera nie wykazują żadnych różnic w tempie wzrostu. Jednak szczep podwójny mutant sgs1 top three przetransformowany białkiem Wernera rośnie znacznie wolniej niż podwójny mutant sgs1 top three przetransformowany wektorem, co pozwala ocenić wymogi funkcjonalne białka Wernera w celu przywrócenia fenotypu powolnego wzrostu. W tle genetycznym sgs1 top three, szczepy sgs1 top three przetransformowane mutantami domeny katalitycznej białka Wernera wysiano na syntetyczne pożywki kompletne pozbawione tryptofanu, zawierające 2% glucose lub 2% galactose, i inkubowano przez dwa dni.

Inkubacja mutantem egzonukleazy Wernera oznaczonego jako E 84 A przywraca fenotyp powolnego wzrostu podobnie jak Werner, wykazując tym samym, że aktywność egzonukleazy nie jest wymagana do przywrócenia fenotypu powolnego wzrostu dla trzech górnych. Mutant helikazy Wernera rośnie dobrze, co dowodzi, że aktywność helikazy Wernera jest wymagana do przywrócenia fenotypu powolnego wzrostu dla trzech górnych. Aby określić zdolność Wernera do wpływania na tempo wzrostu sgs.

Pasemkuj jeden z trzech szczepów o niskim poziomie ekspresji białka sgs1 oraz trzy szczepy przekształcone wektorem Werner lub sgs1 na syntetyczne pożywki kompletne pozbawione tryptofanu, lecz zawierające zwiększające się stężenia galaktozy. Inkubuj wszystkie płytki w temperaturze 30 °C przez dwa dni. Werner oraz mutant egzonukleazy Werner przywracają fenotyp top3-slp przy wszystkich poziomach galaktozy.

Jednakże mutanty helikazy Wernera nie wykazują takich właściwości. Wykazano, że podwójny mutant SGS1 top three jest mniej wrażliwy niż pojedynczy mutant top three na alkilujący czynnik DNA metanosulfonian metylu (MMS) lub inhibitor replikacji hydroksymocznik (HU). Aby określić wpływ ekspresji białka Wernera na wrażliwość szczepów SGS1 lub SGS1 top three na MMS i HU, należy hodować szczepy drożdży przekształcone wektorem lub białkiem Wernera w syntetycznym podłożu kompletnym z rafinozą, pozbawionym tryptofanu, w temperaturze 30 °C jako kontrolę.

Użyj szczepu rodzicielskiego typu dzikiego przekształconego wektorem, ponownie zaszczep wszystkie hodowle w syntetycznym medium kompletnym z rafinozą z brakiem tryptofanu i inkubuj w temperaturze 30 °C do wczesnej fazy logarytmicznej. Gdy hodowle osiągną wczesną fazę logarytmiczną, przygotuj dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne tych szczepów do 10 000 razy, korzystając z syntetycznego medium kompletnego z brakiem tryptofanu; nanieś cztery µL każdego rozcieńczenia na płytki z syntetycznym medium kompletnym GAL z brakiem tryptofanu zawierającym 10 mM HU lub 0,0025% MMS; inkubuj płytki w temperaturze 30 °C przez cztery dni. Podwójny mutant SGS1 top3 przekształcony typem dzikim sgs.

W przypadku jednego z nich następuje opóźnienie w późnej fazie SG2 cyklu komórkowego, co skutkuje morfologią w kształcie hantla. W przeciwieństwie do nich, drożdże typu dzikiego kończą podział komórkowy, co pozostawia mniej komórek w kształcie hantla do badania rozkładu cyklu komórkowego szczepu sgs1 top 3 przekształconego białkiem Wernera. Najpierw należy przez noc hodować kultury w fazie wzrostu logarytmicznego następujących szczepów w syntetycznym medium kompletnym RAF pozbawionym tryptofanu w temperaturze 30 °C.

Przekształć szczepy SGS one top three za pomocą wektora Werner lub SGS one i wektora przekształconego szczepu rodzicielskiego typu dzikiego. Ponownie zaszczep kultury przy OD 0,05. Po ponownym zaszczepieniu hoduj kultury do OD 0,5 i zbierz je poprzez wirowanie. Ekspresję Werner indukuje następnie poprzez dodanie galaktozy w stężeniu 2%. Pozostaw kultury do wzrostu w temperaturze 30 °C przez sześć godzin.

Po sześciu godzinach zebrać kultury i odwirować komórki w wirówce. Po wirowaniu przenieść kultury do probówek do mikrowirówki i raz przemyć komórki PBS. Następnie utrwalić komórki w 70% etanolu przez 20 minut w temperaturze pokojowej; po dwukrotnym przemyciu utrwalonych komórek PBS, resuspender je w XPBS.

Nanieś zawiesinę komórkową na szkiełko i dodaj Vector Shield. Pożywkę montażową z DAPI w stężeniu 1 µg/mL. Przeanalizuj preparaty pod mikroskopem XI Saxo vert w celu zlokalizowania komórek z jądrami w kształcie hantla, co jest charakterystyczne dla komórek drożdży w fazie SG2 cyklu komórkowego.

Aby określić ekspresję białka Wernera lub jego wariantów w przekształconych szczepach drożdży SGS one lub SGS one top three, należy najpierw hodować szczepy przez sześć godzin w pożywce zawierającej galaktozę w celu indukcji ekspresji białka Wernera. Po zebraniu komórek przez wirowanie, należy je przemyć buforem PBS i resuspendować.

Bufor do lizy alkalicznej. Komórki gotować przez pięć minut, następnie klarować poprzez wirowanie i neutralizować jedenmolarowym kwasem solnym. Tak przygotowane lizaty są gotowe do elektroforezy w 8-16% żelach poliakrylamidowych SDS w celu określenia poziomu ekspresji białka Warner pod wpływem zmiennych stężeń galaktozy.

Najpierw poddaj hodowle indukcji za pomocą różnych stężeń galaktozy przez sześć godzin. Następnie zbierz komórki poprzez wirowanie i resuspenduj je w buforze zawierającym inhibitory proteaz. Do mieszaniny dodaj szklane kuleczki o rozmiarze od 425 do 600 mikronów i rozbij komórki, mieszając je na vortexie z wysoką prędkością przez minutę, a następnie chłodząc w lodzie przez minutę.

Powtórz tę czynność łącznie osiem razy. Następnie odwiruj otrzymany homogenat przez pięć minut przy 15 000 Gs i zbierz frakcję nadsączu. Po oznaczeniu ilości białka w frakcjach lizatu metodą Bradforda, rozdziel równe stężenia białka na żelach SDS-PAGE o stężeniu poliakryloamidu od 8 do 16%. Następnie ekspresję białka Wernera określono za pomocą techniki Western blot w komórkach sgs.

Wariant sgs1-top3 przywraca fenotyp powolnego wzrostu sgs1-top3, co pokazano na tych fotografiach. Szczepy sgs1-top3 przekształcone wektorem Werner lub szczepy sgs1 wysiano na płytki SC z tryptofanem zawierające 2% glukozy lub 2% galaktozy. Indukowana galaktozą ekspresja Werner powoduje, że szczep sgs1-top3 rośnie wolniej.

Z kolei szczep rodzicielski typu dzikiego lub szczep SGS one transformowany Wernerem nie wykazuje zmian w tempie wzrostu, co wskazuje, że spowolniony wzrost wywołany przez Wernera jest specyficzny dla tła sgs. One top three. Gdy szczepy SGS one top three transformowane wariantami Wernera wysiano na płytki SC z tryptofanem zawierające wyłącznie 2% glukozy lub 2% galaktozy.

Wariant Wernera z nieaktywną egzonukleazą nadal był w stanie przywrócić fenotyp powolnego wzrostu. Dowodzi to, że do przywrócenia fenotypu powolnego wzrostu w przypadku top three wymagana jest aktywność helikazy ATPase Wernera, a nie aktywność egzonukleazy. W tle SGS one top three, Werner przywrócił fenotyp powolnego wzrostu SGS one top three w całym zakresie stężeń GAL.

Wyniki te wskazują, że przywrócenie fenotypu wolnego wzrostu w tle mutantów sgs1, 3 zachodzi przy niskim poziomie ekspresji białka Wernera. Gdy kultury sgs1, 3 w fazie wzrostu logarytmicznego, przetransformowane białkiem Wernera lub jego wariantami, naniesiono metodą dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych na płytki SC z tryptofanem zawierające glukozę lub galaktozę oraz MMS lub HU, zaobserwowano, że ekspresja białka Wernera zwiększyła wrażliwość szczepu sgs1, 3 na MMS i HU. Co więcej, efekt ten w zakresie wrażliwości na MMS i HU w tle sgs1, 3 wymaga aktywności helikazowej ATP białka Wernera, ale nie jego aktywności egzonukleazy.

Wreszcie ekspresja białka Wernera przywraca również charakterystyczne opóźnienie SG two dla top three, co objawia się zwiększoną populacją komórek o dużych wybrzuszeniach. W komórkach mutantów sgs one top three wykazujących ekspresję białka Wernera, w porównaniu z komórkami sgs one top three przekształconymi wektorem, przeprowadzono barwienie Dabi.

Aby zwizualizować jądra komórkowe, strzałki wskazują ekspresję białka Werner w niepodzielonych jądrach. W transformowanych sgs, w trzech górnych komórkach indukcję wywołano poprzez dodanie wskazanych stężeń galaktozy, a komórki zebrano sześć godzin po indukcji. Równe ilości całkowitego lizatu komórkowego naniesiono na żele SDS-PAGE z poliakryloamidem 8-16%, a następnie przeprowadzono detekcję metodą western blot przy użyciu przeciwciała anty-Werner.

Przedstawiliśmy sposób badania fenotypów komórkowych związanych z określonymi tłem mutantów drożdży, aby wyjaśnić komórkowe i molekularne funkcje badanego genu u ludzi, pośredniczone przez jego aktywności katalityczne oraz oddziaływania białkowe. Drożdże mogą być wykorzystywane jako organizm modelowy do badania funkcji genu w określonych szlakach. Podczas wykonywania tych procedur ważne jest wybranie odpowiedniego tła mutanta drożdży, aby rozpoznać rolę badanego genu w określonych szlakach.

To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.