Elektroforeza w żelu z gradientem denaturującym (DGGE)

Dzień dobry. Nazywam się Celeste Peterson i jestem stypendystką na Uniwersytecie Harvarda, gdzie badam społeczności mikrobiologicznych biofilmów. Analizuję profil społeczności bakteryjnych, badając ich sekwencję 16S rRNA oraz to, jak sekwencja ta zmienia się w czasie i przestrzeni. W tym celu wykorzystuję metodę DGGE.

To nie jest zwykła elektroforeza; podczas przebiegu próbka musi być utrzymywana w temperaturze 60°C, a bufor musi być stale pompowany. Dlatego będziemy podgrzewać bufor przez około godzinę, aż osiągnie on 60°C, a następnie będziemy mogli przeprowadzić analizę. Teraz przemyję tę płytkę rozcieńczonym roztworem detergentu, usuwając wszelkie zanieczyszczenia, a następnie ją oświetlę.

Wszelkie tego typu zjawiska mogą powodować powstawanie regularności. Ważne jest, aby wytrzeć całą wodę. Dlatego podczas przygotowywania żelu umieszczę ten chip na zewnętrznej stronie żelu.

Zatem żel znajdzie się pomiędzy tymi dwiema płytkami szklanymi, a chip zostanie umieszczony na zewnątrz, więc nie wpłynie on na żel znajdujący się w środku. Teraz zamocuję żel w tych zaciskach, a następnie ścisnę je i dokręcę, obracając w prawo. Jak przy każdym żelu, ważne jest, aby upewnić się, że spód przylega płasko.

Aby zapobiec wyciekom, odwracamy teraz żel i umieszczamy go tutaj, aby został uszczelniony za pomocą uszczelki. Ważne jest, aby podczas tej czynności płytki były dokładnie wyrównane z uszczelką. Następnie wkładamy pokrętła znajdujące się z boku i dociskamy je, aby stworzyć uszczelnienie.

Jest to strzykawka 30 ml. Te elementy są częścią zestawu Bio-Rad i montuje się je w ten sposób. Służą one do usunięcia nadmiaru wody z rurek.

Następnie umieść rurkę na żelu, aby przystąpić do jego ładowania. Najpierw włóż adapter do rurki, a następnie igłę z tym małym adapterem i umieść ją dokładnie w centrum żelu, nieco poniżej dolnej szybki. Następnie ten adapter drutowy zostaje włożony do długiej rurki i zostanie połączony z dwiema strzykawkami zawierającymi roztwór o wysokiej i niskiej gęstości.

Oto przygotowane wcześniej roztwory. Do niebieskiego dodałem barwnik, który wskazuje, że jest to roztwór o najwyższym stopniu denaturacji, natomiast ten o niskiej gęstości jest najmniej denaturujący. Wszystkie zawierają niezbędne składniki.

A teraz przygotuję, właściwie zrobię dwa razy tyle w tygodniu. Po osiągnięciu odpowiedniej temperatury mają Państwo około pięciu do siedmiu minut na wypełnienie żelu, zanim dojdzie do polimeryzacji. Teraz napełniamy strzykawkę roztworem.

Wypełnię go zatem około 15 µL roztworu. Następnie, aby pozbyć się pęcherzyków powietrza, odwrócę go do góry dnem i będę delikatnie ściskać, aż górna bańka powietrza zniknie. Teraz ta mała śruba zostanie umieszczona w tym rowku.

Ten adapter zostanie wyrównany z tym zaciskiem, a następnie zostanie bardzo mocno przymocowany za pomocą ścisku w kształcie litery C. Następnie ta rurka zostanie podłączona do strzykawki. To samo wykonuje się po drugiej stronie z macierzą o wysokiej gęstości w miejscu podawania.

Będę teraz obracać tym kołem w stałym ruchu zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Najpierw wypłynie niebieski roztwór, ponieważ jest on najcięższy, i utworzy on dolną część żelu. Następnie po krótkim czasie żel zacznie wypełniać się przezroczystym roztworem, w wyniku czego powstanie gradient.

Przez chwilę trzymaj pod lekkim kątem. Zaraz po zakończeniu wlewania żelu natychmiast wypłucz probówki, ponieważ żel ulegnie polimeryzacji. Teraz przechodzimy do tej grupy. Następnie dociśnij. Tak, ten mały element, a po drugiej stronie zrobię to samo. Dobrze.

Cześć, nazywam się Celeste Peterson i jestem stypendystką na Uniwersytecie Harvarda, gdzie badam mikrobiologiczne społeczności biologiczne. Profiluję społeczności bakteryjne, analizując ich sekwencje 16S rRNA oraz to, jak sekwencje te zmieniają się w czasie i przestrzeni. W tym celu wykorzystuję metodę DGGE.

Zatem DGE to denaturująca elektroforeza żelowa. Podstawowym założeniem jest wykorzystanie gradientu, w którym DNA, przemieszczając się w dół, ulega denaturacji. W rezultacie różne gatunki DNA zatrzymają się w różnych punktach wzdłuż tego gradientu.

W rezultacie otrzymujemy swoisty „odcisk palca” różnych gatunków sekwencjonowanych w danej społeczności. Celem mojego eksperymentu jest więc sprawdzenie, jakie gatunki występują w społeczności oraz jak zmienia się to w czasie i przestrzeni. Mogę przeprowadzić elektroforezę żelową DDD dla sekwencjonowanych próbek, a następnie wyciąć prążki i zidentyfikować gatunki reprezentowane w każdej społeczności.

Jednym z największych wyzwań podczas wykonywania żelu DDG jest ustalenie optymalnego gradientu. Wymaga to doświadczalnego dopasowania i ustalenia, jaki typ gradientu jest odpowiedni dla danej społeczności. W dniu dzisiejszym stosuję gradient mocznika od 35 do 55%.

Jednym z głównych problemów, jakie mogą wystąpić przy tej technice, jest pojawianie się smug w pasmach. Odkryłem, że z jakiegoś powodu jednym z najlepszych rozwiązań jest prowadzenie elektroforezy żelowej przez bardzo długi czas, co powoduje znikanie smug. Obecnie stosuję tę metodę w badaniach nad ogólnymi zbiorowiskami bakteryjnymi, ale można ją również wykorzystać do analizy konkretnej rodziny bakterii w celu sprawdzenia, jak zmieniają się one w czasie; w takich przypadkach żele zazwyczaj są bardzo przejrzyste.

Za pomocą DDGE można również badać mutacje w pojedynczych genach.