Name: Elektroforeza żelowa z denaturacją gradientu (DGGE) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Poznaj elektroforezę DGGE do profilowania społeczności bakteryjnych w biofilmach mikroorganizmów. Ta metoda pozwala analizować zmiany sekwencji 16S rRNA w czasie i przestrzeni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

elektroforeza w żelu z gradientem denaturującym (dgge)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Elektroforeza w żelu z gradientem denaturującym (DGGE)

Dzień dobry. Nazywam się Celeste Peterson i jestem stypendystką na Uniwersytecie Harvarda, gdzie badam społeczności mikrobiologicznych biofilmów. Analizuję profil społeczności bakteryjnych, badając ich sekwencję 16S rRNA oraz to, jak sekwencja ta zmienia się w czasie i przestrzeni. W tym celu wykorzystuję metodę DGGE.To nie jest zwykła elektroforeza; podczas przebiegu próbka musi być utrzymywana w temperaturze 60°C, a bufor musi być stale pompowany. Dlatego będziemy podgrzewać bufor przez około godzinę, aż osiągnie on 60°C, a następnie będziemy mogli przeprowadzić analizę. Teraz przemyję tę płytkę rozcieńczonym roztworem detergentu, usuwając wszelkie zanieczyszczenia, a następnie ją oświetlę.Wszelkie tego typu zjawiska mogą powodować powstawanie regularności. Ważne jest, aby wytrzeć całą wodę. Dlatego podczas przygotowywania żelu umieszczę ten chip na zewnętrznej stronie żelu.Zatem żel znajdzie się pomiędzy tymi dwiema płytkami szklanymi, a chip zostanie umieszczony na zewnątrz, więc nie wpłynie on na żel znajdujący się w środku. Teraz zamocuję żel w tych zaciskach, a następnie ścisnę je i dokręcę, obracając w prawo. Jak przy każdym żelu, ważne jest, aby upewnić się, że spód przylega płasko.Aby zapobiec wyciekom, odwracamy teraz żel i umieszczamy go tutaj, aby został uszczelniony za pomocą uszczelki. Ważne jest, aby podczas tej czynności płytki były dokładnie wyrównane z uszczelką. Następnie wkładamy pokrętła znajdujące się z boku i dociskamy je, aby stworzyć uszczelnienie.Jest to strzykawka 30 ml. Te elementy są częścią zestawu Bio-Rad i montuje się je w ten sposób. Służą one do usunięcia nadmiaru wody z rurek.Następnie umieść rurkę na żelu, aby przystąpić do jego ładowania. Najpierw włóż adapter do rurki, a następnie igłę z tym małym adapterem i umieść ją dokładnie w centrum żelu, nieco poniżej dolnej szybki. Następnie ten adapter drutowy zostaje włożony do długiej rurki i zostanie połączony z dwiema strzykawkami zawierającymi roztwór o wysokiej i niskiej gęstości.Oto przygotowane wcześniej roztwory. Do niebieskiego dodałem barwnik, który wskazuje, że jest to roztwór o najwyższym stopniu denaturacji, natomiast ten o niskiej gęstości jest najmniej denaturujący. Wszystkie zawierają niezbędne składniki.A teraz przygotuję, właściwie zrobię dwa razy tyle w tygodniu. Po osiągnięciu odpowiedniej temperatury mają Państwo około pięciu do siedmiu minut na wypełnienie żelu, zanim dojdzie do polimeryzacji. Teraz napełniamy strzykawkę roztworem.Wypełnię go zatem około 15 µL roztworu. Następnie, aby pozbyć się pęcherzyków powietrza, odwrócę go do góry dnem i będę delikatnie ściskać, aż górna bańka powietrza zniknie. Teraz ta mała śruba zostanie umieszczona w tym rowku.Ten adapter zostanie wyrównany z tym zaciskiem, a następnie zostanie bardzo mocno przymocowany za pomocą ścisku w kształcie litery C. Następnie ta rurka zostanie podłączona do strzykawki. To samo wykonuje się po drugiej stronie z macierzą o wysokiej gęstości w miejscu podawania.Będę teraz obracać tym kołem w stałym ruchu zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Najpierw wypłynie niebieski roztwór, ponieważ jest on najcięższy, i utworzy on dolną część żelu. Następnie po krótkim czasie żel zacznie wypełniać się przezroczystym roztworem, w wyniku czego powstanie gradient.Przez chwilę trzymaj pod lekkim kątem. Zaraz po zakończeniu wlewania żelu natychmiast wypłucz probówki, ponieważ żel ulegnie polimeryzacji. Teraz przechodzimy do tej grupy. Następnie dociśnij. Tak, ten mały element, a po drugiej stronie zrobię to samo. Dobrze.Cześć, nazywam się Celeste Peterson i jestem stypendystką na Uniwersytecie Harvarda, gdzie badam mikrobiologiczne społeczności biologiczne. Profiluję społeczności bakteryjne, analizując ich sekwencje 16S rRNA oraz to, jak sekwencje te zmieniają się w czasie i przestrzeni. W tym celu wykorzystuję metodę DGGE.Zatem DGE to denaturująca elektroforeza żelowa. Podstawowym założeniem jest wykorzystanie gradientu, w którym DNA, przemieszczając się w dół, ulega denaturacji. W rezultacie różne gatunki DNA zatrzymają się w różnych punktach wzdłuż tego gradientu.W rezultacie otrzymujemy swoisty „odcisk palca” różnych gatunków sekwencjonowanych w danej społeczności. Celem mojego eksperymentu jest więc sprawdzenie, jakie gatunki występują w społeczności oraz jak zmienia się to w czasie i przestrzeni. Mogę przeprowadzić elektroforezę żelową DDD dla sekwencjonowanych próbek, a następnie wyciąć prążki i zidentyfikować gatunki reprezentowane w każdej społeczności.Jednym z największych wyzwań podczas wykonywania żelu DDG jest ustalenie optymalnego gradientu. Wymaga to doświadczalnego dopasowania i ustalenia, jaki typ gradientu jest odpowiedni dla danej społeczności. W dniu dzisiejszym stosuję gradient mocznika od 35 do 55%.Jednym z głównych problemów, jakie mogą wystąpić przy tej technice, jest pojawianie się smug w pasmach. Odkryłem, że z jakiegoś powodu jednym z najlepszych rozwiązań jest prowadzenie elektroforezy żelowej przez bardzo długi czas, co powoduje znikanie smug. Obecnie stosuję tę metodę w badaniach nad ogólnymi zbiorowiskami bakteryjnymi, ale można ją również wykorzystać do analizy konkretnej rodziny bakterii w celu sprawdzenia, jak zmieniają się one w czasie; w takich przypadkach żele zazwyczaj są bardzo przejrzyste.Za pomocą DDGE można również badać mutacje w pojedynczych genach.

denaturing-gradient-gel-electrophoresis-dgge

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Elektroforeza żelowa z denaturacją gradientu (DGGE)

Denaturująca elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie z dodatkiem mocznika jest stosowana do rozdzielania jednoniciowego DNA lub RNA o długości do 500 nukleotydów. Mocznik w połączeniu z ciepłem denaturuje próbki, a nieustrukturyzowane pojedyncze nici migrują wewnątrz matrycy żelowej zgodnie z ich masą cząsteczkową.

Denaturująca elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie z dodatkiem mocznika (Urea PAGE)

Opisano podstawowy protokół rozdzielania fragmentów DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Elektroforeza w żelu agarozowym do rozdziału fragmentów DNA

Ten film demonstruje dwuwymiarową, częściowo denaturującą separację włókien amyloidowych za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym detergentu. Technika ta polega na oddzieleniu polimorficznych agregatów amyloidowych na podstawie ich niejednorodnego rozmiaru.

Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu agarozowym częściowo denaturującym: technika rozdzielania polimorficznych włókien amyloidowych na podstawie niejednorodności wielkości

W tym filmie demonstrujemy dwuwymiarową metodę elektroforezy żelowej, która oddziela pojedyncze białka od złożonej mieszaniny białek uzyskanej z tkanek nowotworowych ludzkiego niefunkcjonalnego gruczolaka przysadki (NFPA). Białka są rozdzielane na podstawie ich ładunku elektrycznego w pierwszym wymiarze i dalej rozdzielane na podstawie mas cząsteczkowych w drugim wymiarze.

Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika rozdzielania do analizy białek w złożonej mieszaninie białek na podstawie ładunku i masy cząsteczkowej

Szybkie wykrywanie i wiarygodna ilościowa identyfikacja zdarzeń edycjonujących RNA na skalę genomową pozostają wyzwaniem i obecnie opierają się na bezpośrednich metodach sekwencjonowania RNA. Opisany tutaj protokół wykorzystuje elektroforezę żelową z gradientem mikrotemperatury (μTGGE) jako prostą, szybką i przenośną metodę wykrywania edycji RNA.

Podejście niesekwencjonujące do szybkiego wykrywania edycji RNA

Niniejszy film prezentuje protokół testu angiogenezy in vitro, który odtwarza kilka etapów angiogenezy. Przedstawiono obrazy time-lapse ukazujące kiełkowanie, formowanie światła naczyń, rozgałęzianie oraz anastomozę – kluczowe cechy angiogenezy.

Zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

Opisujemy protokół mikrofabrykacji mikroprzepływowego urządzenia do generowania gradientów, które umożliwia tworzenie przestrzennych i czasowych gradientów w ściśle określonym mikrośrodowisku. W tym podejściu mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów może być wykorzystane do badania kierunkowej migracji komórek, embriogenezy, gojenia ran oraz przerzutów nowotworowych.

Mikroprzepływowe urządzenie do generowania gradientów w biologii komórki

Demonstrujemy, że nadekspresja receptorówy czynnika wzrostu naskórka (EGFR) zwiększa ruchliwość neuralnych komórek macierzystych (NSCs) z wykorzystaniem nowatorskiego urządzenia mikroprzepływowego opartego na żelu agarozy. Technologia ta może być łatwo zaadaptowana do innych systemów komórek ssaków, w których źródła komórek są ograniczone, takie jak ludzkie neuralne komórki macierzyste, a czas realizacji badania jest krytyczny.

Ocena mobilności neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem mikroprzepływowego urządzenia opartego na żelu agarozy

SDD-AGE jest użyteczną techniką wykrywania i charakteryzacji polimerów amyloidopodobnych w komórkach. Przedstawiamy tutaj adaptację, która sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań na szeroką skalę.

Przesiewowe badanie agregacji amyloidu metodą półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym z detergentem

Opisujemy metodę ekstrakcji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z biomasy planktonicznej skoncentrowanej na filtrach Sterivex 0.22 μm, a następnie oczyszczania go za pomocą wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu.

Ekstrakcja DNA z filtrów Sterivex 0,22 $\mu$M oraz wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu

Poznaj elektroforezę DGGE do profilowania społeczności bakteryjnych w biofilmach mikroorganizmów. Ta metoda pozwala analizować zmiany sekwencji 16S rRNA w czasie i przestrzeni.

Elektroforeza w żelu z gradientem denaturującym (DGGE)

Przeglądaj więcej filmów