Name: Pomiar indukowanego napięcia membrany za pomocą Di-8-ANEPPS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-19T20:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Poznaj metodę pomiaru indukowanego napięcia membrany w komórkach CHO za pomocą barwnika potencjometrycznego di-8-ANEPPS. Protokół umożliwia nieinwazyjne badanie dynamiki napięcia w mikroskopii fluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Słowiańską Agencję Badawczą w ramach projektu Z2-9229 oraz programu P2-0249. Niniejsze wideo stanowi materiał uzupełniający do warsztatów naukowych i kursu podyplomowego „Technologie i terapie oparte na elektroporacji”, organizowanych raz na dwa lata przez Wydział Elektrotechniki Uniwersytetu w Lublanie w Słowenii.

Część I: Kroki wstępne
<ol>
<li>W tym eksperymencie wykorzystano linię komórkową jajnika chomika chińskiego (CHO-K1). Komórki wysiano do komór Lab-Tek II (2 dołki, 4 cm2 każdy) (Nalge Nunc, Niemcy) w zagęszczeniu ~0,7x105 komórek/ml w pożywce hodowlanej HAM-F12 uzupełnionej o 8% płodowej surowicy cielęcej, 0,15 mg/ml L-glutaminy, 16 mg/ml gentamyciny (wszystkie od Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy) oraz 200 jednostek/ml Crystacilliny (Pliva, Zagrzeb, Chorwacja) i inkubowano w 5% CO2 w temperaturze 37°C. Alternatywnie komórki można również wysiać na szklane okładki nr 1 (o grubości od 0,13 do 0,16 mm), pokryte adhezywem komórkowym, takim jak polilizyna.</li>
<li>Inkubuj komórki w ich pożywce hodowlanej. Inkubacja trwająca od 2 do 4 godzin pozwala uzyskać komórki, które są wciąż w przybliżeniu sferyczne, ale mocno przytwierdzone do powierzchni niewielką częścią swojej błony. Alternatywnie, po 16 do 20 godzinach inkubacji komórki są całkowicie przytwierdzone do powierzchni i mają bardziej złożone kształty, jednak większość z nich nadal się nie dzieli.</li>
<li>Przygotuj 10 mM roztwór zapasowy di-8-ANEPPS (Invitrogen, Eugene, Oregon, USA), dodając 843 μl DMSO (Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy) do 5 mg barwnika w oryginalnej fiolce od firmy Invitrogen. Roztwór zapasowy można przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C przez kilka miesięcy. Przed rozpoczęciem doświadczeń ogrzej roztwór, aż kryształy DMSO się rozpuszczą.</li>
<li>Niektóre linie komórkowe mogą wymagać zastosowania pluronicu w celu ułatwienia wbudowania barwnika w błonę komórkową. Pluronic można nabyć jako 20% roztwór zapasowy w DMSO (F-127, Invitrogen, Eugene, Oregon, USA) lub przygotować roztwór zapasowy o takim samym stężeniu, rozpuszczając pluronic w DMSO. Roztwór zapasowy pluronicu można przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Część II: Obciążanie komórek di-8-ANEPPS
<ol>
<li>W probówce Eppendorf o pojemności 1,5 ml zmieszaj 3 μl di-8-ANEPPS (10 mM) oraz 2,5 μl 20% pluroniku w 1 ml pożywki Minimum Essential Medium w modyfikacji Spinnera (wersja pozbawiona wapnia) SMEM (pożywka M8167 lub M4767, Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy). W ten sposób otrzymuje się „roztwór ładujący” zawierający około 30 μM di-8-ANEPPS i 0,05% pluroniku. W przypadku innych typów komórek zamiast SMEM można zastosować ich natywne pożywki hodowlane.</li>
<li>Wymień pożywkę hodowlaną w komorze Lab-Tek na roztwór ładujący. Przenieś komorę do lodówki na 10 min w temperaturze 4°C. W tej temperaturze internalizacja barwnika przez błonę plazmatyczną jest w znacznym stopniu zahamowana.</li>
<li>Po barwieniu delikatnie wypłucz nadmiar barwnika dwa lub trzy razy czystą pożywką SMEM.</li>
<li>Pozostaw w komorze 1,5 ml SMEM.</li>
</ol>
Część III: Eksperyment i akwizycja obrazu
<ol>
<li>Komórki obserwuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (w naszym przypadku Zeiss AxioVert 200, Zeiss, Niemcy) wyposażonego w obiektyw imersyjny olejowy (x63, NA 1.4), monochromator (Polychrome IV, Visitron, Niemcy) oraz chłodzoną kamerę CCD (VisiCam 1280, Visitron, Niemcy). Obrazy są pozyskiwane za pomocą oprogramowania MetaFluor 7.1.1 i przetwarzane w MetaMorph 7.1.1 (oba od Molecular Devices, Downingtown, PA, USA), jednak można również użyć innego podobnego oprogramowania do akwizycji. W oprogramowaniu do akwizycji należy ustawić długość fali wzbudzenia na 490 nm i wybrać odpowiedni filtr emisji dla ANEPPS, na przykład filtr pasmowy centrowany na 605 nm (605/55m, dichroic 565 DCXR, Chroma, Rockingham, VT, USA). W przypadku braku monochromatora można zamiast niego zastosować filtr wzbudzenia centrowany na 490 nm.</li>
<li>Komorę z komórkami należy umieścić na stoliku mikroskopu, ustawić elektrody na dnie komory i podłączyć je do generatora impulsów. Elektrody powinny być przykryte medium.</li>
<li>Aby zachować żywotność komórek i ograniczyć nagrzewanie, impuls powinien mieć dostatecznie niską amplitudę i krótki czas trwania. W tym eksperymencie impuls prostokątny o amplitudzie 35 V i czasie trwania 50 ms (wystarczająco niskiej, aby uniknąć elektroporacji) jest generowany przy użyciu zasilacza DC i specjalnie wykonanego urządzenia przełączającego sterowanego mikroprocesorem. Alternatywnie można użyć komercyjnego generatora impulsów, takiego jak 33210A (Agilent, Santa Clara, CA, USA) podłączonego do wzmacniacza lub komercyjnego stymulatora, takiego jak S88 (Grass, West Warwick, RI, USA). Impuls jest dostarczany do dwóch równoległych elektrod z drutu Pt/Ir o średnicy 0.8 mm i odległości 4 mm między nimi, co tworzy pole elektryczne o natężeniu około 88 V/cm między elektrodami i indukuje ΔΦ. Dokładny rozkład pola między elektrodami użytymi w tym eksperymencie został opisany w innym opracowaniu [1].</li>
<li>Należy odnaleźć interesujące komórki. Następnie przykłada się pojedynczy impuls elektryczny lub sekwencję impulsów. Dla każdego impulsu należy pozyskać dwa obrazy fluorescencyjne: jeden bezpośrednio przed impulsem (obraz kontrolny) i jeden w trakcie impulsu (obraz impulsowy). Ze względu na słabą odpowiedź di-8-ANEPPS, zmiany w fluorescencji są trudne do zauważenia gołym okiem i stają się widoczne dopiero po przetworzeniu. Dostarczanie impulsu musi być zsynchronizowane z akwizycją obrazu, co jest funkcją oprogramowania do akwizycji. Aby uniknąć fotoblaknięcia i ewentualnego nagrzewania, oświetlenie można ograniczyć do czasu trwania impulsu.</li>
</ol>
Część IV: Przetwarzanie i analiza obrazów
<ol>
<li>Otwórz obrazy w oprogramowaniu MetaMorph. Dla każdego impulsu odejmij tło zarówno z obrazu kontrolnego, jak i z obrazu po impulsie.</li>
<li>Wybierz komórkę i ustaw obszar zainteresowania (ROI) tak, aby odpowiadał on błonie. Zmierz natężenie fluorescencji wzdłuż tego obszaru na obrazie kontrolnym i po impulsie, a następnie przenieś wartości do arkusza kalkulacyjnego.</li>
<li>Dla każdego impulsu odejmij dane kontrolne od danych po impulsie, a wynik podziel przez dane kontrolne, aby uzyskać względne zmiany fluorescencji. W przypadku zastosowania sekwencji impulsów można wyciągnąć średnią z wartości względnych zmian fluorescencji wyznaczonych dla każdego impulsu, aby uzyskać bardziej wiarygodny pomiar.</li>
<li>Przekształć względne zmiany fluorescencji na ΔΦ, korzystając z krzywej kalibracyjnej. Wstępne oszacowanie tej krzywej można znaleźć w literaturze, jednak dla uzyskania wyższej dokładności musi ona zostać zmierzona dla każdego konkretnego układu. Dla komórek i układu zastosowanego w tym eksperymencie spadek fluorescencji o 6% odpowiada wzrostowi ΔΦ o 100 mV [2].</li>
<li>Na koniec wykreśl napięcie jako funkcję względnej długości łuku w programie graficznym, takim jak Excel (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA), Sigma Plot (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA) lub Origin (OriginLab Corp., Northampton, MA, USA). Krzywą można również wygładzić za pomocą odpowiedniego filtra, np. filtra średniej ruchomej.</li>
</ol>

<ol><li>Mazères, S., Šel, D., Golzio, M., Pucihar, G., Tamzali, Y., Miklavčič, D., Teissie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non+invasive+contact+electrodes+for+in+vivo+localized+cutaneous+electropulsation+and+associated+drug+and+nucleic+acid+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Non invasive contact electrodes for in vivo localized cutaneous electropulsation and associated drug and nucleic acid delivery.</a> J. Control. Release. 134, 125-131 (2009).</li>
<li>Pucihar, G., Kotnik, T., Valič, B., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+determination+of+transmembrane+voltage+induced+on+irregularly+shaped+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Numerical determination of transmembrane voltage induced on irregularly shaped cells.</a> Annals Biomed. Eng. 34, 642-652 (2006).</li>
<li>Huang, C. J., Harootunian, A., Maher, M. P., Quan, C., Raj, C. D., McCormack, K., Numann, R., Negulescu, P. A., Gonzalez, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+voltage-gated+sodium-channel+blockers+by+electrical+stimulation+and+fluorescence+detection+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of voltage-gated sodium-channel blockers by electrical stimulation and fluorescence detection of membrane potential.</a> Nat. Biotechnol. 24, 439-446 (2006).</li>
<li>Bedlack, R. S., Wei, M., Fox, S. H., Gross, E., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+electric+potentials+in+soma+and+neurite+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct electric potentials in soma and neurite membranes.</a> Neuron. 13, 1187-1193 (1994).</li>
<li>Cheng, D. K. L., Tung, L., Sobie, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+responses+of+transmembrane+potential+during+electric+field+stimulation+of+single+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nonuniform responses of transmembrane potential during electric field stimulation of single cardiac cells.</a> Am. J. Physiol. 277, H351-H362 (1999).</li>
<li>Teissie, J., Eynard, N., Gabriel, B., Rols, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electropermeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Del.+Rev%22%5BJournal%5D)">Electropermeabilization of cell membranes.</a> Adv. Drug. Del. Rev. 35, 3-19 (1999).</li>
<li>Sersa, G., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemotherapy+of+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Electrochemotherapy of tumours.</a> JoVE. 22, (2008).</li>
<li>Kotnik, T., Bobanović, F., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+transmembrane+voltage+induced+by+applied+electric+fields+a+theoretical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochem.+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of transmembrane voltage induced by applied electric fields a theoretical analysis.</a> Bioelectrochem. Bioenerg. 43, 285-291 (1997).</li>
<li>Schwan, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+properties+of+tissue+and+cell+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biol.+Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">Electrical properties of tissue and cell suspensions.</a> Adv. Biol. Med. Phys. 5, 147-209 (1957).</li>
<li>Gowrishankar, T. R., Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+electrical+modeling+of+single+and+multiple+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">An approach to electrical modeling of single and multiple cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 3203-3208 (2003).</li>
<li>Joshi, R. P., Hu, Q., Schoenbach, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+studies+of+cell+response+to+ultrashort%2C+high-intensity+electric+fields+-+Implications+for+intracellular+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Plasma+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling studies of cell response to ultrashort, high-intensity electric fields - Implications for intracellular manipulation.</a> IEEE Trans. Plasma Sci. 32, 1677-1686 (2004).</li>
<li>Gross, D., Loew, L. M., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cell+membrane+potential+changes+induced+by+applied+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cell membrane potential changes induced by applied electric fields.</a> Biophys. J. 50, 339-348 (1986).</li>
<li>Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. S. pectra <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((membrane+binding%2C+and+potentiometric+responses+of+new+charge+shift+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes.</a> Biochemistry. 24, 5749-5755 (1985).</li>
<li>Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dyes%3A+measurement+of+membrane+potentials+induced+by+DC+and+AC+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectromagnetics+Suppl%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dyes: measurement of membrane potentials induced by DC and AC electric fields.</a> Bioelectromagnetics Suppl. 1, 179-189 (1992).</li>
<li>Hibino, M., Shigemori, M., Itoh, H., Nagayama, K., Kinosita, K. J. r <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+conductance+of+an+electroporated+cell+analyzed+by+submicrosecond+imaging+of+transmembrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Membrane conductance of an electroporated cell analyzed by submicrosecond imaging of transmembrane potential.</a> Biophys. J. 59, 209-220 (1991).</li>
<li>Lojewska, Z., Franks, D. L., Ehrenberg, B., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+effect+of+medium+and+membrane+conductance+on+the+amplitude+and+kinetics+of+membrane+potentials+induced+by+externally+applied+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of the effect of medium and membrane conductance on the amplitude and kinetics of membrane potentials induced by externally applied electric fields.</a> Biophys. J. 56, 121-128 (1989).</li>
<li>Zhang, J., Davidson, R. M., Wei, M. D., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electric+properties+by+combined+patch+clamp+and+fluorescence+ratio+imaging+in+single+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Membrane electric properties by combined patch clamp and fluorescence ratio imaging in single neurons.</a> Biophys. J. 74, 48-53 (1998).</li>
<li>Montana, V., Farkas, D. L., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-wavelength+ratiometric+fluorescence+measurements+of+membrane-potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurements of membrane-potential.</a> Biochemistry. 28, 4536-4539 (1989).</li>
<li>Knisley, S. B., Justice, R. K., Kong, W., Johnson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometry+of+transmembrane+voltage-sensitive+fluorescent+dye+emission+in+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ratiometry of transmembrane voltage-sensitive fluorescent dye emission in hearts.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279, H1421-H1433 (2000).</li>
<li>Pucihar, G., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-dependent+numerical+model+of+transmembrane+voltage+inducement+and+electroporation+of+irregularly+shaped+cells%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+T.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">A time-dependent numerical model of transmembrane voltage inducement and electroporation of irregularly shaped cells.</a> IEEE T. Biomed. Eng. 56, 1491-1501 (2009).</li>
</ol>

Pomiary indukowanego napięcia błonowego (transbłonowego), ΔΦ, mogą być istotne w różnych układach eksperymentalnych, takich jak badania nad bramkowanymi napięciowo kanałami błonowymi, propagacja potencjału czynnościowego, stymulacja komórek serca lub elektroporacja błony komórkowej [3, 4, 5, 6, 7]. W przypadku prostych kształtów komórek ΔΦ można obliczyć analitycznie. Na przykład dla komórki sferycznej ΔΦ jest określone równaniem Schwana, zgodnie z którym napięcie jest proporcjonalne do natężenia pola i rozmiaru komórki i zgodnie z funkcją cosinus przebiega wzdłuż błony [8, 9]. W przypadku bardziej skomplikowanych kształtów komórek ΔΦ może znacząco odbiegać od funkcji cosinus i musi zostać wyznaczone numerycznie, przy użyciu komputera [2, 10, 11], lub eksperymentalnie, z wykorzystaniem barwnika potencjometrycznego [12, 13, 14, 15].
Jednym z szeroko stosowanych do tego celu barwników potencjometrycznych jest di-8-ANEPPS (di-8-butyl-amino-naphthyl-ethylene-pyridinium-propyl-sulfonate), szybki barwnik o widmach wzbudzenia i emisji zależnych od napięcia błony, co pozwala na nieinwazyjną obserwację zmian ΔΦ na błonie komórkowej oraz pomiar jego wartości. W tym filmie przedstawiamy podejście eksperymentalne do wyznaczania ΔΦ przy użyciu di-8-ANEPPS.
Barwnik ten został opracowany przez profesora Lesliego Loewa i współpracowników [13, 14] na Uniwersytecie Connecticut i należy do klasy barwników o szybkim czasie odpowiedzi. di-8-ANEPPS jest niefluorescencyjny w wodzie i staje się silnie fluorescencyjny po wbudowaniu się w lipidową dwuwarstwę błony komórkowej. Zmiana ΔΦ powoduje zmianę wewnątrzcząsteczkowego rozkładu ładunku i odpowiadające temu zmiany w profilu spektralnym oraz intensywności fluorescencji barwnika. Intensywność fluorescencji di-8-ANEPPS zmienia się proporcjonalnie do zmiany ΔΦ; odpowiedź barwnika jest liniowa dla napięć w zakresie od −280 mV do +250 mV [4, 16]. Stosunkowo niewielkie zmiany fluorescencji barwnika, nierównomierne barwienie błony oraz internalizacja barwnika sprawiają, że di-8-ANEPPS jest mniej odpowiedni do absolutnych pomiarów napięcia błonowego, np. jego składowej spoczynkowej, choć donoszono również o takich próbach [17]. Nadaje się on jednak do pomiaru większych zmian napięcia błonowego, takich jak początek indukowanego napięcia błonowego w komórkach niepobudliwych poddanych działaniu zewnętrznych pól elektrycznych [12, 13] lub potencjały czynnościowe w komórkach pobudliwych [4, 5]. Choć nie zastosowano tego w niniejszym protokole, di-8-ANEPPS umożliwia również wyznaczenie ΔΦ za pomocą ratiometrycznych pomiarów wzbudzenia fluorescencji [18] lub emisji [19], co zwiększa czułość odpowiedzi i redukuje wspomniane wcześniej efekty. Ponieważ di-8-ANEPPS barwi błonę, może być również stosowany po prostu jako marker błonowy [2].
Jedną z wad tego barwnika jest jego skłonność do fotoblaknięcia, dlatego należy unikać długotrwałej ekspozycji na silne światło. Kalibrację barwnika przeprowadza się albo za pomocą (i) jonoforu potasowego walinomycyny i zestawu różnych stężeń potasu w medium zewnętrznym [2,18], albo (ii) metody patch-clamp w trybie clampowania napięcia [17].
Na koniec, na podstawie pomiarów ΔΦ w komórkach sferycznych oraz komórkach o bardziej złożonych kształtach, w filmie zaprezentowano wpływ kształtu komórki na amplitudę i rozkład przestrzenny ΔΦ. Zatem dla komórek sferycznych ΔΦ jest bliskie funkcji cosinus, zgodnie z równaniem Schwana, natomiast dla bardziej złożonych kształtów komórek rozkład przestrzenny ΔΦ jest bardziej skomplikowany [20]...

<table><tbody><tr><td>di-8-ANEPPS</td><td>Invitrogen</td><td>D-3167</td><td>potencjometryczny barwnik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>pluronic</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td>ionofor potasu</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>SMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8167 lub M4767</td><td>podłoże Minimum Essential Medium w wersji Spinner</td></tr><tr><td>Ham-F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4888</td><td>podłoże hodowlane</td></tr><tr><td>płodowa surowica cielęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>krystacylina</td><td>Pliva</td><td>625110</td><td>antybiotyk</td></tr><tr><td>gentamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>antybiotyk</td></tr><tr><td>Lab-Tek II</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155379</td><td>komora</td></tr><tr><td>zasilacz DC</td><td>Elektro-Automatik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>przełącznik sterowany mikroprocesorowo</td><td>wykonanie własne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>elektrody</td><td>wykonanie własne</td><td></td><td>Pt/Ir</td></tr></tbody></table>

pomiar indukowanego napięcia błonowego z użyciem di-8-anepps

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Umieszczenie komórki w zewnętrznym polu elektrycznym powoduje lokalną redystrybucję ładunku wewnątrz i na zewnątrz komórki w sąsiedztwie błony komórkowej, co skutkuje powstaniem napięcia na błonie. Napięcie to, nazywane indukowanym napięciem błonowym (również indukowanym napięciem transbłonowym lub indukowaną różnicą potencjałów transbłonowych) i oznaczane symbolem &Delta;&Phi;, występuje tylko tak długo, jak obecne jest pole zewnętrzne. Jeśli na błonie występuje napięcie spoczynkowe, napięcie indukowane nakłada się na nie (sumuje się z nim). Dzięki zastosowaniu jednego z potencjometrycznych barwników fluorescencyjnych, takich jak di-8-ANEPPS, możliwe jest obserwowanie zmian &Delta;&Phi; na błonie komórkowej oraz nieinwazyjne pomierzenie jego wartości. di-8-ANEPPS wykazuje silną fluorescencję po związaniu z dwuwarstwą lipidową błony komórkowej, przy czym zmiana intensywności fluorescencji jest proporcjonalna do zmiany &Delta;&Phi;. Niniejsze wideo przedstawia protokół pomiaru &Delta;&Phi; z użyciem di-8-ANEPPS, a także demonstruje wpływ kształtu komórki na amplitudę i rozkład przestrzenny &Delta;&Phi;.

Zewnętrzne pole elektryczne indukuje napięcie na błonie komórkowej, określane jako indukowane napięcie błonowe (ΔΦ). Dzięki zastosowaniu barwnika potencjometrycznego di-8-ANEPPS możliwe jest nieinwazyjny pomiar ΔΦ. Niniejsze wideo przedstawia protokół pomiaru ΔΦ przy użyciu di-8-ANEPPS.

Pomiar indukowanego napięcia błonowego z użyciem Di-8-ANEPPS

Umieszczenie komórki w zewnętrznym polu elektrycznym powoduje lokalną redystrybucję ładunków wewnątrz i na zewnątrz komórki w jej bezpośrednim sąsiedztwie...

Z punktu widzenia biologa komórka jest podstawową jednostką budulcową życia, zawierającą szereg różnych organelli, z których każdy wykonuje określone zadania, co wspólnie umożliwia komórce realizację funkcji życiowych. Z perspektywy elektrycznej struktura wewnętrzna nie jest jednak bardzo istotna i komórkę można rozpatrywać jako przewodzące cytoplazmę zamkniętą w izolującej błonie i otoczoną przewodzącym środowiskiem zewnętrznym. Niewielka nierównowaga stężeń jonowych, przy której nadmiar jonów gromadzi się w pobliżu błony, skutkuje powstaniem spoczynkowego potencjału błonowego.Umieszczenie komórki w polu elektrycznym powoduje lokalną redystrybucję ładunku po obu stronach błony. Wynikiem jest indukowane napięcie błonowe, które nakłada się na napięcie spoczynkowe i znika po wyłączeniu pola. W przypadku prostych kształtów komórek, indukowane napięcie błonowe można obliczyć analitycznie dla komórki sferycznej.Wyraża go równanie Schwanna, zgodnie z którym napięcie jest proporcjonalne do natężenia pola i rozmiaru komórki oraz zmienia się zgodnie z funkcją cosinusową wzdłuż błony. W przypadku bardziej skomplikowanych kształtów komórek indukowane napięcie może znacznie odbiegać od funkcji cosinusowej i musi zostać wyznaczone albo numerycznie przy użyciu wydajnego komputera, albo eksperymentalnie za pomocą potencjometrycznego barwnika. Jednym z powszechnie stosowanych w tym celu barwników potencjometrycznych są diAIPs.Szybki barwnik o widmach wzbudzenia i emisji zależnych od potencjału błonowego, AIPs staje się silnie fluorescencyjny po związaniu z błoną, przy czym zmiana intensywności fluorescencji jest proporcjonalna do zmiany potencjału błonowego. Niniejsze wideo przedstawia protokół pomiaru indukowanego potencjału błonowego z wykorzystaniem D AIPs. W tym przykładzie zastosowano komórki jajnika chomika syryjskiego, wysiewając je do komór w zagęszczeniu 100 000 komórek na komorę.W hodowli HAMF 12, w pożywce uzupełnionej o płodowe serum cielęce, L-glutaminę oraz antybiotyki, inkubuj komórki w ich pożywce hodowlanej od dwóch do czterech godzin, aby uzyskać przytwierdzone komórki o kształcie sferycznym, lub od 16 do 20 godzin, aby uzyskać pojedyncze przytwierdzone komórki o bardziej złożonych kształtach. Przygotuj w oryginalnej fiolce roztwór stokowy DiI AAPS o stężeniu 10 mM rozpuszczony w DMSO. Niektóre linie komórkowe mogą wymagać dodatku pluroniku, aby ułatwić wbudowanie barwnika w błonę. Przenieś jeden mililitr zmodyfikowanej minimalnej pożywki niezbędnej (SMEM) do probówki typu EOL, dodając 2,5 µL 20% pluroniku oraz trzy µL 10 mM DiI AAPS.W ten sposób otrzymuje się roztwór ładujący zawierający około 30 µM diet aaps oraz 0,05% of onic. Należy zastąpić pożywkę hodowlaną w komorze roztworem ładującym. Przenieś komorę do lodówki na 10 minut w temperaturze 4 °C.Aby w znacznym stopniu zahamować internalizację barwnika przez błonę plazmatyczną po barwieniu, należy starannie wypłukać nadmiar barwnika kilkukrotnie czystym SMEM. Na koniec pozostawić w komorze 1,5 milliliters SMEM. Komórki obserwuje się przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem imersyjnym olejowym, monochromatora i kamery CCD.W oprogramowaniu do akwizycji ustaw długość fali wzbudzenia na 419 nanometrów i wybierz filtr pasmowy ustawiony na około 605 nanometrów, choć nie został on tutaj zastosowany. Diet aaps umożliwia również pomiary ratiometryczne napięcia błony. Umieść komorę z komórkami na stoliku mikroskopu, ustaw elektrody na dnie komory i podłącz je do generatora impulsów.W tym przykładzie generowany jest impuls prostokątny o amplitudzie 35 V i czasie trwania 50 ms. Przy użyciu zasilacza DC i przełącznika sterowanego mikroprocesorem impuls jest dostarczany do pary elektrod, co tworzy między nimi pole elektryczne i indukuje napięcie błonowe. Dostarczenie impulsu musi być zsynchronizowane z akwizycją obrazu.Znaleźć komórki będące przedmiotem zainteresowania, a następnie przyłożyć pojedynczy impuls elektryczny lub sekwencję impulsów. Dla każdego impulsu należy pozyskać dwa obrazy fluorescencyjne: obraz kontrolny bezpośrednio przed impulsem oraz obraz impulsu w trakcie jego trwania, ze względu na niską odpowiedź barwnika. Zmiany w fluorescencji są trudne do rozróżnienia i stają się widoczne dopiero po przetworzeniu obrazów dla każdego impulsu.Odejmij tło zarówno z obrazu kontrolnego, jak i z obrazu impulsu. Wybierz komórkę i ustaw obszar zainteresowania tak, aby odpowiadał on błonie. Zmierz fluorescencję wzdłuż tego obszaru w obrazie kontrolnym oraz w obrazie impulsu, a następnie przenieś wartości do arkusza kalkulacyjnego dla każdego impulsu.Odejmij dane kontrolne od danych z impulsu, a następnie podziel wynik przez dane kontrolne, aby uzyskać względne zmiany fluorescencji. W przypadku zastosowania sekwencji impulsów można wyciągnąć średnią z wartości względnych zmian określonych dla każdego impulsu. Aby uzyskać bardziej wiarygodny pomiar, przelicz względne zmiany fluorescencji na indukowane napięcie błonowe.Krzywą kalibracyjną można przybliżyć na podstawie literatury, jednak w celu uzyskania wyższej dokładności należy ją zmierzyć dla każdego konkretnego układu. Należy wykreślić zależność napięcia od względnej długości łuku. W przypadku komórek sferycznych krzywą można również wygładzić, stosując odpowiedni filtr.Otrzymany wykres przypomina cosinus, co jest zgodne z równaniem Schwanna. W przypadku bardziej złożonych kształtów komórek ta sama procedura prowadzi do bardziej skomplikowanych rozkładów przestrzennych napięcia błonowego.

measuring-the-induced-membrane-voltage-with-di-8-anepps

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomiar napięcia błony indukowanej za pomocą Di-8-ANEPPS

Niniejszy materiał stanowi demonstrację sposobu rozumienia błon biologicznych przy użyciu modeli elektrycznych. Przedstawiamy również procedury rejestracji potencjałów czynnościowych z brzusznego sznura nerwowego raka, przeznaczone do wykorzystania w laboratoriach dydaktycznych.

Modelowanie błon biologicznych za pomocą płytek drukowanych i pomiar sygnałów elektrycznych w aksonach: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Opisano wytwarzanie, kalibrację oraz zastosowanie nieinwazyjnych sond wibracyjnych do pomiaru prądu bioelektrycznego w różnych systemach biologicznych.

Pomiar prądu bioelektrycznego za pomocą wibrującej sondy

Technika amperometryczna mierzy uwalnianie dopaminy z pojedynczej komórki poprzez wykrywanie prądu utleniania powstającego podczas spontanicznego utleniania dopaminy. Metodologia jednoczesnego zaciskania napięcia (voltage clamp) i amperometrii ujawnia mechanistyczną zależność między całkowitą „aktywnością” transportera dopaminy a regulacyjną rolą tej aktywności w transporcie zwrotnym dopaminy.

Pomiar uwalniania dopaminy z pojedynczej komórki przy jednoczesnym zastosowaniu zacisku napięciowego i amperometrii

Tutaj prezentujemy metodę elektrofizjologiczną opartą na solidnych membranach z naciskiem na jej zastosowania do charakterystyki elektrogenicznych transporterów membranowych.

Wprowadzenie do elektrofizjologii opartej na membranach podpartych ciałem stałym

Transportery w błonach komórkowych umożliwiają różnicową segregację jonów przez błony komórkowe lub warstwy komórkowe i odgrywają kluczową rolę podczas fizjologii, naprawy i patologii tkanek. Opisujemy jonoselektywną, samoreferencyjną mikroelektrodę, która umożliwia pomiar określonych strumieni jonów w pojedynczych komórkach i tkankach in vivo.

Pomiar zewnątrzkomórkowych strumieni jonów za pomocą techniki jonoselektywnych mikroelektrod samoreferencyjnych

Bakteryjne kanały mechanowrażliwe mogą być używane jako przetworniki mechanoelektryczne w urządzeniach biomolekularnych.  Dwuwarstwy interfejsu kropelkowego (DIB), inspirowane komórkami elementami budulcowymi takich urządzeń, stanowią nowe platformy do włączania i stymulowania kanałów mechanowrażliwych.  W tym miejscu demonstrujemy nową metodę tworzenia DIB opartą na mikropipetach, umożliwiającą badanie kanałów mechanoczułych pod wpływem stymulacji mechanicznej.

Wielofunkcyjna, oparta na mikropipetach metoda wprowadzania i stymulacji mechanowrażliwych kanałów jonowych bakterii w dwuwarstwach interfejsu kropelkowego

Opisano metodę obrazowania zmian potencjału błonowego za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników napięcia.

Obrazowanie potencjału błony za pomocą dwóch typów genetycznie kodowanych fluorescencyjnych czujników napięcia

Opisujemy metodę przygotowania pojedynczych, świeżo wyizolowanych komórek mięśni gładkich wypieracza z próbek ludzkiego pęcherza moczowego, stosując dwuetapową procedurę enzymatyczną. Uzyskane żywotne komórki DSM można badać za pomocą różnych technik jednokomórkowych, w tym opisanej elektrofizjologii amfoterycyny-B patch-clamp, w celu ujawnienia właściwości fizjologicznych i farmakologicznych.

Przygotowanie i wykorzystanie świeżo wyizolowanych ludzkich komórek mięśni gładkich wypieracza do charakterystyki 9-fenantrolowych prądów kationowych

Tutaj pokazujemy, jak skonfigurować tani woltoamperomierz z programowalną częstotliwością wyjściową, który może być używany z dostępnymi na rynku elektrodami pałeczkowymi do pomiarów przezprzeznabłonkowego/śródbłonkowego oporu elektrycznego.

Proste podejście do wykonywania pomiarów TEER za pomocą samodzielnie wykonanego woltoamperomierza z programowalną częstotliwością wyjściową

Ten protokół opisuje reproduktywalną metodę wytwarzania trwałych metalowo-organicznych ramek/polimerowych membran mieszanych i dokładnego pomiaru ich przewodnictwa protonowego w płaszczyźnie pod zmienną temperaturą i wilgotnością z wykorzystaniem spektroskopii impedancji elektrochemicznej, co może być przydatne dla ogniw paliwowych z membranami wymienników protonowych (PEMFC).

Pomiar przewodności protonowej w membranie matrycowej mieszanej na bazie MOF za pomocą spektroskopii impedancji elektrochemicznej

Poznaj metodę pomiaru indukowanego napięcia membrany w komórkach CHO za pomocą barwnika potencjometrycznego di-8-ANEPPS. Protokół umożliwia nieinwazyjne badanie dynamiki napięcia w mikroskopii fluorescencyjnej.

Pomiar indukowanego napięcia błonowego z użyciem Di-8-ANEPPS

Przeglądaj więcej filmów