Pomiar indukowanego napięcia błonowego z użyciem Di-8-ANEPPS

Z punktu widzenia biologa komórka jest podstawową jednostką budulcową życia, zawierającą szereg różnych organelli, z których każdy wykonuje określone zadania, co wspólnie umożliwia komórce realizację funkcji życiowych. Z perspektywy elektrycznej struktura wewnętrzna nie jest jednak bardzo istotna i komórkę można rozpatrywać jako przewodzące cytoplazmę zamkniętą w izolującej błonie i otoczoną przewodzącym środowiskiem zewnętrznym. Niewielka nierównowaga stężeń jonowych, przy której nadmiar jonów gromadzi się w pobliżu błony, skutkuje powstaniem spoczynkowego potencjału błonowego.

Umieszczenie komórki w polu elektrycznym powoduje lokalną redystrybucję ładunku po obu stronach błony. Wynikiem jest indukowane napięcie błonowe, które nakłada się na napięcie spoczynkowe i znika po wyłączeniu pola. W przypadku prostych kształtów komórek, indukowane napięcie błonowe można obliczyć analitycznie dla komórki sferycznej.

Wyraża go równanie Schwanna, zgodnie z którym napięcie jest proporcjonalne do natężenia pola i rozmiaru komórki oraz zmienia się zgodnie z funkcją cosinusową wzdłuż błony. W przypadku bardziej skomplikowanych kształtów komórek indukowane napięcie może znacznie odbiegać od funkcji cosinusowej i musi zostać wyznaczone albo numerycznie przy użyciu wydajnego komputera, albo eksperymentalnie za pomocą potencjometrycznego barwnika. Jednym z powszechnie stosowanych w tym celu barwników potencjometrycznych są diAIPs.

Szybki barwnik o widmach wzbudzenia i emisji zależnych od potencjału błonowego, AIPs staje się silnie fluorescencyjny po związaniu z błoną, przy czym zmiana intensywności fluorescencji jest proporcjonalna do zmiany potencjału błonowego. Niniejsze wideo przedstawia protokół pomiaru indukowanego potencjału błonowego z wykorzystaniem D AIPs. W tym przykładzie zastosowano komórki jajnika chomika syryjskiego, wysiewając je do komór w zagęszczeniu 100 000 komórek na komorę.

W hodowli HAMF 12, w pożywce uzupełnionej o płodowe serum cielęce, L-glutaminę oraz antybiotyki, inkubuj komórki w ich pożywce hodowlanej od dwóch do czterech godzin, aby uzyskać przytwierdzone komórki o kształcie sferycznym, lub od 16 do 20 godzin, aby uzyskać pojedyncze przytwierdzone komórki o bardziej złożonych kształtach. Przygotuj w oryginalnej fiolce roztwór stokowy DiI AAPS o stężeniu 10 mM rozpuszczony w DMSO. Niektóre linie komórkowe mogą wymagać dodatku pluroniku, aby ułatwić wbudowanie barwnika w błonę. Przenieś jeden mililitr zmodyfikowanej minimalnej pożywki niezbędnej (SMEM) do probówki typu EOL, dodając 2,5 µL 20% pluroniku oraz trzy µL 10 mM DiI AAPS.

W ten sposób otrzymuje się roztwór ładujący zawierający około 30 µM diet aaps oraz 0,05% of onic. Należy zastąpić pożywkę hodowlaną w komorze roztworem ładującym. Przenieś komorę do lodówki na 10 minut w temperaturze 4 °C.

Aby w znacznym stopniu zahamować internalizację barwnika przez błonę plazmatyczną po barwieniu, należy starannie wypłukać nadmiar barwnika kilkukrotnie czystym SMEM. Na koniec pozostawić w komorze 1,5 milliliters SMEM. Komórki obserwuje się przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem imersyjnym olejowym, monochromatora i kamery CCD.

W oprogramowaniu do akwizycji ustaw długość fali wzbudzenia na 419 nanometrów i wybierz filtr pasmowy ustawiony na około 605 nanometrów, choć nie został on tutaj zastosowany. Diet aaps umożliwia również pomiary ratiometryczne napięcia błony. Umieść komorę z komórkami na stoliku mikroskopu, ustaw elektrody na dnie komory i podłącz je do generatora impulsów.

W tym przykładzie generowany jest impuls prostokątny o amplitudzie 35 V i czasie trwania 50 ms. Przy użyciu zasilacza DC i przełącznika sterowanego mikroprocesorem impuls jest dostarczany do pary elektrod, co tworzy między nimi pole elektryczne i indukuje napięcie błonowe. Dostarczenie impulsu musi być zsynchronizowane z akwizycją obrazu.

Znaleźć komórki będące przedmiotem zainteresowania, a następnie przyłożyć pojedynczy impuls elektryczny lub sekwencję impulsów. Dla każdego impulsu należy pozyskać dwa obrazy fluorescencyjne: obraz kontrolny bezpośrednio przed impulsem oraz obraz impulsu w trakcie jego trwania, ze względu na niską odpowiedź barwnika. Zmiany w fluorescencji są trudne do rozróżnienia i stają się widoczne dopiero po przetworzeniu obrazów dla każdego impulsu.

Odejmij tło zarówno z obrazu kontrolnego, jak i z obrazu impulsu. Wybierz komórkę i ustaw obszar zainteresowania tak, aby odpowiadał on błonie. Zmierz fluorescencję wzdłuż tego obszaru w obrazie kontrolnym oraz w obrazie impulsu, a następnie przenieś wartości do arkusza kalkulacyjnego dla każdego impulsu.

Odejmij dane kontrolne od danych z impulsu, a następnie podziel wynik przez dane kontrolne, aby uzyskać względne zmiany fluorescencji. W przypadku zastosowania sekwencji impulsów można wyciągnąć średnią z wartości względnych zmian określonych dla każdego impulsu. Aby uzyskać bardziej wiarygodny pomiar, przelicz względne zmiany fluorescencji na indukowane napięcie błonowe.

Krzywą kalibracyjną można przybliżyć na podstawie literatury, jednak w celu uzyskania wyższej dokładności należy ją zmierzyć dla każdego konkretnego układu. Należy wykreślić zależność napięcia od względnej długości łuku. W przypadku komórek sferycznych krzywą można również wygładzić, stosując odpowiedni filtr.

Otrzymany wykres przypomina cosinus, co jest zgodne z równaniem Schwanna. W przypadku bardziej złożonych kształtów komórek ta sama procedura prowadzi do bardziej skomplikowanych rozkładów przestrzennych napięcia błonowego.