Elektrofizjologia rdzenia kręgowego
18 stycznia 2010
Demonstracja izolacji rdzenia kręgowego noworodka myszy do badań elektrofizjologicznych.
Dzień dobry, nazywam się Alan Meyer i jestem asystentem badawczym w laboratorium faf w Instytucie Salka. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzić brzuszną laminektomię w celu wyizolowania rdzenia kręgowego myszy, a także zaprezentuję sposób przymocowania rdzenia kręgowego do elektrody. Aby zarejestrować jego aktywność neuronalną, należy przygotować dwa roztwory do rdzenia kręgowego: jeden do sekcji, a drugi do kąpieli rejestracyjnej.
Jedyną różnicą między tymi dwoma roztworami będzie stężenie chlorku wapnia. W pierwszej kolejności należy przygotować roztwór 10 X-A-C-S-F. Będą do tego potrzebne odczynniki wymienione poniżej.
Zacznij od dodania 100 mililitrów 10 X-A-C-S-F do kolby miarowej o pojemności jednego litra. Następnie napełnij kolbę wodą, pozostawiając wolną przestrzeń, aby roztwór nie przelał się. W przypadku nasycania gazem, zastosuj roztwory o stężeniu gazu 5%CO2 i 95%O2.
Aby obniżyć pH i natlenić roztwór, należy dodać 1 mL 1 M siarczanu magnezu. Następnie do roztworu do sekcji dodaje się 1 mL 1 M roztworu chlorku wapnia, a do roztworu do rejestracji dodaje się 2 mL 1 M chlorku wapnia. W eksperymentach tych można wykorzystać myszy w wieku od E 16.5 do P 4.
Rozpocznij sekcję myszy, najpierw szybko odcinając jej głowę ostrymi nożyczkami. Następnie wykonaj nacięcie wzdłuż linii pośrodkowej strony brzusznej aż do ogona. Potem, używając pęsety, usuń wnętrzności myszy i wypłucz je roztworem A CSF.
Do przeprowadzenia sekcji należy użyć roztworu chlorku wapnia 1 mM A CSF. Umieść mysz w naczyniu sekcyjnym i unieruchom ją, wbijając szpilki w cztery łapy oraz u nasady ogona. Celem tego etapu będzie wyizolowanie rdzenia kręgowego poprzez cięcie wzdłuż czerwonej przerywanej linii, co pozwoli na oddzielenie kolumny kręgowej od blaszek łukowatych otaczających rdzeń kręgowy.
Pozwoli to na odsłonięcie rdzenia kręgowego. Następnie, prowadząc cięcie wzdłuż linii, usuń oponu i korzenie spinalne, uwalniając rdzeń kręgowy. Zlokalizuj kolumnę rdzeniową, a następnie jedną ręką z pęsetą mocno chwyć kolumnę rdzeniową, a drugą posługuj się małymi nożyczkami.
Aby usunąć rdzeń kręgowy, należy prowadzić nożyczki pod niskim kątem. Aby uniknąć przebicia rdzenia końcówkami nożyczek, przystąpimy teraz do jego wypreparowania. Przecinamy opony i korzenie spinalne, prowadząc cięcie wzdłuż czerwonej linii.
Aby usunąć rdzeń kręgowy, można wykonać cięcia wzdłuż obu stron rdzenia, a następnie wzdłuż brzusznej linii środkowej. Należy prowadzić nożyczki pod niskim kątem, aby nie przebić rdzenia kręgowego. Ważne jest, aby nie odcinać korzeni zbyt blisko rdzenia kręgowego.
Następnie przenieś rdzeń kręgowy do komory rejestracyjnej i podłącz elektrody do korzeni rdzeniowych. Umieść elektrodę w pobliżu korzenia. Następnie, używając ssania, delikatnie wciągnij nerw do wnętrza elektrody.
Dziękujemy za oglądanie i mamy nadzieję, że ten film okaże się pomocny w Państwa przyszłych eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł demonstruje izolację rdzenia kręgowego noworodka myszy do badań elektrofizjologicznych. Procedura obejmuje wykonanie laminektomii brzusznej oraz przytwierdzenie rdzenia kręgowego do elektrody w celu rejestracji aktywności neuronalnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
Wstęp
- Izolacja rdzenia kręgowego jest kluczowa dla badania aktywności neuronalnej.
- Techniki elektrofizjologiczne pozwalają na pomiar sygnałów neuronalnych.
- Stężenie chlorku wapnia jest istotne w przypadku roztworów do sekcji i rejestracji.
Cel badania
- Zaprezentowanie techniki izolacji rdzenia kręgowego noworodka myszy.
- Pokazanie sposobu mocowania rdzenia kręgowego do elektrody.
- Ułatwienie rejestracji aktywności neuronalnej.
Zastosowane metody
- Procedura brzusznej laminektomii w celu izolacji rdzenia kręgowego.
- Przygotowanie roztworów do sekcji i rejestracji.
- Zastosowanie elektrod do rejestracji aktywności neuronalnej.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja rdzenia kręgowego myszy noworodkowych.
- Efektywne przytwierdzenie rdzenia kręgowego do elektrod.
- Wykazanie rejestracji aktywności neuronalnej.
Wnioski
- Technika ta jest odpowiednia do badań elektrofizjologicznych.
- Przygotowanie roztworów jest kluczowe dla uzyskania pomyślnych wyników.
- Metodę tę można zastosować w różnych kontekstach badań z zakresu neuronauki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia izolację rdzenia kręgowego noworodków myszy w celu oceny elektrofizjologicznej centralnych generatorów wzorców, co wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w walidacji celów terapeutycznych dla schorzeń nerwowo-mięśniowych. Metoda ta dostarcza istotnego w kontekście choroby układu do badania funkcji sieci lokomocyjnych i oceny wpływu związków na przesyłanie sygnałów neuronalnych. Zwiększa ona pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania leków, umożliwiając ilościowy pomiar parametrów elektrofizjologicznych w walidowanym modelu przedklinicznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych związanych z rozwojem obwodów lokomocyjnych oraz angażowaniem celów nerwowo-mięśniowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne przygotowanie tkanki rdzenia kręgowego dla spójnych pomiarów elektrofizjologicznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Wspiera standaryzację testów poprzez zastosowanie kontrolowanych roztworów do sekcji i określonych stężeń chlorku wapnia w celu zapewnienia stabilności kąpieli rejestracyjnej.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów przesiewania związków i detekcji sygnałów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Oferuje istotny w kontekście chorobowym system do oceny zmian aktywności neuronalnej powiązanych z fenotypami lokomotorycznymi w modelach przedklinicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki dostarczeniu mierzalnych odczytów elektrofizjologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych, dostarczając izolowane preparaty rdzenia kręgowego, które umożliwiają testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych dla celów neuromięśniowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących funkcji centralnego generatora wzorców oraz modulacji obwodów neuronalnych.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie analizy poprzez standaryzowane rozwiązania w zakresie sekcji i rejestracji o zdefiniowanym składzie jonowym.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary elektrofizjologiczne z brzusznych korzeni nerwowych w celu porównania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez dostarczenie mierzalnego wyniku dla modulacji celów związanych z lokomocją.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę preparatyki tkanki nerwowej z możliwością ponownego wykorzystania w wielu programach badawczych nad układem nerwowo-mięśniowym.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w funkcji obwodów lokomocyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym sposobom przygotowania roztworów oraz technikom sekcji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go, umożliwiając wczesną ocenę wpływu związków na sygnalizację neuronalną.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów neuromięśniowych skorygowaną o ryzyko, w oparciu o profile odpowiedzi elektrofizjologicznej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach sekcji myszy noworodkowych oraz rejestracji elektrofizjologicznej.
- Zależność od aparatury do mocowania elektrod ssących i pozyskiwania sygnałów neuronowych.
- Konieczność standaryzacji przygotowania roztworów do sekcji i rejestracji pomiędzy zespołami.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji przy zastosowaniu w różnych etapach rozwoju lub modelach chorobowych.
- Ograniczenie wynikające z potrzeby precyzyjnej kontroli stężenia chlorku wapnia w celu utrzymania żywotności tkanki podczas rejestracji.
