Name: Pomiar wskaźników endocytarności białek błony komórkowej za pomocą odwracalnej biotynylacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Poznaj metodę pomiaru wskaźników endocytarności białek błony komórkowej za pomocą odwracalnej biotynylacji. Technika ta umożliwia izolację zinternalizowanych białek i badanie dynamiki białek błonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantu NIH nr #DA15169 przyznanego H.E.M.

Przegląd procedury:
Stosując to podejście, białka powierzchni komórki są kowalencyjnie znakowane biotyną w dostępnych pozakomórkowych resztach lizyny przy użyciu nieprzenikającego przez błonę odczynnika do biotynylacji z wiązaniem dwusiarczkowym (sulfo-NHS-SS-biotin) w warunkach ograniczających transport (tzn. w niskiej temperaturze) (ilustracja na Rys. 1). Jedną grupę komórek przenosi się do warunków dopuszczających transport (37°C), co prowadzi do internalizacji biotynylowanych białek. Drugą grupę komórek utrzymuje się w niskiej temperaturze jako kontrolę dla: 1) całkowitej zawartości białek powierzchniowych w czasie t=0 oraz 2) kontroli usuwania biotyny (strippingu). Po krótkim okresie internalizacji komórki ponownie przenosi się do niskiej temperatury, aby zatrzymać ten proces, a następnie usuwa się pozostałą biotynę z powierzchni poprzez potraktowanie komórek czynnikiem redukującym, który rozrywa wiązanie dwusiarczkowe biotyny. Biotynylowane białka, które pochodziły z powierzchni komórki i zostały zinternalizowane, są chronione przed etapem usuwania biotyny i będą jedynymi pozostałymi białkami biotynylowanymi. Po lizie komórek białka biotynylowane izoluje się za pomocą chromatografii powinowactwa ze streptawidyną, a poszukiwane białko wykrywa metodą ilościowego immunoblottingu. Aby określić tempo endocytozy, ilość zinternalizowanego białka porównuje się z kontrolą całkowitej zawartości białek powierzchniowych znakowanych w czasie t=0. Z sukcesem zastosowaliśmy to podejście do pomiaru tempa internalizacji neuronalnych transporterów norepinefryny1 i dopaminy1-4.
Szczegółowy protokół:
Dzień 1:
<ol>
	<li>Wysiać komórki na płytki 6-dołkowe w taki sposób, aby w 2. dniu osiągnęły około 80% konfluencji. Alternatywnie, w przypadku użycia komórek transfekowanych, przeprowadzić transfekcję przy gęstości zapewniającej około 80% konfluencji w momencie pomiaru szybkości internalizacji. Jeśli komórki nie wykazują silnej adhezji, naczynia do hodowli tkanek należy poddać obróbce substratem adhezyjnym (np. poli-D-lizyną), aby zapobiec utracie komórek podczas etapów intensywnego płukania.</li>
<li>Dla każdego testowanego białka wysiać komórki do 2 dołków na jednej płytce, które posłużą jako kontrola całkowitego białka powierzchniowego (t=0) oraz kontrola strippingu. Na drugiej płytce wysiać komórki do jednego dołka dla każdego badanego warunku internalizacji (np. podstawowa szybkość endocytozy w porównaniu z szybkością po zastosowaniu leku).</li>
<li>Przygotować następujące roztwory i przechowywać je w indicated temperaturach do użycia w 2. dniu:<ul>
<li>PBS2+: roztwór soli fizjologicznej fosforanowej (pH 7.4) uzupełniony o 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM CaCl2, (4°C)</li>
<li>Roztwór do wygaszania biotynylacji: PBS2+ uzupełniony o 100 mM glicyny, (4°C)</li>
<li>Bufor NT: 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA, 0.2% BSA, 20 mM Tris, pH 8.6, (4°C)</li>
<li>Bufor RIPA: 10 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA, 0.1% SDS, 1.0% Triton X 100, 1.0% dejksycholan sodu, (4°C)</li>
<li>Roztwór zapasowy Sulfo-NHS-SS-biotyny: rozpuścić w dimetylosulfoksydzie (DMSO) do stężenia 200 mg/ml, (-20°C)</li>
<li>Roztwór zapasowy chlorowodorku Tris(2-karboksyetylu) fosfiny (TCEP): 500 mM w H2O, (-20°C, owinięty w folię w celu ochrony przed światłem)</li>
</ul>
</li>
</ol>
Dzień 2:
<ol>
<li>Przygotować PBS2+ uzupełniony o 0,18 g/ml glukozy oraz 0,2% IgG/wołowiej albuminy bez proteazy (PBS2+/g/BSA). Roztwór ten należy uprzednio ogrzać do 37°C w łaźni wodnej.</li>
<li>Rozmrozić roztwór stokowy sulfo-NHS-SS-biotyny na blacie laboratoryjnym, aby rozpuścić DMSO. Bezpośrednio przed użyciem przygotować świeży roztwór sulfo-NHS-SS-biotyny (2,5 mg/ml w lodowatym PBS2+, w ilości wystarczającej na 0,75 ml/dołek). Roztwór energicznie wymieszać w wirówce typu vortex w celu rozpuszczenia DMSO. Należy pamiętać, że odczynnik NHS-biotyna ulega łatwej hydrolizie w roztworach wodnych, dlatego wszystkie roztwory należy przygotowywać bezpośrednio przed użyciem.</li>
<li>Biotynylacja: Płytki umieścić w łaźni lodowej w pomieszczeniu chłodniczym i przepłukać 3 x 2 ml lodowatym PBS2+. Należy upewnić się, że płytki są ustawione pod lekkim kątem, aby umożliwić całkowite odlanie i usunięcie roztworu buforu. Do każdego dołka dodać 0,75 ml świeżego roztworu sulfo-NHS-SS-biotyny. Inkubować przez 15', 4°C w łaźni lodowej przy energicznym wstrząsaniu. Po zakończeniu inkubacji przygotować kolejny świeży roztwór sulfo-NHS-SS-biotyny. Stary roztwór zastąpić świeżym i inkubować przez kolejne 15', 4°C.</li>
<li>Wygaszanie (quenching): Kluczowe jest wygaszenie wszystkich niereagujących cząsteczek NHS-biotyny, aby nie reagowały one z białkami wewnątrzkomórkowymi i nie powodowały ich biotynylacji po lizie komórek. Komórki przemyć 3 x 2 ml roztworem wygaszającym i inkubować dwukrotnie w 2 ml roztworu wygaszającego przez 15', 4°C przy delikatnym wstrząsaniu.</li>
<li>Internalizacja: W przypadku testowania działania leków, do PBS2+/g/BSA dodać odpowiednie stężenie leku. Płytkę kontrolną pozostawić w temperaturze 4°C, a płytkę do internalizacji wyjąć z pomieszczenia chłodniczego. Przemyć 3 x 2 ml uprzednio ogrzanym PBS2+/g/BSA (+/- leki) i pozostawić w tych samych roztworach (2 ml/dołek). Puste dołki wypełnić ogrzanym roztworem, aby zapewnić równomierną temperaturę na całej płytce. Przenieść komórki do inkubatora 37°C na 10'. Bezpośrednio przed zakończeniem inkubacji w 37°C przygotować świeży roztwór TCEP 50 mM w buforze NT do etapu usuwania (strippingu) i przechowywać na lodzie. Przygotować ilość wystarczającą na 1,0 ml/dołek.</li>
<li>Usuwanie (stripping): Natychmiast przenieść płytkę(i) do łaźni lodowej i zwrócić do pomieszczenia chłodniczego. Szybko przemyć komórki lodowatym buforem NT (3 x 2 ml), aby zatrzymać endocytozę. Dołki kontrolne do usuwania również przemyć 3 x 2 ml buforem NT. Do każdego dołka dodać 1,0 ml świeżego roztworu do usuwania. Inkubować na lodzie przez 15', 4°C przy delikatnym wstrząsaniu. Roztwór w dołkach zastąpić świeżym roztworem do usuwania i inkubować przez dodatkowe 15', 4°C na lodzie.</li>
<li>Liza: Wszystkie dołki eksponowane na roztwór do usuwania przemyć 3 x 2 ml buforem NT. Następnie wszystkie dołki (w tym kontrole całkowite) przemyć 3 x 2 ml PBS2+. Przeprowadzić lizę w 300 μl/dołek buforu RIPA (lub innego buforu do lizy kompatybilnego z badanym białkiem) zawierającego świeże inhibitory proteaz (1,0 mM PMSF, 1,0 μg/ml leupeptyny, aprotininy i pepstatyny). Lizę przeprowadzić poprzez wstrząsanie przez 20', 4°C. Przenieść do probówek do mikrowirówki i usunąć szczątki komórkowe poprzez wirowanie przy 18 000 ×g przez 10', 4°C.</li>
<li>Oznaczanie stężenia białka: Użyć testu białkowego kompatybilnego z warunkami lizy (np. test białkowy DC, Bio-Rad), aby oznaczyć stężenie białka w lizatach w odniesieniu do krzywej wzorcowej BSA.</li>
<li>Chromatografia powinowactwa ze streptawidyną: Przygotować probówki do mikrowirówki z równą ilością białka dla każdej próbki. Dodać bufor do lizy, aby doprowadzić końcową objętość każdej próbki do 200 μl. Kulki agarozowe ze streptawidyną energicznie wymieszać w wirówce typu vortex do uzyskania jednorodnej zawiesiny. Używając pipety 200 μl z odciętą końcówką, nanieść kulki do każdej probówki. Zalecane proporcje to 20 μl kulek / 50 μg lizatu. Inkubować przez noc, 4°C na rotatorze do probówek.</li>
</ol>
Dzień 3:
<ol>
<li>Przemywanie kulek: Wirować próbki z prędkością 18,000 x g przez 2' w celu zebrania kulek. Odessać lizat, uważając, aby aspirator nie zbliżył się do osadu kulek. Aby uzyskać lepszą kontrolę, na końcu aspiratora należy zastosować plastikowy końcówkę do pipety. Do każdej probówki dodać 0,75 ml buforu do lizy i wymieszać w wstrząsaciu typu vortex, aby przemyć kulki. Wirować próbki z prędkością 18,000 x g przez 2' w celu zebrania kulek, a następnie powtórzyć etap odsysania i przemywania dwukrotnie (łącznie trzy przemycia). Po ostatnim przemyciu odessać jak najwięcej buforu, nie naruszając osadu kulek. Przechylenie probówki w stronę aspiratora ułatwia ten krok.</li>
<li>Elucja próbek: Do każdej probówki dodać 20-25μl 2x buforu Laemmli do próbek (redukujący). Środek redukujący spowoduje rozszczepienie mostka dwusiarczkowego NHS-SS-biotyny, uwalniając wyizolowane białka do roztworu. Większość białek błonowych jest bardzo podatna na agregację podczas gotowania i nie powinna być podgrzewana przed nałożeniem na żele do SDS-PAGE. Przed przeprowadzeniem tych eksperymentów należy określić wrażliwość badanego białka na wysoką temperaturę. Jeśli białko nie toleruje gotowania/podgrzewania, należy inkubować je na rotatorze przez 30' w temperaturze pokojowej przed analizą metodą SDS-PAGE. Jest to wystarczające do rozszczepienia mostka dwusiarczkowego i elucji białek.</li>
<li>SDS-PAGE i immunoblotting: Rozdzielić białka metodą SDS-PAGE. W przypadku każdej próbki najłatwiej jest prowadzić analizę w następującej kolejności: całkowita powierzchnia (czas=0), strip, warunek internalizacji nr 1, warunek nr 2 itd. Przenieść białka na membranę do immunoblottingu i wykonać blot z użyciem odpowiedniego przeciwciała przeciwko badanemu białku. Przechwycić prążki immunoreaktywne za pomocą systemu dokumentacji żeli z kamerą CCD, upewniając się, że nie występują nasycone piksele. Ilościowo określić gęstość każdego prążka za pomocą oprogramowania do analizy żeli/densytometrii.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Reprezentatywny wynik immunoblottingu przedstawiono na Ryc. 2A. Najsilniejszy sygnał znajduje się w ścieżce „całkowita” (T), która reprezentuje całkowitą ilość białka powierzchniowego przed internalizacją. Kontrola „usuwania” (S) powinna być idealnie bliska pustej ścieżce, co świadczy o tym, że proces usuwania był efektywny dla danego eksperymentu. Efektywność usuwania oblicza się poprzez porównanie gęstości ścieżki „usuwania” z gęstością ścieżki „całkowitej” (np. białko, które zostało biotynilowane równolegle z procesem usuwania, ale nie było podgrzewane do 37°C ani nie zostało poddane działaniu roztworu do usuwania). Stosuje się następujący wzór: [1-(strip/total)]*100%
Stosując ten wzór, wydajność paska na Rysunku 2 wyniosła 99,8%. Na koniec w ścieżce(zach) internalizacji (I) widoczne będą prążki o mniejszym natężeniu niż całkowite. W przykładzie (Rysunek 2) komórki traktowano nośnikiem lub 1μM octanu mirystanu forbolu (PMA) podczas 10-minutowej internalizacji, a szybkość internalizacji transportera dopaminy mierzono dla początkowego 10-minutowego okresu internalizacji. Szybkość internalizacji oblicza się w następujący sposób: 
internalizowane/całkowite*100
Jak pokazano na rysunku 2B, w warunkach z zastosowaniem nośnika w ciągu 10' zinternalizowano 10,4% powierzchniowego DAT. Leczenie PMA zwiększyło stopień internalizacji DAT do 23,2% całkowitej ilości DAT na powierzchni.
<img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig1.jpg" alt="Schemat internalizacji białek; proces biotinylacji, znakowania i izolacji w różnych temperaturach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Ilustracja protokołu. Komórki poddawane są biotinylacji w 4°C w celu wyłącznego oznakowania populacji powierzchniowej, a następnie przenoszone do 37°C, aby zainicjować internalizację. Po internalizacji komórki są szybko schładzane w celu zatrzymania procesów endocytozy, a pozostała biotyna powierzchniowa jest usuwana poprzez traktowanie komórek czynnikiem redukującym. Jedynymi pozostałymi biotynylanymi białkami są te, które znajdowały się na powierzchni w czasie t=0 i zostały zinternalizowane, co chroni je przed procesem usuwania biotyny. Białka biotynylowane są izolowane za pomocą seryjnej chromatografii powinowactwa z użyciem kulek streptawidyny, a poszukiwane białko jest wykrywane metodą immunoblottingu.
<img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig2.jpg" alt="Żel SDS-PAGE i wykres słupkowy; eksperyment dotyczący internalizacji białek z efektami traktowania PMA." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Aktywacja PKC zwiększa tempo endocytozy DAT. Test internalizacji. Komórki PC12 stabilnie ekspresyjne dla DAT poddano biotinylacji w 4°C, zgodnie z opisem w sekcji „Detailed Protocol”. Komórki szybko ogrzano do 37°C ±1 μM PMA i inkubowano przez 10' w 37°C. Pozostałą biotynę usunięto poprzez redukcję, następnie komórki zlizowano, a biotinylowane białka wyizolowano za pomocą chromatografii powinowactwa do streptawidyny. (A) Reprezentatywny immunoblot pokazujący całkowitą ilość DAT na powierzchni w t=0 (T), kontrolę usuwania biotyny (S) oraz zinternalizowany DAT (I) w określonych warunkach. (B) Prążki zarejestrowano za pomocą kamery CCD i skwantyfikowano przy użyciu oprogramowania Quantity Data (Bio-Rad). Dane przedstawiono jako % całkowitego DAT zinternalizowanego w ciągu 10 min.
<img src="/files/ftp_upload/1669/1669fig3.jpg" alt="Wyniki elektroforezy białek; prążki żelu TSI; analiza rozdziału masy cząsteczkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Przykład immunoblottu przedstawiający niepełne usuwanie biotyny. Test internalizacji. Komórki PC12 stabilnie eksponujące DAT poddano biotynylacji w 4°C zgodnie z opisem w sekcji „Detailed Protocol”. Komórki szybko ogrzano do 37°C i inkubowano przez 10' w 37°C. Pozostałą biotynę usunięto poprzez redukcję, komórki poddano lizie, a biotynilowane białka wyizolowano za pomocą chromatografii powinowactwa ze streptawidyną. Immunoblot przedstawia całkowitą ilość DAT na powierzchni w t=0 (T), kontrolę usuwania biotyny (S) oraz zinternalizowany DAT (I). Widoczny prążek w ścieżce kontroli usuwania biotyny wskazuje na niską wydajność tego procesu.

<ol><li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li>
<li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine-induced+decreases+in+dopamine+transporter+surface+expression+are+protein+kinase+C-independent%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent.</a> Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).</li>
<li>Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+transporter+endocytic+determinants%3A+carboxy+terminal+residues+critical+for+basal+and+PKC-stimulated+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).</li>
<li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li>
</ol>

Typowe problemy: Najczęstszym problemem występującym w tych eksperymentach jest niska wydajność usuwania białek z powierzchni (strip efficiency). Wydajność tego procesu jest kluczowa dla możliwości interpretacji wyników. Jeśli usuwanie białek nie było wysoce wydajne, nie można wyciągnąć wniosku, że jakiekolwiek biotynilowane białka w ścieżkach internalizacji zostały faktycznie zinternalizowane z powierzchni. Optymalna wydajność wynosi ≥90% i odrzucamy wszelkie wyniki, jeśli wskaźnik ten spadnie poniżej tego poziom...

pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Białka błony komórkowej stanowią dużą i zróżnicowaną grupę białek, w skład której wchodzą receptory, kanały jonowe, transportery oraz pompy. Aktywność tych białek odpowiada za szereg kluczowych zdarzeń komórkowych, w tym dostarczanie składników odżywczych, pobudliwość komórkową oraz sygnalizację chemiczną. Wiele białek błony komórkowej jest dynamicznie regulowanych poprzez transport endocytyczny, który moduluje funkcję białek poprzez zmianę ich ekspresji powierzchniowej. Mechanizmy ułatwiające endocytozę białek są złożone i w przypadku wielu białek błonowych nie są w pełni poznane. Aby w pełni zrozumieć mechanizmy kontrolujące transport endocytyczny danego białka, kluczowe jest precyzyjne zmierzenie tempa jego endocytozy. W przypadku wielu receptorów bezpośrednie pomiary tempa endocytozy są często przeprowadzane z wykorzystaniem znakowanych ligandów receptorowych. Jednakże dla wielu klas białek błonowych, takich jak transportery, pompy i kanały jonowe, nie istnieje wygodny ligand, który można by wykorzystać do pomiaru tempa endocytozy. W niniejszym raporcie opisujemy metodę odwracalnej biotinylacji, którą stosujemy do pomiaru tempa endocytozy transportera dopaminy (DAT). Metoda ta zapewnia prosty sposób pomiaru tempa internalizacji i może być łatwo zastosowana w badaniach transportu większości białek błonowych.

Regulowana endocytoza kontroluje poziomy ekspresji na powierzchni komórki dla większości białek błonowych. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy redukowalne, nieprzenikające przez błonę odczynniki do biotinylacji, aby zmierzyć tempo endocytozy transportera dopaminy (DAT), który jest politopeowym białkiem błonowym. Metoda ta umożliwia prostą procedurę pomiaru tempa endocytozy większości białek błony plazmatycznej.

Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Białka błony plazmatycznej stanowią dużą i zróżnicowaną grupę białek, w skład której wchodzą receptory, kanały jonowe, transportery i pompy. Aktywność tych białek ...

Niniejszy protokół przedstawia ogólną metodę pomiaru szybkości endocytozy większości białek błony plazmatycznej przy użyciu redukowalnych odczynników do przenikania przez błonę. W tej procedurze białka powierzchni komórki zawierające lizyny zewnątrzkomórkowe są kowalencyjnie znakowane w temperaturze 4°C za pomocą sulfo-NHS-SS-biotyny, przedstawionej tutaj na kolor zielono. Następnie komórki są ogrzewane do 37°C, aby umożliwić endocytozę białek powierzchniowych. Komórki są następnie schładzane z powrotem do 4°C w celu zatrzymania transportu błonowego, a pozostała biotyna powierzchniowa jest usuwana przy użyciu czynnika redukującego, który rozrywa wiązanie disiarczkowe.W ten sposób jedynymi pozostałymi biotynylowanymi białkami są te, które pochodziły z powierzchni komórki, zostały zinternalizowane i chronione przed procedurą usuwania biotyny. Na koniec komórki są solubilizowane, a biotynylowane białka izolowane za pomocą strep avid i chromatografii powinowactwa. Cześć, jestem Luke Gabriel z laboratorium Heli Milk Ian w Katedrze Psychiatrii na University of Massachusetts Medical School.Dzisiaj przedstawimy procedurę pomiaru szybkości endocytozy lub internalizacji z wykorzystaniem techniki odwracalnego usuwania biotyny. Procedurę tę stosujemy do pomiaru szybkości internalizacji transportera dopaminy. Zapraszamy do rozpoczęcia.Na dzień przed eksperymentem należy przygotować komórki i podłoża do użycia w kolejnym dniu. Typy komórek i pożywki będą się różnić, jednak jeśli komórki doświadczalne nie wykazują silnej adhezji, należy użyć odpowiedniego podłoża adhezyjnego, takiego jak płytki do hodowli tkankowej powlekane polilizyną. Na każdej płytce z sześcioma dołkami należy oznaczyć łącznie cztery dołki, wykorzystując dwie oddzielne płytki.Dla każdego badanego białka dwa dołki na płytce kontrolnej zostaną wykorzystane do kontroli całkowitego białka powierzchniowego oraz kontroli strippingu. Przygotuj dołek na płytce eksperymentalnej dla każdego badanego warunku internalizacji. Wysiej 1 × 10⁶ komórek w 2 ml pożywki hodowlanej w taki sposób, aby następnego dnia komórki osiągnęły około 80% konfluencji.Po wyhodowaniu komórek należy przygotować następujące roztwory i przechowywać je w temperaturze 4 °C do użycia w drugim dniu. Roztwór PBS 2+ przygotowuje się z soli fosforanowo-buforowanej (PBS) o pH 7,4 z dodatkiem 1,5 mM chlorku magnezu i 0,2 mM chlorku wapnia. Roztwór do gaszenia tonacji przygotowuje się, używając PBS 2+ z dodatkiem 100 mM glicyny. Bufor NT składa się z 150 mM chlorku sodu, 1 mM EDTA, 0,2% BSA oraz 20 mM Trisu przy pH 8,6. Bufor RIPA przygotowuje się, używając 10 mM Trisu o pH 7,4, 150 mM chlorku sodu, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 1% Triton X-100 oraz 0,1% dodecylosiarczanu sodu.Następnie przygotuj roztwór zapasowy SULF N-H-S-S-S biotyny, rozpuszczając go w SULFOKSYDZIE lub DMSO do stężenia 200 mg/mL. Przygotuj aliquoty o objętości 500 µL i przechowuj w temperaturze -20 °C. Alikwoty mogą być poddawane kilku cyklom zamrażania i rozmrażania po tym etapie.Roztwór zapasu węglanu 2-karboksyetylofosfiny chlorowodorku (TCEP) przygotowuje się w stężeniu 500 mM w 50 mM TRIS, a pH dostosowuje się do wartości 7,4. Ponieważ TCEP jest silnie kwasowy, pH roztworu musi zostać skorygowane do 7,4; następnie TCEP należy przykryć folią aluminiową przed przechowywaniem w temperaturze -20°C. Drugiego dnia należy przygotować PBS 2+ uzupełniony o 0,18% glukozy i 0,2% IgG albuminy surowicy bydlęcej wolnej od proteaz lub PBS 2+ GBSA, a następnie podgrzać go do 37°C w kąpieli wodnej.Rozmrozić roztwór zapasowy biotyny SFO N-H-S-S-S w temperaturze pokojowej. Świeży roztwór biotyny siarkowej N-H-S-S-S przygotować bezpośrednio przed użyciem. Wymieszać roztwór intensywnie w wirówce vorex, aby rozpuścić DMSO.Umieść obie płytki w łaźni lodowej w pomieszczeniu chłodniczym i wypłucz każdą studzienkę trzykrotnie, używając 2 mL lodowatego PBS 2×, trzymając płytki pod niewielkim kątem w celu całkowitego odprowadzenia buforu. Po ostatnim płukaniu dodaj do każdej studzienki 0,75 mL świeżego roztworu sulfo-NHS-biotyny. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze 4 °C w łaźni lodowej, stosując energiczne wstrząśnięcie na wytrząsarku platformowej tuż przed zakończeniem inkubacji.Przygotować kolejny świeży roztwór biotyny SUHO N-H-S-S-S i po 15 minutach zastąpić stary roztwór nowym. Inkubować przez dodatkowe 15 minut w temperaturze four degrees Celsius przy intensywnym wstrząsaniu na inkubatorze z wytrząsaniem; po drugiej inkubacji przemyć komórki szybko trzy razy dwiema mililitrami roztworu gaszącego, aby zneutralizować wszystkie niereagujące cząsteczki biotyny NHS. Następnie inkubować w dwóch mililitrach roztworu gaszącego przez 15 minut.Wymień roztwór gaszący na świeży po 15 minutach i inkubuj przez kolejne 15 minut. Podczas każdej inkubacji utrzymuj płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając je na wytrząsarce platformowej, podczas gdy płytka kontrolna pozostaje w roztworze gaszącym na blacie w chłodni. W tym momencie wyjmij płytkę eksperymentalną z chłodni, umieszczając ją w łaźni lodowej.Jeśli testowane są leki, do podgrzanego PBS 2 z GBSA należy dodać odpowiednie stężenia leków. W tym przypadku zastosowano nośnik etanolowy lub 1 µM PMA w celu aktywacji szlaku PKC. Każdy dołek płytki eksperymentalnej należy przemyć trzykrotnie 2 mL podgrzanego PBS 2 z GBSA, dodając odpowiednie leki po ostatnim przemyciu.Dodaj dwa mililitry odpowiednich roztworów PBS plus GBSA i wypełnij pozostałe puste dołki podgrzaną pożywką, aby zapewnić równomierną temperaturę na całej płytce. Bezpośrednio przed zakończeniem inkubacji przenieś komórki do inkubatora w temperaturze 37 °C na 10 minut. Przygotuj świeży roztwór do strippingu, wykorzystując 50 mM roztwór TCEP w buforze NT, i przechowuj go w lodzie.Przygotować wystarczającą ilość roztworu, aby zapewnić jeden mililitr na dołek. Po 10 minutowej inkubacji szybko przenieść płytkę eksperymentalną do łaźni z lodem, a następnie szybko powrócić do chłodni. Trzykrotnie przemyć dołki eksperymentalne dwiema mililitrami lodowatego buforu NT na dołek, aby przerwać endocytozę.Następnie trzy razy przemyj dołek kontrolny do usuwania przeciwciał (stripping control) dwiema mililitrami lodowatego buforu NT. Dołki kontrolne całkowite pozostaw w roztworze gaszącym (quench solution). Do każdego dołka eksperymentalnego oraz dołka kontrolnego do usuwania przeciwciał dodaj jeden mililitr roztworu do usuwania przeciwciał (stripping solution) i inkubuj na lodzie przez 15 minut.Cztery stopnie Celsjusza przy delikatnym wstrząsaniu przed zakończeniem inkubacji. Ponownie przygotuj taką samą objętość świeżego roztworu do strippingu jak poprzednio. Po 15 minutach zastąp stary roztwór strippingowy świeżym i inkubuj przez dodatkowe 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy delikatnym wstrząsaniu, aby najpierw zlizować komórki.Wszystkie dołki, które były wystawione na działanie roztworu do usuwania przeciwciał (stripping solution), przemyć trzykrotnie 2 mL buforu NT. Następnie wszystkie dołki, w tym kontrole całkowite, przemyć trzykrotnie 2 mL zimnego pbs. Po ostatnim przemyciu dodać 300 µL buforu RIPPA zawierającego świeże inhibitory proteaz do każdego dołka; przeprowadzić lizę komórek poprzez wstrząsanie przez 20 minut w temperaturze 4 °C.Przenieś lizat do probówek typu microtube o pojemności 1,5 mililitra i usuń szczątki komórkowe poprzez wirowanie w wirówce przez 10 minut przy 18 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj testu białkowego kompatybilnego z warunkami lizy, na przykład testu białkowego BCA firmy Pierce, aby określić stężenie białek w lizacie w odniesieniu do krzywej standardowej albuminy surowicy bydlęcej. Następnie przygotuj lizaty do chromatografii powinowactwa i chromatografii strep.Napełnić probówki do wirówki o pojemności 1,5 ml równymi ilościami białka z każdej próbki. W tym doświadczeniu izolujemy białka biotynilowane z 50 µg lizatów komórkowych. Dodać bufor RIPA zawierający inhibitory proteaz do końcowej objętości 200 µl dla każdej próbki.Następnie energicznie wymieszaj na wirówce (vortex) paciorki strep-avid i agro przed użyciem; za pomocą pipety 200 µL z odciętym końcem przeniesion 20 µL paciorków strep-avid i agro do każdej probówki. Wymieszaj probówki na wirówce i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze do probówek. Następnego dnia odzyskaj paciorki, odwirując próbki przy 18 000 g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej; odessij lizat, uważając, aby nie zbliżyć aspiratora do osadu z paciorków, a następnie dodaj 0,75 ml w temperaturze pokojowej.Dodaj bufor rip do każdej probówki i wymieszaj w vortexie z maksymalną prędkością, aby wyprać kuleczki. Odwiruj w wirówce przy 18 000 GS przez dwie minuty. W temperaturze pokojowej zbierz kuleczki i powtórz ten cykl płukania, mieszania w vortexie i wirowania jeszcze dwa razy, tak aby łącznie wykonać trzy płukania po końcowym etapie.Odssać jak największą ilość buforu, uważając, aby nie naruszyć osadu kulek. Następnie do każdej probówki dodać od 20 do 25 µL dwukrotnego buforu Laemmli redukującego. Odczynnik redukujący rozszczepi mostek dwusiarczkowy NHS-S-S-S biotyny, uwalniając wyizolowane białka do roztworu.Ponieważ większość białek błonowych nie toleruje gotowania, po redukcji i denaturacji należy inkubować probówki na rotatorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu rozdzielenia białek. Wykorzystując standardowy żel SDS-PAGE, przenieś białka na membranę w celu przeprowadzenia immunoblotingu i inkubuj z odpowiednim przeciwciałem. W tym doświadczeniu zastosowano przeciwciało szczurze przeciwko DAT firmy Checon (numer 360 9) w rozcieńczeniu 1:2000. Przechwyć immunoreaktywne prążki za pomocą systemu dokumentacji żeli z kamerą CCD, upewniając się, że nie występują nasycone piksele. W tym doświadczeniu wykorzystano system obrazowania BioRad VersaDoc z oprogramowaniem Quantity One do kwantyfikacji gęstości każdego prążka.Tutaj przedstawiono reprezentatywny blok immunologiczny z procedury odwracalnej atacji transportera dopaminy. Najsilniejszy sygnał odpowiada całkowitej ilości białka powierzchniowego przed internalizacją, widocznej w ścieżce całkowitej lub T. Kontrola po stripowaniu lub S powinna w idealnych warunkach być zbliżona do tła i wykazywać wysoką wydajność stripowania. Wydajność stripowania oblicza się, wykorzystując pomiary gęstości prążków według następującego wzoru.W tym eksperymencie wydajność tego paska wyniosła 99,8%. Paski o wydajności większej niż lub równej 90% są optymalne, a wyniki poniżej tego poziomu należy odrzucić. Ten przykład paska porowego wykazuje widoczny prążek w ścieżce paska przy wydajności paska wynoszącej 34%. Prążki o mniejszej intensywności to ścieżki internalizacji z płytki eksperymentalnej. Komórki poddano działaniu roztworu nośnika lub 1 µM PMA podczas 10-minutowej internalizacji, a następnie zmierzono szybkość internalizacji transportera dopaminy.Szybkość internalizacji oblicza się na podstawie pomiarów gęstości prążków w następujący sposób: jak widać na tym wykresie, w warunkach z użyciem nośnika zinternalizowano 10,4% powierzchniowego DAT w ciągu 10 minut. Jednak traktowanie PMA zwiększyło szybkość internalizacji DAT do 23,2% całkowitego DAT powierzchniowego. W ten sposób zaprezentowano sposób pomiaru szybkości internalizacji białek błony plazmatycznej z wykorzystaniem techniki odwracalnej biotynylacji.Należy pamiętać o dwóch kwestiach: odczynnik do bio-tonacji oraz TCP należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Jeśli zauważą Państwo dużą utratę komórek podczas realizacji protokołu, należy zastosować na płytkach podłoże adhezyjne do komórek. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

measuring-plasma-membrane-protein-endocytic-rates-reversible

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej przez odwracalną biotinylację

Ten film demonstruje metodę oceny internalizacji docelowego białka w astrocytach korowych myszy za pomocą biotynylacji, a następnie lizy komórek, ekstrakcji białka na bazie streptawidyny, denaturacji i analizy Western blot w celu potwierdzenia udanej internalizacji.

Ocena internalizacji docelowych białek powierzchniowych za pomocą pochodnej biotyny

Transportowanie błony polega na transporcie białek z błony plazmatycznej do wnętrza komórki (np. endocytoza), a następnie transporcie do lizosomów w celu degradacji lub do błony plazmatycznej w celu recyklingu. Metody opisane w tym artykule mają na celu badanie endocytozy i recyklingu białek błony komórkowej.

Komórkowe testy ochrony L-glutationu do badania endocytozy i recyklingu białek błony komórkowej

Ruch błony neuronalnej dynamicznie kontroluje dostępność białek błony plazmatycznej i znacząco wpływa na neuroprzekaźnictwo. Do tej pory trudno było zmierzyć neuronalny transport endocytarny w dorosłych neuronach. W tym miejscu opisujemy wysoce skuteczną, ilościową metodę pomiaru szybkich zmian ekspresji białek powierzchniowych ex vivo w ostrych wycinkach mózgu.

Biotynylacja wycinków mózgu: podejście ex vivo do pomiaru specyficznego dla regionu transportu białek błony plazmatycznej w dorosłych neuronach

Protokoły tutaj opisują kinetyczne testy interakcji białko-białko za pomocą interferometrii warstwy biologicznej. Syntaza ATP typu F, która bierze udział w metabolizmie energii komórkowej, może być hamowana przez swoją ε podjednostka u bakterii. Dostosowaliśmy interferometrię biowarstw do badania oddziaływań kompleksu katalitycznego z hamującą domeną C-końcową ε.

Interferometria biowarstwowa do pomiaru kinetyki oddziaływań białko-białko i efektów ligandów allosterycznych

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

W tym raporcie przedstawiono dwie metody oparte na biotynylacji, przeznaczone do określania ekspresji na powierzchni komórki i szybkości endocytarnej białek wyrażanych na błonie plazmatycznej.

Określanie ekspresji białek na powierzchni komórki i szybkości endocytów w pierwotnych kulturach astrocytów za pomocą biotynylacji

Przedstawione tutaj są protokoły do testów biochemicznych in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny, które mogą być szeroko stosowane do badania interakcji białko-kwas nukleinowy.

Testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

W protokole przedstawiono metodę kowalencyjnego przyłączania biotyny do białek in vivo w oparciu o ich bliskość do ligazy biotyny połączonej z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Modyfikacja ta pozwala na selektywne wzbogacanie białek za pomocą kulek streptawidyny, zgodnie z potrzebami w badaniach interakcji białkowych.

In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

Poznaj metodę pomiaru wskaźników endocytarności białek błony komórkowej za pomocą odwracalnej biotynylacji. Technika ta umożliwia izolację zinternalizowanych białek i badanie dynamiki białek błonowych.

Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Przeglądaj więcej filmów