Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Niniejszy protokół przedstawia ogólną metodę pomiaru szybkości endocytozy większości białek błony plazmatycznej przy użyciu redukowalnych odczynników do przenikania przez błonę. W tej procedurze białka powierzchni komórki zawierające lizyny zewnątrzkomórkowe są kowalencyjnie znakowane w temperaturze 4°C za pomocą sulfo-NHS-SS-biotyny, przedstawionej tutaj na kolor zielono. Następnie komórki są ogrzewane do 37°C, aby umożliwić endocytozę białek powierzchniowych. Komórki są następnie schładzane z powrotem do 4°C w celu zatrzymania transportu błonowego, a pozostała biotyna powierzchniowa jest usuwana przy użyciu czynnika redukującego, który rozrywa wiązanie disiarczkowe.

W ten sposób jedynymi pozostałymi biotynylowanymi białkami są te, które pochodziły z powierzchni komórki, zostały zinternalizowane i chronione przed procedurą usuwania biotyny. Na koniec komórki są solubilizowane, a biotynylowane białka izolowane za pomocą strep avid i chromatografii powinowactwa. Cześć, jestem Luke Gabriel z laboratorium Heli Milk Ian w Katedrze Psychiatrii na University of Massachusetts Medical School.

Dzisiaj przedstawimy procedurę pomiaru szybkości endocytozy lub internalizacji z wykorzystaniem techniki odwracalnego usuwania biotyny. Procedurę tę stosujemy do pomiaru szybkości internalizacji transportera dopaminy. Zapraszamy do rozpoczęcia.

Na dzień przed eksperymentem należy przygotować komórki i podłoża do użycia w kolejnym dniu. Typy komórek i pożywki będą się różnić, jednak jeśli komórki doświadczalne nie wykazują silnej adhezji, należy użyć odpowiedniego podłoża adhezyjnego, takiego jak płytki do hodowli tkankowej powlekane polilizyną. Na każdej płytce z sześcioma dołkami należy oznaczyć łącznie cztery dołki, wykorzystując dwie oddzielne płytki.

Dla każdego badanego białka dwa dołki na płytce kontrolnej zostaną wykorzystane do kontroli całkowitego białka powierzchniowego oraz kontroli strippingu. Przygotuj dołek na płytce eksperymentalnej dla każdego badanego warunku internalizacji. Wysiej 1 × 10⁶ komórek w 2 ml pożywki hodowlanej w taki sposób, aby następnego dnia komórki osiągnęły około 80% konfluencji.

Po wyhodowaniu komórek należy przygotować następujące roztwory i przechowywać je w temperaturze 4 °C do użycia w drugim dniu. Roztwór PBS 2+ przygotowuje się z soli fosforanowo-buforowanej (PBS) o pH 7,4 z dodatkiem 1,5 mM chlorku magnezu i 0,2 mM chlorku wapnia. Roztwór do gaszenia tonacji przygotowuje się, używając PBS 2+ z dodatkiem 100 mM glicyny. Bufor NT składa się z 150 mM chlorku sodu, 1 mM EDTA, 0,2% BSA oraz 20 mM Trisu przy pH 8,6. Bufor RIPA przygotowuje się, używając 10 mM Trisu o pH 7,4, 150 mM chlorku sodu, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 1% Triton X-100 oraz 0,1% dodecylosiarczanu sodu.

Następnie przygotuj roztwór zapasowy SULF N-H-S-S-S biotyny, rozpuszczając go w SULFOKSYDZIE lub DMSO do stężenia 200 mg/mL. Przygotuj aliquoty o objętości 500 µL i przechowuj w temperaturze -20 °C. Alikwoty mogą być poddawane kilku cyklom zamrażania i rozmrażania po tym etapie.

Roztwór zapasu węglanu 2-karboksyetylofosfiny chlorowodorku (TCEP) przygotowuje się w stężeniu 500 mM w 50 mM TRIS, a pH dostosowuje się do wartości 7,4. Ponieważ TCEP jest silnie kwasowy, pH roztworu musi zostać skorygowane do 7,4; następnie TCEP należy przykryć folią aluminiową przed przechowywaniem w temperaturze -20°C. Drugiego dnia należy przygotować PBS 2+ uzupełniony o 0,18% glukozy i 0,2% IgG albuminy surowicy bydlęcej wolnej od proteaz lub PBS 2+ GBSA, a następnie podgrzać go do 37°C w kąpieli wodnej.

Rozmrozić roztwór zapasowy biotyny SFO N-H-S-S-S w temperaturze pokojowej. Świeży roztwór biotyny siarkowej N-H-S-S-S przygotować bezpośrednio przed użyciem. Wymieszać roztwór intensywnie w wirówce vorex, aby rozpuścić DMSO.

Umieść obie płytki w łaźni lodowej w pomieszczeniu chłodniczym i wypłucz każdą studzienkę trzykrotnie, używając 2 mL lodowatego PBS 2×, trzymając płytki pod niewielkim kątem w celu całkowitego odprowadzenia buforu. Po ostatnim płukaniu dodaj do każdej studzienki 0,75 mL świeżego roztworu sulfo-NHS-biotyny. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze 4 °C w łaźni lodowej, stosując energiczne wstrząśnięcie na wytrząsarku platformowej tuż przed zakończeniem inkubacji.

Przygotować kolejny świeży roztwór biotyny SUHO N-H-S-S-S i po 15 minutach zastąpić stary roztwór nowym. Inkubować przez dodatkowe 15 minut w temperaturze four degrees Celsius przy intensywnym wstrząsaniu na inkubatorze z wytrząsaniem; po drugiej inkubacji przemyć komórki szybko trzy razy dwiema mililitrami roztworu gaszącego, aby zneutralizować wszystkie niereagujące cząsteczki biotyny NHS. Następnie inkubować w dwóch mililitrach roztworu gaszącego przez 15 minut.

Wymień roztwór gaszący na świeży po 15 minutach i inkubuj przez kolejne 15 minut. Podczas każdej inkubacji utrzymuj płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając je na wytrząsarce platformowej, podczas gdy płytka kontrolna pozostaje w roztworze gaszącym na blacie w chłodni. W tym momencie wyjmij płytkę eksperymentalną z chłodni, umieszczając ją w łaźni lodowej.

Jeśli testowane są leki, do podgrzanego PBS 2 z GBSA należy dodać odpowiednie stężenia leków. W tym przypadku zastosowano nośnik etanolowy lub 1 µM PMA w celu aktywacji szlaku PKC. Każdy dołek płytki eksperymentalnej należy przemyć trzykrotnie 2 mL podgrzanego PBS 2 z GBSA, dodając odpowiednie leki po ostatnim przemyciu.

Dodaj dwa mililitry odpowiednich roztworów PBS plus GBSA i wypełnij pozostałe puste dołki podgrzaną pożywką, aby zapewnić równomierną temperaturę na całej płytce. Bezpośrednio przed zakończeniem inkubacji przenieś komórki do inkubatora w temperaturze 37 °C na 10 minut. Przygotuj świeży roztwór do strippingu, wykorzystując 50 mM roztwór TCEP w buforze NT, i przechowuj go w lodzie.

Przygotować wystarczającą ilość roztworu, aby zapewnić jeden mililitr na dołek. Po 10 minutowej inkubacji szybko przenieść płytkę eksperymentalną do łaźni z lodem, a następnie szybko powrócić do chłodni. Trzykrotnie przemyć dołki eksperymentalne dwiema mililitrami lodowatego buforu NT na dołek, aby przerwać endocytozę.

Następnie trzy razy przemyj dołek kontrolny do usuwania przeciwciał (stripping control) dwiema mililitrami lodowatego buforu NT. Dołki kontrolne całkowite pozostaw w roztworze gaszącym (quench solution). Do każdego dołka eksperymentalnego oraz dołka kontrolnego do usuwania przeciwciał dodaj jeden mililitr roztworu do usuwania przeciwciał (stripping solution) i inkubuj na lodzie przez 15 minut.

Cztery stopnie Celsjusza przy delikatnym wstrząsaniu przed zakończeniem inkubacji. Ponownie przygotuj taką samą objętość świeżego roztworu do strippingu jak poprzednio. Po 15 minutach zastąp stary roztwór strippingowy świeżym i inkubuj przez dodatkowe 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy delikatnym wstrząsaniu, aby najpierw zlizować komórki.

Wszystkie dołki, które były wystawione na działanie roztworu do usuwania przeciwciał (stripping solution), przemyć trzykrotnie 2 mL buforu NT. Następnie wszystkie dołki, w tym kontrole całkowite, przemyć trzykrotnie 2 mL zimnego pbs. Po ostatnim przemyciu dodać 300 µL buforu RIPPA zawierającego świeże inhibitory proteaz do każdego dołka; przeprowadzić lizę komórek poprzez wstrząsanie przez 20 minut w temperaturze 4 °C.

Przenieś lizat do probówek typu microtube o pojemności 1,5 mililitra i usuń szczątki komórkowe poprzez wirowanie w wirówce przez 10 minut przy 18 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj testu białkowego kompatybilnego z warunkami lizy, na przykład testu białkowego BCA firmy Pierce, aby określić stężenie białek w lizacie w odniesieniu do krzywej standardowej albuminy surowicy bydlęcej. Następnie przygotuj lizaty do chromatografii powinowactwa i chromatografii strep.

Napełnić probówki do wirówki o pojemności 1,5 ml równymi ilościami białka z każdej próbki. W tym doświadczeniu izolujemy białka biotynilowane z 50 µg lizatów komórkowych. Dodać bufor RIPA zawierający inhibitory proteaz do końcowej objętości 200 µl dla każdej próbki.

Następnie energicznie wymieszaj na wirówce (vortex) paciorki strep-avid i agro przed użyciem; za pomocą pipety 200 µL z odciętym końcem przeniesion 20 µL paciorków strep-avid i agro do każdej probówki. Wymieszaj probówki na wirówce i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze do probówek. Następnego dnia odzyskaj paciorki, odwirując próbki przy 18 000 g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej; odessij lizat, uważając, aby nie zbliżyć aspiratora do osadu z paciorków, a następnie dodaj 0,75 ml w temperaturze pokojowej.

Dodaj bufor rip do każdej probówki i wymieszaj w vortexie z maksymalną prędkością, aby wyprać kuleczki. Odwiruj w wirówce przy 18 000 GS przez dwie minuty. W temperaturze pokojowej zbierz kuleczki i powtórz ten cykl płukania, mieszania w vortexie i wirowania jeszcze dwa razy, tak aby łącznie wykonać trzy płukania po końcowym etapie.

Odssać jak największą ilość buforu, uważając, aby nie naruszyć osadu kulek. Następnie do każdej probówki dodać od 20 do 25 µL dwukrotnego buforu Laemmli redukującego. Odczynnik redukujący rozszczepi mostek dwusiarczkowy NHS-S-S-S biotyny, uwalniając wyizolowane białka do roztworu.

Ponieważ większość białek błonowych nie toleruje gotowania, po redukcji i denaturacji należy inkubować probówki na rotatorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu rozdzielenia białek. Wykorzystując standardowy żel SDS-PAGE, przenieś białka na membranę w celu przeprowadzenia immunoblotingu i inkubuj z odpowiednim przeciwciałem. W tym doświadczeniu zastosowano przeciwciało szczurze przeciwko DAT firmy Checon (numer 360 9) w rozcieńczeniu 1:2000. Przechwyć immunoreaktywne prążki za pomocą systemu dokumentacji żeli z kamerą CCD, upewniając się, że nie występują nasycone piksele. W tym doświadczeniu wykorzystano system obrazowania BioRad VersaDoc z oprogramowaniem Quantity One do kwantyfikacji gęstości każdego prążka.

Tutaj przedstawiono reprezentatywny blok immunologiczny z procedury odwracalnej atacji transportera dopaminy. Najsilniejszy sygnał odpowiada całkowitej ilości białka powierzchniowego przed internalizacją, widocznej w ścieżce całkowitej lub T. Kontrola po stripowaniu lub S powinna w idealnych warunkach być zbliżona do tła i wykazywać wysoką wydajność stripowania. Wydajność stripowania oblicza się, wykorzystując pomiary gęstości prążków według następującego wzoru.

W tym eksperymencie wydajność tego paska wyniosła 99,8%. Paski o wydajności większej niż lub równej 90% są optymalne, a wyniki poniżej tego poziomu należy odrzucić. Ten przykład paska porowego wykazuje widoczny prążek w ścieżce paska przy wydajności paska wynoszącej 34%. Prążki o mniejszej intensywności to ścieżki internalizacji z płytki eksperymentalnej. Komórki poddano działaniu roztworu nośnika lub 1 µM PMA podczas 10-minutowej internalizacji, a następnie zmierzono szybkość internalizacji transportera dopaminy.

Szybkość internalizacji oblicza się na podstawie pomiarów gęstości prążków w następujący sposób: jak widać na tym wykresie, w warunkach z użyciem nośnika zinternalizowano 10,4% powierzchniowego DAT w ciągu 10 minut. Jednak traktowanie PMA zwiększyło szybkość internalizacji DAT do 23,2% całkowitego DAT powierzchniowego. W ten sposób zaprezentowano sposób pomiaru szybkości internalizacji białek błony plazmatycznej z wykorzystaniem techniki odwracalnej biotynylacji.

Należy pamiętać o dwóch kwestiach: odczynnik do bio-tonacji oraz TCP należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Jeśli zauważą Państwo dużą utratę komórek podczas realizacji protokołu, należy zastosować na płytkach podłoże adhezyjne do komórek. To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.