Aktywowane fluorescencją sortowanie komórek protoplastów roślinnych

Pokazano metodę izolowania określonych typów komórek z materiału roślinnego. Technika ta wykorzystuje transgeniczne linie markerowe wyrażające białka fluorescencyjne w określonych typach komórek, dysocjację komórkową i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Dodatkowo ustala się tutaj konfigurację wzrostu, która ułatwia leczenie sadzonek Arabidopsis thaliana przed sortowaniem komórek.

Procedura ta opiera się na roślinach wykazujących ekspresję GFP w określonych typach komórek, które można następnie wyizolować od reszty komórek roślinnych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją lub faktów. W tym przykładzie wykorzystano dwie linie markerów ulegające ekspresji w określonych typach komórek rzodkiewnika. Sadzonki korzeni Aliana są uprawiane na tackach fitogenicznych lub na płytkach agarowych.

Ich korzenie są zbierane i traktowane enzymami trawiącymi ścianę komórkową. Po godzinie roztwór jest filtrowany w celu usunięcia dużych zanieczyszczeń. Roztwór jest następnie odwirowywany i usuwany jest supernatant.

Protoplasty dodatnie według GFP są następnie rozdzielane faksem. Posortowany materiał może być wykorzystany do analizy specyficznej dla typu komórki, takiej jak profile transkrypcyjne całego genomu. Cześć, nazywam się Basian Barman i pracuję w laboratorium Kena Birnbauma na Wydziale Biologii Uniwersytetu Nowojorskiego.

Dzisiaj pokażemy Ci procedurę sortowania komórek protoplastów roślinnych aktywowanego fluorescencją. W tym przykładzie będziemy sortować dwa określone typy komórek w trasie Arabidopsis. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania profili transkrypcyjnych specyficznych dla typu komórki.

Więc zacznijmy. Aby rozpocząć tę procedurę, wyhoduj siewki typu dzikiego, a także sadzonki, które mają ekspresję GFP specyficzną dla typu komórki. Promotor stracha na wróble napędzający GFP oznacza endodermę korzenia i spoczynkowy środek w jednej grupie siewek.

A w innej grupie centrum spoczynku korzenia jest oznaczone przez spacery pięć promotorów prowadzących GFP. Sadzonki są uprawiane hydroponicznie, a tace FIA są umieszczone na nylonowym filtrze, który pozwala korzeniom wrastać w podłoże wzrostowe. Alternatywnie, rośliny można uprawiać na nylonowej siatce i pionowo ustawionych 1%płytkach agarowych.

Oprócz pomocy w zbiorach korzeni, filtry umożliwiają masowe przenoszenie sadzonek do nowych tacek fitograficznych lub płytek agarowych, gdzie można je uzupełnić interesującym katalizatorem. Można to zrobić, aby zbadać specyficzne dla typu komórki odpowiedzi transkrypcyjne na składniki odżywcze, hormony lub leczenie stresu. Sprawdź pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby upewnić się, że marker fluorescencyjny jest wyrażony zgodnie z oczekiwaniami.

Upewnij się, że wzorzec ekspresji markera jest spójny w zastosowanych warunkach leczenia, ponieważ może się zmienić w wyniku leczenia. Przystąp do zbioru i przygotowania protoplastów. Zacznij od przygotowania roztworu protoplastów.

Połącz 1,25% masy na objętość, celulazę 0,3% masy na objętość, maser zym 0,4 molowego D mannitolu 20 milimolowego, MES i 20 milimolowego KCL w wodzie demineralizowanej i dostosuj pH do 5,7 za pomocą jednego molowego tris HCL przy pH 7,5. To rozwiązanie będzie lekko mętne. Następnie podgrzewaj roztwór do 55 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Roztwór stanie się klarowny, pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej, a następnie dodaj 0,1% masy na objętość BSA 10 milimolowego chlorku wapnia i pięć milimolowych beta me capto etanolu zbieraj jednotygodniowe sadzonki z jednej tacy na fito. W przypadku stracha na wróble, linii GFP lub ośmiu talerzy czterodniowych dzieci spaceruje po sadzonkach 5G FP. Zeskrob korzenie z nylonowej siatki skalpelem, a następnie umieść je w pojemniku z roztworem protoplastów.

Użyj około 10 mililitrów roztworu protoplastów na 1500 sadzonek. Delikatnie wstrząsać kolbami przy prędkości 75 obr./min w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Dłuższy czas inkubacji może zwiększyć wydajność protoplastów, ale także zwiększy wpływ samych protoplastów na ekspresję genów.

Teraz, gdy protoplasty są uwalniane, użyj sitka do komórek o średnicy 40 mikrometrów, aby przefiltrować roztwór i podzielić zawiesinę protoplastów między stożkowe rurki o grubości 15 mil. Ważne jest, aby wytworzyć czystą zawiesinę protoplastów bez zbyt dużej ilości zanieczyszczeń, aby zapobiec zatykaniu faktów i zminimalizować czas potrzebny na sortowanie komórek. Odwirować probówki w wirówce z odchylanym wiadrem o stężeniu 500 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Należy zauważyć, że szybkość wirowania zależy od składu sekcji rośliny, w której powstają protoplasty i ilości resztek komórkowych wytwarzanych podczas obróbki enzymatycznej. Po odwirowaniu usunąć większość supernatantu i delikatnie ponownie zawiesić osad zawierający protoplasty w małej objętości pozostałego roztworu protoplastów. Na koniec policz protoplasty za pomocą hemocytometru i określ ich gęstość, aby obliczyć wydajność i zdecydować o parametrach przebiegu faktów.

Po zliczeniu sprawdź protoplasty. Sprawdź ich integralność, poziom ekspresji GFP i zawartość zanieczyszczających szczątków komórkowych. Następnie przejdź do faksowania.

Jeśli nie, przejdź bezpośrednio do faksu. Protoplasty mogą być myte, ponownie zawieszane i przechowywane w roztworze inkubacyjnym, takim jak roztwór do powlekania protopowaniem bez dodatku enzymów lub roztwór W five. Włącz sortownik komórek i komputer stacji roboczej.

Tutaj używamy fria wyprodukowanego przez Becton Dixon and Company. Użyj jednego XPBS jako płynu osłonowego i uruchom procedurę uruchamiania fluidycznego. Zainstaluj dyszę o średnicy 100 mikrometrów i ustaw ciśnienie w osłonie 20 PSI.

Ustaw stabilny strumień przepływu i skalibruj opóźnienie upuszczania. Należy pamiętać, że kalibracja nie jest pokazana w tej procedurze. Zawiesiny protoplastów o gęstości sięgającej 10 milionów komórek na promil mogą być z powodzeniem sortowane.

Aby zapobiec sedymentacji protoplastów, należy użyć opcji mieszania próbki na faktach. Jeśli problemem jest zatkanie faktów, istnieją trzy możliwe etapy strzelania. Najpierw wykonaj płukanie wsteczne linii próbkowania.

Po drugie, rozcieńczyć zawiesinę protoplastów, aby zmniejszyć gęstość. Po trzecie, oczyść roztwór protoplastów, powtarzając etap filtracji po odwirowaniu i zawiesinie rezu. Tylko cztery parametry są używane do odróżnienia protoplastów GFP dodatnich od protoplastów ujemnych GFP i szczątków komórkowych po wzbudzeniu przez laser o długości fali 488 nanometrów, rozproszenie do przodu jest wskaźnikiem wielkości cząstek, rozproszenie boczne jako wskaźnik ziarnistości cząstek.

Emisja przy 530 nanometrach jako miara zielonej fluorescencji i emisja przy 610 nanometrach jako miara autofluorescencji widma czerwonego. Zacznij od skonfigurowania wykresu punktowego dla punktu rozproszonego do przodu w porównaniu z wykresem punktowym z boku. Zastosuj ustawienie napięcia tak, aby mierzone zdarzenia były wyśrodkowane na wykresie.

PROTOPLASTY GFP dodatnie można odróżnić po zwiększonym stosunku emisji zielonej do czerwonej w porównaniu ze zdarzeniami z autofluorescencją. Ustaw tylko wykres punktowy z zieloną fluorescencją i czerwoną autofluorescencją widma. Zastosować ustawienia napięcia w taki sposób, aby zmierzone zdarzenia spowodowały powstanie pojedynczej populacji przekątnej na wykresie.

Patrząc na zawiesinę protoplastów typu dzikiego, PROTOPLASTY GFP dodatnie powinny wytworzyć wyraźną populację zdarzeń zielonej fluorescencji, których nigdy nie obserwowano w próbkach typu dzikiego. Ustaw ograniczenia kompensacji, aby dostosować się do nakładania się widma między zieloną fluorescencją a czerwoną autofluorescencją widma. Stosując zawiesinę PROTOPLASTS z dodatnim wynikiem GFP, odpowiednie ustawienia ograniczeń kompensacji pozwolą na lepsze oddzielenie protoplastów dodatnich GFP od protoplastów i szczątków niebędących GFP, tworząc bramkę do identyfikacji zdarzeń dodatnich GFP.

Zaleca się zabranie ze sobą PROTOPLASTÓW innych niż GFP za każdym razem, gdy przygotowujesz eksperyment sortowania, aby pomóc w zdefiniowaniu granic bramek. Na koniec należy ustawić punkt odcięcia progu rozproszenia do przodu, aby nie uwzględniać drobnych zanieczyszczeń w analizie. Wizualizacja zdarzeń dodatnich GFP na wykresie punktowym do przodu i na bocznym wykresie punktowym pomoże w określeniu, gdzie należy ustawić próg.

Parametry skonfigurowane w tym początkowym przebiegu faktów mogą być ponownie używane do sortowania w przyszłości. Do codziennego korzystania z faktów konieczne będą niewielkie korekty. Do ekstrakcji RNA przygotuj probówki zbiorcze zawierające bufor do ekstrakcji RNA, co najwyżej użyj objętości sortowania 100 mikrolitrów do 350 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego jako przewodnika.

20 000 zdarzeń sortowania daje łączną objętość sortowania około 100 mikrolitrów. Teraz, gdy parametry faksu i tryby pracy są ustawione, a probówki zbiorcze są gotowe, rozpocznij sortowanie protoplastów po zakończeniu sortowania. Wymieszaj probówki do pobierania próbek, ponieważ zawiesina komórkowa może gromadzić się na górze, ponieważ zaledwie 500 posortowanych zdarzeń można użyć do analizy mikromacierzy po ekstrakcji RNA i amplifikacji CD NA.

Tutaj używamy zestawu do mikroekstrakcji RNEZ, systemu amplifikacji RNA WT ovation PICO oraz modułu biotyny FL ovation CD NA V dwa. Oto typowe wyniki faksu dla protoplastów pochodzących z siewek strachów na wróble innych niż GFP, GFP i W 5G FP: 100 000 zdarzeń przedstawiono na każdym wykresie kropkowym zielonej fluorescencji na osi x w porównaniu z czerwoną fluorescencją. Na osi Y zdarzenia wchodzące w skład bramki sortującej GFP są wyróżnione na zielono.

Jest to podsumowanie typowego plonu protoplastów z siewek wyrażających albo strach na wróble, GFP, oznaczający endodermę korzenia i środek spoczynku, albo spacery 5G FP oznaczające środek spoczynku korzenia. W środku spoczynku korzenia znajduje się mniej komórek w porównaniu z endodermą korzenia. Dlatego, pomimo rozpoczęcia od większej liczby protoplastów, wydajność komórek eksprymujących GFP jest mniejsza w sortowaniu 5G FP w porównaniu z sortowaniem GFP stracha na wróble pokazanymi tutaj są typowe wyniki ekstrakcji RNA z potrójnych próbek.

Każda próbka odpowiada RNA wyekstrahowanemu z 10 000 zdarzeń. Wyekstrahowany RNA jest analizowany na bioanalizatorze, pokazując piki rybosomalne dla próbek GFP stracha na wróble na górze, a próbki 5G FP poniżej wyekstrahowanego RNA mogą być dalej wykorzystywane do analizy mikromacierzy. Ten wykres punktowy logarytmu dwóch poziomów wyrażeń pokazuje podobieństwo między dwiema replikacjami.

Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić aktywowane fluorescencją sortowanie komórek protoplastów roślinnych w celu analizy specyficznej dla typu komórki. Technika ta ma zastosowanie do wielu różnych tkanek i gatunków roślin. Dobre plony przy niskiej zawartości zanieczyszczeń i zdrowych protoplastach zapewnią lepsze wyniki w dalszych analizach transkrypcyjnych, a także innych.

Należy również pamiętać, że ważne jest, aby warunki wzrostu materiału roślinnego były identyczne dla porównania między posortowanymi próbkami. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.