Sortowanie komórek protoplastów roślinnych metodą fluorescencyjnej aktywacji (FACS)

Procedura ta opiera się na roślinach wykazujących ekspresję GFP w określonych typach komórek, które mogą następnie zostać wyizolowane z pozostałych komórek rośliny przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). W tym przykładzie wykorzystano dwie linie markerowe wykazujące ekspresję w określonych typach komórek Arabidopsis thaliana. Siewki korzeniowe są hodowane w tackach do roślin lub na płytkach z agarem.

Ich korzenie są zbierane i traktowane enzymami trawiącymi ścianę komórkową. Po jednej godzinie roztwór jest filtrowany w celu usunięcia dużych zanieczyszczeń. Następnie roztwór jest wirowany, a nadsącz jest usuwany.

Protoplasty wykazujące pozytywny wynik w kierunku GFP są następnie oddzielane za pomocą FACS. Posortowany materiał może zostać wykorzystany do analiz specyficznych dla danego typu komórek, takich jak profilowanie transkrypcyjne w całym genomie. Cześć, jestem Basian Barman z laboratorium Kena Birnbauma w Katedrze Biologii na Uniwersytecie Nowojorskim.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) protoplastów roślinnych. W tym przykładzie przeprowadzimy sortowanie dwóch specyficznych typów komórek z korzenia Arabidopsis. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania profili transkrypcyjnych specyficznych dla danego typu komórek.

Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyhodować siewki typu dzikiego oraz siewki z ekspresją GFP specyficzną dla określonego typu komórek. Promotor scarecrow sterujący ekspresją GFP znakuje endodermis korzenia oraz centrum spoczynkowe w jednej grupie siewek.

W innej grupie centrum spoczynkowe korzenia jest znakowane przez promotor walks five napędzający GFP. Siewki są hodowane hydroponicznie w tace FIA na nylonowym filtrze, który umożliwia przerastanie korzeni do podłoża hodowlanego. Alternatywnie rośliny można hodować na siatce nylonowej i pionowo ustawionych płytkach z 1% agar.

Oprócz ułatwiania zbioru korzeni, filtry pozwalają na masowy przenoszenie siewek do nowych tacek fitotronowych lub na płytki agarowe, gdzie mogą one zostać uzupełnione o wybrany katalizator. Może to zostać przeprowadzone w celu zbadania specyficznych dla typu komórek odpowiedzi transkrypcyjnych na składniki odżywcze, hormony lub zabiegi stresowe. Należy sprawdzić pod mikroskopem fluorescencyjnym, czy marker fluorescencyjny jest wyrażany zgodnie z oczekiwaniami.

Należy upewnić się, że wzór ekspresji markera jest spójny w zastosowanych warunkach traktowania, ponieważ może on ulec zmianie w wyniku przeprowadzonej procedury. Następnie należy przystąpić do pozyskiwania i przygotowania protoplastów. Rozpocznij od przygotowania roztworu do protoplastów.

W wodzie zdemineralizowanej połączyć celulazę (1,25% w/v), maser zyme (0,3% w/v), mannitol-D (0,4 M), MES (20 mM) oraz KCl (20 mM), a następnie skorygować pH do 5,7 za pomocą 1 M Tris-HCl o pH 7,5. Roztwór ten będzie lekko mętny. Następnie podgrzać roztwór do 55 °C przez 10 minut.

Roztwór stanie się klarowny; należy go schłodzić do temperatury pokojowej, a następnie dodać BSA w stężeniu 0,1% m/v, 10 mM chlorku wapnia oraz 5 mM beta-merkaptoetanolu. Zebrać tygodniowe siewki z jednej tacki do hodowli in vitro. W przypadku linii scarecrow GFP należy zebrać siewki GFP w wieku czterech dni z ośmiu płytek. Zeskrobać korzenie z siatki nylonowej za pomocą skalpela, a następnie umieścić je w pojemniku z roztworem do izolacji protoplastów.

Należy zużyć około 10 mililitrów roztworu protoplastów na 1500 siewek. Kolby należy delikatnie potrząsać z prędkością 75 RPM w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Dłuższy czas inkubacji może zwiększyć wydajność protoplastów, ale jednocześnie nasili wpływ samych protoplastów na ekspresję genów.

Po uwolnieniu protoplastów należy przefiltrować roztwór przez sitko komórkowe o oczkach 40 µm, a następnie podzielić zawiesinę protoplastów do stożkowych probówek 15 ml. Ważne jest uzyskanie czystej zawiesiny protoplastów z minimalną ilością zanieczyszczeń, aby zapobiec zapychaniu się dysz i zminimalizować czas potrzebny na sortowanie komórek. Probówki należy odwirować w wirówce z koszykiem wahadłowym przy 500 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Należy pamiętać, że prędkość wirowania zależy od budowy części rośliny, z której pozyskiwane są protoplasty, oraz od ilości zanieczyszczeń komórkowych powstających podczas obróbki enzymatycznej. Po wirowaniu należy usunąć większość nadsączu i delikatnie resuspender osad zawierający protoplasty w niewielkiej objętości pozostałego roztworu protoplastów. Na koniec należy policzyć protoplasty za pomocą hemocytometru i określić ich gęstość, aby obliczyć wydajność oraz ustalić parametry przepływu.

Po przeliczeniu należy sprawdzić protoplasty. Ocenić ich integralność, poziom ekspresji GFP oraz zawartość zanieczyszczeń w postaci szczątków komórkowych. Następnie przejść do fazy.

Jeśli nie przechodzimy bezpośrednio do frakcjonowania. Protoplasty można przemyć, resuspenderować i przechowywać w roztworze inkubacyjnym, takim jak roztwór do wysiewania protoplastów bez dodatku enzymów lub roztwór W5. Włącz sorter komórkowy oraz komputer stacji roboczej.

W niniejszym protokole używamy urządzenia firmy Becton Dixon and Company. Jako płyn osłonowy należy zastosować XPBS i przeprowadzić procedurę uruchamiania układu płynowego. Należy zainstalować dyszę o średnicy 100 µm i ustawić ciśnienie osłony na 20 PSI.

Ustaw stabilny strumień przepływu i skalibruj opóźnienie kropli. Należy pamiętać, że kalibracja nie jest pokazana w niniejszej procedurze. Można z sukcesem sortować zawiesiny protoplastów o gęstości sięgającej 10 milionów komórek na ml.

Aby zapobiec sedymentacji protoplastów, należy użyć opcji mieszania próbki w faktach. W przypadku wystąpienia problemu z zatykaniem się faktów, możliwe są trzy kroki rozwiązywania problemów. Po pierwsze, należy przeprowadzić płukanie wsteczne linii próbkowania.

Po drugie, rozcieńcz zawiesinę protoplastów, aby zmniejszyć jej gęstość. Po trzecie, oczyść roztwór protoplastów, powtarzając etap filtracji po wirowaniu i ponownym zawieszeniu. Do odróżnienia protoplastów GFP-dodatnich od protoplastów GFP-ujemnych oraz debris komórkowych po wzbudzeniu laserem o długości fali 488 nm stosuje się cztery parametry: rozproszenie przednie (forward scatter) jako wskaźnik wielkości cząstek oraz rozproszenie boczne (side scatter) jako wskaźnik ziarnistości cząstek.

Emisja przy 530 nanometrach jako miara fluorescencji zielonej oraz emisja przy 610 nanometrach jako miara autofluorescencji ze spektrum czerwonego. Należy rozpocząć od ustawienia wykresu kropkowego dla rozproszenia w przód (forward scatter) względem rozproszenia bocznego (side scatter). Następnie należy ustawić napięcie w taki sposób, aby mierzone zdarzenia znajdowały się w centrum wykresu.

PROTOPLASTY pozytywne pod kątem GFP można odróżnić po zwiększonym stosunku emisji zielonej do czerwonej w porównaniu z zdarzeniami wykazującymi autofluorescencję. Należy utworzyć wyłącznie wykres kropkowy (dot plot) fluorescencji zielonej względem autofluorescencji w spektrum czerwonym. Ustawienia napięcia należy dobrać w taki sposób, aby mierzone zdarzenia tworzyły na wykresie pojedynczą populację diagonalną.

Podczas analizy zawiesiny protoplastów typu dzikiego, protoplasty GFP-dodatnie powinny tworzyć wyraźną populację zielonych zdarzeń fluorescencyjnych, których nie obserwuje się w próbkach typu dzikiego. Należy ustawić parametry kompensacji, aby skorygować nakładanie się widm fluorescencji zielonej i autofluorescencji w spektrum czerwonym. Przy użyciu zawiesiny protoplastów GFP-dodatnich odpowiednie ustawienia kompensacji pozwolą na lepszą separację protoplastów GFP-dodatnich od protoplastów GFP-ujemnych oraz zanieczyszczeń; następnie należy ustawić bramkę w celu identyfikacji zdarzeń GFP-dodatnich.

Zaleca się, aby przy każdym przygotowaniu eksperymentu sortowania uwzględnić PROTOPLASTY nie GFP, co pomoże w zdefiniowaniu granic bramkowania. Na koniec należy ustawić próg odcięcia rozproszenia przedniego (forward scatter), aby wykluczyć z analizy drobne zanieczyszczenia. Wizualizacja zdarzeń GFP-dodatnich na wykresie rozproszenia przedniego względem rozproszenia bocznego (side scatter) pomoże w określeniu, na jakim poziomie należy ustawić próg.

Parametry ustawione podczas tego wstępnego uruchomienia systemu facts mogą być ponownie wykorzystane w przyszłych sortowaniach. W codziennym użytkowaniu systemu facts wymagane będą niewielkie korekty. Do ekstrakcji RNA należy przygotować probówki zbiorcze zawierające bufor do ekstrakcji RNA; jako wytyczną przyjmuje się stosunek maksymalnie 100 µL objętości sortowania do 350 µL buforu do ekstrakcji.

20 000 zdarzeń sortowania daje całkowitą objętość sortowania wynoszącą około 100 µL. Po ustawieniu parametrów FACS i trybów pracy oraz przygotowaniu probówek do zbierania, należy rozpocząć sortowanie protoplastów; po zakończeniu procesu należy wymieszać probówki z zebranymi próbkami, ponieważ zawiesina komórkowa może gromadzić się u góry. Do analizy mikromacierzy, po ekstrakcji RNA i amplifikacji cDNA, można wykorzystać nawet 500 posortowanych zdarzeń.

W niniejszym doświadczeniu wykorzystujemy zestaw do mikroekstrakcji RNEZ, system amplifikacji RNA WT ovation PICO oraz moduł biotynowania NA fl ovation CD V two. Przedstawione są typowe wyniki analizy FACS dla protoplastów pochodzących z siewek non GFP Scarecrow, GFP oraz W 5G FP. Na każdym wykresie kropkowym zaprezentowano 100 000 zdarzeń, gdzie na osi X naniesiono fluorescencję zieloną, a na osi Y fluorescencję czerwoną. Zdarzenia mieszczące się w bramce sortowania GFP zostały wyróżnione kolorem zielonym.

Poniżej przedstawiono podsumowanie typowej wydajności protoplastów z siewek wykazujących ekspresję albo białka scarecrow GFP znakującego endodermę korzenia i centrum spoczynkowe, albo białka walks 5G FP znakującego centrum spoczynkowe korzenia. W centrum spoczynkowym korzenia znajduje się mniej komórek niż w endodermie korzenia. W związku z tym, mimo rozpoczęcia procesu od większej liczby protoplastów, wydajność komórek wykazujących ekspresję GFP jest mniejsza w sortowaniu walks 5G FP w porównaniu z sortowaniem scarecrow GFP; tutaj przedstawiono typowe wyniki ekstrakcji RNA z próbek wykonanych w trzech powtórzeniach.

Każda próbka odpowiada RNA wyekstrahowanemu z 10 000 zdarzeń. Wyekstrahowane RNA jest analizowane za pomocą bioanalizatora, który pokazuje piki rybosomalne dla próbek scarecrow GFP na górze oraz próbek walks 5G FP poniżej; wyekstrahowane RNA może być dalej wykorzystane do analizy mikromacierzy. Ten wykres rozrzutu logarytmów dwójkowych poziomów ekspresji wykazuje podobieństwo między dwoma powtórzeniami.

Właśnie przedstawiliśmy sposób przeprowadzania sortowania protoplastów roślinnych za pomocą fluorescencyjnie aktywowanej sorterki komórek w celu analizy specyficznej dla danego typu komórek. Technika ta ma zastosowanie do wielu różnych tkanek i gatunków roślin. Wysoka wydajność przy niskiej zawartości zanieczyszczeń oraz zdrowe protoplasty pozwolą na uzyskanie lepszych wyników w dalszych analizach transkrypcyjnych oraz innych rodzajach badań.

Należy również pamiętać, że dla zapewnienia porównywalności pomiędzy posortowanymi próbkami istotne jest zachowanie identycznych warunków wzrostu materiału roślinnego. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.