Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA za pomocą testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA

Ten film przedstawia protokół wizualizacji replikacji DNA za pomocą szerokokątnej mikroskopii optycznej, zlinearyzowanej i chemicznie modyfikowanej lambda. DNA jest przymocowane do funkcjonalizowanego szklanego szkiełka nakrywkowego. Wolny koniec DNA jest znakowany kulkami, a DNA jest rozciągane przez przepływ laminarny.

Po zainicjowaniu replikacji nić wiodąca zaczyna się wydłużać, a nić opóźniona skraca się z powodu zwijania. Duża różnica w długości między dwuniciowym i jednoniciowym DNA przy niskich siłach pozwala na bezpośrednią obserwację konwersji DNA podczas replikacji. Długość konstruktu DNA jest monitorowana poprzez śledzenie położenia kulki, co pozwala na precyzyjne określenie szybkości i procesu replikacji DNA.

Cześć, nazywam się Ari Ulrich i pracuję w Laboratoriach Anto One Vanian i Charlesa Richardsona na Wydziale Chemii Biologicznej i Farmakologii Molekularnej w Harvard Medical School. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę obrazowania replikacji DNA na poziomie pojedynczym molekularnym. Stosujemy tę procedurę w naszych laboratoriach do badania aktywności enzymatycznej, która zachodzi podczas syntezy DNA.

Więc zacznijmy na początku tej procedury. Linearyzowany bakteryjny DNA Lambda jest modyfikowany przez klęczące oligonukleotydy w celu utworzenia widełek replikacyjnych, komplementarnego ramienia widełek lambda, biotynylowanego ramienia widelca i startera widełkowego. Biotynylowane przedramię widelca zawiera biotynę t przymocowaną do jego pięciu głównych końców, co umożliwia przywiązanie matrycy DNA do powierzchni komórki przepływowej.

DNA lambda jest dalej modyfikowane przez wyżarzanie, inny oligonukleotyd, który zawiera diggen i ugrupowanie, służąc jako znacznik immunologiczny o wysokim powinowactwie do mocowania koralika. Aby wygenerować widełki replikacyjne, uzyskaj DNA lambda oraz kilka oligonukleotydów, których sekwencje można znaleźć w pisemnym protokole dołączonym do tego filmu. Te oligonukleotydy obejmują biotynylowane ramię widelca, komplementarne ramię widelca lambda, starter widełkowy oraz komplementarny diggen lambda i fosforylują końcowe pięć pierwszych końców komplementarnego ramienia widelca lambda i końca komplementarnego geniny lambda przy użyciu kinazy polinukleotydowej T cztery.

Następnie wymieszaj ufosforylowane komplementarne ramię widelca lambda, biotynylowane ramię widelca, starter widelca i lambda DNA w stosunku molowym od 10 do 10 do 100 do jednego. W buforze ligazy T four DNA podgrzej mieszaninę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut i powoli schładzaj do temperatury pokojowej, wyłączając blok grzewczy, aby umożliwić prawidłowe wyżarzanie oligonukleotydów i ligazy DNA T 4 do mieszaniny i inkubować przez dwie godziny. W temperaturze pokojowej ligaza DNA T four będzie katalizować uszczelnianie nacięć między oligonukleotydami a lambdą.

DNA na koniec anil komplementarny diggen lambda i koniec matrycy replikacji DNA, dodając fosforylowany komplementarny diggen lambda i kończąc w buforze T four Ligazy, inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 45 stopni Celsjusza i ponownie, powoli schłodzić do temperatury pokojowej, wyłączając blok grzewczy, zligować fosforylowany komplementarny tlen Lambda i zakończyć do matrycy replikacji DNA, dodając do mieszaniny ligazę DNA T cztery i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Ostateczna matryca replikacji DNA jest już gotowa do użycia. Aby przymocować kulki magnetyczne aktywowane frędzlami do matrycy replikacji DNA, muszą one zostać sfunkcjonalizowane fragmentem FAB specyficznym dla digogeniny.

Aby rozpocząć ten proces, ponownie zawieś roztwór podstawowy kulek i przenieś 400 mikrolitrów do probówki einor. Umieść probówkę w separatorze magnetycznym i inkubuj, aż roztwór się klaruje. Następnie usunąć supernatant przez pipetowanie Aby aktywować grupy toal do sprzężenia przeciwciał, dodać jeden mililitr buforu boid i delikatnie wymieszać przez pipetowanie.

Ponownie usunąć supernatant za pomocą separatora magnetycznego. Następnie dodać 240 mikrolitrów fragmentu FAB i ponownie zawiesić kulki w 400 mikrolitrach buforu boranowego. Dokładnie wymieszaj i pozostaw do inkubacji na rotatorze na 16 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po inkubacji oddzielić kulki za pomocą separatora magnetycznego i usunąć supernatant. Przemyć kulki jednym mililitrem buforu płuczącego i inkubować przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, usunąć bufor za pomocą separatora magnetycznego. To pranie powtarza się dwukrotnie.

Aby zablokować wolne grupy tosilu, dodaj jeden mililitr buforu BSA zawierającego tris i inkubuj przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji usunąć bufor z kulek za pomocą separatora magnetycznego, dwukrotnie przemyć buforem i podwielokrotnością. W celu użycia, DNA, które ma zostać zreplikowane, jest umieszczane na szklanych szkiełkach nakrywkowych funkcjonalizowanych za pomocą Amil lane.

Grupa tlenowa Amil Lane wiąże się ze szkłem, pozostawiając aminę dostępną do wiązania się z biotynylowanymi cząsteczkami peg. Powłoka ta pomaga zmniejszyć niespecyficzne wiązanie z powierzchnią. Aby dokładnie wyczyścić szkiełka pokrywy, umieść je w słoikach do barwienia i napełnij słoiki sonikatem etanolu.

Przez 30 minut wypłukiwać słoiki i napełniać jednym molowym wodorotlenkiem potasu sonikować przez 30 minut i powtórzyć oba mycia. W pierwszej reakcji funkcjonalizacji należy usunąć wszelkie ślady wody. Napełnij słoiki do barwienia acetonem i sonikuj przez 10 minut.

Opróżnij słoiki i ponownie napełnij acetonem. Kontynuuj dodawanie odczynnika sinusoidalnego do słoików i mieszaj przez dwie minuty. Następnie ugasić dużym nadmiarem wody.

Następnie osusz szkiełka przykrywkowe, piecząc je w piekarniku w temperaturze 110 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie przygotuj mieszankę kołków o masie około 0,2% na objętość. Biotynylowany kołek, w tym szklana przekładka szkiełka nakrywkowego, umożliwi oddzielenie szkiełek nakrywkowych, pipetuj 100 mikrolitrów na suche, silosowe szkiełko nakrywkowe.

Umieść drugi szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Inkubować szkiełka nakrywkowe w roztworze PEG przez trzy godziny. Następnie oddziel każdą parę szkiełek nakrywkowych i obficie umyj wodą.

Uważaj, aby szkiełka nakrywkowe były funkcjonalnie skierowane do góry, ponieważ tylko jedna strona będzie pokryta kołkiem. Na koniec wysusz szkiełka nakrywkowe sprężonym powietrzem i przechowuj je w próżni W osuszaczu powierzchnie pozostają stabilne przez co najmniej miesiąc. W ten sposób można wykonać dziesiątki szkiełek nakrywkowych w partii i wykorzystać w razie potrzeby.

Teraz, gdy szkiełka nakrywkowe są gotowe, można zmontować komorę przepływową do eksperymentu z pojedynczą cząsteczką. Eksperyment z pojedynczą cząsteczką jest przeprowadzany przy użyciu prostej komory przepływowej zbudowanej z funkcjonalnego szkiełka nakrywkowego, taśmy dwustronnej, szkiełka kwartowego i rurki. Dla każdego eksperymentu z pojedynczą cząsteczką przygotowywana jest jedna komora przepływowa.

Zacznij od wymieszania pięciu mililitrów buforu blokującego i 20 mililitrów buforu roboczego i umieszczenia mieszaniny w osuszaczu, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza na późniejsze kroki. Następnie rozprowadź 100 mikrolitrów roztworu roboczego strp din w PBS na powierzchni funkcjonalizowanego kołkiem Szkiełko nakrywkowe inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić wiązanie biotyny powierzchniowej. W międzyczasie wytnij kawałek taśmy dwustronnej, aby dopasować go do rozmiaru szkiełka kwarcowego, zaznacz położenie otworów na rurki na taśmie.

Obrysuj komorę przepływową, rysując środkowy kanał o szerokości trzech milimetrów i prostokąty zawierające oba otwory. Studzienki przepływowe mogą być zaprojektowane z dwoma kanałami wlotowymi i dwoma wylotowymi w kształcie litery Y. Teraz przetnij zaznaczoną taśmę wzdłuż narysowanego konturu, wykonując proste, czyste cięcia, aby upewnić się, że żaden klej nie wystaje do kanału.

Dokładnie wyczyść szkiełko kwarcowe za pomocą acetonu, aby usunąć klej z konstrukcji komory przepływowej używanej w poprzednich eksperymentach. Znajdź najlepsze wyrównanie konturu kanału. Usuń jedną stronę podkładu samoprzylepnego i ostrożnie umieść taśmę na prowadnicy kortu.

Uważaj, aby prawidłowo wyrównać taśmę, ponieważ otwory wlotowe i wylotowe muszą pozostać niezablokowane. Następnie przygotuj rurki o średnicy wewnętrznej 0,76 milimetra do wlotu i wylotu komory przepływowej. Odetnij koniec rurki pod kątem około 30 stopni, aby rurka nie naciskała płasko na dno komory.

Zawieś rurki na stojakach na probówki, aby łatwo przymocować je do komory przepływowej w kolejnych krokach. Do tej pory inkubacja szkiełek nakrywkowych powinna zostać zakończona. Opłucz pokrowiec, dokładnie wsuń go wodą i osusz sprężonym powietrzem.

Uważaj, aby nie odwrócić szkiełka nakrywkowego, ponieważ tylko jedna strona jest funkcjonalna za pomocą kołka. Zakończ montaż komory przepływowej, usuwając drugą stronę podkładu taśmy i umieszczając szkiełko kwarcowe na szkiełku nakrywkowym Lekko naciśnij szkiełko nakrywkowe, aby wypchnąć powietrze uwięzione w kleju. Pomoże to zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do kanału przepływowego.

Uszczelnij boki komory żywicą epoksydową. Włóż wyciętą rurkę do otworów kwarcu i uszczelnij ją żywicą epoksydową. Pozostaw do wyschnięcia na kilka minut.

Po wyschnięciu użyj igły o rozmiarze 21, aby przeciągnąć część bufora blokującego DGA przez jedną z probówek w celu zablokowania powierzchni komory. Przepłukać kilka razy, aby usunąć pęcherzyki powietrza i pozostawić komorę do inkubacji przez co najmniej 30 minut przed przejściem do eksperymentu replikacji pojedynczej cząsteczki. Po przygotowaniu funkcjonalizowanych kulek z matrycą DNA i komory przepływowej można przeprowadzić eksperyment z pojedynczą cząsteczką.

Aby rozpocząć, umieść komórkę przepływową na stoliku mikroskopu. Przytrzymaj komorę na miejscu za pomocą stage zaciski i upewnij się, że kanał przepływowy jest ustawiony w jednej linii z kamerą CCD. Podłączyć do wcześniej skonstruowanego sprężyny powietrznej do pompy strzykawkowej i do rurek wylotowych komory przepływowej.

Używając rurki łączącej o większej średnicy, umieść rurki wlotowe komory przepływowej w buforze blokującym i pociągnij strzykawkę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z rurek, delikatnie przesuń rurki wylotowe, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w komorze przepływowej. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza zatkaj jedną z rurek wlotowych igłą i uszczelnij jedną z rurek wylotowych, zginając ją pod kątem 180 stopni i zabezpieczając taśmą klejącą Przed dodaniem DNA do komórki rozcieńczyć podstawową matrycę DNA do 10 pikomolarów w jednym mililitrze buforu blokującego DGA jeden x. Wlej matrycę do komory z umiarkowanym natężeniem przepływu, aby umożliwić dobre pokrycie powierzchni DNA.

Rozcieńczyć roztwór kulki podstawowej do ilości od dwóch do czterech razy 10 szóstych kulek na mililitr. W jednym mililitrze DGA jeden x bufor blokujący. Następnie zmieszaj mieszaninę i poddaj sonikacji przez 20 sekund.

Wlej rozcieńczony roztwór kulki do komory. Po dodaniu kulek wyłącz przepływ i pozwól komorze osiągnąć równowagę. Następnie zamknij obie rurki wylotowe.

Wszelkie zmiany w probówkach bez zamkniętej komory spowodują wahania ciśnienia, które będą wywierać dużą siłę na kulki i ścinać uwięzione cząsteczki DNA. Zatkaj rurkę wlotową, która była używana do ładowania koralików, igłą za pomocą drugiej rurki wlotowej. Rozpocznij mycie komory przepływowej za pomocą roztworu DGA jeden x blokującego płukanie buforu.

Porusz stolikiem, stukając, aby usunąć wszelkie koraliki, które nie są specjalnie przyklejone do powierzchni, aby to sprawdzić. Koraliki są przywiązane do DNA. Spróbuj zmienić kierunek przepływu.

Gdy wolne kulki zostaną wystarczająco usunięte, wyłącz przepływ i pozwól komorze osiągnąć równowagę. Przygotować świeżą mieszaninę reakcyjną zawierającą białka replikacyjne, jak wskazano w protokole tekstowym. Zamknąć otwartą rurkę wylotową i przełączyć zbiornik wlotowy na świeżo przygotowaną mieszaninę reakcyjną.

Powolne otwieranie wylotu, aby uniknąć gwałtownych zmian ciśnienia w celu przeprowadzenia reakcji enzymatycznej. Najpierw wlej roztwór białka do komory z umiarkowaną szybkością przepływu, aby umożliwić skuteczne wiązanie z DNA. Wyłącz przepływ i pozwól, aby komora osiągnęła równowagę.

Zamknąć rurki wylotowe i wymienić rurkę zawierającą mieszaninę reakcyjną. Za pomocą rurki składającej się z buforu płuczącego DGA, umyj komorę, aby usunąć wolne białka po umyciu. Ponownie wyłącz przepływ i pozwól komorze osiągnąć równowagę.

Zamknąć rurki wylotowe i wymienić rurkę zawierającą bufor myjący. Z probówką zawierającą bufor replikacyjny T seven, bufor replikacyjny T seven zawiera chlorek magnezu, który wyzwala początek reakcji replikacji. Użyj natężenia przepływu 0,012 mililitra na minutę, które odpowiada trzem piko sile oporu Newina na pętach DNA, używając warunków opisanych w tym protokole.

Przed obrazowaniem umieść magnes trwały ziem rzadkich nad komorą przepływową, aby zapobiec niespecyficznym interakcjom między kulkami a powierzchnią. Umieść oświetlacz światłowodowy pod kątem padania między 10 stopniami i równolegle do stolika mikroskopu w pobliżu mikroskopu view pole z obiektywem 10 x i kamerą CCD. Oświetlenie ciemnego pola służy do zwiększenia kontrastu w ostrości obrazowania koralików za pomocą koralika na uwięzi.

Rozpocznij akwizycję danych przez 20 do 30 minut z niską liczbą klatek na sekundę. W udanym eksperymencie można jednocześnie zaobserwować 100 koralików. Eksperyment powinien przynieść liczne ślady wskazujące na syntezę wiodącej nici DNA.

Aby zmierzyć szybkość i proces odwijania i polimeryzacji DNA, należy określić dokładne pozycje kulek, aby to osiągnąć. Dopasuj te pozycje do dwuwymiarowych funkcji Gaussa. Wizualizuj trajektorię, śledząc pozycję ściegu w każdej klatce za pomocą oprogramowania do śledzenia.

Następnie wykreśl pozycję ściegu w funkcji czasu za pomocą dowolnego oprogramowania graficznego, aby uzyskać dane dotyczące szybkości. Dopasuj wykresy do regresji liniowej i oblicz nachylenie dla procesu. Określ całkowitą długość DNA od początku do końca zdarzenia skracania.

Połącz wszystkie pojedyncze pomiary i wykreśl rozkłady szybkości i produktywności, dopasuj dane za pomocą odpowiednio funkcji Gaussa i pojedynczej funkcji wykładniczej. Właśnie pokazaliśmy, jak mierzyć tempo i proces replikacji DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że siła i niektóre zakłady przepływu blaszki nie wpływają na aktywność enzymatyczną białek replikacyjnych.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy miłej zabawy w swoich eksperymentach.