Name: Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA za pomocą testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 3 s
Description: Poznaj metodę bezpośredniej obserwacji replikacji DNA za pomocą mikroskopii optycznej szerokopolowej z wykorzystaniem DNA faga lambda. Technika ta umożliwia badanie dynamiki enzymów replikujących w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Opracowanie testu rozciągania DNA odbyło się przy wsparciu Paula Blaineya, Jong-Bonga Lee i Samira Hamdana. Praca ta jest finansowana z grantów National Institutes of Health przyznanych Charlesowi Richardsonowi (GM54397) oraz Antoine van Oijenowi (GM077248).

<ol><li>Lee, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+primase+acts+as+a+molecular+brake+in+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication.</a> Nature. 439, 621-624 (2006).</li>
<li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+Grafted+to+Silicon+Surfaces%3A+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li>
<li>van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+of+lambda+exonuclease+reveal+base+dependence+and+dynamic+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li>
</ol>

Ważne jest, aby upewnić się, że siła oporu wywierana na koraliki przez przepływ laminarny nie wpływa na aktywność enzymatyczną białek replikacyjnych. Na przykład siła 3 pN, odpowiadająca szybkości przepływu 0,012 ml/min, nie wpływa na replikację nici wiodącej DNA. Wpływa ona jednak na aktywności enzymatyczne zachodzące podczas skoordynowanej syntezy DNA, dlatego musi zostać zredukowana do 1,5 pN. Siłę oporu można łatwo kontrolować poprzez zmianę szybkości przepływu lub szerokości kanału przepływowego5.
<p...

<table><tbody><tr><td>DNA bakteriofaga &amp;#955;</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011L</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy DNA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Polinukleotydowa kinaza T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>Fab &amp;alpha;-digoksygeniny</td><td>Roche Group</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>Kulek aktywowane tosylanem</td><td>Invitrogen</td><td>142-03</td><td></td></tr><tr><td>Separator magnetyczny</td><td>Invitrogen</td><td>Dynal MPC</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropylotrietoksysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td>Można stosować inne aminosilany lub mieszać je z silanami niereaktywnymi względem grup aminowych w celu uzyskania rzadszych powierzchni</td></tr><tr><td>PEG z propionianem sukcynimidylowym</td><td>Nektar</td><td></td><td>Podobne PEG-i można nabyć w firmach Nanocs, CreativePEGWorks itp.</td></tr><tr><td>Biotyna-PEG-NHS</td><td>Nektar</td><td></td><td>Podobne PEG-i można nabyć w firmach Nanocs, CreativePEGWorks itp.</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>SA-S-1L</td><td>grubość 100 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>Szkiełko kwarcowe</td><td>Technical Glass</td><td>20 mm (S)x 50 mm (D)x 1mm (W)</td><td>Rozmiar dopasowany do szkiełek nakrywkowych. Wiercić otwory wiertłami z końcówką diamentową (DiamondBurs.net)</td></tr><tr><td>Przewody polietylenowe</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>ID 0,76 mm, OD 1,22&lt;br/&gt;Można zastąpić przewodami o innych rozmiarach.</td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td>Przygotować roztwór 1 mg/mL, alikwoty 25 &amp;#x03BC;L w PBS pH 7,3</td></tr><tr><td>Mieszanina roztworów trifosforanów deoksyrybonukleotydowych</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop optyczny z obiektywem 10X</td><td>Olympus Corporation</td><td>Olympus IX-51</td><td></td></tr><tr><td>Stały magnes ziemi rzadkich</td><td>National Imports</td><td>www.rare-earth-magnets.com</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>QImaging</td><td>Rolera-XR Fast 139</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>11 Plus</td><td>Uruchamiać w trybie dopełniania, aby ułatwić wymianę roztworów</td></tr><tr><td>Iluminator światłowodowy</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>OSL1</td><td></td></tr></tbody></table>

bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących dna z wykorzystaniem testu rozciągania pojedynczej cząsteczki dna

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

Opisujemy metodę obserwacji w czasie rzeczywistym replikacji pojedynczych cząsteczek DNA pośredniczonej przez białka systemu replikacyjnego bakteriofaga. Linearyzowane DNA $\lambda$ zostaje zmodyfikowane w taki sposób, aby na końcu jednej nici znajdowała się biotyna, a na drugim końcu tej samej nici grupa digoksygeniny. Koniec biotylowany zostaje przyłączony do funkcjonalizowanej szkiełka przedmiotowego, a koniec digoksygenylowany do małego koralika. Montaż tych powiązań DNA-koralik na powierzchni komory przepływowej pozwala na zastosowanie przepływu laminarnego w celu wywarcia siły oporu na koralik. W rezultacie DNA zostaje rozciągnięte blisko i równolegle do powierzchni szkiełka pod wpływem siły określonej przez szybkość przepływu (Rycina 1). Długość DNA jest mierzona poprzez monitorowanie pozycji koralika. Różnice w długości między jednoniciowym a dwuniciowym DNA są wykorzystywane do uzyskania informacji w czasie rzeczywistym na temat aktywności białek replikacyjnych w widelcu replikacyjnym. Pomiar pozycji koralika pozwala na precyzyjne określenie szybkości i procesywności rozplatania oraz polimeryzacji DNA (Rycina 2).

Opisujemy metodę obserwacji replikacji pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym, pośredniczonej przez białka systemu replikacyjnego bakteriofaga.

Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA z wykorzystaniem testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA

Opisujemy metodę obserwacji replikacji pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym, przebiegającej przy udziale białek systemu replikacyjnego bakteriofaga. ...

W niniejszym filmie zaprezentowano protokół wizualizacji replikacji DNA za pomocą szerokopolowej mikroskopii optycznej z wykorzystaniem zlinearyzowanego i chemicznie zmodyfikowanego DNA faga lambda. DNA jest przytwierdzone do funkcjonalizowanego szkiełka podstawowego. Wolny koniec DNA jest znakowany koralikiem, a następnie DNA jest rozciągane poprzez przepływ laminarny.W momencie inicjacji replikacji nić prowadząca zaczyna się wydłużać, natomiast nić opóźniona skraca się z powodu zwijania. Duża różnica w długości między dwuniciowym a jednoniciowym DNA przy niskich siłach umożliwia bezpośrednią obserwację konwersji DNA podczas replikacji. Długość konstrukcji DNA jest monitorowana poprzez śledzenie pozycji kuleczki, co pozwala na precyzyjne określenie szybkości i przebiegu replikacji DNA.Witajcie, jestem Ari Ulrich z laboratoriów Anto one Vaniana i Charlesa Richardsona w Katedrze Chemii Biologicznej i Farmakologii Molekularnej na Harvard Medical School. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę obrazowania replikacji DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek. Stosujemy tę procedurę w naszych laboratoriach do badania aktywności enzymatycznych zachodzących podczas syntezy DNA.Zacznijmy zatem. Na

direct-observation-enzymes-replicating-dna-using-single-molecule-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Bezpośrednie obserwowanie enzymów replikujących DNA za pomocą pojedynczego assayu rozciągania DNA

Niniejszy protokół demonstruje prostą technikę mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek służącą do wizualizacji replikacji DNA przez poszczególne replisomy w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja replikacji pojedynczych cząsteczek DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

DT40, modelowy system genetyczny kręgowców, stanowi potężne narzędzie do analizy funkcji białek. Opisujemy tutaj prostą metodę umożliwiającą jakościową analizę parametrów wpływających na syntezę DNA podczas fazy S w komórkach DT40 na poziomie pojedynczych cząsteczek.

Wizualizacja replikacji DNA w kręgowym systemie modelowym DT40 z wykorzystaniem techniki włókien DNA

To badanie przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną do pomiaru dynamiki pętli dwuniciowego DNA za pomocą jednocząsteczkowego transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET). Protokół opisuje również, w jaki sposób wyodrębnić zapętloną gęstość prawdopodobieństwa zwaną współczynnikiem J.

Badanie pętli DNA za pomocą pojedynczej cząsteczki FRET

Ten protokół demonstruje prosty, solidny i wysokoprzepustowy test rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania jednowymiarowej (1D) dyfuzji cząsteczek wzdłuż DNA.

Prosta, solidna i wysokowydajna implementacja testu rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania transportu cząsteczek wzdłuż DNA

Ten protokół opisuje charakterystykę syntezy modyfikowanego DNA przez polimerazę DNA poprzez obserwację zmian w DNA znakowanym fluorescencyjnie w bliskiej podczerwieni za pomocą elektroforezy żelowej i obrazowania żelowego. Żele akrylamidowe są używane do obrazowania w wysokiej rozdzielczości separacji krótkich kwasów nukleinowych, które migrują z różną szybkością w zależności od wielkości.

Test aktywności polimerazy DNA przy użyciu znakowanego fluorescencyjnie DNA w bliskiej podczerwieni wizualizowanego za pomocą elektroforezy w żelu akrylowym

Opisano wysoce równoległą metodę pomiaru specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Protokół ten demonstruje technikę przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej NdeI. Metodę można łatwo zmodyfikować w celu zbadania dowolnego procesu, który prowadzi do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA.

Równoległy, wysokoprzepustowy test kinetyczny pojedynczej cząsteczki do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA

Korzystając z DNA znakowanego kwantowo kropkami i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem, możemy badać mechanizm reakcji endonukleaz restrykcyjnych, używając nieznakowanego białka. Ta technika jednocząsteczkowa pozwala na masowo multipleksowaną obserwację poszczególnych interakcji białko-DNA, a dane mogą być łączone w celu wygenerowania dobrze wypełnionych rozkładów czasu przebywania.

Analiza w czasie przebywania pojedynczej cząsteczki rozszczepienia DNA za pośrednictwem endonukleazy restrykcyjnej

Metodologia pomaga w analizie zmienności dynamiki replikacji DNA w obecności nanocząstek. Można przyjąć różne metodologie w zależności od poziomu cytotoksyczności materiału będącego przedmiotem zainteresowania. Dodatkowo zamieszczono opis analizy obrazu, który ma pomóc w analizie włókien DNA.

Demonstracja testu włókien DNA do badania uszkodzeń DNA i dynamiki naprawy indukowanych przez nanocząstki

Opracowano wzbogacanie i sekwencjonowanie nowogenetycznego DNA (eSPAN) związanego z białkiem, aby wykryć względną obfitość białka związanego z chromatyną na dwóch replikujących się niciach DNA, co ujawniło molekularne wgląd w replikację chromatyny i jej sprzężone procesy. Protokół ten opisuje procedury eSPAN w komórkach macierzystych drożdży i myszy embrionalnych (ES).

Analiza białek specyficznych dla nici łańcuchowej w replikacji nici DNA poprzez wzbogacenie i sekwencjonowanie metody DNA powiązanego z białkiem

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Ten protokół opisuje test replikacji pojedynczej cząsteczki DNA oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym interakcji między polimerazami DNA a przeszkodami, takimi jak struktury G-quadruplex.

Wizualizacja fluorescencji pojedynczej cząsteczki dynamiki polimerazy DNA w G-kwadrupleksach

Poznaj metodę bezpośredniej obserwacji replikacji DNA za pomocą mikroskopii optycznej szerokopolowej z wykorzystaniem DNA faga lambda. Technika ta umożliwia badanie dynamiki enzymów replikujących w czasie rzeczywistym.

Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA z wykorzystaniem testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA

Przeglądaj więcej filmów