Indukcja toksyn i ekstrakcja białek z Fusarium spp. Kultury do badań proteomicznych

Ekstrakcja białek do analiz proteomicznych u gatunków grzybów wymaga wysokiego poziomu standaryzacji, aby można było osiągnąć zgodnie z wytycznymi minimum informacji o eksperymencie proteomicznym (MIAPE). Przedstawiamy protokół wideo, który zawiera procedurę minimalizacji błędu systematycznego podczas indukcji toksyny i ekstrakcji białek z Fusarium spp.

Ten film opisuje procedurę stosowaną do indukowania synezy toksyn u niektórych gatunków, w tym przypadku dla i protokół ekstrakcji całego prote stosowany do badań proteomicznych w naszym laboratorium. Czas trwania zabiegu: 16 dni, cztery dni w przypadku wzrostu grzybów, 10 dni w przypadku synezy toksyn i dwa dni w przypadku ekstrakcji białka. Po czterech dniach kolonie nadal aktywnie rosną w kierunku krawędzi płyty.

Typowa grzybnia powietrzna jest tworzona i zbierana za pomocą ostrza steroidowego pod skrzynką przepływu blaszki poprzez delikatne drapanie powierzchni płytki. Grzybnię kroi się na pięć małych kawałków i dodaje do wczesnej kolby zawierającej 25 mililitrów pożywki indukującej toksyny. Indukcja toksyn jest bardziej wydajna niż ciemny pył.

Kolba pokryta jest aluminium. Kultury są następnie wstrząsane przez 10 dni, 150 rund na minutę w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Pożywka składa się z SAPH i zawiera wysoko skoncentrowany roztwór S rzęd.

Łóżko razem z ciemnością jest znane z tego, że ułatwia syntezę toksyn w ria. Grzybnia jest następnie oddzielana od cieczy zawierającej toksynę poprzez filtrowanie na zamkniętej tkance MI. Ciecz może być używana do pomiaru zawartości toksyn, podczas gdy grzybnia jest używana do ekstrakcji białek.

Aby uniknąć przenoszenia mediów, mój sufit jest myty trzy razy sterylną wodą. Nadmiar wody należy następnie usunąć, podobnie jak ciekły azot, a próbki można przechowywać w temperaturze minus 80 lub wykorzystać do ekstrakcji białek. Procedura ekstrakcji białka opiera się na zastosowaniu SDS i TCA i składa się z różnych etapów lizy.

Zaproponuje metodę, która obejmuje wielu operatorów do przeprowadzenia. W tym samym czasie, gdy ekstrakcja kontrprób biologicznych, każdy z nich przeprowadza inny operator. W procedurze tej uwzględniane są różnice w procedurze ekstrakcji, które mogą być generowane przez różne operatory, które przetwarzają kontrpróby.

W związku z tym powinien on wykazywać większą odporność w przypadku porównywania kontrprób biologicznych, ponieważ zmienna operatorska jest uwzględniona w kontrpróbie. Jednocześnie korzystanie z wielu operatorów skraca czas przetwarzania. Próbka jest mielona w sterylnym moździerzu przy użyciu ciekłego azotu, aż grzybnia stanie się drobnym proszkiem.

Ten etap ma kluczowe znaczenie dla jakości i ilości białek. Grzybnia jest zbierana w 10 mili probówkach teflonowych w proporcji czterech dziesiątych całkowitej objętości probówek. Następnie dodaje się bufor do lizy zawierający SDS i różne inhibitory proteazy.

Probówki są następnie wstrząsane aż do uzyskania jednorodnego roztworu. Następnie próbki wstrząsa się przez 30 minut w komorze kodowej w celu dalszej homogenizacji, próbki gotuje się w celu rozpuszczenia ścian komórkowych i białek hydrofobowych. Obecność SDS zapobiega tworzeniu się oligomerów, które przerywają wytrącanie się białek.

Etap wirowania rozdziela trzy fazy. Białka są zawieszone w przezroczystym roztworze, który zbiera się w nowej probówce trzymanej na lodzie. Paleta jest następnie używana do wykonania drugiego etapu, powtarzającego wirowanie, gotowanie i wirowanie.

Snat z dwóch liz łączy się w celu przeprowadzenia wytrącania z wytrącaniem lodowcowym, buforem zawierającym ton kwasowy, kwasem trójkwasowym i DTT. Próbki są następnie przechowywane przez noc przez 16 godzin w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby umożliwić białko. Białka wytrącające znajdują się na dnie rurek, aby poprawić wytrącanie.

Probówki odwirowuje się na wysokich obrotach przez 45 minut. Podniebienie jest teraz dobrze widoczne. Supernatanty można wyrzucić za pomocą pięciomililitrowej podkładki do rury.

TCA jest następnie usuwany przez dodanie 25 mililitrów buforu do płukania lodowca zawierającego aceton i naziemną rejestrację informacji cyfrowych. Następnie jest dokładnie i energicznie wstrząsany. Następnie wykonywany jest nowy etap wirowania.

Podniebienie białkowe unosi się teraz w powietrzu, więc należy zwrócić uwagę na napięcie, aby wyeliminować snat. Wykonywany jest drugi etap mycia, dodając mycie, bufor, wstrząsanie i odwirowywanie. Środek SUP jest eliminowany, a próbka jest suszona za pomocą worka speedbag.

Gdy próbka jest sucha, białko ma konsystencję przypominającą proszek. Przechowywać. Próbka białka powinna zostać pobrana z probówki, aby zmniejszyć zakłócenia elektrostatyczne tworzywa sztucznego.

Używany jest pistolet elektrostatyczny, a proszek białkowy zbiera się za pomocą metalowej szpatułki. Białka są następnie zawieszane bezpośrednio w buforze znakującym. Używany do kreski 2D 30 minut z prędkością 800 gramów na minutę.

Wystarczy do solubilizacji. Białko przed przystąpieniem do kosztownego znakowania kreską 2D. Jakość białka jest testowana na stronie SDS jednowymiarowy żel, jak widać.

Brak znacznych smug na krawędzi pasa ruchu sugeruje dobrą jakość próbki.