Name: Indukcja toksyn i ekstrakcja białek z Fusarium spp. Kultury do badań proteomicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-16T15:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj protokół indukcji toksyn i ekstrakcji białek z Fusarium spp. dla badań proteomicznych. Metoda zgodna z wytycznymi MIAPE zapewnia wysoką powtarzalność i jakość próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Servane Contal i Borisowi Untereinerowi za wkład techniczny. Przyznajemy, że wsparcie zapewnił projekt FNR „FUTOX”.

Protokół wymaga 16 dni do jego ukończenia. Harmonogram przedstawiono szczegółowo na rysunku 1.
Szczegóły przygotowania buforu
<ul>
 <li>Przygotowanie buforu do lizy (3mL na próbkę).</li>
 <li>Przygotowanie buforu do płukania (50mL na próbkę). Bufor ten należy uprzednio schłodzić i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20°C do momentu analizy, a w trakcie całej procedury utrzymywać na lodzie.</li>
 <li>Przygotowanie buforu do precypitacji (20mL na próbkę). Bufor ten należy uprzednio schłodzić i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20°C do momentu użycia, a w trakcie całej procedury utrzymywać na lodzie.</li>
 <li>Prace powinny być prowadzone preferencyjnie w komorze chłodniczej w temperaturze 4°C.</li>
</ul>
Gatunki grzybów
Trzy szczepy wykorzystane do analiz proteomicznych sklasyfikowano jako Fusarium graminearum na podstawie ich cech morfologicznych oraz analizy czynnika elongacji translacji alfa-1 (O'Donnell et al., 198)
Szczepy te pochodziły z kolekcji CRP-Gabriel Lippmann i były przechowywane w temperaturze - 80°C w 15% glicerolu.
Przygotowanie grzybni
Grzyby hodowano na podłożu V8 przez 4 dni w temperaturze 25°C, z cyklem 12-godzinnych okresów światła i ciemności. Kultury pofragmentowano za pomocą sterylnego ostrza, a następnie fragmenty tych kultur wykorzystano do zaszczepienia kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierających 10 mL pożywki indukującej produkcję toksyn. Grzybnię zebrać po 10 dniach, oddzielając ją od pożywki poprzez przefiltrowanie kultury za pomocą sterylnego filtra. Grzybnię przemyto 3 razy sterylną wodą w celu usunięcia pozostałości pożywki oraz innych związków. Następnie komórki bezzwłocznie zamrożono poprzez dodanie ciekłego azotu i przechowywano próbki w temperaturze -80°C.
Ogólny opis ekstrakcji białek
Próbki białek wyekstrahowano metodą opisaną na rysunkach 3A i 3B. Próbki Fusarium utarto w ciekłym azocie, a proszek zebrano do teflonowych probówek o pojemności 10 ml. Następnie próbki inkubowano przez 30 minut z buforem do lizy, gotowano przez 10 minut i odwirowano dwukrotnie w temperaturze pokojowej (120g przez 15 minut). Nadlodówki zebrano i inkubowano przez noc w temperaturze -20 °C z buforem do wytrącania. Po wirowaniu przy 4°C i 30g przez 45 minut osady wytrąconych białek przemyto 3 razy zimnym acetonem zawierającym DTT. Na koniec osady wysuszono na powietrzu, a białka rozpuszczono ponownie w buforze do znakowania, dostosowując pH do 8. Pobrano podpróbkę o objętości 30 ml do ilościowego oznaczenia całkowitego białka, a pozostałą nadlodówkę przechowywano w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia elektroforezy białek.
<img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig1.jpg" alt="Schemat ram czasowych protokołu: wzrost szczepu V8 na płytce, wzrost w pożywce z toksyną, harmonogram ekstrakcji białek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rysunek 1. Harmonogram procedury.
<img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig2.jpg" alt="schemat macierzy procedur dla wielu operatorów dla powtórzeń biologicznych z uwzględnieniem szczepów i operatorów" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Schemat przetwarzania próbek przez wielu operatorów.
<img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3atmb.jpg" alt="Schemat blokowy ekstrakcji białek z Fusarium spp.; wirowanie; etapy buforu lizującego i wytrącania." border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3a"> Rysunek 3a. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3btmb.jpg" alt="Schemat procesu wirowania, etapy przemywania buforem, suszenie osadu, resuspensja, przechowywanie w -20°C." border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3b"> Rycina 3b. Proszę <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1690/1690fig3a.jpg">kliknij tutaj</a> aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 3a, lub <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1690/1690fig3b.jpg">Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</a> w celu uzyskania powiększonej wersji rysunku 3b. 
Rysunki 3a-b. Schematy blokowe procedury ekstrakcji białek (A: pierwszy dzień; B: drugi dzień).
<img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig4tmb.jpg" alt="Schemat żelu elektroforetycznego; proces rozdziału DNA; prążki wskazujące masę cząsteczkową." border="0" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> Rysunek 4. Obraz 1D ekstraktów białkowych. Białka były prowadzone aż do pełnej migracji barwnika niebieskiego do końca żelu, który następnie zbarwiono barwnikiem Lava Purple. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1690/1690fig4.jpg">kliknij tutaj</a> aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 4.

<ol><li>Bridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Extraction+from+Fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Purification+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protein Extraction from Fungi.</a> Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).</li>
<li>Jiao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+carbon+sources+on+trichothecene+production+and+Tri+gene+expression+by+Fusarium+graminearum+in+liquid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture.</a> FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).</li>
<li>Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Proteomics of filamentous fungi.</a> Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).</li>
<li>Milles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+proteomic+approach+to+monitor+protein+synthesis+in+mycotoxin+producing+moulds%5BTitle%5D)+AND+%22Mycotoxin+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds.</a> Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).</li>
<li>Morrison, N., Field, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concept+of+sample+in+OMICS+technology%5BTitle%5D)+AND+%22OMICS%22%5BJournal%5D)">Concept of sample in OMICS technology.</a> OMICS. 10, 127-137 (2006).</li>
<li>O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+evolutionary+origins+of+the+fungus+causing+Panama+disease+of+banana%3A+Concordant+evidence+from+nuclear+and+mitochondrial+gene+genealogies%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies.</a> PNAS. 95, 2044-2049 (1998).</li>
<li>Paper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+of+extracellular+proteins+in+vitro+and+in+planta+from+the+pathogenic+fungus+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum.</a> Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).</li>
<li>Pasquali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+in+science.+Protocol+videos%3A+the+implications+for+research+and+society%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Video in science. Protocol videos: the implications for research and society.</a> EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).</li>
<li>Taylor, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+about+a+proteomics+experiment+%28MIAPE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE).</a> Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).</li>
<li>Taylor, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analyses+of+Fusarium+graminearum+grown+under+mycotoxin-inducing+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions.</a> Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).</li>
</ol>

Niedawne zainteresowanie podejściami proteomicznymi w dziedzinie biologii grzybów doprowadziło do zwiększenia liczby publikacji wykorzystujących tę technikę (zgodnie z przeglądem w Kim et al., 2007). Metody ekstrakcji białek opierają się na kombinacji procedur ekstrakcyjnych; są one często słabo opisane w sekcjach metodologicznych i wymagają doświadczenia w zakresie potencjalnych metod rozwiązywania problemów.
Podobnie jak w przypadku innych podejść typu „omika”, ustanowienie standardów przetwarzania próbek i danych jest niezbędne w celu wygenerowania wiarygodnych informacji naukowych. Ponadto próbki oraz procedury manipulacji powinny być odpowiednio opisane, aby umożliwić wspólną interpretację wyników pomiędzy różnymi eksperymentami „omicznymi”. Byłoby to kluczowe dla pełnego wykorzystania potencjału cross-data mining w genomice, proteomice, metabolomice itd. (Morrison et al., 2006). Opracowano minimalny zestaw informacji na temat eksperymentu proteomicznego (MIAPE) i powołano grupy robocze w celu omówienia wszystkich aspektów eksperymentu (elektroforeza w żelu, spektrometria mas, oddziaływania molekularne, modyfikacje białek, informatyka proteomiczna, przygotowanie próbek). Obecnie nie dostępne są żadne zdefiniowane informacje na temat procedur przygotowania próbek. Biorąc pod uwagę znaczenie procedur ekstrakcji białek w określaniu końcowej jakości badań proteomicznych, w celu wdrożenia procedur mogących zwiększyć standaryzację w ramach wytycznych MIAPE (Taylor et al., 2007), zaproponowaliśmy zastosowanie protokołu wideo szczegółowo opisującego przygotowanie próbek. Opis eksperymentów w formie wideo może w znacznym stopniu przyczynić się do zwiększenia ilości informacji o przygotowaniu próbek, co może przełożyć się na lepszą powtarzalność eksperymentów „omicznych” (Pasquali, 2007).
W rzeczywistości powtarzalność międzylaboratoryjna jest fundamentalnym wymogiem w celu zagwarantowania ważności wyników proteomicznych (http://www.fixingproteomics.org). Na powtarzalność międzylaboratoryjną wpływają dwa czynniki: różnice w instrumentacji oraz różni operatorzy manipulujący próbkami.
W opisanym protokole proponujemy przeprowadzenie replikatów biologicznych z udziałem wielu operatorów (Ryc. 2 i wideo) w celu zwiększenia niezawodności danych (tj. uwzględnienia technicznej zmienności wyników).
Opisana procedura ekstrakcji białek opiera się na zastosowaniu SDS i ogrzewaniu. Wykazano wcześniej, że metoda ta gwarantuje wysoką czystość i ilość uzyskiwanych białek (Bridge 1996). SDS w połączeniu z gotowaniem rozpuszcza ściany komórkowe, białka hydrofobowe oraz zapobiega tworzeniu się oligomerów, które mogą utrudniać wytrącanie białek. Gotowanie umożliwia również inaktywację proteaz. Podobny efekt wywołują EDTA, PMSF oraz kompletny mini inhibitor proteaz. DTT usuwa mostki dwusiarczkowe wewnątrz i pomiędzy białkami, co ułatwia ich solubilizację.
W celu usunięcia SDS przed IEF białka są wytrącane za pomocą acetonu/TCA/DTT. Co więcej, wytrącanie acetonem/TCA/DTT pozwala na usunięcie niektórych zanieczyszczeń, takich jak lipidy, kwasy nukleinowe, sole lub/i związki fenolowe, jeśli są one obecne. Podobnie jak SDS, cząsteczki te utrudniają prawidłową migrację podczas IEF. Po tym wytrącaniu konieczne jest przemycie wytrąconych białek acetonem/DTT w celu usunięcia TCA, ponieważ może on zakłócać przebieg IEF.
Prawidłowe przygotowanie próbki jest kluczem do uzyskania dobrych wyników. W tym celu niezbędne jest unikanie kontaminacji białek z otoczenia poprzez pracę w rękawiczkach bezpudrowych oraz przestrzeganie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. Z technicznego punktu widzenia, w ramach opisanego protokołu, najbardziej krytycznymi etapami pozwalającymi na uzyskanie odpowiedniej ilości i czystości białek są dwie fazy. Pierwszą jest faza rozcierania, w której kluczowe dla uwolnienia białek jest całkowite zniszczenie komórki; drugą zaś oczyszczanie białek całkowitych, obejmujące usunięcie większości lipidów, DNA i innych zanieczyszczeń, które mogłyby zakłócać migrację białek.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Pożywki i roztwory&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Nie podano tekstu źródłowego do przetłumaczenia w sekcji „Source text”. Proszę o dostarczenie treści, którą należy przełożyć na język polski.&quot;&gt;&lt;u&gt;PDA&lt;/u&gt;: 39 g agaru ziemniaczano-dekstrozowego (Difco); 1 L wody destylowanej.&lt;br/&gt;&lt;u&gt;agar V8&lt;/u&gt;: 200 ml V8 (campbell&amp;rsquo;USA), 2 g CaCO3 (Sigma), 16 g agaru (DIFCO), 800 ml wody destylowanej&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;Protokół wymaga 16 dni na jego ukończenie. Harmonogram szczegółowo przedstawiono na rysunku 1. Szczegóły przygotowania buforów: Przygotowanie buforu do lizy (3 ml na próbkę). Przygotowanie buforu do przemywania (50 ml na próbkę). Bufor ten należy schłodzić i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20°C do czasu dalszej analizy oraz utrzymywać w lodzie przez cały czas trwania procedury. Przygotowanie buforu do precypitacji (20 ml na próbkę). Bufor ten należy schłodzić i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20°C do momentu użycia oraz utrzymywać w lodzie przez cały czas trwania procedury. Prace powinny być preferencyjnie prowadzone w komorze chłodniczej w temperaturze 4°C. Gatunki grzybów: Trzy szczepy wykorzystane do analiz proteomicznych zostały sklasyfikowane jako Fusarium graminearum na podstawie ich cech morfologicznych oraz analizy czynnika elongacji translacji alfa-1 (Translation-Elongation factor Alpha-1) (O'Donnell et al., 1998). Szczepy te pochodziły z kolekcji CRP-Gabriel Lippmann i były utrzymywane oraz przechowywane w temperaturze -80°C w 15% glicerolu. Przygotowanie grzybni: Grzyby hodowano na pożywce V8 przez 4 dni w temperaturze 25°C przy naprzemiennym cyklu światła i ciemności co 12 godzin. Kultury pofragmentowano za pomocą sterylnego ostrza, a fragmenty tych kultur wykorzystano do zaszczepienia kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierających 100 ml pożywki indukującej produkcję toksyn. Grzybnię zebrano po 10 dniach i oddzielono od pożywki poprzez filtrowanie kultury za pomocą sterylnego filtra. Grzybnię przemyto 3 razy sterylną wodą w celu usunięcia pozostałości pożywki i innych związków. Następnie natychmiast zamrożono komórki, dodając ciekły azot, a próbki przechowywano w temperaturze -80°C. Ogólny opis ekstrakcji białek: Próbki białek ekstrahowano metodą opisaną na rysunkach 3A i 3B. Próbki Fusarium rozcierano w ciekłym azocie, a proszek zbierano do teflonowych probówek o pojemności 10 ml. Próbki inkubowano następnie przez 30 minut z buforem do lizy, gotowano przez 10 minut i wirowano 2 razy w temperaturze pokojowej (12000 g przez 15 minut). Zebrane nadnadfiltraty inkubowano przez noc w temperaturze -20°C z buforem do precypitacji. Po wirowaniu w temperaturze 4°C przy 30000 g przez 45 minut, osady zprecypitowanych białek przemyto 3 razy zimnym acetonem zawierającym DTT. Na koniec osady wysuszono na powietrzu, a białka rozpuszczono ponownie w buforze do znakowania, dostosowując pH do 8. Pobrano subpróbkę o objętości 30 ml do ilościowego oznaczenia całkowitego białka, a pozostały nadnadfiltrat przechowywano w temperaturze -20°C do czasu elektroforezy białek. Rysunek 1. Harmonogram procedury. Rysunek 2. Schemat przetwarzania próbek dla wielu operatorów. Rysunek 3a. Rysunek 3b. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 3a lub tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 3b. Rysunki 3a-b. Schematy blokowe procedury ekstrakcji białek (A: pierwszy dzień; B: drugi dzień). Rysunek 4. Obraz 1D ekstraktów białkowych. Białka rozdzielano do momentu pełnej migracji barwnika niebieskiego do końców żelu, który zabarwiono barwnikiem Lava Purple. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 4.&quot;&gt;&lt;u&gt;Pośrodki indukujące produkcję toksyn&lt;/u&gt;: 1 g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0,5 g KCl, 0,5 g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 10 mg FeEDTA, 2 g kwasu L-glutaminowego, 10 g sacharozy w 1 l wody destylowanej.&lt;/p&gt;&lt;p&gt;&lt;u&gt;Bufor lizy&lt;/u&gt;:&lt;/p&gt;&lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt;&lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;100 ml&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Stężenie końcowe &lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Tris-HCl pH 8&lt;/td&gt; &lt;td&gt;5 ml&lt;/td&gt; &lt;td&gt;50 mM &lt;/td&gt; &lt;td&gt;1 M&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;SDS&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2 g lub 10 ml&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2%&lt;/td&gt; &lt;td&gt;20%&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;DTT&lt;/td&gt; &lt;td&gt;500 ml&lt;/td&gt; &lt;td&gt;10 mM&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2 M&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;EDTA&lt;/td&gt; &lt;td&gt;20 ml&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0,1 mM&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0,5 M&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;PMSF&lt;/td&gt; &lt;td&gt;200 ml&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Kompletny mini inhibitor proteaz&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1 tabletka&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Woda&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Qsp&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt;&lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p&gt;&lt;u&gt;Bufor do wytrącania&lt;/u&gt;:&lt;/p&gt;&lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt;&lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;100 ml&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Stężenie końcowe&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;TCA &lt;/td&gt; &lt;td&gt;20 ml&lt;/td&gt; &lt;td&gt;20%&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;DTT &lt;/td&gt; &lt;td&gt;0,1 ml&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.1%&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Aceton&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Qsp&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt;&lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p&gt;&lt;u&gt;Bufor płuczący:&lt;/u&gt;&lt;/p&gt;&lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt;&lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;100 ml&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Stężenie końcowe&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;DTT &lt;/td&gt; &lt;td&gt;0,1 ml&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.1%&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Aceton&lt;/td&gt; &lt;td&gt;100 ml&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt;&lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p&gt;&lt;u&gt;Bufor do znakowania (przechowywać w -18&amp;#x00B0;C w małych alikwotach):&lt;/u&gt;&lt;/p&gt;&lt;tabela obramowanie=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt;&lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1 ml&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Stężenie końcowe &lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Mocznik &lt;/td&gt; &lt;td&gt;140 mg&lt;/td&gt; &lt;td&gt;7M &lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Tiochniklista &lt;/td&gt; &lt;td&gt;50 mg&lt;/td&gt; &lt;td&gt;2 M &lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;CHAPS&lt;/td&gt; &lt;td&gt;40 mg&lt;/td&gt; &lt;td&gt;4% &lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Tris&lt;/td&gt; &lt;td&gt;30 &amp;#x03BC;L&lt;/td&gt; &lt;td&gt;30 mM &lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;Woda&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1 mL&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt;&lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;</td></tr></tbody></table>

indukcja toksyn i ekstrakcja białek z kultur fusarium spp. do badań proteomicznych

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria to grzyby nitkowate zdolne do produkcji różnych toksyn. Mikotoksyny Fusarium, takie jak deoksyniwalenol, niwalenol, T2, zearalenon, kwas fusarowy, moniliformina itd., wywierają niekorzystny wpływ na zdrowie ludzi i zwierząt, a niektóre z nich są uznawane za czynniki patogenności. Badania proteomiczne okazały się skuteczne w rozszyfrowywaniu mechanizmów produkcji toksyn (Taylor et al., 2008), a także w identyfikacji potencjalnych czynników patogennych (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) u Fusaria. Dlatego podstawowe staje się opracowanie wiarygodnych metod porównywania badań proteomicznych, aby można było polegać na rzeczywistych różnicach w ekspresji białek stwierdzonych pomiędzy eksperymentami, szczepami i laboratoriami. Opisywana procedura powinna przyczynić się do zwiększenia stopnia standaryzacji procedur proteomicznych na dwa sposoby. Nagrany protokół służy do zwiększenia poziomu szczegółów, które mogą zostać precyzyjnie opisane. Ponadto dostępność ustandaryzowanych procedur przetwarzania powtórzeń biologicznych powinna zagwarantować większą odporność danych, uwzględniając również czynnik ludzki w ramach powtarzalności technicznej procedury ekstrakcji.
Opisany protokół wymaga 16 dni na jego ukończenie: czternastu dni na hodowle oraz dwóch dni na ekstrakcję białek (rycina 1).
Krótko mówiąc, szczepy Fusarium hoduje się na podłożach stałych przez 4 dni; następnie są one ręcznie fragmentowane i przenoszone do zmodyfikowanego podłoża indukującego produkcję toksyn (Jiao et al., 2008) na 10 dni. Grzybnię zbiera się poprzez filtrację przez warstwę Miracloth. Rozcieranie przeprowadza się w komorze chłodniczej. Różni operatorzy przeprowadzili powtórzenia ekstrakcji (n=3), aby uwzględnić błędy wynikające z wariacji technicznych (rycina 2). Ekstrakcję oparto na buforze SDS/DTT zgodnie z opisem w Taylor et al. (2008) z niewielkimi modyfikacjami. Ekstrakcja białek całkowitych wymagała procesu wytrącania białek przy użyciu buforu Aceton/TCA/DTT przez noc oraz przemywania Acetonem/DTT (rycina 3a, 3b). Białka zostały ostatecznie ponownie rozpuszczone w buforze do znakowania białek i poddane kwantyfikacji. Wyniki ekstrakcji zwizualizowano na żelu 1D (rycina 4, SDS-PAGE) przed przejściem do żeli 2D (IEF/SDS-PAGE). Tę samą procedurę można zastosować do analiz proteomicznych na innych podłożach wzrostowych i u innych grzybów nitkowatych (Miles et al., 2007).

Ekstrakcja białek do analiz proteomicznych u gatunków grzybów wymaga wysokiego poziomu standaryzacji, aby została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi dotyczącymi minimalnych informacji o eksperymencie proteomicznym (MIAPE). Przedstawiamy protokół wideo, który obejmuje procedurę minimalizacji błędów doświadczalnych podczas indukcji toksyn i ekstrakcji białek z Fusarium spp.

Indukcja toksyn i ekstrakcja białek z kultur Fusarium spp. do badań proteomicznych

Grzyby z rodzaju *Fusarium* są grzybami nitkowatymi zdolnymi do produkcji różnych toksyn. Mikotoksyny *Fusarium*, takie jak deoksyniwalenol, niwalenol, T2, zearalenon, kwas fusarowy, ...

W niniejszym filmie opisano procedurę służącą do indukcji syntezy toksyn u niektórych gatunków, w tym przypadku dla Fusarium, oraz protokół ekstrakcji białek całkowitych wykorzystywany do badań proteomicznych w naszym laboratorium. Czas trwania procedury wynosi 16 dni: cztery dni na wzrost grzybów, 10 dni na syntezę toksyn oraz dwa dni na ekstrakcję białek. Po czterech dniach kolonie wciąż aktywnie rosną w kierunku krawędzi płytki.Typowa grzybnia powietrzna jest formowana i zbierana za pomocą sterylnego ostrza w laminarnym przepływie powietrza poprzez delikatne zeskrobanie powierzchni płytki. Grzybnię tnie się na pięć małych kawałków i dodaje do kolby Erlenmeyera zawierającej 25 ml pożywki indukującej produkcję toksyn. Indukcja toksyn jest bardziej wydajna w ciemności.Kolba zostaje owinięta folią aluminiową. Następnie kultury są inkubowane przez 10 dni przy wytrząsaniu z prędkością 150 obr./min w temperaturze 25 °C. Pożywka to SAPH zawierająca wysokostężony roztwór S.Wiadomo, że ciemność w połączeniu z odpowiednimi warunkami sprzyja syntezie toksyn w grzybach. Grzybnię oddziela się następnie od zawierającej toksyny cieczy poprzez filtrowanie na gęstej tkaninie. Ciecz może zostać wykorzystana do pomiaru zawartości toksyn, natomiast grzybnię wykorzystuje się do ekstrakcji białek.Aby uniknąć zanieczyszczeń z pożywki, grzybnię przemywa się trzykrotnie sterylną wodą. Następnie należy usunąć nadmiar wody, po czym dodaje się ciekły azot; próbki można przechowywać w temperaturze -80°C lub wykorzystać do ekstrakcji białek. Procedura ekstrakcji białek opiera się na zastosowaniu SDS oraz TCA i składa się z kilku etapów lizy.Zaproponowana zostanie metoda obejmująca pracę wielu operatorów. W czasie ekstrakcji replikatów biologicznych każdy z nich jest przygotowywany przez innego operatora. Procedura ta uwzględnia różnice w procesie ekstrakcji, które mogą wynikać z pracy różnych operatorów przetwarzających replikaty.Powinno to zatem wykazywać większą odporność podczas porównywania powtórzeń biologicznych, ponieważ zmienna związana z operatorem jest uwzględniona w powtórzeniu. Jednocześnie zaangażowanie wielu operatorów skraca czas przetwarzania. Próbkę uciera się w sterylnym moździerzu z użyciem ciekłego azotu, aż grzybnia stanie się drobnym proszkiem.Ten etap jest kluczowy dla jakości i ilości białek. Grzybnię zbiera się do 10 mililitrowych probówek teflonowych w proporcji czterech dziesiątych całkowitej objętości probówek. Następnie dodaje się bufor lizujący zawierający SDS oraz różne inhibitory proteaz.Następnie probówki wstrząsa się do uzyskania jednorodnego roztworu. Potem próbki wstrząsa się przez 30 minut w komorze chłodniczej w celu ich dalszej homogenizacji; próbki gotuje się, aby rozpuścić ściany komórkowe i białka hydrofobowe. Obecność SDS zapobiega tworzeniu się oligomerów, które hamują precypitację białek.Etap wirowania rozdziela próbkę na trzy fazy. Białka pozostają w zawiesinie w przezroczystym roztworze, który należy zebrać do nowej probówki przechowywanej w lodzie. Osad jest następnie wykorzystywany do przeprowadzenia drugiego etapu lizy, z powtórzeniem mieszania w vortexie, gotowania i wirowania.Próbki z dwóch etapów lizy są łączone w celu przeprowadzenia wytrącania za pomocą buforu wytrącającego zawierającego kwas trichloroaktylowy i DTT. Następnie próbki przechowuje się przez noc (16 godzin) w temperaturze -20°C, aby umożliwić wytrącanie białek. Białka osadzają się na dnie probówek, co usprawnia proces wytrącania.Probówki są wirowane z wysoką prędkością przez 45 minut. Osad jest teraz dobrze widoczny. Nadnadciecze można usunąć za pomocą pipety o pojemności 5 ml.Następnie TCA jest usuwany poprzez dodanie 25 ml lodowatego buforu piorącego zawierającego aceton i DTT. Próbkę należy następnie dokładnie i energicznie wymieszać. Następnie przeprowadza się kolejny etap wirowania.Osad białkowy unosi się teraz, dlatego należy zwrócić uwagę na usunięcie naddatku. Wykonuje się drugi etap przemywania poprzez dodanie buforu piorącego, mieszanie i wirowanie. Odcisk nadpływu zostaje usunięty, a próbkę suszy się za pomocą wirówki próżniowej.Po wyschnięciu próbki białko ma konsystencję proszku. Do przechowywania: białko z próbki należy zebrać z probówki, aby zminimalizować zakłócenia elektrostatyczne wywołane przez plastik.Użyto pistoletu elektrostatycznego, a proszek białkowy zebrano za pomocą metalnej szpatułki. Białka ponownie zawieszono bezpośrednio w buforze do znakowania. Wykorzystano do 2D przez 30 minut przy 800 g/min.Wystarczy do solubilizacji białek przed przejściem do kosztownego znakowania 2D. Jakość białka testuje się na jednowymiarowym żelu SDS-PAGE, co przedstawiono na rycinie.Brak istotnych smug na krawędzi ścieżki sugeruje dobrą jakość próbki.

toxin-induction-protein-extraction-from-fusarium-spp-cultures-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Indukcja toksyn i ekstrakcja białka z kultur Fusarium spp. do badań proteomicznych

Do badania procesów rozwojowych z askospory w Gibberella zeae, procedury zbierania w sterylnych warunkach jest filmowany w celu wygenerowania najwyższy poziom informacji dla opisu protokołu. Powinno to ułatwić powtarzalność eksperymentu, kluczowym aspektem, gdy pełne testy ekspresji genomu profil są realizowane.

Gibberella zeae Produkcja Ascospore i Kolekcja dla Eksperymenty mikromacierzy.

Szkodliwość grzybów infekujących nasiona w uprawach zbóż skłoniła do licznych wysiłków badawczych mających na celu lepsze zrozumienie interakcji między rośliną a patogenem. Aby badać interakcje nasion z grzybami w warunkach laboratoryjnych, opracowaliśmy niezawodną metodę ilościowego określania reprodukcji grzybów, biomasy oraz skażenia mikotoksynami przy użyciu bioassayów na ziarnach.

Ilościowe określanie kolonizacji grzybowej, sporogenezy i produkcji mikotoksyn z wykorzystaniem biotestów na ziarnach kukurydzy

Członkowie rodzaju Burkholderia są patogenami o znaczeniu klinicznym.  Opisujemy metodę całkowitej ekstrakcji białek bakteryjnych, wykorzystującą mechaniczne rozerwanie i elektroforezę żelową 2D do późniejszej analizy proteomicznej.

Metody ekstrakcji białka całkowitego i elektroforezy żelowej 2D dla gatunków Burkholderia

Pokazujemy metodę analizy aflatoksyn i ekspresji transgenów w nasionach orzeszków ziemnych, które zawierają sygnały interferencji RNA do wyciszania genów syntezy aflatoksyn u grzyba Aspergillus flavus. Kontrola mikotoksyn w roślinach za pośrednictwem RNAi nie została wcześniej zgłoszona.

Kontrola aflatoksyn w orzeszkach ziemnych za pośrednictwem RNAi: metoda analizy produkcji mikotoksyn i ekspresji transgenów w patosystemie orzeszków ziemnych/aspergillus

Tutaj prezentujemy protokół do analizy wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w ziarnach kukurydzy wyrażających białko przeciwgrzybicze. Używając szczepu A. flavus wykazującego ekspresję GFP, monitorowaliśmy infekcję i rozprzestrzenianie się grzyba w dojrzałych ziarnikach w czasie rzeczywistym. Test jest szybki, wiarygodny i powtarzalny.

Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L.

Celem tego protokołu jest wykrycie różnych toksnotypów Clostridium perfringens w lokalnie zakupionej żywności, szczególnie w przypadku szczepów B i D wytwarzających toksynę epsilon, bez użycia komór beztlenowych.

Wzbogacanie i wykrywanie toksyn Clostridium perfringens w detalicznych próbkach żywności

Tutaj prezentujemy protokół do profilowania interakcji między gospodarzem a patogenem podczas infekcji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas. Protokół ten wykorzystuje kwantyfikację bez znaczników do pomiaru zmian w obfitości białek zarówno gospodarza (np. Makrofagi), jak i patogenu (np. Cryptococcus neoformans) w jednym eksperymencie.

Bezznacznikowy przepływ pracy proteomiki ilościowej dla interakcji gospodarz-patogen opartych na odkryciach

Tutaj prezentujemy protokół szybkiej identyfikacji białek wytwarzanych przez genomowo sekwencjonowane bakterie chorobotwórcze za pomocą tandemowej spektrometrii mas MALDI-TOF-TOF i odgórnej analizy proteomicznej za pomocą oprogramowania opracowanego przez nas. Metastabilne jony białkowe fragmentują się ze względu na działanie kwasu asparaginowego i ta specyficzność jest wykorzystywana do identyfikacji białek.

Identyfikacja białek odporności przeciwbakteryjnej w Escherichia coli za pomocą MALDI-TOF-TOF-MS/MS i odgórnej analizy proteomicznej

Tutaj prezentujemy protokół oparty na systemie przynęty na mącznika mącznika (Tenebrio molitor), który był używany do izolowania i selekcji grzybów entomopatogenicznych (EPF) z próbek gleby. Skuteczna formuła liczby konidiów (ECN) jest stosowana do wyboru EPF o wysokiej tolerancji na stres w oparciu o cechy fizjologiczne do zwalczania mikrobiologicznego szkodników na polu.

Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

Entomopatogeniczne kolonie grzybów są izolowane z próbek gleby tropikalnej za pomocą przynęty Tenebrio, przynęty Galleria, a także selektywnego sztucznego podłoża, tj. agaru z dekstrozą ziemniaczaną wzbogaconego ekstraktem drożdżowym uzupełnionym chloramfenikolem, tiabendazolem i cykloheksymidem (pożywka CTC).

Porównanie metod izolowania grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby

Obecny artykuł ma na celu dostarczenie szczegółowych i adekwatnych protokołów do izolacji grzybów endofitycznych związanych z roślinami, długoterminowego przechowywania izolatów, charakterystyki morfologicznej i całkowitej ekstrakcji DNA w celu późniejszej identyfikacji molekularnej i analiz metagenomicznych.

Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

Poznaj protokół indukcji toksyn i ekstrakcji białek z Fusarium spp. dla badań proteomicznych. Metoda zgodna z wytycznymi MIAPE zapewnia wysoką powtarzalność i jakość próbek.

Indukcja toksyn i ekstrakcja białek z kultur Fusarium spp. do badań proteomicznych

Przeglądaj więcej filmów