Pomiar natlenienia krwi mózgowej w oparciu o zależne od tlenu wygaszanie fosforescencji
May 4th, 2011
Przedstawiamy eksperymentalną procedurę pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu (pO2) w unaczynieniu mózgu opartą na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji. Przedstawiono procedury przygotowania i obrazowania zwierząt zarówno dla obrazowania pO2 opartego na CCD o dużym polu widzenia u szczurów, jak i obrazowania pO2 opartego na wzbudzeniu 2-fotonowym u myszy.
Cześć, nazywam się Sava Saje i pracuję w Laboratorium Obrazowania Migracji Zdjęć Davida Bo w Martino Center for Biomedical Imaging w Massachusetts General Hospital. Jestem szefem z Laboratorium Davida Bowa i pochodzę z tego samego laboratorium. Dzisiaj pokażemy Wam dwie procedury pomiaru napięcia tlenu w mikrokrążeniu korowym u małych gryzoni oparte na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji.
Używamy tych technik w naszym laboratorium do badania dostarczania i zużycia tlenu w normalnych i patologicznych warunkach mózgu. Więc zacznijmy. Najpierw przygotuj kilka kawałków szkiełek nakrywkowych otoczonych optycznie chłonnymi maskami wykonanymi z czarnej taśmy elektrycznej.
Maski powinny mieć otwory o średnicy około 3,5 milimetra. Te szkiełka nakrywkowe służą do uszczelniania okien czaszki, podczas gdy maska absorpcyjna blokuje sygnał fosforyzujący z dowolnego barwnika, który wyciekł z krawędzi okien czaszki. Teraz przygotuj uszczelnione okno czaszki na kości kostnej.
Szczegóły dotyczące preparatu można znaleźć w pracach Kleinfelda i wsp. oraz Masiniego i wsp., do których odwołuje się niniejsza publikacja. W tym preparacie usuwa się materię opony twardej. Upewnij się, że maska zakrywa wszystkie krawędzie okna czaszki.
Teraz za pomocą wiertła dentystycznego wykonaj dodatkowy milimetrowy otwór na wiertło w kości czołowej. Otwór ten zostanie później wykorzystany do wywołania depresji rozprzestrzeniania się kory mózgowej. Uważaj, aby na żadnym kroku nie uszkodzić naczynia korowego.
Konfiguracja obrazowania składa się z kwantowego lasera ind YAG z genialnymi impulsami o długości 532 nanometrów i częstotliwości 10 herców, w którym niewielka część energii impulsu jest sprzężona ze światłowodem wielomodowym i dostarczana do próbki. Energia każdego impulsu jest również próbkowana za pomocą fotodiody. Kamera CCD.
QE od law vision jest zamontowane na pionowym stoliku Z. Używamy obiektywu Olympus four X o odległości roboczej 29 milimetrów. Filtr górnoprzepustowy o długości fali granicznej 650 nanometrów i obiektyw tubusowy o ogniskowej 100 milimetrów są zamontowane przed kamerą ze zwierzęciem na miejscu.
Dostosuj położenie obiektywu. Teraz ustaw laser na minimalną energię impulsu i włącz go. Zmierz energię wiązki za pomocą optycznego miernika energii impulsów, wyreguluj przełącznik Q.
Czas opóźnienia taki, aby energia impulsu dostarczana do próbki nie przekraczała 10 milidżuli na centymetr kwadratowy. Następnie upewnij się, że wszystkie parametry fizjologiczne zwierzęcia mieszczą się w normalnym zakresie fizjologicznym. Następnie rozpuść odpowiednią wagowo ilość czułej sondy fosforescencyjnej.
Oxy cztery R trzy, opracowany przez Libi Dev et wszystko w jednym mililitrze soli fizjologicznej, aby osiągnąć stężenie 40 mikromolów we krwi. Powoli wstrzyknąć roztwór do żyły udowej. Teraz wstrzyknij około jednego mikrolitra jednomolowego roztworu chlorku potasu przez otwór w kości czołowej, aby wywołać depresję rozprzestrzeniania się kory mózgowej i uruchom oprogramowanie do zbierania danych.
Obrazowanie fosforescencji powinno trwać około 10 minut. Podczas eksperymentu obrazy fosforescencji są wyświetlane w czasie rzeczywistym na ekranie. Po obrazowaniu należy pobrać kolejną próbkę krwi, aby potwierdzić, że gazometria zwierzęcia nadal mieści się w normalnym zakresie fizjologicznym.
Oto kilka reprezentatywnych wyników z szerokokątnego obrazowania CCD PO O2 podczas depresji rozprzestrzeniania się kory mózgowej. Lewa strona tego rysunku wyświetla obraz ciśnienia tlenu w szerokim polu widzenia przed nadejściem fali A CSD. Prawa strona pokazuje ewolucję w czasie średniego ciśnienia tlenu podczas propagacji CSD w obszarze zainteresowania zaznaczonym po lewej stronie.
Film ten pokazuje czasową ewolucję ciśnienia tlenu w całym oknie czaszkowym. Podczas rozchodzenia się fali CSD pasek skali wskazuje ciśnienie tlenu w milimetrach słupa rtęci dla obrazowania dwufotonowego napięcia tlenu i mikrokrążenia korowego myszy. Przygotuj okno czaszki zgodnie z opisem w Jo artykułu numer sześć 80 i włóż kaniulę do tętnicy udowej.
Do obrazowania używamy obiektywu Olympus 20 x do zanurzenia w wodzie z powłoką podczerwoną, rozpuszczamy odpowiednią wagowo ilość wrażliwej na tlen sondy fosforescencyjnej PTPC 3 43 opracowanej przez Kova i wsp. w 0,2 mililitra soli fizjologicznej i filtrujemy ją przez filtr o grubości dwóch mikronów. Po upewnieniu się, że parametry fizjologiczne zwierzęcia mieszczą się w normalnym zakresie fizjologicznym, należy bardzo powoli wstrzyknąć roztwór PTP C3 43 do tętnicy udowej. Głównymi elementami eksperymentalnego zestawu są laser femtosekundowy o długości fali 840 nanometrów, modulator elektrooptyczny, skanery galwanometryczne, skanery Olympus i soczewki lampowe oraz czterokanałowy detektor z PMT.
Jeden kanał detekcji zawiera zarówno PMT, jak i dyskryminator. Zliczanie fotonów jest zbierane za pomocą szybkiej tablicy cyfrowej. Wszystkie aspekty eksperymentu są kontrolowane przez oprogramowanie napisane w widoku laboratoryjnym i c.
Rozpocznij eksperyment od ustawienia żądanych przedziałów czasowych dla wzbudzenia barwnika i zbierania emisji W każdym pikselu najpierw uzyskaj skan ankietowy, który jest powolnym dwuwymiarowym skanem rastrowym zaniku intensywności fosforescencji, który wyświetla strukturę naczyniową na bieżącej głębokości. Korzystając z obrazu skanu ankiety, wybierz lokalizacje wewnątrznaczyniowe, aby zmierzyć PO dwa. Podczas pomiarów oprogramowanie przekierowuje laser wzbudzający w wybrane miejsca poprzez zmianę położenia zwierciadeł skanujących galwanometru.
Ustaw żądaną wartość interwału uśredniania pomiaru i czas trwania eksperymentu, a następnie rozpocznij pomiar. PO dwa pomiary są wykonywane w wybranych lokalizacjach w określonym interwale pomiarowym przez czas trwania eksperymentu. Po zebraniu danych na różnych głębokościach kory mózgowej wstrzyknij sprzężony z dekstryną barwnik fluorescencyjny do naczyń krwionośnych w celu obrazowania.
Struktura mikro naczyń krwionośnych. Uzyskaj stos obrazów strukturalnych układu naczyniowego, wykonując obrazowanie dwufotonowe fluorescencji fit c przy użyciu zielonego kanału w detektorze czterokanałowym. Poniżej prezentujemy projekcję 3D zobrazowanego stosu mikrokrążenia.
Odcienie szarości reprezentują wolumetryczną maskę naczynia utworzoną na podstawie obrazu strukturalnego. Zmierzone wartości PO dwie zostały oznaczone kolorami. Podziałka wynosi 200 mikrometrów.
Właśnie pokazaliśmy Ci dwie procedury pomiaru ciśnienia tlenu w mikrokrążeniu korowym u małych gryzoni, oparte na zależnym od tlenu chrupaniu fosforyzującym. Podczas wykonywania tych zabiegów ważne jest, aby mieć bardzo czyste operacje mózgu, a także nosić okulary ochronne podczas obsługi laserów. Więc to wszystko.
Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia procedury eksperymentalne do pomiaru ciśnienia częściowego tlenu (pO2) w narządzie krążenia mózgu przy użyciu zależnego od tlenu zgaśnięcia fosforescencji. Techniki te są stosowane zarówno u szczurów, jak i myszy w celu badania dostarczania i zużycia tlenu w różnych stanach mózgu.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biomedyczne obrazowanie
- Fizjologia
Tło
- Rozumienie dynamiki tlenu w mózgu jest kluczowe dla badania różnych stanów neurologicznych.
- Zgaśnięcie fosforescencji jest metodą stosowaną do pomiaru poziomów pO2.
- Modele zwierzęce, takie jak szczury i myszy, są powszechnie stosowane w tych badaniach.
- Techniki te mogą dostarczyć informacji zarówno o normalnym, jak i patologicznym stanach funkcjonowania mózgu.
Cel badania
- Aby pokazać procedury pomiaru pO2 w korowej mikrokrążeniu.
- Aby zbadać dostarczanie i zużycie tlenu w mózgu.
- Aby zapewnić podstawę dla dalszych badań nad tlenowaniem mózgu.
Stosowane metody
- Przygotowanie szkiełek pokrywowych z optycznie absorpcyjnymi maskami.
- Obrazowanie z dużym polem widzenia oparte na CCD u szczurów.
- Obrazowanie oparte na 2-fotonowym wzbudzeniu u myszy.
- Zastosowanie technik zgaśnięcia fosforescencji zależnych od tlenu.
Główne wyniki
- Sukces w pomiarze poziomów pO2 w narządzie krążenia mózgu.
- Demonstracja technik obrazowań stosowanych u małych gryzoni.
- Wgląd w dynamikę dostarczania tlenu w różnych warunkach.
- Potencjalne zastosowania w zrozumieniu patologii mózgu.
Wnioski
- Przedstawione metody są skuteczne w badaniu napięcia tlenowego w mózgu.
- Te techniki mogą wzbogacić nasze rozumienie dynamiki tlenu w mózgu.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach, aby zbadać różne stany neurologiczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of cerebral blood oxygenation using phosphorescence lifetime imaging addresses a critical gap in neurovascular research by enabling absolute pO2 mapping with high spatial and temporal resolution. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early-stage CNS drug discovery, particularly for programs targeting neurovascular and metabolic pathways. The approach enhances translational continuity by providing robust, model-independent oxygenation data relevant to both normal and pathological brain states.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of neurovascular and metabolic hypotheses through absolute pO2 quantification.
- Supports biological de-risking by providing artifact-resistant oxygenation readouts unaffected by tissue optical variability.
- Facilitates functional target validation in disease-relevant CNS models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated in vivo and ex vivo systems for downstream compound screening targeting oxygen delivery or consumption.
- Delivers standardized, quantitative pO2 outputs for assay reproducibility and cross-study comparability.
- Enables scalable imaging modalities adaptable to both wide-field and high-resolution applications.
Translational & Preclinical Research
- Aligns oxygenation measurements with translational biomarkers for neurovascular and metabolic disorders.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting longitudinal and heterogeneous tissue analysis.
- Reduces risk in advancing CNS assets by clarifying mechanistic links between intervention and tissue oxygenation.
Pipeline & Workflow Integration
This phosphorescence-based pO2 measurement platform integrates from early discovery through preclinical research, supporting both hypothesis testing and translational biomarker development.
- Discovery Biology: Enables robust hypothesis testing and pathway clarification in neurovascular models.
- Screening: Provides reproducible, quantitative oxygenation data for compound evaluation.
- Analytics: Delivers absolute pO2 measurements and spatial-temporal mapping for comparative analytics.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity in CNS disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analytics capability across multiple CNS and metabolic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes oxygenation measurement workflows and enhances reproducibility across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in neurovascular portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of CNS and metabolic assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical imaging, animal surgery, and phosphorescence probe handling.
- Demands specialized instrumentation such as pulsed lasers, CCD cameras, or two-photon microscopes.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of imaging protocols and data analysis.
- Adaptation across species and model systems may require probe and hardware optimization.
- Practical limitations include the need for invasive cranial windows and careful physiological monitoring.
