Name: Pomiar natlenienia krwi mózgowej w oparciu o zależne od tlenu wygaszanie fosforescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj metodę pomiaru natlenienia krwi mózgowej w oparciu o wygaszanie fosforescencji zależne od tlenu u szczurów i myszy. Technika ta umożliwia badanie dynamiki dostarczania i zużycia tlenu w mózgu w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować za wsparcie finansowe z grantów Narodowych Instytutów Zdrowia USA (US National Institutes of Health) o numerach R01NS057476, P50NS010828, P01NS055104, R01EB000790, K99NS067050, R01HL081273 i R01EB007279 oraz z grantu American Heart Association o numerze 0855772D.

1. Obrazowanie szerokopolowe pO2 w naczyniach krwionośnych kory mózgu szczura
<ol>
 <li>Szczury (250 g -350 g) są wstępnie znieczulane izofluranem, a tętnica i żyła udowa są kanulowane w celu monitorowania tętna, ciśnienia tętniczego i gazometrii krwi, a także do infuzji dożylnej. Temperaturę ciała utrzymuje się na poziomie 37 ± 0,1 °C. Wykonuje się tracheotomię, a szczury są wentylowane mieszanką powietrza i tlenu.</li>
 <li>Próbki krwi do pomiaru gazów krwi pobiera się co 30-45 min, a wentylację i znieczulenie dostosowuje się tak, aby utrzymać gazy krwi w normalnym zakresie fizjologicznym.</li>
 <li>Do obrazowania przygotowuje się zamknięte okno czaszkowe na kości ciemieniowej o rozmiarze 4 mm x 4 mm. Kość i oponę twardą usuwa się, a okno czaszkowe wypełnia 1,5% agarozy i uszczelnia szkiełkiem podstawnym do mikroskopu. Dodatkowy otwór trepanacyjny o powierzchni 1 mm2 na kości czołowej służy do indukcji CSD poprzez wewnątrzkorową mikroiniekcję KCl (~10 μl, 1 M). Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia naczyń korowych. Nadmierne ciepło, nacisk mechaniczny lub krótki okres hipoksji mogą naruszyć barierę krew-mózg i spowodować wyciek barwnika z naczyń do przestrzeni śródmiąższowej.</li>
 <li>Wokół okna czaszkowego umieszcza się maskę z materiału nieprzezroczystego optycznie. Celem maski jest pochłanianie sygnału fosforescencji pochodzącego z barwnika, który wyciekł do tkanki z krawędzi opony twardej. Barwnik w przestrzeni śródmiąższowej jest źródłem bardzo jasnej fosforescencji, która może zakłócić pomiar. Zwiększona jasność barwnika w przestrzeni śródmiąższowej jest wynikiem gromadzenia się barwnika w środowisku o niskim ciśnieniu tlenu i niskiej szybkości wygaszania. Uszkodzenie naczyń w eksperymencie jest zatem łatwo rozpoznawalne po pojawieniu się jasnych plam fosforescencyjnych, w takim przypadku dane eksperymentalne są odrzucane.</li>
 <li>Po zakończeniu operacji przerywa się podawanie izofluranu i zmienia znieczulenie na alfachloraloza (bolus dożylny 50 mg/kg, a następnie infuzja 40 mg/(kg h)).</li>
 <li>Zwierzę zostaje przeniesione na wózku wraz z respiratorem, monitorem ciśnienia krwi i temperatury. Oddychając powietrzem pokojowym, zwierzę jest szybko przenoszone do układu obrazowania i ponownie podłączane do przepływomierza z odpowiednią mieszanką powietrza i tlenu.</li>
 <li>Rama stereotaktyczna utrzymująca zwierzę jest umieszczana pod obiektywem. Okno czaszkowe jest centrowane w polu widzenia pod obiektywem i ustawiane równolegle do płaszczyzny ogniskowej.</li>
 <li>Włącza się laser impulsowy i ustawia minimalną energię impulsu. Wiązka optyczna jest kierowana w stronę miernika energii impulsu, a dostarczana do próbki energia impulsu jest dostosowywana tak, aby nie przekraczała 10 mJ/cm2. Wiązka jest centrowana na oknie czaszkowym pod kątem padania ok. 60 stopni, a następnie laser jest wyłączany.</li>
 <li>Pomiary gazów krwi oraz korekty wentylacji i znieczulenia są wykonywane aż do momentu, gdy wszystkie parametry fizjologiczne zwierzęcia znajdą się w normalnym zakresie fizjologicznym.</li>
 <li>Przy założeniu, że objętość krwi wynosi około 7% masy ciała, odpowiednią ilość sondy fosforescencyjnej Oxyphor R3 rozpuszcza się w 1 mL soli fizjologicznej, aby uzyskać stężenie sondy we krwi wynoszące 4 x 10-5 M. Roztwór sondy wstrzykuje się do żyły udowej.</li>
 <li>Przygotowuje się 1 M roztwór chlorku potasu i wstrzykuje ~1 ul za pomocą strzykawki przez otwór trepanacyjny na kości czołowej w celu indukcji CSD.</li>
 <li>Laser jest włączany, a obrazowanie rozpoczyna się natychmiast po wstrzyknięciu roztworu KCl. Obrazowanie fosforescencji jest przeprowadzane przez ok. 10 min.</li>
 <li>Wykonuje się kolejny pomiar gazów krwi, aby potwierdzić, że parametry fizjologiczne zwierzęcia nadal znajdują się w normie.</li>
 <li>Czasy życia fosforescencji dla wszystkich pikseli uzyskuje się poprzez dopasowanie pojedynczego wykładniczego zaniku przy użyciu nieliniowej metody najmniejszych kwadratów z wagowaniem statystycznym w programie Matlab. Czasy życia fosforescencji są przeliczane na wartości pO2 przy użyciu empirycznej zależności typu Sterna-Volmera (patrz niżej).</li>
</ol>
2. Wysokorozdzielcze obrazowanie pO2 metodą dwufotonową w mikronaczyniach kory mózgowej myszy
<ol>
 <li> Myszy znieczula się izofluranem, a tętnicę udową kaniuluje się w celu monitorowania tętna, ciśnienia krwi i gazów krwi, a także do podania barwnika. Temperaturę ciała utrzymuje się na poziomie 37 ± 0.1 °C, a zwierzęta oddychają samoistnie mieszaniną powietrza i tlenu. </li>
 <li> Okno czaszkowe przygotowuje się zgodnie z techniką opracowaną pierwotnie przez Davida Kleinfelda i Winfrieda Denka. Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia naczyń krwionośnych, co zapobiegnie ewentualnemu wyciekowi barwnika do przestrzeni śródmiąższowej.</li>
 <li> W trakcie całej procedury przygotowania pobiera się kilka próbek krwi do pomiaru gazów krwi, a wentylację i znieczulenie dostosowuje się tak, aby utrzymać gazy krwi w normalnym zakresie fizjologicznym.</li>
 <li> Zwierzę przenosi się do układu obrazowania. Zmodyfikowaną ramę stereotaktyczną utrzymującą zwierzę umieszcza się pod obiektywem. Okno czaszkowe centruje się w polu widzenia pod obiektywem Olympus 4X i ustawia równolegle do płaszczyzny ogniskowej.</li>
 <li> Za pomocą kamery cyfrowej przez okulary wykonuje się zdjęcie okna czaszkowego, a następnie obiektyw 4X zastępuje się obiektywem Olympus 20X (NA = 0.95).</li>
 <li> Pomiary gazów krwi oraz korekty wentylacji i znieczulenia wykonuje się do momentu, aż wszystkie parametry fizjologiczne zwierzęcia znajdą się w normalnym zakresie fizjologicznym.</li>
 <li> Zakładając, że objętość krwi wynosi około 7% masy ciała, odpowiednią ilość sondy fosforescencyjnej PtP-C343 rozpuszcza się w 0.2 mL soli fizjologicznej, aby uzyskać stężenie sondy we krwi na poziomie ~15 μM. Roztwór sondy wstrzykuje się przez tętnicę udową.</li>
 <li> Eksperyment rozpoczyna się od ustawienia pożądanych odstępów czasowych dla wzbudzenia barwnika i zbierania emisji dla każdego piksela.</li>
 <li> Wykonuje się skan przeglądowy, który jest powolnym dwuwymiarowym skanowaniem rastrowym zaniku intensywności fosforescencji, obrazującym strukturę naczyń krwionośnych na danej głębokości. Obiektyw przesuwa się prostopadle do okna czaszkowego (oś Z) i wykonuje powolne dwuwymiarowe skany przeglądowe intensywności fosforescencji, używając minimalnej mocy lasera przy 840 nm, aby zlokalizować mikro-naczynia w płaszczyźnie obrazowania.</li>
 <li> Na każdej głębokości obrazowania, na podstawie skanu przeglądowego fosforescencji na tej głębokości, wybiera się zestaw punktów w obrębie naczyń krwionośnych, a rejestrację zaników fosforescencji w każdym punkcie powtarza się dla zdefiniowanej liczby uśrednień.</li>
 <li> Ustawia się pożądaną liczbę uśrednień, odstęp pomiarowy oraz czas trwania eksperymentu i rozpoczyna pomiar. Pomiary pO2 są pozyskiwane w wybranych lokalizacjach w określonym odstępie pomiarowym przez cały czas trwania eksperymentu. </li>
 <li> Podczas pomiarów oprogramowanie przekierowuje laser wzbudzający do wybranych lokalizacji poprzez zmianę pozycji zwierciadeł skanujących galwanometru. Sterowanie skanerami galwanometrycznymi, modulatorem elektrooptycznym i całym pozostałym sprzętem odbywa się za pomocą specjalistycznego oprogramowania w LabView.</li>
 <li> Czasy życia fosforescencji dla wszystkich wybranych punktów uzyskuje się poprzez dopasowanie pojedynczego zaniku wykładniczego przy użyciu nieliniowej metody najmniejszych kwadratów w programie Matlab. Czasy życia fosforescencji przelicza się na wartości pO2, korzystając z empirycznej zależności typu Sterna-Volmera (vide infra).</li>
 <li> Po zebraniu danych z różnych głębokości kory, do naczyń krwionośnych wstrzykuje się barwnik fluorescencyjny sprzężony z dekstraną w celu obrazowania struktury mikronaczyniowej.</li>
 <li> Pozyskuje się stos obrazów strukturalnych naczyń krwionośnych, wykonując dwufotonowe obrazowanie fluorescencji FITC przy użyciu kanału zielonego w detektorze czterokanałowym.</li>
 <li> Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami ustanowionymi przez Podkomitet ds. Opieki nad Zwierzętami Doświadczalnymi Massachusetts General Hospital.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopowy i wykres przedstawiające zmiany pO2 w tkance; analiza pomiaru poziomu tlenu." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Panel (a) po lewej stronie przedstawia obraz szerokiego pola widzenia ciśnienia tlenu przed nadejściem fali CSD. Panel (b) po prawej stronie przedstawia ewolucję czasową średniego ciśnienia tlenu podczas propagacji CSD w obrębie obszaru zainteresowania zaznaczonego na panelu (a).
Rycina 2 (film avi): Ten film przedstawia ewolucję czasową ciśnienia tlenu w całym oknie czaszkowym podczas propagacji fali CSD. Pasek skali wskazuje ciśnienie tlenu w milimetrach słupa rtęci.
<img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig3.jpg" alt="Schemat sieci dystrybucji tlenu z wartościami pO2 (30-70 mmHg) zakodowanymi kolorami w analizie naczyniowej." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Projekcja 3D obrazowanego stosu naczyń krwionośnych. Odcienie szarości reprezentują wolumetryczną maskę naczyń, stworzoną na podstawie obrazu strukturalnego. 
Zmierzone wartości pO2 są zakodowane kolorami. Pasek skali wynosi 200 micrometers. Przedrukowano za zgodą Nature Publishing Group.7

<ol><li>Kleinfeld, D., Friedman, B., Lyden, P. D., Shih, A. Y. Targeted occlusion to surface and deep vessels in neocortex via linear and nonlinear optical absorption, Animal Models of Acute Neurological Injuries. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleinfeld%2C+D+%22Contemporary+Neuroscience+Series%22">Contemporary Neuroscience Series</a>. Chen, J., Xu, Z., Xu, X., Zhang, J. , Humana Press Inc. (2007).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Lebedev, A. Y., Cheprakov, A. V., Sakadzic, S., Boas, D. A., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A., A, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Phosphorescent+Probes+for+Oxygen+Imaging+in+Biological+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Dendritic Phosphorescent Probes for Oxygen Imaging in Biological Systems.</a> Applied Materials & Interfaces. , (2009).</li>
<li>Finikova, O. S., Lebedev, A. Y., Aprelev, A., Troxler, T., Gao, F., Garnacho, C., Muro, S., Hochstrasser, R. M., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+microscopy+by+two-photon-excited+phosphorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Oxygen microscopy by two-photon-excited phosphorescence.</a> Chemphyschem. 9, 1673-1679 (2008).</li>
<li>Sakadžić, S., Yuan, S., Dilekoz, E., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Ayata, C., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+cerebral+partial+pressure+of+oxygen+and+blood+flow+during+functional+activation+and+cortical+spreading+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of cerebral partial pressure of oxygen and blood flow during functional activation and cortical spreading depression.</a> Appl Opt. 48, D169-D177 (2009).</li>
<li>Yaseen, M. A., Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Wu, W., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+monitoring+of+oxygen+tension+in+cortical+microvessels+with+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Optical monitoring of oxygen tension in cortical microvessels with confocal microscopy.</a> Opt Express. 17, 22341-22350 (2009).</li>
<li>Sakadzic, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat Methods. 7, 755-759 (2010).</li>
</ol>

Przedstawiliśmy dwa zastosowania pomiaru pO2 w mikrokrążeniu korowym oparta na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji. Podczas gdy pierwsza metoda, oparta na obrazowaniu CCD, zapewnia monitorowanie pO2 w szerokim polu widzenia, pomiar ciśnienia parcjalnego tlenu w mikrokrążeniu korowym z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej zapewnia rozdzielczość kapilarną i umożliwia obrazowanie w głębszych warstwach. Obie metody zapewniają pomiary o wysokiej szybkości i wysokim stosunku sygnału do szumu. Ponadto pomiar pO2 opar...

<table><tbody><tr><td>Glikopirolanu</td><td>Odczynnik</td><td>American Regent Inc.</td><td>NDC 0517-4605-25</td><td>Stosowany do kontrolowania wydzieliny gardłowej, tchawiczej i oskrzelowej.</td></tr><tr><td>Chlorowodorek lidokainy</td><td>Odczynnik</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-4277-01</td><td>Stosowany jako miejscowe znieczulenie podczas operacji.</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Odczynnik</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>NDC 10019-360-40</td><td>Stosowany jako ogólny anestetyk wziewny podczas operacji oraz jako znieczulenie ogólne podczas eksperymentów z myszami.</td></tr><tr><td>Alfa-chloraloza</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0128</td><td>Stosowana jako znieczulenie ogólne podczas eksperymentów ze szczurami.</td></tr><tr><td>Dekstran &amp;#8211; izotiocyjanian fluoresceiny</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S</td><td>Podawany w celu uzyskania stężenia ~ 500 nM we krwi.</td></tr></tbody></table>

pomiar utlenowania krwi mózgowej oparty na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji

Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence

Monitorowanie charakterystyki czasowo-przestrzennej utlenowania krwi i tkanek mózgu jest kluczowe dla lepszego zrozumienia zależności neuro-metaboliczno-naczyniowych. Opracowanie nowych metod pomiaru pO2, umożliwiających jednoczesne monitorowanie pO2 w szerszych polach widzenia przy wyższej rozdzielczości przestrzennej i/lub czasowej, pozwoli na głębszy wgląd w funkcjonowanie zdrowego mózgu, a także będzie miało istotny wpływ na diagnostykę i leczenie chorób naczyniowo-mózgowych, takich jak udar, choroba Alzheimera oraz urazy głowy.
Metody obrazowania optycznego wykazują ogromny potencjał w zapewnianiu wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej oraz ilościowego obrazowania pO2 w oparciu o absorpcję hemoglobiny w zakresie widzialnym i bliskiej podczerwieni widma optycznego. Jednak wielospektralny pomiar utlenowania krwi w mózgu opiera się na migracji fotonów przez silnie rozpraszającą tkankę mózgową. Do dokładnej oceny utlenowania krwi zazwyczaj wymagana jest estymacja i modelowanie parametrów optycznych tkanki, które mogą ulegać dynamicznym zmianom w trakcie eksperymentu. Z drugiej strony, estymacja ciśnienia parcjalnego tlenu (pO2) oparta na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji nie powinna być w znacznym stopniu wpływana przez zmiany parametrów optycznych tkanki i zapewnia bezwzględny pomiar pO2. Systemy eksperymentalne wykorzystujące barwniki wrażliwe na tlen zostały zaprezentowane w badaniach in vivo perfundowanej tkanki, a także w monitorowaniu zawartości tlenu w hodowlach tkankowych, co wykazało, że wygaszanie fosforescencji jest skuteczną technologią zdolną do dokładnego obrazowania tlenu w fizjologicznym zakresie pO2.
W niniejszym materiale demonstrujemy, przy użyciu dwóch różnych modalności obrazowania, sposób pomiaru pO2 w naczyniach korowych oparty na obrazowaniu czasu życia fosforescencji. W pierwszej demonstracji przedstawiamy obrazowanie pO2 w szerokim polu widzenia na powierzchni kory szczura. Ta modalność obrazowania opiera się na stosunkowo prostym układzie eksperymentalnym wykorzystującym kamerę CCD i impulsowy zielony laser. Przedstawiono przykład monitorowania korowej depresji rozprzestrzeniającej się na podstawie czasu życia fosforescencji barwnika Oxyphor R3. W drugiej demonstracji prezentujemy wysokorozdzielcze dwufotonowe obrazowanie pO2 w mikro naczyniach korowych myszy. Układ eksperymentalny obejmuje zbudowany na zamówienie mikroskop dwufotonowy z laserem femtosekundowym, modulatorem elektrooptycznym i fotopowielaczem z licznikiem fotonów. Przedstawiamy przykład obrazowania heterogeniczności pO2 w mikro naczyniach korowych, w tym w kapilarach, przy użyciu nowego barwnika PtP-C343 o zwiększonym przekroju czynnym wzbudzenia dwufotonowego.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiązany artykuł <a href="http://www.jove.com/Details.php?ID=1731">Synteza i kalibracja fosforescencyjnych nanoprobników do obrazowania tlenu w systemach biologicznych.</a>

Przedstawiamy procedurę eksperymentalną pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu (pO2) w naczyniach krwionośnych mózgu, opartą na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji. Opisano procedury przygotowania zwierząt oraz obrazowania zarówno dla obrazowania pO2 w szerokim polu widzenia z wykorzystaniem detektora CCD u szczurów, jak i obrazowania pO2 opartego na dwufotonowym wzbudzeniu u myszy.

Pomiar utlenowania krwi mózgowej oparty na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji

Monitorowanie charakterystyki czasowo-przestrzennej utlenowania krwi i tkanek mózgowych jest kluczowe dla lepszego zrozumienia...

Witajcie, jestem Sava Saje z Laboratorium Obrazowania Migracji Foto w David Bo w Centrum Obrazowania Biomedycznego Martino w Massachusetts General Hospital. A ja jestem również z laboratorium Davida Bowa i pochodzę z tego samego laboratorium. Dzisiaj przedstawimy dwie procedury pomiaru ciśnienia tlenu w mikrokrwiobiegu kory u małych gryzoni, opierając się na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji.W naszym laboratorium stosujemy te techniki do badania dostarczania i zużycia tlenu w normalnych i patologicznych warunkach mózgu. Zacznijmy zatem. Najpierw przygotuj kilka szkiełek nakrywkowych otoczonych maskami absorbującymi światło, wykonanymi z czarnej taśmy izolacyjnej.Maski powinny mieć otwory o średnicy około 3,5 mm. Szkiełka zakrywkowe służą do uszczelnienia okien czaszkowych, podczas gdy maska absorpcyjna blokuje sygnał fosforyzacyjny pochodzący z barwnika, który mógł wycieknąć z krawędzi okien czaszkowych. Teraz należy przygotować uszczelnione okno czaszkowe na kości ciemieniowej.Szczegóły przygotowania można znaleźć w publikacjach Kleinfelda i wsp. oraz Masiniego i wsp., przywołanych w niniejszej pracy. W tej metodzie przygotowania usuwana jest opona twarda. Należy upewnić się, że maska zakrywa wszystkie krawędzie okna czaszkowego.Następnie, używając wiertarki stomatologicznej, wykonaj dodatkowy otwór wiertarski o średnicy 1 mm w kości czołowej. Otwór ten zostanie wykorzystany później do wywołania depresji rozprzestrzeniającej kory mózgu. Na każdym etapie należy uważać, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych kory.Układ obrazowania składa się z pulsacyjnego laseru Quantel Brilliant Nd:YAG o długości fali 532 nm i częstotliwości 10 Hz, w którym niewielka część energii impulsu jest sprzęgana z włóknem wielomodowym i dostarczana do próbki. Energia każdego impulsu jest również rejestrowana za pomocą fotodiody. Obrazowanie odbywa się przy użyciu kamery CCD.Kamera QE firmy law vision jest zamontowana na pionowej przekładni Z. Używamy obiektywu Olympus 4X z odległością roboczą 29 mm. Przed kamerą, przy umieszczonym zwierzęciu, zamontowano filtr górnoprzepustowy z długością fali odcięcia 650 nm oraz soczewkę tubusową o ogniskowej 100 mm.Dostosuj położenie obiektywu. Następnie ustaw laser na minimalną energię impulsu i włącz go. Zmierz energię wiązki za pomocą optycznego miernika energii impulsów, a następnie dostosuj przełącznik Q.Dostosuj czas opóźnienia tak, aby energia impulsu dostarczona do próbki nie przekraczała 10 mJ/cm². Następnie upewnij się, że wszystkie parametry fizjologiczne zwierzęcia mieszczą się w normie fizjologicznej. Następnie rozpuść odpowiednią ilość odważonej sondy fosforescencyjnej czułej na tlen.Oxy four R three, opracowany przez Libi Dev i współpracowników, w jednym mililitrze soli fizjologicznej, aby uzyskać stężenie 40 µM we krwi. Powoli wstrzyknij roztwór do żyły udowej. Następnie wstrzyknij około 1 µL 1 M roztworu chlorku potasu przez otwór trepanacyjny w kości czołowej, aby wywołać kortykalną depresję rozprzestrzeniającą, i uruchom oprogramowanie do akwizycji danych.Obrazowanie fosforescencji powinno trwać około 10 minut. W trakcie eksperymentu obrazy fosforescencji są wyświetlane w czasie rzeczywistym na ekranie. Po obrazowaniu należy pobrać kolejną próbkę krwi, aby potwierdzić, że gazy krwi zwierzęcia nadal znajdują się w normalnym zakresie fizjologicznym.Poniżej przedstawiono kilka reprezentatywnych wyników obrazowania CCD w szerokim polu widzenia PO O2 podczas korowej depresji rozprzestrzeniającej się. Lewa strona tej ryciny przedstawia obraz ciśnienia tlenu w szerokim polu widzenia przed nadejściem fali CSD. Prawa strona pokazuje ewolucję czasową średniego ciśnienia tlenu podczas propagacji CSD w obrębie obszaru zainteresowania zaznaczonego po lewej stronie.Ten film przedstawia ewolucję czasową ciśnienia tlenu w obrębie całego okna czaszkowego. Podczas propagacji fali CSD pasek skali wskazuje ciśnienie tlenu w milimetrach słupa rtęci dla obrazowania dwufotonowego napięcia tlenowego oraz mikro naczyniowości kory mózgu myszy. Przygotuj okno czaszkowe zgodnie z opisem w artykule JoVE nr 680 i wprowadź kaniulę do tętnicy udowej.Do obrazowania wykorzystujemy obiektyw Olympus 20x z powłoką podczerwoną do imersji w wodzie, rozpuszczamy odpowiednią masowo ilość sondy fosforescencyjnej czułej na tlen, PTPC 3 43, opracowanej przez Kovę i wsp. w 0,2 ml soli fizjologicznej i filtrujemy ją przez filtr o wielkości porów dwóch mikronów. Po upewnieniu się, że parametry fizjologiczne zwierzęcia znajdują się w normalnym zakresie fizjologicznym, bardzo powoli wstrzykujemy roztwór PTP C3 43 do tętnicy udowej. Główne elementy układu eksperymentalnego to laser femtosekundowy ustawiony na 840 nanometrów, modulator elektrooptyczny, skanery galwanometryczne, skanery i soczewki tubusowe Olympus oraz czterokanałowy detektor z PMT.Jeden kanał detekcyjny zawiera zarówno PMT, jak i dyskryminator. Liczba fotonów jest zbierana za pomocą szybkiej płyty cyfrowej. Wszystkie aspekty eksperymentu są kontrolowane przez oprogramowanie napisane w LabVIEW oraz C.Eksperyment należy rozpocząć od ustawienia pożądanych odstępów czasowych dla wzbudzenia barwnika i zbierania emisji. W każdym pikselu należy najpierw przeprowadzić skanowanie wstępne, czyli powolne dwuwymiarowe skanowanie rastrowe zaniku intensywności fosforescencji, które obrazuje strukturę naczyń krwionośnych na aktualnej głębokości. Na podstawie obrazu ze skanowania wstępnego należy wybrać miejsca wewnątrz naczyniowe do pomiaru PO₂. Podczas pomiarów oprogramowanie przekierowuje laser wzbudzający do wybranych lokalizacji poprzez zmianę położenia skanujących luster galwanometrycznych.Ustaw żądaną liczbę odstępów uśredniania pomiaru oraz czas trwania eksperymentu, a następnie rozpocznij pomiar. W wybranych lokalizacjach dwa pomiary są rejestrowane w określonych odstępach czasu przez cały czas trwania eksperymentu. Po zebraniu danych z różnych głębokości kory mózgu, wstrzyknij do naczyń krwionośnych barwnik fluorescencyjny sprzężony z dekstryną w celu przeprowadzenia obrazowania.Struktura mikro naczyniowa. Uzyskaj stos obrazów strukturalnych naczyń, wykonując obrazowanie dwufotonowe fluorescencji fitc przy użyciu kanału zielonego w detektorze czterokanałowym. Przedstawiamy tutaj projekcję 3D obrazowanego stosu mikro naczyniów.Odcienie szarości reprezentują maskę objętościową naczynia stworzoną na podstawie obrazu strukturalnego. Pomierzone wartości PO two zostały zakodowane kolorystycznie. Pasek skali wynosi 200 micrometers.Właśnie zaprezentowaliśmy dwie procedury pomiaru napięcia tlenowego w naczyniach krwionośnych kory mózgu u małych gryzoni, oparte na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji. Podczas wykonywania tych procedur ważne jest zachowanie wysokiej sterylności podczas operacji mózgu oraz noszenie okularów ochronnych podczas pracy z laserami. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.

cerebral-blood-oxygenation-measurement-based-on-oxygen-dependent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Pomiar natlenienia krwi mózgowej w oparciu o zależne od tlenu wygaszanie fosforescencji

Przedstawiamy zasady pomiarów poziomu tlenu metodą wygaszania fosforescencji oraz omawiamy konstrukcję dendrytycznych nanoczujników opartych na porfirynach do obrazowania tlenu w systemach biologicznych.

Synteza i kalibracja fosforescencyjnych nanosond do obrazowania tlenu w układach biologicznych

W niniejszej pracy opisujemy metodę bezpośredniej wizualizacji mikroregionalnej hipoksji tkankowej w korze mózgu myszy in vivo. Metoda ta opiera się na jednoczesnym obrazowaniu dwufotonowym nikotynamidowo-adeniny-dinukleotydu (NADH) oraz mikrokrążenia korowego. Metoda ta jest przydatna do wysokorozdzielczej analizy zaopatrzenia tkanki w tlen.

Wykrywanie mikroregionalnej hipoksji w korze mózgowej myszy za pomocą obrazowania dwufotonowego endogennej fluorescencji NADH

Połączyliśmy pomiary utlenowania hemoglobiny mózgowej wykonane za pomocą spektroskopii bliskiej podczerwieni w dziedzinie częstotliwości z pomiarami wskaźnika przepływu krwi mózgowej za pomocą dyfuzyjnej spektroskopii korelacyjnej, aby oszacować wskaźnik metabolizmu tlenu. Przebadaliśmy przydatność tego pomiaru jako narzędzia do przesiewowej oceny przy łóżku pacjenta w celu ewaluacji stanu zdrowia i rozwoju mózgu noworodka.

Nieinwazyjny pomiar optyczny metabolizmu mózgowego i hemodynamiki u niemowląt

Ten protokół opisuje powtarzające się wstępne kondycjonowanie hipoksyjne, czyli krótkie ekspozycje na niedotlenienie ogólnoustrojowe, które zmniejszają objętość zawału i zaburzenie bariery krew-mózg po przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu u myszy. Szczegółowo opisano również podwójną kwantyfikację objętości zawału i przerwania bariery krew-mózg po udarze, aby ocenić skuteczność ochrony nerwowo-naczyniowej.

Kwantyfikacja ochrony nerwowo-naczyniowej po powtarzającym się kondycjonowaniu wstępnym hipoksyjnym i przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu u myszy

Symulacja niedotlenienia u ludzi zazwyczaj była przeprowadzana poprzez wdychanie mieszanin gazów hipoksycznych. W tym badaniu wykorzystano nurków z bezdechem do symulacji dynamicznej hipoksji u ludzi. Ponadto fizjologiczne zmiany w kinetyce desaturacji i ponownego nasycenia oceniano za pomocą nieinwazyjnych narzędzi, takich jak spektroskopia bliskiej podczerwieni (NIRS) i nasycenie natlenieniem obwodowym (SpO2).

Model symulujący klinicznie istotną hipoksję u ludzi

Tutaj prezentujemy metodę spektroskopowej charakterystyki cząsteczek organicznych za pomocą czasowo-rozdzielczej spektroskopii fotoluminescencyjnej w skali nanosekundowej do milisekundowej w warunkach beztlenowych. Opisano również metody skutecznego usuwania tlenu z próbek, a tym samym ograniczania wygaszania luminescencji.

Czasowo-rozdzielcza charakterystyka fotofizyczna związków organicznych zbierających potrójnie w środowisku beztlenowym przy użyciu kamery iCCD

Ten protokół pokazuje, jak mierzyć funkcjonalną łączność w stanie spoczynku w ludzkiej korze przedczołowej za pomocą specjalnie zaprojektowanego instrumentu do spektroskopii korelacji dyfuzyjnej. W raporcie omówiono również praktyczne aspekty eksperymentu, a także szczegółowe kroki analizy danych.

Funkcjonalna łączność ludzkiego mózgu w stanie spoczynku oparta na przepływie krwi w mózgu przy użyciu optycznej spektroskopii korelacji rozproszonej

Prezentowany tutaj jest protokół do nieinwazyjnego monitorowania hemodynamiki mózgu pacjentów neurokrytycznych w czasie rzeczywistym i przy łóżku pacjenta przy użyciu optyki dyfuzyjnej. W szczególności proponowany protokół wykorzystuje hybrydowe rozproszone systemy optyczne do wykrywania i wyświetlania w czasie rzeczywistym informacji na temat natlenienia mózgu, przepływu krwi w mózgu i metabolizmu mózgowego.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym pacjentów w stanie neurokrytycznym za pomocą dyfuzyjnej spektroskopii optycznej

Protokół opisuje wysokoprzepustowe generowanie sferoidów do biodruku przy użyciu wieloparametrycznej analizy ich natlenienia i śmierci komórki pod standardowym mikroskopem fluorescencyjnym. Podejście to można zastosować do kontrolowania żywotności sferoid i przeprowadzania standaryzacji, co jest ważne w modelowaniu tkanki 3D, mikrośrodowiska guza i udanej biofabrykacji (mikro)tkanek.

Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

Ten artykuł opisuje użycie nowego, szybkiego imagera optycznego do makroskopowego obrazowania czasu życia fotoluminescencji próbek emitujących długie rozpady. Opisano procedury integracji, akwizycji i analizy obrazu, a także przygotowanie i charakterystykę materiałów sensorów do obrazowania oraz zastosowania imagera w badaniu próbek biologicznych.

Termoobrazownik o żywotności fluorescencji do zastosowań biomedycznych

Opisujemy protokół do nieinwazyjnego i ciągłego pomiaru bezwzględnego wskaźnika przepływu krwi w mikronaczyniach krwionośnych i nasycenia krwi tlenem za pomocą multimodalnego urządzenia opartego na optyce dyfuzyjnej bliskiej podczerwieni. Następnie oceniamy tempo metabolizmu zużycia tlenu i reaktywnego przekrwienia za pomocą testu okluzji naczyniowej.

Nieinwazyjne monitorowanie utlenowania mikrokrążenia i reaktywnego przekrwienia przy użyciu hybrydowej, rozproszonej spektroskopii optycznej w bliskiej podczerwieni do intensywnej terapii

Poznaj metodę pomiaru natlenienia krwi mózgowej w oparciu o wygaszanie fosforescencji zależne od tlenu u szczurów i myszy. Technika ta umożliwia badanie dynamiki dostarczania i zużycia tlenu w mózgu w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

Pomiar utlenowania krwi mózgowej oparty na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji

Przeglądaj więcej filmów