Name: Preparat kości nieodwapnionej do badań histologicznych, histomorfometrycznych i fluorochromowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Poznaj metodę przygotowania preparatów kości nieodwapnionej do badań histologicznych i fluorochromowych. Film pokazuje techniki pokonywania trudności przy dużych próbkach oraz uzyskiwania wysokiej jakości przekrojów do analizy mikroarchitektury kostnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować pani Sue Connell za jej wiedzę specjalistyczną w zakresie zatapiania w żywicy oraz pani Stephanii Tombs za jej doświadczenie laboratoryjne. Autorzy pragną podziękować profesorowi Frankowi Kandziorze oraz dr Marie-Anne Polboth za udzielone rady.

<ol>
 <li>Tkankę umieszcza się w szczelnym pojemniku zawierającym 10% roztwór formaliny w buforze fosforanowym.3W przypadku planowanej analizy fluorochromów należy zapewnić ich minimalną ekspozycję na światło, ponieważ są one światłoczułe. </li>
 <li>Należy ustalić wymaganą orientację tkanki. </li>
 <li>Przytnąć preparat do odpowiedniego rozmiaru i w prawidłowej orientacji, używając piły taśmowej. Należy przestrzegać zasad bezpieczeństwa. Następnie preparat umieszcza się w nieprzezroczystym pojemniku, którego objętość powinna być około dziesięciokrotnie większa od rozmiaru preparatu, aby zapewnić odpowiednią fiksację. Preparat powinien pozostawać w roztworze formaliny łącznie od jednego do dwóch tygodni, w zależności od jego wielkości. W celach testowych i optymalizacyjnych zaleca się użycie tkanki kontrolnej.</li>
 <li>Należy sprawdzić, czy tkanka mieści się w kasetce do zatapiania, a następnie umieścić ją w szczelnym, nieprzezroczystym pojemniku zawierającym 70% etanol. </li>
 <li>Przetwarzać tkankę w rosnących stężeniach etanolu, chroniąc przed światłem i przy stałym mieszaniu.
 <ol class="lalpha">
 <li>70% etanol przez 1 tydzień</li>
 <li>80% etanol, 1 tydzień</li>
 <li>90% etanol przez 1 tydzień</li>
 <li>100% etanol, 1 tydzień</li>
 </ol>
</li> 
 <li>Następnie tkankę odtłuńcza się w butanolu przez 1 tydzień, ponownie chroniąc ją przed światłem i poddając stałemu mieszaniu.</li>
 <li>Gęstość żywicy i kości powinna być ściśle dopasowana. Gęstość żywicy można zmienić (patrz krok 8); zalecamy uprzednie zatopienie próbki testowej w celu zapewnienia prawidłowej gęstości. Do mikroskopii świetlnej i analizy fluorochromów stosujemy żywicę Technovit 7100 (Heraeus Kulzer). W przypadku konieczności przeprowadzenia immunohistochemii należy zastosować alternatywną żywicę, np. Technovit 9100 (Heraeus Kulzer). </li>
 <li>Roztwór przygotowawczy Technovit 7100 można, w razie potrzeby, zmieszać z niewielkimi alikwotami dołączonego do zestawu roztworu zmiękczającego, jednak w ilości nieprzekraczającej 5% objętości roztworu przygotowawczego; z naszego doświadczenia wynika, że roztwór zmiękczający jest rzadko wymagany. Równe części etanolu bezwodnego i płynu bazowego Technovit 7100 miesza się i nanosi na tkankę jako roztwór przedinfiltracyjny na 24 godziny, minimalizując ekspozycję na światło i zapewniając mieszanie.</li>
 <li>Następnie przygotowuje się roztwór infiltracyjny, używając 1 g utwardzacza I (= 1 woreczek), który rozpuszcza się w 100 ml cieczy bazowej. Zastępuje on roztwór do preinfiltracji, a proces infiltracji trwa 1 tydzień przy stałym mieszaniu. </li>
 <li>Umieść tkankę w formie powierzchnią cięcia skierowaną w dół. Upewnij się, że wokół tkanki znajduje się margines (w idealnym przypadku co najmniej 5 milimetrów) na żywicę; zapewni to wytrzymałość bloku. Wymieszaj 15 ml roztworu przygotowawczego Technovit 7100 z 1 ml utwardzacza II, wlej wokół preparatu w formie i przykryj go warstwą co najmniej 5 milimetrów. Proces utwardzania rozpocznie się w ciągu 2 godzin, ale zostanie zakończony w ciągu nocy.</li>
 <li>Następnie wykonuje się montaż poprzez przygotowanie bloku podkładowego z użyciem Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). Technovit 3040 miesza się w stosunku objętościowym 2 części proszku do 1 części płynu, aby uzyskać gęstą ciecz. Technovit 3040 wlewa się do wgłębienia z tyłu bloku do poziomu co najmniej 2 mm powyżej podstawy bloku. Po około 10 minutach można zdjąć formę, a blok jest gotowy.</li>
 <li> Gęstość, a tym samym właściwości skrawania żywicy metakrylowej, są zależne od wilgotności powietrza w pomieszczeniu. Bloczki powinnyTherefore być przechowywane w eksykatorze.</li>
 <li>Przecięcie metodą szlifowania pozwala na uzyskanie grubszych sekcji o grubości od 20 do 50 mikrometrów. Metoda ta jest przydatna przy analizie fluorochromów (patrz w sekcji poniżej), ponieważ grubsze sekcje dają silniejszą fluorescencję. Zamocuj ostrze diamentowe w makrotomie. Do zbiornika w makrotomie wlej środek smarujący, np. benzynę ekstrakcyjną. Umieść blok w uchwycie i ustaw go względem ostrza. Proces szlifowania powinien przebiegać powoli (około 20–30 minut na sekcję), przy zapewnieniu odpowiedniego smarowania. Pierwsza sekcja odsłania powierzchnię cięcia i służy do ustawienia orientacji – należy ją odrzucić.</li>
 <li>Następnie kolejny skrawek nanosi się na szkiełko Superfrost Plus. Skrawki mają tendencję do zwijania się, dlatego zaleca się przykrycie ich fragmentem woreczka strunowego, a następnie dociśnięcie ich drugim szkiełkiem w celu ich wyprostowania. Tak przygotowane szkiełko umieszcza się w inkubatorze w temperaturze od 60 do 80 stopni Celsjusza na 1 godzinę. Zabieg ten zmiękcza metakrylan i ułatwia płaskie przyleganie skrawka do szkiełka. </li>
 <li>Sekcję szlifowaną można w razie potrzeby oczyścić i wypolerować, używając w delikatny sposób papieru ściernego o drobnej ziarnistości.</li>
 <li>Mikrotom poślizgowy służy do wycinania cienkich przekrojów, które zapewniają najlepsze preparaty do mikroskopii świetlnej. Należy użyć mikrotomu poślizgowego ze względu na jego zwiększoną sztywność, która jest niezbędna do cięcia tych twardych bloków. Alternatywnie można zastosować zautomatyzowany mikrotom obrotowy. Należy użyć ostrego ostrza ze stali nierdzewnej. Zaleca się posiadanie dwóch ostrzy, aby jedno mogło zostać naostrzone w czasie użytkowania drugiego. Ostrze powinno tworzyć kąt 45 stopni z blokiem. W razie potrzeby można zmiękczyć powierzchnię bloku, przykładając do niego mokry papier. Uzyskanie optymalnych warunków cięcia w celu otrzymania wysokiej jakości przekroju może wymagać wykonania kilku wstępnych cięć. Następnie przekrój umieszcza się na kąpieli wodnej, a potem przenosi na szkiełko przedmiotowe zgodnie z opisem w punkcie 16 powyżej.</li>
 <li>Odczynniki do barwienia wymieniono poniżej w sekcji Materiały. Protokoły oparto na opracowaniu Bancrofta.4 it al. Ze względu na zmienną grubość preparatów zaleca się optymalizację barwień na szkiełkach testowych. Barwienie w statywach może spowodować odklejenie się tkanki od szkiełka, dlatego może być konieczne nanoszenie barwników bezpośrednio na płaskie szkiełko. W celu uzyskania spójnych wyników barwienia, niezbędnych do histomorfometrii, konieczne jest zastosowanie identycznego protokołu lub barwienia w statywach.
 <ol class="lalpha">
 <li>Hematoksylina i eozyna
 <ol class="lroman">
 <li>Barwić hematoksyliną przez 5–10 minut</li>
 <li>Dokładnie przemyć wodą z kranu Scott s</li>
 <li>Barwić eozyną przez 5 minut</li>
 <li>Płukanie w wodzie z kranu</li>
 <li>Przejaśnianie w ksylenie</li>
 <li>Montowanie</li>
 <li>Wyniki 
 <ol>
 <li>Osteoid = różowy</li>
 <li>Zwapniała kość = purpurowobrązowa</li>
 <li>Jądra komórkowe = niebieskie</li>
 </ol></li>
 </ol></li>
 <li>Metoda Von Kossy
 <ol class="lroman">
 <li>Umieścić w roztworze azotanu srebra i naświetlać silnym światłem, aż zmineralizowana kość stanie się czarna (ok. 10 min).</li>
 <li>Przemyć trzykrotnie wodą destylowaną</li>
 <li>Traktować tiosiarczanem sodu przez 5 minut</li>
 <li>Przemyć wodą destylowaną</li>
 <li>Przeciwbarwienie safraniną O</li>
 <li>Przejrzyście w ksylenole</li>
 <li>Montaż</li>
 <li>Wyniki
 <ol>
 <li>Kość zmineralizowana = czarna</li>
 <li>Osteoid = czerwony/różowy</li>
 </ol></li>
 </ol></li>
 <li>Trójbarwienie Massona-Goldnera
 <ol class="lroman">
 <li>Przemyć alkoholem alkalicznym (90 ml 80% etanolu i 10 ml 25% amoniaku przez 20 minut)</li>
 <li>Płukać w wodzie</li>
 <li>Przepłukać wodą destylowaną</li>
 <li>Barwić hematoksyliną Weigerta przez 10 minut</li>
 <li>Przepłukać wodą destylowaną</li>
 <li>Barwić końcowym roztworem Ponceau-Fuchsin przez 5 minut</li>
 <li>Płukać 1% kwasem octowym przez 15 sekund</li>
 <li>Barwić w roztworze kwasu fosfomolibdenowego i pomarańczowego G przez 5 minut</li>
 <li>Płukać 1% kwasem octowym przez 15 sekund</li>
 <li>Barwić jasnozielonym przez 5 minut</li>
 <li>Płukanie 1% kwasem octowym (3 zmiany)</li>
 <li>Płukać w wodzie destylowanej</li>
 <li>Zamocuj</li>
 <li>Wyniki
 <ol>
 <li>Kostć zmineralizowana = zielony</li>
 <li>Osteoid = czerwony/pomarańczowy</li>
 <li>Jądra komórkowe = niebieskoszare</li>
 <li>Chrząstka = fioletowy</li>
 </ol></li>
 </ol></li>
 </ol></li>
 <li>Przygotowanie fluorochromów:</li>
 <li>Preparaty te podaje się w formie powolnego wstrzyknięcia dożylnego w odstępach co najmniej dwóch tygodni.</li>
 <li>Dawki
 <ol class="lalpha">
 <li>Kalcyna zielona 10 mg/kg i.v.</li>
 <li>Oksytetracyklina 50 mg/kg i.v.</li>
 <li>Alizarynowy komplekson 30 mg/kg i.v.</li>
 </ol></li>
 <li>Przygotowanie kalceiny zielonej
 <ol class="lalpha">
 <li>Jeden gram Calcein Green miancuje się za pomocą 1 M NaOH aż do całkowitego rozpuszczenia. </li>
 <li>Wartość pH reguluje się za pomocą 1% NaOH, aż do uzyskania pH = 7,1-7,2.</li>
 <li>Przefiltrować i przechowywać w ciemności</li>
 </ol></li>
 <li>Przygotowanie kompleksonu alizarynowego
 <ol class="lalpha">
 <li>Trzy gramy kompleksonu alizarynowego miareczkuje się 1 M NaOH do momentu rozpuszczenia. </li>
 <li>Następnie pH jest korygowane za pomocą 1% HCl lub NaOH do wartości 7,1–7,2.</li>
 <li>Przefiltrować i przechowywać w warunkach ochrony przed światłem</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przygotowanie oksytetracykliny
	<ol class="lalpha">
 <li>Oksytetracyklina jest dostępna jako gotowy do użycia lek przeciwmikrobowy. Nie wymaga on przygotowania.</li>
 </ol>
 </li>
 </ol>

<ol><li>Kerr, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKerr%2C+J+%22Atlas+of+Functional+Histology%22">Atlas of Functional Histology</a>. , Harcourt Publishing. Melbourne, Australia. 164-168 (2000).</li>
<li>Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+histomorphometry%3A+standardization+of+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units.+Report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).</li>
<li>An, Y. H., Martin, K. l <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAn%2C+YH+%22Handbook+of+histology+methods+for+bone+and+cartilage%22">Handbook of histology methods for bone and cartilage</a>. , Humana Press Inc. New Jersey, USA. (2003).</li>
<li>Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. , Churchill Livingston. Nottingham, United Kingdom. 352-360 (2008).</li>
</ol>

przygotowanie nieodekwalcjowanej kości do badań histologicznych, histomorfometrycznych i analizy fluorochromowej

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Histologia kości nieodwapnionej obrazuje mikroarchitekturę tkanki kostnej. Przedstawia ona zarówno komponenty zmineralizowane, jak i komórkowe, co dostarcza kluczowych informacji na temat przebudowy kości, a w szczególności procesów tworzenia i resorpcji kostnej. Ma to ogromne znaczenie w wielu zastosowaniach klinicznych i badawczych. Metoda ta pozwala na uzyskanie wysokiej jakości obrazów1 oraz zastosowanie takich technik jak ocena fluorochromowa i histomorfometria2. Analiza fluorochromowa to technika, w której w określonym punkcie czasowym wstrzykuje się barwniki fluorescencyjne wiążące się z wapniem, co umożliwia ilościowe określenie stopnia mineralizacji w danym czasie. Histomorfometria jest procesem ilościowej analizy kości na poziomie mikroskopowym.
Wykonanie histologii nieodwapnionej kości jest trudne pod względem technicznym, szczególnie w przypadku dużych próbek. Wymaga ono modyfikacji technik stosowanych w standardowej histologii z zatopieniem w parafinie. Niniejszy film przedstawia proces przygotowywania wysokiej jakości skrawków oraz demonstruje trudności techniczne i metody pozwalające na ich pokonanie. Przygotowanie, utrwalenie i procesowanie próbek odbywa się w sposób podobny do innych tkanek miękkich, jednak ze względu na gęstość i niższą przepuszczalność kości wymagany jest znacznie dłuższy czas utrwalania i procesowania, co często trwa kilka tygodni. Zatapianie wykonuje się przy użyciu medium wspierającego o twardości i gęstości zbliżonej lub równej gęstości kości, np. żywic na bazie metakrylanu; w przeciwieństwie do infiltracji i zatapiania w parafinie, jest to etap nieodwracalny. Skrawanie można przeprowadzić poprzez szlifowanie, co pozwala uzyskać grubszy przekrój, optymalny dla takich badań jak analiza fluorochromowa. Najlepiej osiągnąć to za pomocą tarczy diamentowej w makrotomie. Alternatywnie można przygotować cieńsze skrawki do mikroskopii świetlnej, wykorzystując do tego mikrotom ślizgowy z bardzo ostrym nożem. Mikrotom ślizgowy zapewnia dodatkową wytrzymałość i stabilność wymaganą dla dużych, twardych bloków. Skrawki zatopione w żywicy można barwić różnymi barwnikami, które zostaną zaprezentowane w filmie.

Histologia nieodwapnionej kości dostarcza istotnych informacji dla wielu zastosowań klinicznych i badawczych. Jest to proces wymagający technicznie, szczególnie w przypadku próbek o dużych rozmiarach. Niniejszy materiał wideo ilustruje proces przygotowywania wysokiej jakości skrawków oraz demonstruje trudności techniczne i metody pozwalające je przezwyciężyć.

Przygotowanie nieodekwalcjowanej kości do badań histologicznych, histomorfometrycznych i analizy fluorochromowej

Histologia kości niedodekalkcyzowanej obrazuje mikroarchitekturę tkanki kostnej. Ukazuje ona zarówno komponenty zmineralizowane, jak i komórkowe kości, co pozwala na...

Histologia odwapnionej kości obrazuje mikroarchitekturę tkanki kostnej, ukazując zarówno jej komponenty zmineralizowane, jak i komórkowe, co dostarcza kluczowych informacji na temat przebudowy kości, a także procesów jej tworzenia i resorpcji. Ma to ogromne znaczenie w wielu zastosowaniach klinicznych i badawczych. Pozwala na uzyskanie wysokiej jakości obrazów oraz zastosowanie takich technik jak ocena fluorescencji i histometria.Wykonanie histologii tkanki spodskostnej (podstętniej) jest trudne pod względem technicznym, zwłaszcza w przypadku próbek o dużym rozmiarze. Ten film zaprezentuje trudności techniczne oraz metody pozwalające je pokonać w celu uzyskania przekrojów kostnych spodskostnych. Materiał nie będzie obejmował histomorfometrycznej oceny tych przekrojów.W tym celu odsyłamy do następującej ważnej publikacji. Niniejsy film obejmie przygotowanie i utrwalenie preparatu, zatapianie, sekcjonowanie metodą szlifowania oraz cięcia, a także przygotowanie i barwienie preparatów histologicznych po pobraniu tkanek. Preparat.W tym przypadku szyjny kręgosłup owcy umieszcza się w szczelnym, nieprzezroczystym pojemniku zawierającym 10% phosphate buffered formula and solution. W przypadku planowania analizy fluorochromowej należy zminimalizować ekspozycję na światło. Ponieważ fluorochromy są światłoczułe, preparat przenosi się do laboratorium i przycina do odpowiedniego rozmiaru, co poprawia utrwalenie i zapewnia jego dopasowanie do bloku.Na tym etapie należy znać orientację tkanki na szkiełku, aby blok można było przygotować w odpowiedniej płaszczyźnie. Bardzo ważne jest zachowanie zasad bezpieczeństwa i stosowanie narzędzi w sposób zapewniający bezpieczną odległość dłoni od ostrza. Obszar zainteresowania zostaje teraz przycięty do odpowiedniego rozmiaru.Następnie wykonuje się końcowe przycinanie za pomocą mniejszej piły taśmowej, co pozwala zminimalizować utratę tkanki. Po docięciu bloku do odpowiedniego rozmiaru, umieszcza się go w szczelnym, nieprzezroczystym pojemniku z nowym utrwalaczem w celu zakończenia procesu fiksacji. Objętość pojemnika powinna być około 10 razy większa niż rozmiar próbki.Aby uzyskać odpowiednią fiksację, preparat powinien pozostawać w roztworze od jednego do dwóch tygodni, w zależności od jego wielkości, po czym zostaje przeniesiony do 70% etanolu. Następnie przeprowadza się powolne przetwarzanie, ponieważ duży rozmiar bloków oraz niska przepuszczalność kości powodują powolną dyfuzję rozpuszczalników. Odwodnienie jest następnie realizowane przy użyciu rosnących stężeń etanolu, a następnie następuje przejaśnianie w butanolu. Preparat należy przechowywać w ciemności i pod stałym mieszaniem.Zalecamy pozostawienie próbek w każdym z roztworów przez około jeden tydzień. Przetwarzanie trwa zatem od czterech do sześciu tygodni. Nie należy przyspieszać tego procesu, ponieważ obniży to końcową jakość preparatów.Dostępnych jest wiele opcji zatapiania dla skalcyfikowanej kości. Wybór żywicy lub metakrylanu zależy od tego, co ma zostać poddane badaniu. Na przykład immunohistochemia nie jest możliwa do przeprowadzenia przy użyciu wszystkich rodzajów żywic.Żywice epoksydowe wymagają światła UV do utwardzania, co mogłoby zakłócić analizę fluorochromową. Zalecamy zapoznanie się ze specyfikacjami producenta przed dokonaniem starannego wyboru. Stosujemy TEVI 7, 100, ponieważ pozwala to na uzyskanie wysokiej jakości skrawków i szlifów do mikroskopii świetlnej oraz analizy fluorochromowej, a jednocześnie jest rozwiązaniem ekonomicznym.Ważnym aspektem podczas zatapiania jest to, aby gęstość kości i gęstość medium zatapiającego były do siebie zbliżone. Jest to kluczowe przy późniejszym krojeniu bloków, szczególnie w przypadku sekcjonowania mikrotermem; mieszaninę przygotowuje się zgodnie z instrukcjami producenta i energicznie wstrząsa. Warto zatopić kilka próbek testowych w celu optymalizacji protokołu.W przeciwieństwie do metody z parafiną, jest to etap nieodwracalny. Bloki umieszcza się powierzchnią tnącą skierowaną w dół w formie. Forma będzie większa od bloku, aby zapewnić odpowiednie wsparcie i wytrzymałość.Infiltrację metakrylanem należy przeprowadzać powoli, aby umożliwić maksymalne przeniknięcie metakrylanu do kości. Ponownie należy zminimalizować ekspozycję na światło. Po jednym tygodniu w roztworze infiltracyjnym, roztwór ten należy wymienić i dodać roztwór utwardzający.Następnie przygotowuje się płytkę wspierającą. W tym celu używamy tevit 30 40. Następnie zdejmuje się formę, a blok jest już gotowy.Sekcjonowanie szlifowe pozwala na uzyskanie grubszych przekrojów o grubości od 20 do 50 mikronów. Jest to użyteczne w analizie fluorescencyjnej, ponieważ grubsze sekcje dają jaśniejszą fluorescencję. Do wykonania sekcji szlifowej niezbędny jest mikrotom, najlepiej z nożem diamentowym. Stosujemy zakrzywiony nóż diamentowy o grubości 0,6 milimetra.Niezbędne jest zastosowanie środka smarnego. Preferowany jest smar na bazie produktów naftowych, choć smary silikonowe również sprawdzają się dobrze. Następnie blok umieszcza się w zacisku.Jest on zamocowany w makroimadle, a blok zostaje przesunięty w stronę noża. Pierwszy skrawek odsłania powierzchnię tnącą i orientuje przekrój. Należy go odrzucić.Szlifowanie jest procesem powolnym i nie powinno być przeprowadzane w pośpiechu. Podczas szlifowania przekroju należy zapewnić odpowiednie smarowanie. Następnie przekrój umieszcza się na szkiełku podstawowym.Można go oczyścić i wypolerować w razie potrzeby. Przekrój ma tendencję do zwijania się, dlatego zalecamy przykrycie go fragmentem woreczka strunowego i przytrzymanie go płasko za pomocą innego przedmiotu zaciśniętego w tym miejscu.Następnie umieszcza się go w inkubatorze w temperaturze od 60 do 80 °C przez jedną godzinę. Pozwala to na zmiękczenie metakrylanu i pomaga w płaskim przytwierdzeniu się przekroju do szkiełka. Tutaj widzimy złożony obraz fluorescencyjny trzech różnych fluorochromów wstrzykiwanych w odstępach miesięcznych.Umożliwia to identyfikację miejsca mineralizacji w określonym punkcie czasowym. Dawki i sposób przygotowania tych znaczników opisano w tekście. Metoda mikrotomii pozwala na uzyskanie cienkich skrawków, co jest optymalne dla mikroskopii świetlnej.Jest to proces trudny pod względem technicznym. Sugerujemy zastosowanie mikrotomu ślizgowego (typu sledge), który zapewnia większą stabilność niezbędną do cięcia tych twardych bloków. Można stosować różne rodzaje noży, w tym noże z węglika wolframu.Zalecamy jednak użycie ostrza ze stali nierdzewnej, ponieważ można je łatwo i często ostrzyć w razie potrzeby. Ostrze powinno być ustawione pod kątem 45 stopni względem bloku. Gęstość metakrylanu jest podatna na wiele czynników, w tym na wilgotność powietrza w pomieszczeniu.Blok powinien być zatem przechowywany w suchym miejscu. Jeśli zajdzie potrzeba, zmiękczenie można uzyskać, przykładając do bloku wilgotny papier; uzyskanie odpowiednich warunków cięcia w celu otrzymania wysokiej jakości skrawka może wymagać wykonania kilku sekcji. Ponownie, worek strunowy i dodatkowy szkiełko są zaciskane, aby spłaszczyć skrawek przed umieszczeniem go w inkubatorze.Barwienie jest podobne do standardowej histologii preparatów zatopionych w parafinie, z tą różnicą, że proces woskowania jest oczywiście zbędny. Powszechnie stosowane barwienia kości obejmują VSA z przeciwbarwieniem szafranem, szafran, zieleń świetlistą oraz masson golden as trione. Protokoły dla tych metod są opisane w tekście.Odczynniki są dobierane i filtrowane przed użyciem. Złoty. Barwnik ten jest często stosowany w histoptometrii. Zalecamy najpierw zoptymalizować barwienie na preparatach testowych.Po każdym kroku można obejrzeć preparat pod mikroskopem, aby upewnić się, że barwienie przebiega prawidłowo. Pozwala to na ustalenie właściwego czasu barwienia dla każdego z komponentów. Po zoptymalizowaniu standardu barwienia wszystkie preparaty z eksperymentu barwi się jednocześnie w statywie według tego samego protokołu, aby uniknąć zmienności barwienia, która mogłaby wpłynąć na ich geometrię termiczną.Następnie preparaty zostaną przykryte szkiełkami w standardowy sposób. Życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

undecalcified-bone-preparation-for-histology-histomorphometry

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Preparacja kości niedekalcyfikowanych do histologii, histomorfometrii i analizy fluorochromowej

Immunocytochemiczna identyfikacja podtypów włókien obwodowych nerwów czuciowych (oraz wykrywanie ekspresji białek w ich obrębie) jest kluczowa dla zrozumienia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw czucia obwodowego. W niniejszej pracy opisujemy metody przygotowania próbek tkanek obwodowych i trzewnych, takich jak skóra i kości kończyn, do specyficznego barwienia immunologicznego obwodowych włókien nerwów czuciowych.

Przygotowanie tkanek i immunobarwienie włókien nerwów czuciowych myszy unerwiających skórę i kości kończyn

Przedstawiono strategię ilościowej analizy danych histologicznych w szpiku kostnym. Mikroskopia konfokalna znakowanych fluorescencyjnie komórek w skrawkach tkanek daje 2-wymiarowe obrazy, które są automatycznie analizowane. Analizy kolokalizacyjne różnych typów komórek są porównywane z danymi z symulowanych obrazów, dostarczając ilościowych informacji o interakcjach komórkowych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

Opracowaliśmy dwa zestawy kombinacji śledzenia u myszy Rosa26tdtomato (wszechobecne w wszystkich komórkach)/Cre (specyficznie wyrażane w chondrocytach): jeden z 2.3Col1a1-GFP (specyficzny dla osteoblastów) i jeden z immunofluorescencją (specyficzny dla komórek kostnych). Dane wskazują na bezpośrednią transformację chondrocytów w komórki kostne.

Kolokalizacja markerów linii komórkowej i sygnału pomidora

Hodowla ex vivo eksplantatów kostnych może być cennym narzędziem do badania fizjologii kości i potencjalnej oceny leków w przebudowie kości i chorobach kości. Prezentowany protokół opisuje przygotowanie i hodowlę kalwarii wyizolowanych z czaszek nowonarodzonych myszy, a także jej zastosowania.

Pomiar przebudowy kości i odtworzenie mikrośrodowiska guz-kość przy użyciu kokultury kalwarii i histomorfometrii

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół do wykrywania i ilościowego określania poziomów białek podczas morfogenezy/patogenezy twarzoczaszki poprzez barwienie immunologiczne na przykładzie tkanek twarzoczaszki myszy. Ponadto opisano metodę przygotowania i kriosekcji nieodwapnionych tkanek twardych od młodych myszy w celu barwienia immunologicznego.

Przygotowanie tkanek i barwienie immunologiczne tkanek twarzoczaszki myszy i kości nieodwapnionej

Adipocyty istnieją w oddzielnych magazynach i pełnią różne role w swoich unikalnych mikrośrodowiskach. W miarę odkrywania regionalnych różnic w charakterze i funkcji adipocytów, ustandaryzowana identyfikacja i izolacja magazynów ma kluczowe znaczenie dla postępu w tej dziedzinie. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół wycinki różnych magazynów tłuszczu myszy.

Identyfikacja i sekcja różnorodnych mysich magazynów tłuszczowych

Ten protokół opisuje procedurę chirurgiczną mającą na celu wykrycie złamania trzonu w kości udowej myszy, która jest stabilizowana drutem śródszpikowym, do badań nad gojeniem złamań.

Ustalenie modelu złamania kości udowej trzonu u myszy

Ten protokół przedstawia ustandaryzowany model myszy do rozszerzania szwów oraz metodę wizualizacji 3D do badania mechanobiologicznych zmian szwu i przebudowy kości pod wpływem siły rozciągającej.

Technika wizualizacji 3D do przebudowy kości w mysim modelu rozszerzania szwów

Ten protokół przedstawia ekonomiczną i efektywną metodę ilościowej oceny mikroarchitektury kości w mysim modelu osteoporozy poprzez połączenie barwienia Hematoxylin-Eosin (HE) i technik mikrotomografii komputerowej (Micro-CT).

Ocena mikroarchitektury kości beleczkowej w mysim modelu osteoporozy

Tutaj opisujemy metodę, która pozwala na odwapnienie świeżo pobranych tkanek kostnych i zachowanie wysokiej jakości RNA. Przedstawiono również metodę cięcia próbek niezdemineralizowanych kości z zatopioną parafiną utrwaloną w formalinie (FFPE) w celu uzyskania dobrej jakości wyników, jeśli świeże tkanki nie są dostępne lub nie można ich pobrać.

Metody umożliwiające przestrzenną transkryptomikę tkanek kostnych

Protokół ten obejmuje krok po kroku workflow dla zwapniałych próbek naczyniowych: obsługę tkanek, odwapnianie, walidację RNA, wykrywanie poziomu zwapnienia oraz strategie wyboru regionów zainteresowania na Nanostring GeoMx Digital Spatial Profilere (DSP). Celem jest przedstawienie kompleksowej metody zachowania morfologii tkanek naczyniowych oraz RNA do wiarygodnej analizy transkryptomii przestrzennej.

Przygotowanie i przetwarzanie zwapnionych tętnic z zachowaną morfologią i RNA do cyfrowego profilowania przestrzennego

Poznaj metodę przygotowania preparatów kości nieodwapnionej do badań histologicznych i fluorochromowych. Film pokazuje techniki pokonywania trudności przy dużych próbkach oraz uzyskiwania wysokiej jakości przekrojów do analizy mikroarchitektury kostnej.

Przygotowanie nieodekwalcjowanej kości do badań histologicznych, histomorfometrycznych i analizy fluorochromowej

Przeglądaj więcej filmów