Przygotowanie nieodekwalcjowanej kości do badań histologicznych, histomorfometrycznych i analizy fluorochromowej

Histologia odwapnionej kości obrazuje mikroarchitekturę tkanki kostnej, ukazując zarówno jej komponenty zmineralizowane, jak i komórkowe, co dostarcza kluczowych informacji na temat przebudowy kości, a także procesów jej tworzenia i resorpcji. Ma to ogromne znaczenie w wielu zastosowaniach klinicznych i badawczych. Pozwala na uzyskanie wysokiej jakości obrazów oraz zastosowanie takich technik jak ocena fluorescencji i histometria.

Wykonanie histologii tkanki spodskostnej (podstętniej) jest trudne pod względem technicznym, zwłaszcza w przypadku próbek o dużym rozmiarze. Ten film zaprezentuje trudności techniczne oraz metody pozwalające je pokonać w celu uzyskania przekrojów kostnych spodskostnych. Materiał nie będzie obejmował histomorfometrycznej oceny tych przekrojów.

W tym celu odsyłamy do następującej ważnej publikacji. Niniejsy film obejmie przygotowanie i utrwalenie preparatu, zatapianie, sekcjonowanie metodą szlifowania oraz cięcia, a także przygotowanie i barwienie preparatów histologicznych po pobraniu tkanek. Preparat.

W tym przypadku szyjny kręgosłup owcy umieszcza się w szczelnym, nieprzezroczystym pojemniku zawierającym 10% phosphate buffered formula and solution. W przypadku planowania analizy fluorochromowej należy zminimalizować ekspozycję na światło. Ponieważ fluorochromy są światłoczułe, preparat przenosi się do laboratorium i przycina do odpowiedniego rozmiaru, co poprawia utrwalenie i zapewnia jego dopasowanie do bloku.

Na tym etapie należy znać orientację tkanki na szkiełku, aby blok można było przygotować w odpowiedniej płaszczyźnie. Bardzo ważne jest zachowanie zasad bezpieczeństwa i stosowanie narzędzi w sposób zapewniający bezpieczną odległość dłoni od ostrza. Obszar zainteresowania zostaje teraz przycięty do odpowiedniego rozmiaru.

Następnie wykonuje się końcowe przycinanie za pomocą mniejszej piły taśmowej, co pozwala zminimalizować utratę tkanki. Po docięciu bloku do odpowiedniego rozmiaru, umieszcza się go w szczelnym, nieprzezroczystym pojemniku z nowym utrwalaczem w celu zakończenia procesu fiksacji. Objętość pojemnika powinna być około 10 razy większa niż rozmiar próbki.

Aby uzyskać odpowiednią fiksację, preparat powinien pozostawać w roztworze od jednego do dwóch tygodni, w zależności od jego wielkości, po czym zostaje przeniesiony do 70% etanolu. Następnie przeprowadza się powolne przetwarzanie, ponieważ duży rozmiar bloków oraz niska przepuszczalność kości powodują powolną dyfuzję rozpuszczalników. Odwodnienie jest następnie realizowane przy użyciu rosnących stężeń etanolu, a następnie następuje przejaśnianie w butanolu. Preparat należy przechowywać w ciemności i pod stałym mieszaniem.

Zalecamy pozostawienie próbek w każdym z roztworów przez około jeden tydzień. Przetwarzanie trwa zatem od czterech do sześciu tygodni. Nie należy przyspieszać tego procesu, ponieważ obniży to końcową jakość preparatów.

Dostępnych jest wiele opcji zatapiania dla skalcyfikowanej kości. Wybór żywicy lub metakrylanu zależy od tego, co ma zostać poddane badaniu. Na przykład immunohistochemia nie jest możliwa do przeprowadzenia przy użyciu wszystkich rodzajów żywic.

Żywice epoksydowe wymagają światła UV do utwardzania, co mogłoby zakłócić analizę fluorochromową. Zalecamy zapoznanie się ze specyfikacjami producenta przed dokonaniem starannego wyboru. Stosujemy TEVI 7, 100, ponieważ pozwala to na uzyskanie wysokiej jakości skrawków i szlifów do mikroskopii świetlnej oraz analizy fluorochromowej, a jednocześnie jest rozwiązaniem ekonomicznym.

Ważnym aspektem podczas zatapiania jest to, aby gęstość kości i gęstość medium zatapiającego były do siebie zbliżone. Jest to kluczowe przy późniejszym krojeniu bloków, szczególnie w przypadku sekcjonowania mikrotermem; mieszaninę przygotowuje się zgodnie z instrukcjami producenta i energicznie wstrząsa. Warto zatopić kilka próbek testowych w celu optymalizacji protokołu.

W przeciwieństwie do metody z parafiną, jest to etap nieodwracalny. Bloki umieszcza się powierzchnią tnącą skierowaną w dół w formie. Forma będzie większa od bloku, aby zapewnić odpowiednie wsparcie i wytrzymałość.

Infiltrację metakrylanem należy przeprowadzać powoli, aby umożliwić maksymalne przeniknięcie metakrylanu do kości. Ponownie należy zminimalizować ekspozycję na światło. Po jednym tygodniu w roztworze infiltracyjnym, roztwór ten należy wymienić i dodać roztwór utwardzający.

Następnie przygotowuje się płytkę wspierającą. W tym celu używamy tevit 30 40. Następnie zdejmuje się formę, a blok jest już gotowy.

Sekcjonowanie szlifowe pozwala na uzyskanie grubszych przekrojów o grubości od 20 do 50 mikronów. Jest to użyteczne w analizie fluorescencyjnej, ponieważ grubsze sekcje dają jaśniejszą fluorescencję. Do wykonania sekcji szlifowej niezbędny jest mikrotom, najlepiej z nożem diamentowym. Stosujemy zakrzywiony nóż diamentowy o grubości 0,6 milimetra.

Niezbędne jest zastosowanie środka smarnego. Preferowany jest smar na bazie produktów naftowych, choć smary silikonowe również sprawdzają się dobrze. Następnie blok umieszcza się w zacisku.

Jest on zamocowany w makroimadle, a blok zostaje przesunięty w stronę noża. Pierwszy skrawek odsłania powierzchnię tnącą i orientuje przekrój. Należy go odrzucić.

Szlifowanie jest procesem powolnym i nie powinno być przeprowadzane w pośpiechu. Podczas szlifowania przekroju należy zapewnić odpowiednie smarowanie. Następnie przekrój umieszcza się na szkiełku podstawowym.

Można go oczyścić i wypolerować w razie potrzeby. Przekrój ma tendencję do zwijania się, dlatego zalecamy przykrycie go fragmentem woreczka strunowego i przytrzymanie go płasko za pomocą innego przedmiotu zaciśniętego w tym miejscu.

Następnie umieszcza się go w inkubatorze w temperaturze od 60 do 80 °C przez jedną godzinę. Pozwala to na zmiękczenie metakrylanu i pomaga w płaskim przytwierdzeniu się przekroju do szkiełka. Tutaj widzimy złożony obraz fluorescencyjny trzech różnych fluorochromów wstrzykiwanych w odstępach miesięcznych.

Umożliwia to identyfikację miejsca mineralizacji w określonym punkcie czasowym. Dawki i sposób przygotowania tych znaczników opisano w tekście. Metoda mikrotomii pozwala na uzyskanie cienkich skrawków, co jest optymalne dla mikroskopii świetlnej.

Jest to proces trudny pod względem technicznym. Sugerujemy zastosowanie mikrotomu ślizgowego (typu sledge), który zapewnia większą stabilność niezbędną do cięcia tych twardych bloków. Można stosować różne rodzaje noży, w tym noże z węglika wolframu.

Zalecamy jednak użycie ostrza ze stali nierdzewnej, ponieważ można je łatwo i często ostrzyć w razie potrzeby. Ostrze powinno być ustawione pod kątem 45 stopni względem bloku. Gęstość metakrylanu jest podatna na wiele czynników, w tym na wilgotność powietrza w pomieszczeniu.

Blok powinien być zatem przechowywany w suchym miejscu. Jeśli zajdzie potrzeba, zmiękczenie można uzyskać, przykładając do bloku wilgotny papier; uzyskanie odpowiednich warunków cięcia w celu otrzymania wysokiej jakości skrawka może wymagać wykonania kilku sekcji. Ponownie, worek strunowy i dodatkowy szkiełko są zaciskane, aby spłaszczyć skrawek przed umieszczeniem go w inkubatorze.

Barwienie jest podobne do standardowej histologii preparatów zatopionych w parafinie, z tą różnicą, że proces woskowania jest oczywiście zbędny. Powszechnie stosowane barwienia kości obejmują VSA z przeciwbarwieniem szafranem, szafran, zieleń świetlistą oraz masson golden as trione. Protokoły dla tych metod są opisane w tekście.

Odczynniki są dobierane i filtrowane przed użyciem. Złoty. Barwnik ten jest często stosowany w histoptometrii. Zalecamy najpierw zoptymalizować barwienie na preparatach testowych.

Po każdym kroku można obejrzeć preparat pod mikroskopem, aby upewnić się, że barwienie przebiega prawidłowo. Pozwala to na ustalenie właściwego czasu barwienia dla każdego z komponentów. Po zoptymalizowaniu standardu barwienia wszystkie preparaty z eksperymentu barwi się jednocześnie w statywie według tego samego protokołu, aby uniknąć zmienności barwienia, która mogłaby wpłynąć na ich geometrię termiczną.

Następnie preparaty zostaną przykryte szkiełkami w standardowy sposób. Życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.