Mozaikowa transgeneza danio pręgowanego do oceny sekwencji wzmacniających
16 lipca 2010
Pokazujemy nasze podejście do znajdowania potencjalnych elementów wzmacniających z genów regulowanych rozwojowo i oceny ich funkcji poprzez mozaikową transgenezę danio pręgowanego.
Cześć, nazywam się Erica Kgi i pracuję w laboratorium Shannon Fisher na Wydziale Biologii Komórki i Rozwoju Uniwersytetu Pensylwanii. Nazywam się Chris Weber i również pracuję w Fisher Lab. Nazywam się Shannon Fisher.
Dzisiaj pokażemy Ci procedurę analizy funkcji elementów wzmacniających za pomocą transgenezy danio pręgowanego. Używamy tej procedury do badania regulacji transkrypcji genów ważnych w rozwoju szkieletu. Więc zacznijmy.
Aby zidentyfikować niekodujące sekwencje otaczające geny kandydujące, używamy algorytmu fast cons, który jest dostępny jako ścieżka w przeglądarce genomu uc SC. Interesują nas przede wszystkim geny ulegające ekspresji podczas rozwoju szkieletu, ale to samo podejście można zastosować do badania dowolnych genów ulegających ekspresji we wczesnym okresie rozwoju. W przedstawionym tutaj przykładzie zidentyfikowaliśmy sekwencje konserwatywne.
W przedziale otaczającym ludzki gen zderzaka badamy cały przedział do sąsiednich genów i określamy odcięcie wyniku logarytmu o niskim rozmiarze, odpowiadające w przybliżeniu górnym 5% sekwencji niekodującej. Po wybraniu sekwencji, zaprojektuj startery przy użyciu startera trzeciego do amplifikacji każdej sekwencji z ludzkiego genomu, startery DNA powinny być wybrane do amplifikacji konserwatywnego regionu plus 30 lub więcej par zasad po każdej stronie. Amplifikuj obszar zainteresowania wysokiej jakości polimerazą przy użyciu ludzkiego genomowego DNA, użyj standardowych laboratoryjnych procedur biologii molekularnej, aby sklonować amplifikowany produkt do wektora ekspresji.
Wektorem używanym w tym protokole jest brama PG wc FOS GFPA. Wektor docelowy. Po utworzeniu wektora kazano mu transponować.
Enzym niezbędny do transpozycji jest najpierw transkrybowany in vitro przy użyciu zestawu maszynowego M message M firmy Ambion i plazmidu PGB 600 przed eksperymentalnymi iniekcjami. Przetestuj każdą partię transpozycji pod kątem skuteczności, wstrzykując znany wzmacniacz, taki jak skarpetki dla myszy. 10 wzmacniacz.
Aby przygotować się do wstrzyknięcia, należy wyciągnąć igły używane do mikroiniekcji ze szkła kapilarnego o średnicy 1,2 milimetra na ściągaczu do mikropipet Sutter P 97. Użyj programu, który daje mocną końcówkę z ostrym stożkiem, aby przeniknąć nienaruszone coriony za pomocą czystej żyletki i szkiełka mikrometrycznego. Połam końcówki ręcznie pod mikroskopem stereoskopowym do średnicy zewnętrznej około 15 mikrometrów.
Igły można przechowywać przez jeden dzień w przykrytym naczyniu. Utrzymuj populację danio pręgowanego w regularnym cyklu jasnego i ciemnego z 14 godzinami światła w standardowych warunkach na dzień przed wykonaniem mikroiniekcji. Przygotuj ryby do krycia w określonym czasie w małych zbiornikach hodowlanych.
Umieść trzy samice lub dwa samce na zbiornik w równoległych rzędach rano w dniu mikrowstrzyknięć, wkrótce po rozpoczęciu cyklu świetlnego. Połącz samce i samice w czystej uzdatnionej wodzie do produkcji jaj. Często sprawdzaj ryby i zbieraj ikrę w ciągu kilku minut od produkcji, aby uzyskać dobrze zsynchronizowane partie.
Utrzymuj produkcję jaj przez dwie do trzech godzin, kontynuując łączenie świeżych grup ryb przez cały poranek za pipetą o szerokim otworze o średnicy pięciu i ćwierć cala wyposażoną w lateksową bańkę. Zebrane zarodki należy posortować na szalki Petriego o wymiarach 60 na 15 milimetrów, częściowo wypełnione pożywką zarodkową w grupach po 50 zarodków. Zaznacz zebrany czas na pokrywie każdego naczynia.
Na każdy pobrany lęg zarodków zachowaj półmiskę z 50 zarodkami do kontroli wstrzykniętej między pobraniami komórek jajowych. Przygotuj świeże roztwory do wstrzykiwań, mieszając następujące składniki w mikroprobówce do fuge i przechowuj na lodzie. Umieścić igły do wstrzykiwań w naczyniach do przytrzymywania i napełnić 1,5 do dwóch mikrolitrów roztworu do wstrzykiwań.
Pipetując 500 nanolitrowych kropli na szeroki koniec każdej igły. Ciecz zostanie wciągnięta do końcówki poprzez działanie kapilarne. Przygotować co najmniej dwie igły do każdego roztworu do wstrzykiwań.
Załaduj napełnioną igłę do ręcznego uchwytu igły pneumatycznej pompy pico lub podobnego wtryskiwacza ciśnieniowego. Skonfigurowany i podłączony do zbiornika azotu zgodnie z instrukcjami producenta. Kalibruj objętości wtrysku, mierząc średnicę kropel wydalanych do oleju mineralnego na szkiełku mikrometrycznym, zwykle czas wtrysku wynosi 120 milisekund.
Przy ciśnieniu 20 PS uzyskam kroplę o wielkości około jednego nanolitra za pomocą mikroskopu stereoskopowego przy powiększeniu od sześciu do 10 razy. Przytrzymaj zarodek na miejscu za pomocą cienkich kleszczy i wepchnij igłę do wstrzykiwań ze stałym naciskiem przez korion do żółtka zarodka w stadium jednokomórkowym lub wczesnym etapie dwukomórkowym, umieść końcówkę igły w żółtku tuż pod blastomerami, wydal około jednego litra roztworu do wstrzykiwań i wycofaj igłę dla każdego wstrzykniętego przez nas konstruktu, który wstrzykujemy, większej lub równej 200 zarodkom po zakończeniu wstrzyknięcia. Sortuj zarodki, usuwając niezapłodnione jaja, uszkodzone zarodki i nieudane zastrzyki lub zarodki bez czerwieni fenolowej w bluźnierstwach.
Następnie inkubujemy zarodki i pożywkę zarodkową w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza do odpowiedniego czasu na obserwacje. Teraz pokażemy Ci kilka reprezentatywnych wyników elementów wzmacniających, które wytwarzają specyficzne dla tkanek wzorce ekspresji GFP w zarodku danio pręgowanego. Badamy geny ulegające ekspresji w kościach lub chrząstkach podczas.
Oto przykład elementu wzmacniającego przed genem acan, który reguluje ekspresję w chrząstce twarzowej czaszki po trzech dniach od zapłodnienia. Oto kolejny wzmacniacz, tym razem z genu zderzaka, który reguluje ekspresję w komórkach kostnych. Po pięciu dniach z wielu wzmacniaczy, które zidentyfikowaliśmy, znajdujemy niewielką korelację między lokalizacją w stosunku do genu a regulacją ekspresji.
Wybierając sekwencje do testowania, należy pamiętać, że wzmacniacz może znajdować się w setkach kilozasad przed lub za genem lub w jednym z intronów, jak widać w tym zarodku. Wydaje się, że znaczna część sekwencji nie reguluje ekspresji specyficznej dla tkanki. Często wykazują one bardzo małą fluorescencję lub mogą mieć kilka rozproszonych komórek w dwóch typowych miejscach ekspresji ektopowej, naskórku i mięśniach szkieletowych.
Właśnie pokazaliśmy, jak zidentyfikować potencjalne elementy wzmacniające poprzez zachowanie sekwencji i przetestować ich funkcję poprzez transgenezę mozaiki u danio pręgowanego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zbadać jakość DNA i RNA do wstrzyknięć. Pamiętaj również, aby dokładnie zbadać wszystkie wstrzyknięte zarodki, zwłaszcza jeśli spodziewasz się ekspresji tylko w małej grupie sprzedawców.
Więc to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł demonstruje procedurę analizy elementów enhancer przy użyciu transgenezy u rybki zebrowej. Celem jest badanie regulacji transkrypcyjnych genów istotnych dla rozwoju szkieletu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwojowa
- Genetyka
- Modele rybki zebrowej
Tło
- Elementy enhancer odgrywają krytyczną rolę w regulacji genów.
- Ryby zebrowe są cennym modelem do badania procesów rozwojowych.
- Rozumienie regulacji transkrypcyjnej jest istotne dla wglądu w rozwój szkieletu.
- Celem tego badania jest zidentyfikowanie i ocena funkcji enhancerów.
Cel badania
- Znalezienie potencjalnych elementów enhancer w genach regulowanych rozwojowo.
- Ocena funkcji tych enhancerów poprzez transgenezę.
- Zwiększenie zrozumienia regulacji genów w rozwoju szkieletu.
Stosowane metody
- Technika mozaikowej transgenezy u rybki zebrowej.
- Analiza elementów enhancer związanych z określonymi genami.
- Ocena aktywności transkrypcyjnej w modelach rybki zebrowej.
- Projekt eksperymentu skupiony na genach rozwoju szkieletu.
Główne wyniki
- Identyfikacja kluczowych elementów enhancer związanych z rozwojem szkieletu.
- Udana implementacja transgenezy do badania funkcji enhancerów.
- Wgląd w mechanizmy regulacji transkrypcyjnej.
- Potencjalne implikacje dla zrozumienia biologii rozwoju.
Wnioski
- To badanie zapewnia ramy dla analizy elementów enhancer.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia regulacji genów w rozwoju.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych metodach, aby zbadać inne procesy rozwojowe.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Evaluating enhancer sequences in zebrafish provides a rapid, cost-effective system for functional validation of non-coding regulatory elements from human DNA. This approach supports target validation by linking sequence conservation to spatial and temporal gene expression in a vertebrate model. It enables mechanistic de-risking of enhancer hypotheses before investing in costly mammalian models or screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Functional assessment of enhancer activity in a native chromatin context.
- Operational Value: High-throughput testing of human non-coding sequences via microinjection.
- Predictive Value: Correlation of sequence conservation with tissue-specific GFP expression patterns.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Standardized microinjection protocol enables reproducible enhancer screening.
- Quantitative Output: Spatial and temporal GFP expression serves as a functional readout.
- Scalability: Capacity to test >200 embryos per construct for statistical confidence.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Enhancers from skeletal development genes (e.g., acan, bumper) model regulatory mechanisms in tissue formation.
- Translational Continuity: Zebrafish expression patterns inform mammalian enhancer function predictions.
- Risk Mitigation: Early identification of non-functional sequences reduces false positives in downstream assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to assess enhancer function prior to lead identification, using zebrafish as a disease-relevant system for mechanistic insight.
- Discovery Biology: Tests transcriptional regulation of developmentally important genes via enhancer cloning and transgenesis.
- Screening: Enables assay development for enhancer activity using GFP as a quantitative reporter.
- Analytics: Spatial expression patterns support comparative analysis of enhancer strength and specificity.
- Translational Research: Links non-coding sequence function to phenotypic outcomes in skeletal development.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to any human non-coding sequence for cross-project enhancer evaluation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of enhancer hypotheses through direct functional readout.
- Operational Value: Standardized workflow from sequence selection to embryo injection and imaging.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions on regulatory element prioritization.
- Portfolio Impact: Enhances confidence in non-coding target selection for therapeutic modulation.
Implementation Considerations
- Molecular biology expertise in cloning and transposase preparation.
- Microinjection equipment and zebrafish facility access.
- Standardization of embryo staging and injection timing.
- Adaptation to different enhancer constructs via primer design and vector cloning.
- Limitations include mosaic expression requiring embryo sorting and phenotypic validation.
