Name: Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek i cytoszkieletu aktynowego poszczególnych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-03T16:25:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w zarodkach Danio rerio. Technika fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej pozwala analizować dynamikę aktyny i ruchliwość komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była finansowana przez NIH R01 NS042228 dla M.C.H. Konfokalny mikroskop Olympus FV1000 został zakupiony dzięki grantowi NIH na wspólną aparaturę S10RR023717 dla Katedry Zoologii UW (PI Bill Bement).
Erica Andersen, Namrata Asuri i Matthew Clay wnieśli równy wkład w tę pracę.

1. Montaż szkiełek do iniekcji i szkiełek do obrazowania
Preparaty do wstrzykiwania:
<ol>
	<li>Przygotuj elastomer silikonowy Sylgard zgodnie z instrukcją producenta.</li>
<li>Użyj preparatu Sylgard do połączenia trzech standardowych szkiełek przedmiotowych, nakładając jedno szkiełko na przecięcie dwóch pozostałych, które ułożone są obok siebie długimi krawędziami. Górne szkiełko tworzy kąt prosty lub „ściankę” pomiędzy szkiełkiem górnym a dolnymi.</li>
<li>Pozostaw Sylgard do zastygnięcia na noc. Tak przygotowane szkiełka mogą być użyte ponownie.</li>
</ol>
Preparat do obrazowania:
<ol>
	<li>Używamy prostokątnych płytek ze stali nierdzewnej dociętych do rozmiaru standardowego szkiełka przedmiotowego (75mm X 25mm X 1mm), aby komora pasowała do uchwytu szkiełek na stoliku mikroskopu. Na środku prostokąta wycina się otwór o średnicy 1,5 cm.</li>
	<li>Do metalowego prostokąta przytwierdza się szkiełko nakrywki o powierzchni 2 mm2 za pomocą Sylgardu. Należy użyć takiej ilości Sylgardu, która zapewni szczelne zamknięcie szkiełka nakrywkowe. W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopu odwróconego, embriony zostaną zamontowane na tej nakrywce i obrazowane od dołu.</li>
	<li>Sylgard pozostawia się do zastygnięcia przez noc. Płytki te można wykorzystać wielokrotnie; pomiędzy użyciami oczyszcza się je 70% etanolem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie konstruktów DNA
Aby uzyskać ekspresję transgenu w sposób tkankowo specyficzny, klonuje się gen zainteresowania za promotorem specyficznym dla danej komórki. Wykorzystujemy cis-element regulacyjny danio-pręgowanego neurogenina 1 gen (-3,1 ng/ml)2 lub dla sox10 gen (-4,9sox10)3 w celu sterowania ekspresją odpowiednio w neuronach sensorycznych lub komórkach grzebienia neuronalnego. Aby zwizualizować dynamikę komórek i błon, wyrazamy fluorofory cytoplazmatyczne lub zlokalizowane w błonie. W celu obrazowania rozkładu F-aktyny wyrazamy DNA kodujące domenę homologii kalponiny utrofiny połączoną z mCherry (UtrCH-mCherry). Sonda biosensorowa UtrCH-mCherry pozwala na wizualizację F-aktyny bez zakłócania dynamiki aktyny1Konstrukty DNA te generujemy przy użyciu strategii klonowania opartego na rekombinacji Invitrogen Gateway.4 oraz wektory dostarczone w zestawie Tol2kit dla danio przebrzanego5.
<ol>
	<li>Wygenerować wektor(y) ekspresyjne, wykorzystując technologię Multisite-Gateway oraz wektory z zestawu zebrafish Tol2kit5. Plazmidy zawierają szkielet Tol2 z pT2KXIGDin.</li>
	<li>Oczyścić DNA plazmidowe za pomocą zestawu QIAfilter Plasmid Midi Prep (QIAGEN Inc.) i eluować w sterylnej wodzie. DNA nie wymaga linearyzacji przed iniekcją.</li>
</ol>
3. Wstrzykiwanie konstruktów DNA
<ol>
 <li>Rozcieńcz DNA do końcowego stężenia od 10 do 50 μg/ml DNA w wodzie z dodatkiem 0,2% czerwieni fenolowej (w celu wizualizacji podczas wstrzykiwania).</li>
 <li>Napełnij i skalibruj igłę: Napełnij od tyłu dociągniętą igłę kapilarną około 1 μl roztworu DNA i włóż ją do uchwytu igły w aparaturze do mikroiniekcji (stosujemy Picospritzer). Za pomocą precyzyjnej pęsety odłam końcówkę igły tak, aby otwór wierzchołka miał średnicę około 10 μm. Zmierz średnicę kropli w oleju mineralnym za pomocą mikrometru okularowego. Dostosuj ustawienie czasu trwania ciśnienia, aby uzyskać kroplę o objętości około 1 nl.</li>
 <li>Zbierz zarodki w stadium 1 komórki w podłożu dla zarodków E3 (5mM NaCl, 0,17mM KCl, 0,3mM CaCl2, 0,33mM MgSO4*7H2O, pH 7,0).</li>
 <li>Przenieś około 30-60 zarodków na szkiełko do iniekcji i ustaw je w prawym kącie utworzonym przez górne i dolne szkiełko. Usuń większość podłoża E3, aby zarodki były przytrzymywane do szkiełka przez napięcie powierzchniowe.</li>
 <li>Użyj zgiętej szpilki sekcyjnej, aby obrócić zarodki tak, by komórka przylegała do ścianki szkiełka do iniekcji.</li>
 <li>Za pomocą mikromanipulatora przeprowadź igłę przez chorion zarodka, przez żółtko i do pojedynczej komórki zarodka. Wstrzyknij do komórki 0,5-1 nl roztworu DNA.</li>
 <li>Przenieś zarodki do naczyń Petriego z podłożem E3 i inkubuj w temperaturze 28,5°C. W razie potrzeby rozwój można spowolnić, inkubując zarodki w niższej temperaturze.</li>
</ol>
4. Montaż embrionów do obrazowania
<ol>
	<li>Usuń błony chorionowe z embrionów za pomocą precyzyjnej pęsety około godzinę przed osiągnięciem przez embriony pożądanego wieku do obrazowania (w naszym przypadku około 14–17 godzin po zapłodnieniu).</li>
 <li>Wybierz embriony z komórkami znakowanymi, korzystając z mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w moduł fluorescencji. Używamy obiektywu 4X (powiększenie 40X) w mikroskopie Nikon AZ10 ze względu na połączenie długiego dystansu roboczego i dużego powiększenia.</li>
 <li>Umieść zarodek w probówce do mikrowirówki z około 50 μl E3 zawierający 0,2% anestetyku Tricaine (stężenie 10X).</li>
 <li>Dodaj 500 μl 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w buforze E3 z 10 mM HEPES (przechowywany w 42°C), rozcieńczając Tricaine do stężenia końcowego 0,02%. </li>
 <li>Natychmiast przenieść zarodek w kropli agarozy na szkiełko nakrywkowe slajdu do obrazowania, używając szklanej pipety o szerokim wylocie. </li>
 <li>Zanim agaroza stwardnieje, ustaw zarodek tak, aby obszar z oznakowanymi komórkami był skierowany w dół, przylegając do dolnego szkiełka nakrywki (stroną grzbietową dołu w przypadku komórek grzebienia neuronalnego oraz stroną grzbietowo-boczną dołu w przypadku neuronów czuciowych rdzenia kręgowego).</li>
 <li>Montaż komory obrazującej: Jedną stronę plastikowego pierścienia (średnica zewnętrzna 2 cm, wysokość 3 mm) pokryć silikonowym smarem próżniowym i przytwierdzić do metalnego szkiełka do obrazowania. Drugą stronę pierścienia pokryć smarem. </li>
 <li>Napełnić komorę roztworem E3 zawierającym 10 mM HEPES oraz 0,02% trikainy. Uszczelnić górną część komory, mocując 2-milimetrowy2 szkiełko nakrywkę do nasmarowanej tłuszczem górnej powierzchni pierścienia.</li>
</ol>
5. Obrazowanie 4D zachowań komórkowych przy użyciu konfokalnego mikroskopu Olympus FV10 z mikroskopem IX81
Szczegóły akwizycji obrazów będą zależeć od specyfiki Twojego systemu mikroskopowego. Poniżej opisano proces akwizycji time-lapse dla konfokalnego mikroskopu Olympus FV100. Patrz poprzedni protokół JoVE dotyczący akwizycji time-lapse z wykorzystaniem systemu konfokalnego Zeiss LSM 5106.
<ol>
 <li>Umieść komorę obrazującą w uchwycie na preparaty na stole mikroskopu i ustaw ostrość na embrion, korzystając z obiektywu 10X lub 20X w świetle przechodzącym.</li>
 <li>Przełącz na obiektyw 60X (N.A. 1,2 lub wyższa) i ustaw ostrość na znakowaną komórkę przy użyciu epifluorescencji. Używamy obiektywu z imersją olejową (UPLSAPO 60xO N.A. 1,35) lub imersją wodną (UPLSAPO 60xW N.A. 1,20).</li>
 <li>W oprogramowaniu FV (Ver 1.7c) kliknij XY repeat, aby rozpocząć skanowanie laserowe.</li>
 <li>Dostosuj ustawienia akwizycji i parametry sterowania obrazowaniem (moc lasera, prędkość skanowania, HV, wzmocnienie oraz poziomy offsetu), aby zoptymalizować sygnał, utrzymując moc lasera na minimalnym poziomie (25% lub mniej), aby zapobiec uszkodzeniu tkanki i ograniczyć fotobielenie.</li>
 <li>Aby uzyskać serię Z, ustaw górną i dolną granicę stosu Z oraz wielkość kroku. Upewnij się, że ikona Depth jest aktywna, tak aby w ikonie XY Sweep podświetlone były wartości XY i Z. Rozpocznij akwizycję, klikając ikonę XYZ Sweep.</li>
 <li>Aby uzyskać serię time-lapse, ustaw interwał czasowy i liczbę punktów czasowych w sekcji TimeScan w oknie Acquisition Settings. Kliknij ikonę Time w oknie Image Acquisition Control, tak aby w ikonie XY Sweep podświetlone były wartości XY(Z) i T. Rozpocznij akwizycję, klikając ikonę XY(Z)T Sweep.</li>
 <li>Alternatywnie do konfiguracji time-lapse można użyć TimeController. Programowanie to jest przydatne przy generowaniu dużych zbiorów danych, ponieważ nie przekracza ono przydzielonej pamięci. W sekcji Device otwórz okno TimeController. Utwórz nowe zadanie obrazowania (Imaging Task). Otworzy się okno parametrów obrazu. Kliknij przycisk FV Status, aby zaktualizować ustawienia akwizycji. Upewnij się, że w sekcji Terminate zaznaczone są opcje Save i Delete. Ustaw nazwę pliku wyjściowego i kliknij OK, aby zapisać ustawienia i zamknąć okno. Użyj funkcji Loop, aby ustawić żądany interwał czasowy i liczbę punktów czasowych. Kliknij Ready i Start, aby rozpocząć akwizycję. Funkcje Pause i Z-shift mogą być wykorzystywane do ponownego ustawienia ostrości podczas obrazowania.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Ryciny i filmy przedstawiają przykłady neuronów sensorycznych oraz komórek grzebienia neuronalnego znakowanych fluoroforami targetowanymi do błony komórkowej lub sondą biosensora aktyny.
<img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig1.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający strukturę neuronu; markery czerwone i zielone sygnalizują szlaki neuronalne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Obrazy konfokalne (projekcje z) a Tg(ngn1:gfp-caax) zarodek transgeniczny wstrzyknięty z 25 pg ngn1:mCherry-caax DNA. mCherry-CAAX znakuje jeden neuron na czerwono (A) na tle, w którym wszystkie neurony sensoryczne Rohona-Bearda są znakowane na zielono (B). C) Złożony obraz obu kanałów, zielonego i czerwonego. Pasek skali = 50 μm.
<img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig2.jpg" alt="Wzrost dendrytów neuronalnych: mikroskopia fluorescencyjna; analiza w neurobiologii rozwojowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rycina 2. Konfokalne projekcje z neuronów w embrionach wstrzykniętych z ilością ~20 pg ngn1:mCherry-UtrCH DNA A) Neuron sensoryczny Rohona-Bearda w embrionie w 16,5 hpf. Sygnał F-aktyny jest silny w stożkach wzrostu (groty strzałek) oraz w wypustkach wzdłuż nowo utworzonych aksonów. B) Neuron w embrionie w 20. godzinie rozwoju (hpf), wykazujący silny sygnał F-aktyny w stożkach wzrostu rozgałęzionego aksonu obwodowego (groty strzałek) oraz słabszy sygnał w bardziej dojrzałych aksonach centralnych (strzałki). Pasek skali = 50 μm.

<ol><li>Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li>
<li>Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+regulatory+elements+with+spatially+and+temporally+distinct+activities+control+neurogenin1+expression+in+primary+neurons+of+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo.</a> Mech Dev. 120, 211-218 (2003).</li>
<li>Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li>
<li>Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerted+assembly+and+cloning+of+multiple+DNA+segments+using+in+vitro+site-specific+recombination%3A+functional+analysis+of+multi-segment+expression+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones.</a> Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).</li>
<li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li>
<li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li>
</ol>

Optymalne stężenie wstrzykiwanego DNA będzie się różnić w zależności od wielkości i siły konstruktu promotora i powinno zostać określone empirycznie. Wstrzyknięcie zbyt dużej ilości DNA może prowadzić do powstania niezdrowych embrionów z rozległą śmiercią komórek, natomiast zbyt mała ilość spowoduje, że tylko bardzo niewielka część wstrzykniętych embrionów będzie wykazywać ekspresję transgenu. Poziom ekspresji DNA koreluje z siłą sygnału fluoroforu, która różni się między poszczególnymi komórkami. Podczas sortowania embr...

<table><tbody><tr><td>Trykaina (metanosulfonian etylu 3-aminobenzoalanu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do elastomeru silikonowego Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw QIAfilter Plasmid Midi</td><td>Qiagen</td><td>12243</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>051-0302-900</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Danio przebrzosławny jest idealnym modelem do obrazowania zachowań komórek podczas rozwoju in vivo. Zarodki danio są zapładniane zewnętrznie, co sprawia, że są łatwo dostępne na wszystkich etapach rozwoju. Ponadto ich przejrzystość optyczna umożliwia obrazowanie dynamiki komórkowej i molekularnej o wysokiej rozdzielczości w naturalnym środowisku nienaruszonego zarodka. Stosujemy metodę obrazowania na żywo w celu analizy zachowań komórek podczas migracji komórek grzebienia neuronalnego oraz wzrostu i prowadzenia aksonów neuronalnych.
Obrazowanie na żywo jest szczególnie przydatne w zrozumieniu mechanizmów regulujących procesy ruchliwości komórek. Aby zwizualizować szczegóły ruchliwości komórkowej, takie jak aktywność protrusyjna i dynamika molekularna, korzystne jest znakowanie pojedynczych komórek. U danio pręgowanego iniekcja plazmidowego DNA prowadzi do przejściowego mozaikowego wzorca ekspresji i oferuje wyraźne zalety w porównaniu z innymi metodami znakowania komórek. Na przykład linie transgeniczne często znakują całe populacje komórek, co może utrudniać wizualizację drobnych wypustek (lub zmian w rozkładzie molekularnym) w pojedynczej komórce. Ponadto iniekcja DNA w stadium jednej komórki jest mniej inwazyjna i bardziej precyzyjna niż iniekcje barwników w późniejszych stadiach.
W niniejszej pracy opisujemy metodę znakowania poszczególnych rozwijających się neuronów lub komórek grzebienia nerwowego oraz obrazowania ich zachowania in vivo. Wstrzykujemy plazmidowe DNA do embrionów w stadium jednej komórki, co prowadzi do mozaikowej ekspresji transgenu. Wektory zawierają specyficzne dla danych komórek promotory, które sterują ekspresją interesującego genu w podgrupie neuronów sensorycznych lub komórek grzebienia nerwowego. Przedstawiamy przykłady komórek znakowanych GFP celowanym w błonę komórkową lub sondą biosensorem, która umożliwia wizualizację F-aktyny w żywych komórkach1.
Erica Andersen, Namrata Asuri i Matthew Clay wnieśli równy wkład w tę pracę.

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Danio pręgowany jest idealnym modelem do obrazowania zachowań komórek podczas rozwoju in vivo. Zarodki danio pręgowanego są zapładniane zewnętrznie, co sprawia, że są łatwo...

Aby zobrazować zachowanie poszczególnych komórek in vivo, do embrionów rybek danio wstrzykuje się plazmidowy DNA zawierający specyficzny dla komórki promotor sterujący ekspresją fluorescencyjnego białka lub biosensora. Dynamiczne zmiany w rozkładzie efektu są wizualizowane in vivo przy użyciu biosensora opartego na domenie wiążącej utrofinę. Nowo zapłodnione embriony są ustawiane wzdłuż szkiełka do wstrzykiwania i umieszczane w narożniku utworzonym pomiędzy górnym a dolnym szkiełkiem.DNA kodujące fluorofory lub biosensory jest wstrzykiwane do komórki. Następnego dnia embriony są montowane w agarozie.Na szkiełku do obrazowania embriony są ustawione etykietowanymi komórkami do dołu, a komora jest zamknięta szkiełkiem nakrywkowym. Cześć, jestem Erica Anderson z Laboratorium Mary Hallin oraz z wydziałów Zoologii i Anatomii na Uniwersytecie Wisconsin w Madison. Jestem Nam Tauri, również z Laboratorium Hallin.Jestem Matt Clay z laboratorium Hallin. Dzisiaj przedstawimy procedurę obrazowania na żywo pojedynczo znakowanych komórek w embrionach rybek danio-ostrobłotników. Stosujemy tę procedurę w laboratorium do badania motywności komórek oraz dynamiki aktyny podczas wzrostu aksonów i migracji komórek grzebienia neuronalnego.Zacznijmy zatem. Aby przygotować slajdy do iniekcji, w pierwszej kolejności przygotuj elastomer silikonowy Cyl Guard zgodnie z instrukcjami producenta. Wymieszaj 10 części bazy elastomeru z jedną częścią utwardzaczem.Użyj osłony cylindrycznej, aby połączyć trzy standardowe szklane lamelki. Ułóż dwie lamelki obok siebie wzdłuż ich dłuższych krawędzi. Na trzecią lamelkę nałóż ARD i umieść ją na wierzchu pozostałych dwóch lamelki.Użyj takiej ilości wosku do uszczelniania (cigar), aby zabezpieczyć preparaty, unikając nadmiernego wypływania materiału spomiędzy szkiełek. Wszelkie nadmiary można usunąć następnego dnia za pomocą żyletki. Pozostaw zabezpieczenie SIL do zastygnięcia przez noc w przypadku preparatów przeznaczonych do obrazowania.Używamy prostokątnych płytek ze stali nierdzewnej wyciętych do rozmiaru standardowego szkiełka przedmiotowego z otworem o średnicy 1,5 centymetra wyciętym w centrum. Szkiełko cover slip o wymiarach 22 mm x 22 mm jest przytwierdzone do stalowego prostokąta za pomocą syl guard. Zarówno szkiełka do iniekcji, jak i szkiełka do obrazowania są wielokrotnego użytku i mogą być czyszczone pomiędzy zastosowaniami 70% ethanol, a następnie płukane wodą przed iniekcją embrionów.Rozcieńcz DNA do końcowego stężenia od 10 do 50 µg/mL. DNA w 0,2% czerwieni fenolowej w wodzie. Czerwień fenolowa umożliwia wizualizację podczas wstrzykiwania.Następnie napełnij i skalibruj igłę. Napełnij kapilarną igłę apol od tyłu, wprowadzając około mikrolitrów roztworu DNA. Odczekaj, aż igła się napełni, a następnie za pomocą precyzyjnej pęsety włóż ją do uchwytu igły w aparacie do wtryskiwania.Odetnij końcówkę igły tak, aby otwór w końcówce miał średnicę około 10 µm. Zmierz średnicę kropli w oleju mineralnym za pomocą mikrometru okularowego. Aby obliczyć objętość iniekcji, dostosuj ustawienie czasu trwania w piko-rozpylaczu.Zatem średnica kropli wynosi 0,12 µm, co odpowiada objętości około jednego nanolitra. Typowy czas trwania wynosi od 10 do 30 ms. Zebrać zarodki w stadium jednego komórki w medium E3 i przenieść około 30–60 zarodków na szkiełko do iniekcji.Umieść embriony wzdłuż krawędzi górnego szkiełka i usuń większość medium E3 za pomocą zgiętej igły sekcyjnej, tak aby embriony przylegały do szkiełka dzięki napięciu powierzchniowemu. Obróć embriony tak, aby komórka przylegała do ścianki szkiełka do mikroiniekcji. Używając mikromanipulatora, wprowadź igłę przez chorion embrionu, przez żółtko i do pojedynczej komórki embrionu.Wstrzyknij od 0,5 do 1 nanolitra roztworu DNA do komórki. Przenieś wstrzyknięte embriony do naczyń Petri z E3 i umieść je w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C. W razie potrzeby rozwój można spowolnić, inkubując embriony w niższej temperaturze w dniu następującym po wstrzyknięciu.Przygotuj zarodki do obrazowania na około godzinę przed osiągnięciem przez nie pożądanego wieku do obrazowania. Usuń COR-y z zarodków za pomocą precyzyjnej pęsety. Zazwyczaj rozpoczynamy obrazowanie zarodków około 14 do 17 godzin po zapłodnieniu.Następnie, przy użyciu mikroskopu stereoskopowego z fluorescencją, wybierz embriony z oznakowanymi komórkami; stosujemy obiektyw Forex w mikroskopie Nikon Z 100 ze względu na połączenie dużej odległości roboczej i wysokiego powiększenia. Umieść embrion w probówce typu microfuge z około 50 µL V3. Za pomocą szerokiej pipety Pasteura dodaj roztwór TCA oraz stopiony 1% agar o niskiej temperaturze topnienia (low melting point agarose), aby uzyskać końcowe stężenie TCA wynoszące 0,02%.Niezwłocznie przenieś embrion z kropli agro na szkiełko nakrywkowe preparatu do obrazowania; zanim agar stwardnieje, ustaw embrion tak, aby obszar z oznakowanymi komórkami był skierowany w dół, przylegając do dolnego szkiełka nakrywkowego. Następnie złóż komorę obrazowania. Pokryj jedną stronę plastikowego pierścienia silikonowym smarem próżniowym i przymocuj go do metalowej podstawy do obrazowania.Na drugą stronę pierścienia nanieść warstwę smaru. Komorę wypełnić medium E3 zawierającym 10 mM HEPES oraz 0,02% Triton X-100. Zamknąć górę komory, mocując szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm do nasmarowanej górnej powierzchni pierścienia. Zarodek jest teraz gotowy do obrazowania 4D, co zostanie omówione w następnej sekcji.Szczegóły akwizycji obrazu będą zależeć od specyfiki posiadanego systemu mikroskopowego. W tym przypadku demonstrujemy proces akwizycji time-lapse dla mikroskopu konfokalnego Olympus FB 1000. W celu uzyskania informacji na temat akwizycji time-lapse z systemem konfokalnym Zeiss LSM 510 należy zapoznać się z poprzednim protokołem JoVE.Umieść komorę obrazującą w uchwycie na preparaty na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość na zarodek, używając obiektywu 10 x lub 20 x. Przy świetle przechodzącym przełącz na obiektyw 60 x z aperturą numeryczną 1,2 lub wyższą i ustaw ostrość na znakowaną komórkę, korzystając z fluorescencji epifokalnej w oprogramowaniu FV. Kliknij opcję xy repeat, aby rozpocząć skanowanie laserowe.Dostosuj ustawienia akwizycji oraz elementy sterujące obrazowaniem w celu optymalizacji obrazu przed wykonaniem serii Z. Ustaw górną i dolną granicę zakresu Z oraz wielkość kroku. Aktywuj ikonę głębokości w oknie sterowania akwizycją obrazu i rozpocznij akwizycję, klikając ikonę zestawu XY, Z, aby uzyskać serię time-lapse.Ustaw interwał czasowy oraz liczbę punktów czasowych w sekcji time scan. W oknie ustawień akwizycji kliknij ikonę czasu w oknie sterowania akwizycją obrazu, a następnie rozpocznij akwizycję, klikając ikonę zestawu XYZT. Przedstawiamy tutaj reprezentatywne filmy i obrazy poszczególnych znakowanych komórek.Gdy pojedyncze neurony zostaną oznakowane, ich aksony nie są przesłonięte przez inne oznakowane komórki, dzięki czemu wypustki OD na aksonach i stożkach wzrostu są wyraźnie widoczne. Ten film przedstawia neuron sensoryczny oznakowany tagiem RFP skierowanym do błony komórkowej. Neuron ten emituje dwa aksony w przeciwnych kierunkach, które wyrosły poza pole widzenia.Trzeci akson wybiega prostopadle z ciała komórki i tworzy rozgałęzienia. Podobnie, znakowanie poszczególnych komórek grzebienia neuronalnego umożliwia obrazowanie cienkich wypustek komórkowych związanych z motylością komórek. Tutaj dwie komórki grzebienia neuronalnego zostały znakowane GFP skierowanym do błony.Wykazują one intensywną aktywność protrusyjną podczas migracji w kierunku przednim. Często przydatne jest znakowanie poszczególnych komórek w linii transgenicznej w celu wizualizacji oddziaływań między sąsiadującymi komórkami w obrębie populacji. Obraz przedstawia embrion ze stabilną ekspresją GFP we wszystkich neuronach sensorycznych, do którego wstrzyknięto DNA kodujące znacznik RFP, aby zaznaczyć jeden neuron na czerwono na tle zielonych neuronów po wstrzyknięciu DNA kodującego.Sonda biosensora aktyny wykazuje silniejszy sygnał w stożkach wzrostu i dynamicznych wypustkach wzdłuż nowo powstałych aksonów w porównaniu do ciała komórki. Na późniejszym etapie sygnał pozostaje silny w stożkach wzrostu, podczas gdy dojrzałe aksony wykazują znacznie słabszy sygnał. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak przeprowadzić obrazowanie na żywo pojedynczo znakowanych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest wybranie embrionów, w których DNA nie jest eksponowane na poziomach wystarczająco wysokich, aby wywołać toksyczność lub śmierć komórek. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

live-imaging-cell-motility-actin-cytoskeleton-individual-neurons

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek i aktynowego szkieletu komórkowego pojedynczych neuronów i komórek grzbietowych zarodków ryby zebrowej

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Obumierające komórki są usuwane z tkanek nabłonkowych poprzez skoordynowany skurcz komórek sąsiednich, bez naruszania funkcji barierowej. Przejrzystość optyczna rozwijających się rybek danio przymrużonych stanowi doskonały system do wizualizacji procesu ekstruzji w żywych nabłonkach. W niniejszej pracy opisujemy metody indukcji i obrazowania ekstruzji w naskórku larw rybek danio przymrużonych z rozdzielczością komórkową.

Obrazowanie na żywo ekstruzji komórek z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego

Źródło: Williams, A. L., et al. Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia protokół obrazowania poklatkowego wielofotonowego w celu wizualizacji migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodku danio pręgowanego w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością.

Wizualizacja migracji komórek grzebienia nerwowego w zarodku danio pręgowanego za pomocą wielofotonowego obrazowania poklatkowego

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Opisane tutaj protokoły pozwalają na badanie właściwości elektrycznych komórek pobudliwych w najbardziej nieinwazyjnych warunkach fizjologicznych poprzez wykorzystanie zarodków danio pręgowanego w systemie in vivo wraz z genetycznie kodowanym wskaźnikiem napięcia (GEVI) opartym na rezonansie fluorescencyjnym (FRET), selektywnie wyrażanym w interesującym typie komórki.

Biodetekcja potencjału błonowego neuronu ruchowego w żywych zarodkach danio pręgowanego

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania aktywności neuronalnej w obszarach mózgu transgenicznego danio pręgowanego, które wyrażają wskaźniki wapnia GCaMP za pomocą mikroskopii konfokalnej.

In vivo (in vivo) Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego

Połączenie nerwowo-mięśniowe larw danio pręgowanego jest atrakcyjnym modelem do badania fizjologii synaptycznej. Jest podatny na wiele technik eksperymentalnych, w tym elektrofizjologię i obrazowanie optyczne. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania transmisji synaptycznej za pomocą sondy na bazie pHluoryny pod pionowym mikroskopem epifluorescencyjnym.

Obrazowanie na żywo recyklingu pęcherzyków synaptycznych w złączu nerwowo-mięśniowym wypreparowanych larw danio pręgowanego

Poznaj metodę obrazowania na żywo pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w zarodkach Danio rerio. Technika fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej pozwala analizować dynamikę aktyny i ruchliwość komórek.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek i cytoszkieletu aktynowego poszczególnych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów