Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek i cytoszkieletu aktynowego poszczególnych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Aby zobrazować zachowanie poszczególnych komórek in vivo, do zarodków zebry danio pręgowanego wstrzykuje się DNA zawierające specyficzny dla komórki promotor napędzający ekspresję flory czterech, czyli biosensor. Dynamiczne zmiany efektu dystrybucji są wizualizowane in vivo za pomocą biosensora opartego na efekcie F i domenie wiążącej utrofiny. Nowo zapłodnione zarodki ustawia się wzdłuż szkiełka iniekcyjnego i umieszcza w rogu utworzonym między górnym i dolnym szkiełkiem.

Do komórki wstrzykuje się DNA kodujące czwórki fluorowe lub biosensory. Następnego dnia. Zarodki są montowane w aros.

Na szkiełku obrazowym zarodki umieszcza się znakowanymi komórkami w dół, a komorę uszczelnia się szkiełkiem nakrywkowym. Cześć, nazywam się Erica Anderson i pracuję w Laboratorium Mary Hallin oraz na Wydziale Zoologii i Anatomii Uniwersytetu Wisconsin w Madison. Nazywam się Nam Tauri i również pracuję w Hallin Lab.

Nazywam się Matt Clay i pracuję w Hallin Lab. Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę obrazowania na żywo indywidualnie znakowanych komórek w zarodkach danio pręgowanego. Stosujemy tę procedurę w laboratorium do badania ruchliwości komórek i dynamiki aktyny podczas wzrostu aksonów i migracji komórek grzebienia nerwowego.

Więc zacznijmy. Aby najpierw zmontować prowadnice iniekcyjne, należy przygotować elastomer silikonowy z osłoną cylindryczną zgodnie z instrukcjami producenta. Wymieszaj 10 części bazy elastomerowej z jedną częścią utwardzacza.

Użyj osłony cylindra, aby połączyć ze sobą trzy standardowe szklane szkiełka mikroskopowe. Ułóż dwa slajdy obok siebie na długich krawędziach. Nałóż ARD na trzeci szkiełko i umieść go na dwóch pozostałych szkiełkach.

Użyj tylko tyle cygara, aby uszczelnić szkiełka bez nadmiernego wyciekania spomiędzy szkiełek. Nadmiar można usunąć następnego dnia za pomocą żyletki. Pozwól, aby osłona SIL została ustawiona na noc w celu obrazowania szkiełek.

Używamy prostokątów ze stali nierdzewnej przyciętych do tego samego rozmiaru co standardowy szkiełko mikroskopowe Szkiełko z 1,5 centymetrowym otworem wyciętym pośrodku. Szkiełko nakrywkowe o grubości 22 milimetrów kwadratowych jest przymocowane do stalowego prostokąta z osłoną syl. Zarówno szkiełka iniekcyjne, jak i szkiełka obrazowe są wielokrotnego użytku i można je czyścić między użyciami 70% etanolem, a następnie spłukać wodą przed wstrzyknięciem zarodków.

Rozcieńczyć DNA do końcowego stężenia od 10 do 50 mikrogramów na mililitr. DNA w 0,2% czerwieni fenylowej w wodzie. Czerwień fenylowa umożliwia wizualizację podczas iniekcji.

Następnie napełnij i skalibruj igłę. Wypełnij igłę kapilarną apol około mikrolitrami roztworu DNA. Poczekaj, aż igła się wypełni, a następnie włóż ją do uchwytu igły aparatu do wstrzykiwań za pomocą cienkich kleszczyków.

Oderwij końcówkę od igły tak, aby otwór końcówki miał średnicę około 10 mikrometrów. Zmierz średnicę kropli w oleju mineralnym za pomocą mikrometru ocznego. Aby obliczyć objętość wtrysku, dostosuj ustawienie czasu trwania piko spritzera.

Tak więc średnica kropli wynosi 0,12 mikrometra lub około jednego nanolitra objętości. Typowy czas trwania wynosi od 10 do 30 milisekund. Pobrać zarodki w jednym stadium komórkowym w pożywce E trzy zarodki i przenieść około 30 do 60 zarodków na szkiełko iniekcyjne.

Umieścić zarodki wzdłuż krawędzi górnego szkiełka i usunąć większość E trzy, tak aby zarodki były przytrzymywane do szkiełka za pomocą napięcia powierzchniowego za pomocą wygiętej szpilki preparcyjnej. Obrócić zarodki tak, aby komórka przylegała do ściany szkiełka iniekcyjnego. Użyj mikromanipulatora, aby przeprowadzić igłę przez korion zarodka, przez żółtko i do pojedynczej komórki zarodka.

Wstrzyknij od 0,5 do jednego nanolitra roztworu DNA do komórki. Przenieś wstrzyknięte zarodki na szalki Petriego w E trzy i umieść je w inkubatorze w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. W razie potrzeby rozwój można spowolnić, inkubując zarodki w niższej temperaturze następnego dnia po wstrzyknięciu.

Przygotuj zarodki do obrazowania na około godzinę przed osiągnięciem przez zarodki pożądanego wieku do obrazowania. Usuń KR z zarodków za pomocą cienkich kleszczy. Zazwyczaj rozpoczynamy obrazowanie zarodków po około 14 do 17 godzinach od zapłodnienia.

Następnie wybieramy zarodki ze znakowanymi komórkami za pomocą mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w fluorescencję, używamy obiektywu Forex na lunecie Nikon Z 100 ze względu na połączenie dużej odległości roboczej i dużego powiększenia. Umieść zarodek w mikroprobówce z około 50 mikrolitrami V trzy. Dodaj bulion trica i stopiony 1% agros o niskiej temperaturze topnienia, aby uzyskać końcowe stężenie 0,02% trica za pomocą szerokiej szklanej pipety borg.

Natychmiast przenieś zarodek w kropli agro na szkiełko nakrywkowe szkiełka obrazowego, zanim aros stwardnieje, ustaw zarodek tak, aby obszar z oznakowanymi komórkami był skierowany w dół do dolnego szkiełka nakrywkowego. Następnie zmontuj komorę obrazowania. Pokryj jedną stronę plastikowego pierścienia silikonowym smarem próżniowym i przymocuj go do metalowego obrazu.

Wsuń smar na drugą stronę pierścienia. Napełnij komorę E trzy zawierającym 10 milimolowych hałd i 0,02% Trica uszczelniła górną część komory, mocując 22-milimetrowy kwadratowy szkiełko nakrywkowe do górnej nasmarowanej powierzchni pierścienia. Zarodek jest teraz gotowy do obrazowania w czterech wariantach D, jak pokazano w następnej sekcji.

Szczegóły akwizycji obrazu będą zależeć od specyfiki systemu mikroskopowego. W tym miejscu przedstawiamy proces akwizycji obrazu poklatkowego w mikroskopie konfokalnym Olympus FB 1000. Zapoznaj się z poprzednim protokołem JO, aby uzyskać informacje na temat akwizycji poklatkowej za pomocą systemu konfokalnego Zeiss LSM five 10.

Umieść komorę obrazowania w uchwycie szkiełka na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość na zarodku za pomocą obiektywu 10 x lub 20 x. W świetle przechodzącym przełącz się na obiektywną aperturę numeryczną 60x 1,2 lub wyższą i skup się na znakowanej komórce z fluorescencją epi w oprogramowaniu FV. Kliknij xy powtórz, aby rozpocząć skanowanie laserowe.

Dostosuj ustawienia akwizycji i elementy sterujące akwizycją obrazu, aby zoptymalizować obraz w celu uzyskania serii Z. Ustaw górne i dolne granice Zacka wraz z rozmiarem kroku. Włącz ikonę głębi w oknie sterowania akwizycją obrazu i rozpocznij akwizycję, klikając ikonę XY, Z suite, aby uzyskać serię poklatkową.

Ustaw przedział czasu i liczbę punktów czasowych pod skanowaniem czasu. Nagłówek w oknie ustawień akwizycji kliknij ikonę czasu w oknie kontroli akwizycji obrazu i rozpocznij akwizycję, klikając ikonę pakietu XYZT. Prezentujemy tutaj reprezentatywne filmy i zdjęcia poszczególnych oznaczonych komórek.

Kiedy poszczególne neurony są znakowane, ich aksony nie są zasłonięte przez inne znakowane komórki, a zatem rozszerzenia OD na aksonach i stożkach wzrostu są wyraźnie widoczne. Ten film pokazuje neuron czuciowy oznaczony znacznikiem ukierunkowanym na błonę RFP. Rozciąga dwa aksony w przeciwnych kierunkach, które wyrastają poza pole widzenia.

Trzeci akson rozciąga się ortogonalnie od ciała komórki i tworzy gałęzie. Podobnie, znakowanie pojedynczych komórek grzebienia nerwowego umożliwia obrazowanie drobnych procesów komórkowych związanych z ruchliwością komórek. Tutaj dwie komórki grzebienia nerwowego są znakowane GFP ukierunkowanym na błonę.

Wykazują rozległą aktywność wystającą podczas migracji w kierunku przednim. Często przydatne jest oznaczanie pojedynczych komórek w obrębie linii transgenicznej, aby zobrazować interakcje między sąsiednimi komórkami w populacji. Ten obraz przedstawia zarodek ze stabilną ekspresją GFP we wszystkich neuronach czuciowych, któremu wstrzyknięto znacznik kodujący DNA RFP, aby oznaczyć jeden neuron na czerwono w tle wstrzyknięcia zielonych neuronów kodujących DNA.

Sonda biosensora aktynowego wykazuje silniejszy wpływ sygnału w stożkach wzrostu i dynamicznych wypukłościach wzdłuż nowo powstałych aksonów w porównaniu z ciałem komórki. Na późniejszym etapie sygnał pozostaje silny w stożkach wzrostu, podczas gdy dojrzałe aksony mają znacznie słabszy sygnał. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić obrazowanie na żywo indywidualnie znakowanych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wybrać zarodki, w których DNA nie ulega ekspresji na wystarczająco wysokim poziomie, aby spowodować toksyczność lub śmierć komórki. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.