Name: Synteza i kalibracja fosforyzujących nanosond do obrazowania tlenu w układach biologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Poznaj syntezę i kalibrację fosforyzujących nanosond do pomiaru tlenu w układach biologicznych. Metoda wykorzystuje porfiryny platyny i palladu w strukturach dendrytycznych z warstwą polietylenoglikolu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością potwierdzamy wsparcie finansowe z grantów EB007279 oraz HL081273 przyznanych przez NIH USA.

1. Ogólny opis protokołu pomiaru tlenu
(Ta sekcja nie zawiera żadnych działań, ale jest kluczowa dla zrozumienia reszty pracy. Można ją sfilmować na przykład jako sekwencję kilku slajdów programu PowerPoint z towarzyszącym komentarzem głosowym.)
1.1) Sondę wprowadza się do badanego środowiska, na przykład wstrzykując ją do krwi lub płynu śródmiąższowego zwierzęcia.
1.2) Obiekt (powierzchnię tkanki) oświetla się światłem o odpowiedniej długości fali, aby doprowadzić sondę do wzbudzonego stanu tripletowego. Typowo wzbudzenie następuje poprzez mechanizm jednofotonowy. Jednak w przypadku specjalnych sond z wzmocnionym pobudzeniem dwufotonowym, wzbudzenie można przeprowadzić poprzez mechanizm dwufotonowy, który umożliwia stosowanie sond w aplikacjach mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Wzbudzenie jednofotonowe zazwyczaj zapewnia niższą rozdzielczość przestrzenną, lecz wymaga prostszej aparatury i może być wykorzystywane w pomiarach jednopunktowych z użyciem światłowodowych fosforometrów opartych na diodach LED. 
1.3) Fosforescencja emitowana przez sondę pochodzi z długożyjącego stanu tripletowego. Cząsteczka sondy musi być specjalnie zaprojektowana tak, aby zapewniać wysoką wydajność kwantową stanu tripletowego i emitować fosforescencję zamiast fluorescencji. W stanie tripletowym sonda może ulegać zderzeniom z cząsteczkami tlenu, które mogą dezaktywować stan tripletowy – proces ten nazywa się „gaszeniem”. Wobec braku tlenu czas życia stanu tripletowego, a co za tym idzie, czas zaniku fosforescencji wynosi τ0. W obecności tlenu czas życia fosforescencji (τ) ulega skróceniu w wyniku gaszenia. Istnieje bezpośrednia zależność między czasem życia stanu tripletowego a ilością tlenu w środowisku. Jest to znana zależność Sterna-Volmera, która wiąże czas życia (τ) fosforescencji z stężeniem tlenu [O2] (lub ciśnieniem parcjalnym tlenu pO2):
<img src="/files/ftp_upload/1731/1731equation.jpg" alt="Równanie Sterna-Volmera dla analizy wygaszania fluorescencji w zależności od stężenia tlenu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="równanie">
W systemach biologicznych tlen jest zdecydowanie najskuteczniejszym wygaszaczem fosforescencji, co sprawia, że metoda wygaszania fosforescencji jest bardzo selektywna w odniesieniu do tlenu.
1.4) W celu pomiaru czasu życia t, emitowane fotony fosforyzacji są grupowane w przedziałach czasowych. Na przykład, po impulsie wzbudzenia, w pierwszych 15 mikrosekundach może zostać zebranych 200 fotonów, w kolejnych 15 mikrosekundach 150 fotonów i tak dalej, aż do momentu, gdy fotony przestaną być rejestrowane. Liczba fotonów w przedziałach naniesiona na oś czasu obrazuje zanik fosforyzacji, którego analiza pozwala wyznaczyć czas życia τ. W obrazowaniu procedura ta jest stosowana dla każdego piksela obrazu, co pozwala na stworzenie map czasu życia fosforyzacji. Pomiary czasu życia są niewrażliwe na niejednorodność rozkładu sondy w obiekcie, co jest zjawiskiem powszechnym w próbkach biologicznych. W związku z tym, czasy życia informują wyłącznie o zawartości tlenu. Czasy życia τ są przeliczane na stężenia tlenu z wykorzystaniem równania Sterna-Volmera.
2. Konstrukcja sond fosforescencyjnych
Sondy fosforescencyjne do pomiarów tlenu w układach biologicznych składają się z chromoforów fosforescencyjnych (rdzeni), zamkniętych w klatkach zbudowanych z dendrymerów – wysoce regularnych polimerów hiperrozgałęzionych [3]. Dendrymerzy chronią rdzenie przed oddziaływaniami z otoczeniem i kontrolują szybkość dyfuzji tlenu do rdzeni, co umożliwia optymalizację czułości i zakresu dynamicznego sond (stała kq w równaniu Sterna-Volmera). Końce dendrymerów są zmodyfikowane chemicznie obojętnymi, hydrofilowymi grupami glikolu polietylenowego (PEG), co sprawia, że sondy są bardzo dobrze rozpuszczalne w wodzie i zapobiega ich oddziaływaniom z biologicznymi makrocząsteczkami.
Rdzenie fosforyzujące sond stanowią kompleksy Pt lub Pd porfiryn oraz porfiryn z rozszerzonym układem π. Porfiryny z rozszerzonym układem π to porfiryny, w których pierścienie pirolu są skondensowane z zewnętrznymi fragmentami aromatycznymi. Rozszerzenie układu π umożliwia dostrojenie właściwości spektroskopowych sond tak, aby spełniały one wymagania konkretnej aplikacji obrazowania (np. mikroskopii w porównaniu z tomografią). Jako przykład opisujemy syntezę Pd-tetaaryltetrabenzoporfiryn (PdAr4TBP) [4]. PdAr4TBP charakteryzują się silnymi pasmami absorpcji w dalekiej czerwieni widma oraz intensywną fosforyzacją, co czyni je odpowiednimi do biologicznych pomiarów tlenu.
Synteza PdAr4TBP składa się z następujących etapów:
2.1) Przygotowanie tetraaryltetracykloheksenoporfiryn (Ar4TCHP) poprzez kondensację Lindsey [5] tetrahydroizoindolu z podstawionymi benzaldehydami. Do 0,01 M roztworu tetrahydroizoindolu (1 eq) w CH2CL2 dodano w atmosferze argonu aldehyd aromatyczny (1 eq). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 10 min w ciemności w temp. pokojowej. Dodano BF3xEt2O (0,2 eq), a mieszaninę reakcyjną mieszano w temp. pokojowej przez kolejne 2 h. Dodano DDQ (1 eq), a mieszaninę pozostawiono na noc w warunkach ciągłego mieszania. Roztwór przemyto 10% wodnym roztworem Na2SO3, 10% wodnym roztworem Na2CO3, 5% wodnym roztworem HCl, a na koniec solanką. Fazę organiczną osuszono nad Na2SO4, a następnie zagęszczono w próżni. Pozostałość przekrystalizowano z mieszaniny CH2Cl2 i eteru tert-butylu, otrzymując Ar4TCHP w postaci zielonego proszku. Wydajność wynosi około 50%. 
2.2) Wprowadzenie Pd w celu otrzymania PdAr4TCHP. Porfiryny w postaci wolnej zasady (1 eq) poddano działaniu PdCl2 lub Pd(OAc)2 (1,2 eq) w cofającym się CH3CN w obecności nadmiaru Et3N (20 eq). Konwersję monitorowano za pomocą spektroskopii UV-vis (rozpuszczalnik CH2Cl2-AcOH) i uznano za zakończoną po zaniku pasma Soreta przy 468-472 nm. Mieszaninie pozwolono ostygnąć, rozcieńczono ją CH2Cl2 i przefiltrowano przez cienką warstwę Celite w celu usunięcia Pd(0). Rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość oczyszczono chromatograficznie na kolumnie z żelem krzemionkowym, używając CH2Cl2 jako rozpuszczalnika. Zebrano ciemnoczerwoną frakcję, a rozpuszczalnik odparowano, otrzymując docelowe PdAr4TCHPs w wydajności niemal ilościowej.
2.3) Związki PdAr4TBP otrzymano poprzez utlenianie PdAr4TCHP dwukrotnym nadmiarem DDQ (16 eq) w THF w temperaturze wrzenia. Podczas ogrzewania w zwrocie barwa zmieniła się z ciemnoczerwonej na ciemnozieloną. Rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość rozcieńczono CH2Cl2 i przemyto 10% aq Na2SO3, wodą oraz solanką. Fazę organiczną osuszono nad Na2SO4 i zagęszczono w próżni. Pozostałość oczyszczono chromatograficznie na żelu krzemionkowym (eluent CH2Cl2). Zebrano pierwszą ciemnozieloną frakcję i zagęszczono ją w próżni, otrzymując 85-90% PdAr4TBP w postaci niebiesko-zielonego proszku.
2.4) Obwodowe grupy estrowe Pd tetrakis-(3,5-dibutoksykarbonylofenyl)-tetrabenzoporfiryny (PdAr4TBP) poddano hydrolizie przy użyciu 10-krotnego nadmiaru KOH w 1% (v/v) roztworze woda/THF w rt. Rozpuszczalnik oddzielono od osadu powstałych soli potasu pochodnych kwasów karboksylowych PdAr4TBP. Substancje stałe rozpuszczono w wodzie, mieszano przez kolejne 2 h, a następnie zakwaszono stężonym HCl do pH~4-5. Otrzymany osad wyizolowano poprzez wirowanie, przemyto wodą i wysuszono w próżni.
Ochrona dendronów. Każda pojedyncza gałąź dendrymeru nazywana jest dendronem. Dendrony ochronne są budowane z bloków budulcowych arylo-glicyny (AG). Dendrony AG można łatwo syntetyzować z niedrogich materiałów wyjściowych i izolować z wysoką czystością i wydajnością metodami bez użycia chromatografii. Synteza dendronu AG drugiej generacji (G2) składa się z następujących etapów: 
2.4) Synteza bloków budulcowych, Boc-chronionego 3,5-dikarboksyfenyloglicynamidu oraz 3,5-dibutoksykarbonylofenyloglicynamidu, z zastosowaniem metody haloacylidenków Fischera.
2.5) Sprzęganie bloków budulcowych przy użyciu chemii sprzęgania peptydowego CDMT/NMM. 
2.6) Deprotekcja ogniskowej grupy aminowej poprzez mieszanie roztworu dendronu G2 w TFA przez 2 h w temperaturze pokojowej. 
2.7) W celu syntezy dendronów wyższych generacji powtarza się etapy sprzęgania i deprotekcji.
Montaż dendrymeru osiąga się poprzez sprzęganie odchronionych dendronów z PdAr4TBP (lub inną porfiryną) z wykorzystaniem chemii sprzęgania HBTU/DIPEA.
2.8) W pierwszej kolejności z dendronu usuwa się grupy ochronne Boc. Na przykład, dendron G3 chroniony grupami Boc (0,58 g) rozpuszczono w TFA (15 ml), a mieszaninę pozostawiono do reakcji w temperaturze pokojowej przez 2 h. Kwas usunięto za pomocą odparowania rotacyjnego, otrzymując dendron w postaci soli TFA. Pozostałość rozpuszczono w suchym NMP (10 ml) i dodano kilka kropli DIPEA, aby zneutralizować śladowe ilości TFA. 
2.9) Przed rozpoczęciem reakcji sprzęgania kluczowe jest całkowite rozpuszczenie porfiryny. Na przykład Pt tetrakarboksyfenylporfirynę (0.061 g) rozpuszczono w suchym NMP (65 ml), podgrzewając w temperaturze 140°C przez 10 min w strumieniu azotu. 
2.10) Roztwór schłodzono do temperatury pokojowej, dodano HBTU (0,211 g), a mieszaninę mieszano przez 5 min. 
2.11) Do mieszaniny w jednej porcji dodano DIPEA (0,35 ml), a następnie niezwłocznie dodano roztwór soli TFA dendronu w NMP (patrz 2.8) i pozostawiono mieszaninę do mieszania przez noc.
2.12) Mieszaninę wlano do 3% roztworu wodnego NaCl (350 ml), a powstały osad zebrano poprzez wirowanie i przemyto wodą, MeOH oraz Et2O poprzez wielokrotne zawieszenie i wirowanie, aby otrzymać docelowy porfirynowy dendrymer. 
2.13) Aby zhydrolizować peryferyjne grupy estrowe, dendrymer poddano najpierw działaniu NMe4OH (~ 5 mM) w DMSO/MeOH przez okres od 20 do 60 min, a następnie całkowicie usunięto rozpuszczalnik. Procedura ta pozwoliła na otrzymanie dendrymerów z wystarczającą liczbą grup karboksylowych, aby zapewnić rozpuszczalność w wodzie. W celu zakończenia hydrolizy dendrymer poddano działaniu 0,1N wodnego roztworu NaOH (przez noc). W rezultacie udało się wyizolować czyste kwasy karboksylowe porfiryna-dendrymer z wydajnością 80-95%.
Modyfikacja peryferii dendrymeru. Na tym etapie, zaczynając od tego samego porfiryna-dendrymeru, można zsyntetyzować sondy jedno- lub dwufotonowe. W pierwszym przypadku wszystkie peryferyjne grupy karboksylowe są modyfikowane jednostkami PEG – jest to metodologia znana jako PEGylacja. W drugim przypadku kilka grup karboksylowych jest najpierw sprzęganych z dwufotonowymi chromoforami antenowymi (kumaryna-343) zmodyfikowanymi łącznikami z etylenodiaminy (EDA), a następnie przeprowadza się PEGylację pozostałych grup karboksylowych [6]. Dendrymeru poddano PEGylacji przy użyciu monometoksyoligoetylenoglikolaminy (m-PEG-NH2, średnia MW 1000), wykorzystując chemię sprzęgania HBTU/DIPEA.
2.14) Do roztworu dendronu w NMP (lub DMF) (1-10 mM) dodano 1,25-krotny nadmiar HBTU, a mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 10 min. Następnie dodano 6,25-krotny nadmiar DIPEA, a bezpośrednio po nim 1,25-krotny nadmiar m-PEG-NH2. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 dni w temperaturze pokojowej. Do mieszaniny reakcyjnej dodano eter dietylowy, powstały osad oddzielono poprzez wirowanie, a następnie ponownie wytrącono z THF poprzez dodanie eteru dietylowego.
2.15) Ostateczne oczyszczanie przeprowadzono za pomocą chromatografii wykluczania wielkości poprzez zebranie pierwszej fazy czołowej. PEGylowaną porfirynę-dendrymer rozpuszczono w niewielkiej ilości THF (~15 ml) i naniesiono na górę kolumny chromatograficznej wypełnionej fazą SEC z polistyrenu (Biorad, Biobeads S-X1). Kolumnę eluoowano czystym THF, a następnie zebrano ciemnobarwny prążek przemieszczający się z czołem.
2.16) THF usunięto za pomocą ewaporatora rotacyjnego, a pozostały materiał wysuszono w próżni.
3. Charakterystyka sondy
Charakterystyka fotofizyczna obejmuje pomiary widm absorpcji i emisji sondy, czasów życia fosforescencji τ0 oraz stałych wygaszania tlenowego Sterna-Volmera kq w warunkach fizjologicznych.
3.1) Widma absorpcji i emisji uzyskuje się w warunkach otoczenia przy użyciu standardowej aparatury (spektrofotometru i fluorometru stacjonarnego). Stosuje się roztwory sondy o stężeniu ~1 μM.
3.2) Następnie sporządza się wykres kalibracyjny Sterna-Volmera. Jest to najważniejszy pomiar, ponieważ pozwala on powiązać czas życia sondy z stężeniem tlenu.
3.3) Roztwór sondy w buforze PBS (pH 7.2) umieszcza się w specjalnej kuwecie cylindrycznej, która jest ustawiona wewnątrz komory z kontrolą temperatury, znajdującej się w nieprzepuszczalnej dla światła klatce z portami dla światłowodów wzbudzenia i emisji. Światłowody są doprowadzane w bezpośredni kontakt z kuwetą wewnątrz komory w geometrii kąta prostego.
3.4) Kuwetę zamyka korek, w którym umieszczona jest wysokoczuła elektroda tlenowa typu Clarka (elektroda tlenowa CK). Korek zawiera również dwa porty igłowe dla dopływu i odpływu argonu. Elektrodę zanurza się w roztworze, natomiast igły służą jedynie do zapewnienia przepływu gazu nad powierzchnią roztworu. Początkowo argon nie jest podłączony do wlotu.
3.5) Temperaturę ustawia się na pożądaną wartość (zazwyczaj 36-37°C), a roztwór pozostawia się pod ciągłym mieszaniem w celu wyrównania temperatury.
3.6) Włókno wzbudzenia jest podłączone do portu wzbudzenia cyfrowego fosforometru sterowanego przez komputer PC. Źródłem światła w fosforometrze jest wysokiej mocy dioda LED, której wyjście jest sterowane przez płytkę D/A o częstotliwości 333 kHz. Włókno emisji jest podłączone do innego portu optycznego fosforometru, który jest sprzężony z wysoce czułą na podczerwień fotodiodą lawinową (APD). Sygnał wyjściowy diody jest wzmacniany i wprowadzany do kanału A/D tej samej płyty sterującej, co umożliwia synchronizację między kanałami wzbudzenia i emisji.
3.7) Oprogramowanie sterujące umożliwia generowanie impulsów wzbudzenia o dowolnej pożądanej długości (np. 5 lub 10 ms), po których następuje pomiar zaniku fosforescencji w dowolnie wybranym przedziale czasu (zazwyczaj 2-3 ms). Czas wymagany do pojedynczego pomiaru czasu życia wynosi zazwyczaj 0,5-1 s, jednak pomiary mogą być wykonywane z częstotliwością do 10-20 na sekundę.
3.8) Sygnał z elektrody tlenowej jest wzmacniany i kierowany do drugiej płyty A/D w tym samym komputerze PC. Jest to płyta niskiej częstotliwości (maks. 1 kHz), która służy do rejestrowania prądu elektrody w wybranych odstępach czasu. Program do rejestracji danych z elektrody działa równolegle z oprogramowaniem fosforometru.
3.9) Po wyrównaniu temperatury roztworu, programy fosforometru i elektrody są inicjowane jednocześnie w celu wykonywania pomiarów co 10 s. Wyniki są rejestrowane synchronicznie w dwóch oddzielnych plikach. Następnie argon zostaje podłączony do wlotu w korku kuwety.
3.10) Gdy argon przepływa nad powierzchnią mieszanego roztworu, stopniowo zastępuje on tlen. Skutkuje to spadkiem prądu elektrody i wydłużeniem czasu życia fosforyzacji, który jest pomiarowy za pomocą fosforometru. Zazwyczaj tlen zostaje całkowicie usunięty z roztworu po około 2 h, podczas których dane są w pełni automatycznie rejestrowane w plikach.
3.11) Po zakończeniu serii miareczkowania dane z elektrody oraz czasy życia fosforescencji są importowane do standardowego programu analitycznego (np. Microcal Origin). Prąd elektrody zależy liniowo od stężenia tlenu, a w przypadku użytej elektrody wynosi on praktycznie zero przy zerowej zawartości tlenu. Przy ciśnieniu atmosferycznym pO2 jest znane (około 150 mm Hg). Zatem dane z elektrody mogą zostać bezpośrednio przeliczone na skalę tlenową, co pozwala na sporządzenie wykresu odwrotności czasu życia fosforescencji w funkcji pO2. Wykres ten jest dopasowywany do linii prostej metodą najmniejszych kwadratów, aby wyznaczyć stałą wygaszania tlenowego kq jako nachylenie tej prostej. Czas życia fosforescencji t0 uzyskuje się albo z tego samego dopasowania (jako odwrotność punktu przecięcia z osią rzędnych), albo bezpośrednio z pomiaru przy zerowej zawartości tlenu.
3.12) W razie potrzeby miareczkowanie powtarza się, używając roztworu sondy w obecności albuminy – białka występującego w osoczu krwi w wysokich stężeniach – w celu odwzorowania warunków panujących w rzeczywistym układzie eksperymentalnym (krew zwierzęcia in vivo). Uzyskane wykresy Sterna-Volmera powinny być identyczne, jeśli dendrymer dobrze chroni sondę, a grupy PEG izolują sondę od kontaktu z albuminą. W przeciwnym razie sonda i białka we krwi będą oddziaływać ze sobą, co doprowadzi do zmiany wykresu Sterna-Volmera, powodując niejednoznaczność w pomiarach tlenu.
W ten sposób uzyskane stałe kalibracyjne są wykorzystywane w eksperymentach obrazowania, w których stężenia tlenu są a priori nieznane.

<ol><li>Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+method+for+measurement+of+dioxygen+concentration+based+on+quenching+of+phosphorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence.</a> J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).</li>
<li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+phosphorescence%3A+A+novel+method+for+measuring+the+distribution+of+oxygen+in+perfused+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue.</a> Science. 241, 1649-1651 (1988).</li>
<li>Lebedev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+phosphorescent+probes+for+oxygen+Imaging+in+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems.</a> Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).</li>
<li>Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+versatile+synthesis+of+substituted+tetrabenzoporphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins.</a> Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).</li>
<li>Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rothemund+and+Adler-Longo+Reactions+revisited%3A+Synthesis+of+tetraphenylporphyrins+under+equilibrium+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions.</a> Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).</li>
<li>Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+metalloporphyrin-based+dendritic+nanoprobes+for+two-photon+microscopy+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Porphyrins+and+Phthalocyanines%22%5BJournal%5D)">Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen.</a> J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>N-metylopirolidnon</td><td></td><td></td><td>NMP</td></tr><tr><td>kwas trifluorooctowy</td><td></td><td></td><td>TFA</td></tr><tr><td>diizopropyloetyloamina</td><td></td><td></td><td>DIPEA</td></tr><tr><td>heksafluorofosforan 2-(1H-benzotriazol-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametylouroniu</td><td></td><td></td><td>HBTU</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek</td><td></td><td></td><td>DMSO</td></tr><tr><td>CDMT=1-chloro-3,5-dimetoksytriazyna</td><td></td><td></td><td>CDMT</td></tr><tr><td>NMM=N-metylomorfolina</td><td></td><td></td><td>NMM</td></tr></tbody></table>

synteza i kalibracja fosforescencyjnych nanosond do obrazowania tlenu w układach biologicznych

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Pomiar tlenu metodą wygaszania fosforescencji [1, 2] składa się z następujących etapów: 1) wprowadzenie sondy do badanego medium (np. krwi lub płynu śródmiąższowego); 2) oświetlenie obiektu światłem o odpowiedniej długości fali w celu wzbudzenia sondy do stanu tripletowego; 3) zbieranie emitowanej fosforescencji i analiza jej przebiegu czasowego w celu wyznaczenia czasu życia fosforescencji, który jest następnie przeliczany na stężenie tlenu (lub ciśnienie parcjalne, pO2). Sonda nie może wchodzić w interakcje z środowiskiem biologicznym, a w niektórych przypadkach powinna zostać 4) usunięta z medium po zakończeniu pomiaru. Każdy z tych etapów nakłada określone wymagania na projekt molekularny sond fosforescencyjnych, które stanowią jedyny inwazyjny element protokołu pomiarowego. W niniejszym opracowaniu przeglądamy projekt dendrytycznych nanofosforowych sensorów do pomiarów tlenu w systemach biologicznych. Sondy składają się z dendrymerów poliaryloglicyny (AG) opartych na porfirynach Pt lub Pd, zmodyfikowanych na obwodzie resztami glikolu polietylenowego (PEG). W celu efektywnego wzbudzenia dwufotonowego, końce dendrymerów mogą być zmodyfikowane chromoforami antenowymi do wzbudzenia dwufotonowego, które przechwytują energię wzbudzenia i przekazują ją do tripletowych rdzeni sond za pomocą wewnątrzmolekularnego FRET (Förster Resonance Energy Transfer). Opisujemy kluczowe właściwości fotofizyczne sond oraz przedstawiamy szczegółowe protokoły kalibracji.

Przedstawiamy zasady pomiarów poziomu tlenu metodą wygaszania fosforescencji oraz omawiamy konstrukcję dendrytycznych nanoczujników opartych na porfirynach do obrazowania tlenu w systemach biologicznych.

Synteza i kalibracja fosforescencyjnych nanosond do obrazowania tlenu w układach biologicznych

Pomiar zawartości tlenu metodą gaszenia fosforescencji [1, 2] składa się z następujących etapów: 1) wprowadzenie sondy do badanego medium (np. krwi ...

Przedstawiamy projekt sond fosforescencyjnych do pomiaru tlenu opartych na DER porfiryn platyny i palladu. Sondy składają się z rdzeni metalicznych porfiryn zawierających dendron oraz zewnętrzną hydrofilową warstwę glikolu polietylenowego; konstrukcja sond oraz ich kalibracja zostaną przedstawione w niniejszym opracowaniu. Cześć, nazywam się Luis Sinks.Współpracuję z profesorem Sergeiem OV tutaj, w Katedrze Biochemii i Biofizyki na Uniwersytecie Pensylwanii. Jestem Emmanuel Losis, również z Vina. Jestem także z, i jestem Sergei V. Pomiary biologicznego tlenu za pomocą fosforu i wygaszania wykorzystują egzogenny fosfor i sondy, które są wprowadzane bezpośrednio do badanego medium.Sondy do badania krwi lub płynu śródrzewnego są jedynym inwazyjnym elementem schematu pomiarowego, który wymaga szczególnej uwagi podczas projektowania. Dzisiaj przedstawimy procedurę syntezy i kalibracji dendrytycznych fosforescencyjnych nanosond do pomiaru tlenu w systemach biologicznych. Wykorzystujemy tę procedurę do syntezy i charakterystyki sond przeznaczonych do pomiarów tlenu w układach półprzewodnikowych i dwuskładnikowych.Zacznijmy zatem. Zanim przystąpimy do konstruowania sond, omówmy najpierw podstawy teoretyczne fosforyzacji sond. Fosforyzacja wynika z długo żyjącego stanu trypletowego.Cząsteczka sondy musi być zaprojektowana tak, aby zapewniała wysoką wydajność kwantową stanu tripletowego i emitowała fosforescencję zamiast fluorescencji. Pobudzenie sondy następuje poprzez mechanizm jednofotonowy lub, w przypadku specjalnych sond o zwiększonej wydajności, poprzez mechanizm dwufotonowy. Pobudzenie jednofotonowe zazwyczaj zapewnia mniejszą rozdzielczość przestrzenną, ale wymaga prostszej aparatury i może być stosowane w pomiarach punktowych z użyciem światłowodowych fosperometrów opartych na diodach LED.Przebywając w stanie tripletowym, sonda może wchodzić w kolizyjne oddziaływania z cząsteczkami tlenu, co może prowadzić do dezaktywacji stanu tripletowego w procesie zwanym gaszeniem. W związku z tym, w obecności tlenu czas życia fosforyzacji ulega skróceniu. W wyniku gaszenia zależność czasu życia stanu tripletowego od ilości tlenu w środowisku jest opisana równaniem Sterna-Volmera.W eksperymentach in vivo sondę wprowadza się do krwi lub płynu śródtkankowego zwierzęcia, a następnie oświetla powierzchnię tkanki światłem o odpowiedniej długości fali, aby wprowadzić sondę w jej wzbudzony stan tripletowy. W celu pomiaru czasu życia fosforescencji, emitowane fotony fosforyzujące są rejestrowane w czasie. Na przykład po impulsie wzbudzenia w ciągu pierwszych pięciu mikrosekund może zostać zebranych 3 609 fotonów, w ciągu kolejnych pięciu mikrosekund 1 421 fotonów i tak dalej, aż do momentu, gdy nie będą już zbierane żadne fotony.Liczby w koszykach naniesione na oś czasu przedstawiają zanik fosforescencji, który jest analizowany w celu wyznaczenia czasu życia fosforescencji. W obrazowaniu procedura ta jest stosowana do każdego piksela obrazu, co pozwala na uzyskanie map czasu życia fosforescencji. Pomiary czasu życia są niewrażliwe na niejednorodności w rozkładzie sondy w całym obiekcie, co jest częstym zjawiskiem w przypadku próbek biologicznych.Przejdźmy teraz do sposobu konstruowania sond. Rozpocznij procedurę syntezy, dodając aldehyd aromatyczny do 0,01 molarnego roztworu tetrahydroizindolu. Mieszaj mieszaninę reakcyjną przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.Następnie dodać trifluoroboran dityla i kontynuować mieszanie przez kolejne dwie godziny. Potem dodać dichlorocyjanobenzochinon (DDQ), co spowoduje zmianę barwy z jasnoczerwonej na ciemnozieloną. Pozostawić mieszaninę na noc przy ciągłym mieszaniu, a następnego dnia przemyć i wysuszyć roztwór, a następnie skoncentrować go w próżni.Ponowna krystalizacja pozostałości pozwala uzyskać produkt docelowy w postaci zielonego proszku. Wydajność wynosi zazwyczaj około 50%. Następnie porfirynę w formie wolnej zasady poddaje się reakcji z octanem palladu. Konwersję monitoruje się za pomocą spektroskopii UV-Vis.Konwersja jest zakończona po zniknięciu pasma absorpcji Dion pomiędzy 468 a 472 nanometrami. Porfiryna jest izolowana za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym. Aby przygotować tetra-benzo-porfirynę palladu, należy utlenić tetra-cyklo-porfirynę palladu.Podczas ogrzewania pod chłodnicą barwa zmienia się z ciemnoczerwonej na głęboką zieleń. Odparuj rozpuszczalnik, rozcieńcz pozostałość dichlorometanem, przemyj, osusz i zagęść fazę organiczną w próżni. Po chromatografii na żelu krzemionkowym wyizoluj tetrabenzo porfirynę palladu w postaci niebiesko-zielonego proszku. Następnie przeprowadź hydrolizę grup eterowych w pozycji peryferyjnej tetrabenzo porfiryny palladu.W pierwszej kolejności poddaj ester tetrabenzoporfiryny działaniu zasady w tetrahydrofuranie. Następnie przeprowadź hydrolizę w zasadowym roztworze wodnym, wytrąć porfirynę poprzez dodanie kwasu solnego, a następnie wysusz ją w próżni. Tym samym kończy się synteza porfiryny.Przejdźmy teraz do syntezy entronów. Przed złożeniem sond należy uprzednio zsyntetyzować entrony, które stanowią ramiona struktury Denmark. Wykorzystujemy do tego aero gly, czyli takie same DER, które można wygodnie przygotować z niedrogich materiałów startowych, stosując metody bezchromatograficzne.Następnie terony z grupami aminowymi w punktach ogniskowych są przyłączane do grup karrilowych w ficie, którego przygotowanie właśnie zaprezentowaliśmy. Następnie grupy estrowe na obwodzie DME są hydrolizowane w sposób analogiczny do grup karboksylowych na obwodzie porfiryny. Na tym etapie, zaczynając od polikarboksylowego kwasu DME porfiryny, można zsyntetyzować jedną lub dwie sondy dwufotonowe w celu otrzymania sond dwufotonowych.W pierwszej kolejności należy rozbieżnie przyłączyć kilka fragmentów anten dwufotonowych do kilku grup karboksylowych na obwodzie dymeru. Następnie należy przystąpić do modyfikacji pozostałych reszt kwasu karboksylowego w dymerze. Proces ten rozpocząć od dodania 1,25-krotnego nadmiaru HBTU do silnie stężonego roztworu rymera porfirynowego i mieszania mieszaniny reakcyjnej w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Następnie należy dodać diizopropyloetyloaminę i metoksypolietylenoglikolaminę. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez dwa dni w temperaturze pokojowej, a następnie dodano eter etylkowy. Osad oddzielono poprzez wirowanie, a następnie kilkukrotnie przeprowadzono ponowne wytrącanie z tetrahedranu poprzez dodawanie eteru etylowego.Na koniec oczyść sondę za pomocą chromatografii wykluczania na kuleczkach polistyrenowych, używając tetrahedranu jako rozpuszczalnika. Teraz przejdźmy do charakterystyki i kalibracji sondy. Widma absorpcyjne i emisyjne sondy uzyskano przy użyciu roztworów sondy o stężeniu 1 µM w warunkach otoczenia, korzystając ze standardowego spektrofotometru i fluorymetru stanu stacjonarnego.Aby następnie uzyskać wykres kalibracyjny Sterna-Volmera, który pozwala powiązać czas życia sondy z stężeniem tlenu, należy umieścić roztwór sondy w specjalnej cylindrycznej kuwecie. Kuweta jest umieszczona w komorze z kontrolowaną temperaturą, wewnątrz nieprzepuszczalnej dla światła klatki z portami dla światłowodów wzbudzenia i emisji. Kuwetę zamyka się korkiem, w którym osadzona jest wysokoczuła elektroda tlenowa typu Clarka.Korek posiada również dwa porty igłowe dla wlotu i wylotu argonu. Ustaw temperaturę na 36 do 37 °C i pozostaw roztwór w mieszaniu, aż osiągnie stan równowagi. Podłącz światłowód wzbudzenia do portu wzbudzenia cyfrowego fosforometru sterowanego przez komputer.Źródłem światła w fosforymetrze jest wysokoenergetyczna dioda LED, której moc wyjściowa jest sterowana przez cyfrowo-analogową płytkę sterującną o częstotliwości 333 kHz. Włókno emisyjne jest podłączone do innego portu optycznego fosforymetru, który jest sprzężony z lawinową fotodiodą czułą na podczerwień. Sygnał wyjściowy z diody jest wzmacniany i wprowadzany do kanału AD tej samej płytki sterującej, co umożliwia synchronizację między kanałami wzbudzenia i emisji.Własnoręcznie napisane oprogramowanie sterujące generuje impulsy wzbudzenia o dowolnej żądanej długości, po których następuje pomiar zaniku fosforescencji. Sygnał wyjściowy elektrody tlenowej jest wzmacniany i kierowany do drugiej karty analogowo-cyfrowej w tym samym komputerze. Jest to karta niskiej częstotliwości, o maksymalnej wartości 1 kHz, która służy do rejestracji prądu elektrody w wybranych punktach czasowych, zazwyczaj 10 razy na sekundę.Po wyrównaniu temperatury roztworu jednocześnie inicjuje się programy obwodu fosforowego oraz elektrody. W celu wykonywania pomiarów co 10 sekund ich wyniki są rejestrowane synchronicznie w dwóch oddzielnych plikach. Następnie Argonne zostaje podłączone do portu wlotowego w stoprze wet.Podczas przepływu argonu przez powierzchnię mieszanego roztworu następuje stopniowe usuwanie tlenu. Prowadzi to do spadku prądu elektrodowego oraz wydłużenia czasu życia fosforu, który jest mierzony za pomocą fosforometru. Zazwyczaj tlen zostaje całkowicie usunięty z roztworu.Około dwie godziny po zakończeniu miareczkowania dane z elektrody oraz czasy życia fosforu są importowane do standardowego programu analitycznego, który tworzy wykres odwrotności czasu życia fosforu w funkcji ciśnienia parcjalnego tlenu. Wykres ten jest dopasowywany do linii prostej metodą najmniejszych kwadratów, aby wyznaczyć stałą gaszenia tlenowego jako nachylenie tej linii. Czas życia fosforescencji uzyskuje się albo z tego samego dopasowania, albo bezpośrednio z pomiaru przy zerowym stężeniu tlenu.Miareczkowanie można powtórzyć, używając roztworu sondy w obecności albuminy, białka występującego w osoczu krwi, aby zasymulować warunki panujące w krwi zwierzęcia in vivo. Uzyskane wykresy Sterna-Volmera powinny być identyczne, jeśli ER chroni sondę, a grupy peg izolują sondę przed kontaktem z albuminą.Poniżej przedstawiono wybrane etapy syntezy tlenu, a następnie opis sond oraz ich kalibracji. Podczas przeprowadzania kalibracji istotne jest upewnienie się, że warunki są jak najbliższe warunkom badanego systemu biologicznego.Ważne jest, aby upewnić się, że cząsteczka sondy nie ulega wpływowi biomolekuł, takich jak albumina. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu doświadczenia.

synthesis-calibration-phosphorescent-nanoprobes-for-oxygen-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Synteza i kalibracja nanosonda fosforescencyjnych do obrazowania tlenu w systemach biologicznych

Przedstawiamy procedurę eksperymentalną pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu (pO2) w naczyniach krwionośnych mózgu, opartą na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji. Opisano procedury przygotowania zwierząt oraz obrazowania zarówno dla obrazowania pO2 w szerokim polu widzenia z wykorzystaniem detektora CCD u szczurów, jak i obrazowania pO2 opartego na dwufotonowym wzbudzeniu u myszy.

Pomiar utlenowania krwi mózgowej oparty na zależnym od tlenu wygaszaniu fosforescencji

Niniejszy protokół opisuje metodę trójwymiarowego obrazowania stężenia tlenu w skali mikronowej w bezpośrednim otoczeniu żywych komórek z wykorzystaniem mikroskopii rezonansu spinowego elektronów.

Mikroobrazowanie za pomocą rezonansu spin-elektronowego żywych organizmów do mapowania tlenu

Fluorescencyjne nanocząsteczki wytwarzane w naszym laboratorium są wykorzystywane do obrazowania stężeń jonów i strumieni jonowych w systemach biologicznych, takich jak komórki podczas sygnalizacji oraz płyn śródmiąższowy podczas homeostazy fizjologicznej.

Nanocząstki fluorescencyjne do pomiaru stężenia jonów w systemach biologicznych

Oksydaza NADPH jest głównym źródłem reaktywnych form tlenu (ROS) w fagocytach. Ze względu na efemeryczną naturę ROS, pomiar i monitorowanie poziomu ROS u żywych zwierząt jest trudne. Opisano mało inwazyjną metodę seryjnego oznaczania ilościowego ROS u żywych myszy.

Obrazowanie bioluminescencyjne aktywnościy oksydazy NADPH w różnych modelach zwierzęcych

Ten manuskrypt przedstawia protokoły zastosowania nowych genetycznie kodowanych sond tlenku azotu (NO•) (geNOps) do monitorowania fluktuacji NO• pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Powstawanie NO• wywołane przez Ca2+ na poziomie pojedynczych komórek śródbłonka uwidoczniono poprzez połączenie geNOps z chemicznym czujnikiem Ca2+.

Zastosowanie genetycznie kodowanych fluorescencyjnych sond tlenku azotu (NO•), geNOps, do obrazowania w czasie rzeczywistym sygnałów NO• w pojedynczych komórkach

Tutaj prezentujemy metodę spektroskopowej charakterystyki cząsteczek organicznych za pomocą czasowo-rozdzielczej spektroskopii fotoluminescencyjnej w skali nanosekundowej do milisekundowej w warunkach beztlenowych. Opisano również metody skutecznego usuwania tlenu z próbek, a tym samym ograniczania wygaszania luminescencji.

Czasowo-rozdzielcza charakterystyka fotofizyczna związków organicznych zbierających potrójnie w środowisku beztlenowym przy użyciu kamery iCCD

Opisujemy użycie nowatorskiej kamery o żywotności luminescencji w dziedzinie częstotliwości do mapowania rozkładów 2D O2 za pomocą folii czujników optycznych. Opisano system kamer i procedury analizy obrazu wraz z przygotowaniem, kalibracją i aplikacją folii sensorycznych do wizualizacji mikrośrodowiskaO2 w ryzosferze roślin wodnych.

Obrazowanie żywotności luminescencjiO2 za pomocą systemu kamer opartego na domenie częstotliwości

Protokół opisuje wysokoprzepustowe generowanie sferoidów do biodruku przy użyciu wieloparametrycznej analizy ich natlenienia i śmierci komórki pod standardowym mikroskopem fluorescencyjnym. Podejście to można zastosować do kontrolowania żywotności sferoid i przeprowadzania standaryzacji, co jest ważne w modelowaniu tkanki 3D, mikrośrodowiska guza i udanej biofabrykacji (mikro)tkanek.

Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

Ten artykuł opisuje użycie nowego, szybkiego imagera optycznego do makroskopowego obrazowania czasu życia fotoluminescencji próbek emitujących długie rozpady. Opisano procedury integracji, akwizycji i analizy obrazu, a także przygotowanie i charakterystykę materiałów sensorów do obrazowania oraz zastosowania imagera w badaniu próbek biologicznych.

Termoobrazownik o żywotności fluorescencji do zastosowań biomedycznych

Prezentujemy protokół do bezpośredniej wizualizacji aktywności metabolicznej w komórkach regulowanych przez aminokwasy za pomocą mikroskopii stymulowanego rozpraszania Ramana (DO-SRS) z tlenkiem deuteru (ciężka wodaD2O), która jest zintegrowana z mikroskopią fluorescencyjną wzbudzenia dwufotonowego (2PEF).

Bioortogonalne obrazowanie chemiczne metabolizmu komórkowego regulowanego przez aminokwasy aromatyczne

Protokół ten przedstawia metodę wytwarzania dwuwarstwowego chipa mikroprzepływowego i analizy wzrostu drobnoustrojów pod wpływem gwałtownych oscylacji tlenu. Wydajność urządzenia została potwierdzona za pomocą wykrywania tlenu w kanałach płynów i hodowli mikroorganizmów.

Tworzenie szybkich oscylacji tlenu w analizie wzrostu pojedynczych komórek drobnoustrojów przy użyciu dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

Poznaj syntezę i kalibrację fosforyzujących nanosond do pomiaru tlenu w układach biologicznych. Metoda wykorzystuje porfiryny platyny i palladu w strukturach dendrytycznych z warstwą polietylenoglikolu.

Synteza i kalibracja fosforescencyjnych nanosond do obrazowania tlenu w układach biologicznych

Przeglądaj więcej filmów