Synteza i kalibracja fosforyzujących nanosond do obrazowania tlenu w układach biologicznych

Przedstawiamy zasady pomiaru tlenu metodą gaszenia fosforescencji i recenzujemy projekt nanosensorów dendrytycznych na bazie porfiryny do obrazowania tlenu w systemach biologicznych.

Przedstawiamy projekt sond fosforyzujących do tlenu na bazie DER porfiryny platynowej i palladowej. Sondy składają się z metalowych rdzeni porfirynowych otaczających dendron i obwodową hydrofilową konstrukcję warstwy glikolu polietylenowego sond, a ich kalibracje zostaną zilustrowane w niniejszym artykule. Cześć, nazywam się Luis Sinks.

Pracuję z profesorem Siergiejem OV na Wydziale Biochemii i Biofizyki Uniwersytetu Pensylwanii. Nazywam się Emmanuel Losis i również pochodzę z Vina. Jestem gruby również z, I jestem Sergei V.Biologiczne pomiary tlenu za pomocą fosforu i hartowania wykorzystują egzogenny fosfor i sondy, które są wprowadzane bezpośrednio do interesującego nas podłoża.

Sondy krwi lub płynu śródmiąższowego są jedynym inwazyjnym elementem schematu pomiarowego, wymagającym szczególnej uwagi w zakresie ich konstrukcji. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę syntezy i kalibracji dendrytycznych fosforyzujących nanosond do pomiaru tlenu i systemów biologicznych. Używamy tej procedury do syntezy i charakteryzowania sond do pół- i dwukrotnych pomiarów tlenu.

Więc zacznijmy. Zanim zaczniemy konstruować sondy, przyjrzyjmy się najpierw podstawowej teorii fosforescencji sondy. Fosforescencja wywodzi się z długotrwałego stanu trypletowego.

Cząsteczka sondy musi być zaprojektowana tak, aby dawała wysoką wydajność kwantową stanu trypletowego i emitowała fosforescencję zamiast fluorescencji. Wzbudzenie sond odbywa się za pomocą jednego fotonu lub, w przypadku specjalnych sond wzmocnionych dwoma fotonami, za pomocą mechanizmu dwufotonowego. Wzbudzenie jednym fotonem na ogół zapewnia mniejszą rozdzielczość przestrzenną, ale wymaga prostszego oprzyrządowania i może być używane w pomiarach jednopunktowych za pomocą obwodów światłowodowych opartych na diodach LED.

W stanie trypletowym sonda może doświadczać zderzeń z cząsteczkami tlenu, które mogą dezaktywować stan trypletowy w procesie zwanym hartowaniem. Dlatego w obecności tlenu skraca się czas życia fosforescencji. W wyniku hartowania zależność czasu życia stanu trypletowego od ilości tlenu w środowisku jest scharakteryzowana równaniem Volmera na rufie.

W eksperymentach in vivo sonda jest dostarczana do krwi lub płynu śródmiąższowego zwierzęcia, a powierzchnia tkanki jest oświetlana światłem o odpowiedniej długości fali, aby wprowadzić sondę w stan wzbudzonego trypletu. Aby zmierzyć czas życia fosforyzacji, emitowane fotony fosforyzujące są bi w czasie. Na przykład po impulsie wzbudzenia można zebrać 3 609 fotonów w ciągu pierwszych pięciu mikrosekund, 1 421 fotonów w ciągu następnych pięciu mikrosekund i tak dalej, aż nie zostaną zebrane żadne fotony.

Liczby w pojemnikach wykreślone w stosunku do czasu dają rozpad fosforescencji, który jest analizowany w celu uzyskania czasu życia fosforescencji. W obrazowaniu procedura ta jest stosowana do każdego piksela obrazu, co skutkuje fosforyzującymi mapami czasu życia. Pomiary czasu życia są niewrażliwe na niejednorodność rozkładu sondy w całym obiekcie, co jest powszechne w przypadku próbek biologicznych.

Zobaczmy teraz, jak konstruować sondy. Rozpocznij procedurę syntezy od dodania aldehydu aromatycznego do 0,01 molowego roztworu tetra hydro iso indolu. Mieszaj mieszaninę reakcyjną przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj bor, trifluorek dathyl, zjedz i mieszaj przez dodatkowe dwie godziny. Następnie dodaj dichlorek cyjanu, benzochinonu lub DDQ, co spowoduje uzyskanie koloru. Zmień kolor z bladoczerwonego na ciemnozielony i pozostaw mieszaninę na noc pod ciągłym mieszaniem następnego dnia, umyj i osusz roztwór, a następnie skoncentruj go w próżni

Reg krystalizacja pozostałości daje cel w postaci zielonego proszku. Plony wynoszą zwykle około 50%Następnie potraktuj wolnozasadową porfirynę octanem palladu. Monitoruj konwersję za pomocą spektroskopii UV-vista.

Konwersja jest zakończona po zniknięciu pasma mydlanego Dion między 468 a 472 nanometrami. Porfirynę izoluje się metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym. Aby wytworzyć pallad tetra benzoporfiryna, należy utlenić pallad tetra cykloporfirynę.

Podczas odruchu kolor zmienia się z ciemnoczerwonego na ciemnozielony, odparować rozpuszczalnik, rozcieńczyć pozostałość płukaniem di chlorometanem, wysuszyć i zagęścić fazę organiczną w próżni. Po chromatografii na żelu krzemionkowym wyizolować pallad tetra benzo-porfirynę w postaci niebieskozielonego proszku. Następnie hydrolizuj obwodowe grupy etro palladu trab benzoporfiryny.

Najpierw potraktuj tetra benzo porfirynę Estery z zasadą w tetra hydro purynie. Następnie kontynuuj hydrolizę i zasadę wodną, wytrącić porfirynę przez dodanie kwasu solnego i wysuszyć ją w próżni. Na tym kończy się synteza porfiryny.

Zobaczmy teraz, jak zsyntetyzować entrony. Zanim sondy zostaną zmontowane, entrony, które są gałęziami Danii, muszą zostać wstępnie zsyntetyzowane. Używamy aerogli, tych samych DER, które można wygodnie przygotować z niedrogich materiałów badawczych przy użyciu metod wolnych od chromatografii.

Therony z grupami aminowymi w ich ogniskach są następnie dołączane do grup chrząstek na fizyce, którą właśnie pokazaliśmy, jak to zrobić. Następnie grupy estrowe na obrzeżach DME są hydrolizowane podobnie jak grupy karboksylowe na obrzeżach porfiryny. W tym momencie, zaczynając od kwasu polikarboksylowego Porphyrin DME, można zsyntetyzować jedną lub dwie sondy fotonowe w celu syntezy dwóch sond fotonowych.

Najpierw należy oddzielnie przyłączyć kilka dwufotonowych fragmentów anteny do kilku grup karboksylowych na obrzeżach demeru. Teraz przystąp do modyfikacji pozostałych reszt kwasu karboksylowego na demerze. Zacznij od dodania 1,25-krotnego nadmiaru HBTU do wysoce stężonego roztworu porfiryny i mieszaj mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Teraz dodaj di-izopropyloetyloaminę i glikogliko-metoksypolietylenogliko-laminę. Mieszaj mieszaninę reakcyjną przez dwa dni w temperaturze pokojowej, a następnie dodaj eter etylowy. Oddziel formę do wytrącenia przez odwirowanie i ponownie wytrącić ją z czworościanu kilka razy, dodając eter dathylu.

Na koniec oczyść sondę za pomocą chromatografii wykluczania wielkości na kulkach polistyrenowych przy użyciu czworościanu jako rozpuszczalnika. Przyjrzyjmy się teraz charakterystyce i kalibracji sondy. Widma absorpcyjne i emisyjne sondy uzyskuje się przy użyciu roztworów jednej sondy mikromolowej w warunkach otoczenia za pomocą standardowego spektrofotometru i fluorymetru w stanie ustalonym.

Następnie, aby uzyskać rufowy wykres kalibracyjny Ulmera, który pozwala nam odnieść żywotność sondy do stężenia tlenu, należy umieścić roztwór sondy w specjalnym cylindrycznym vete. Vete jest umieszczony w komorze o kontrolowanej temperaturze wewnątrz nieprzepuszczalnej dla światła klatki z portami do wzbudzenia i emisji światłowodów. Zamknij vete korkiem, w który włożona jest bardzo czuła elektroda tlenowa typu Clark

Korek posiada również dwa otwory na igły do wlotu i wylotu Argonne. Ustaw temperaturę na 36 do 37 stopni Celsjusza i pozostaw roztwór mieszając, aż osiągnie równowagę. Podłącz włókno wzbudzenia do wylewu wzbudzenia cyfrowego obwodu fosfonowego sterowanego przez komputer.

Źródłem światła i obwodem phos jest dioda LED dużej mocy, której wyjście jest kontrolowane przez 333 kilohercową płytkę cyfrowo-analogową. Światłowód emisyjny jest podłączony do innego portu optycznego obwodu fosu, który jest sprzężony z czułą na podczerwień fotodiodą lawinową. Wyjście diody jest wzmacniane i podawane do kanału reklamowego tej samej płyty sterującej, co umożliwia synchronizację między kanałami wzbudzenia i emisji.

Oprogramowanie sterujące napisane w domu generuje impulsy wzbudzenia o dowolnej długości, po których następuje zbieranie rozpadu fosforescencji. Wyjście elektrody tlenowej jest wzmacniane i kierowane do innej analogowej płytki cyfrowej na tym samym komputerze. Jest to tablica o niskiej częstotliwości, maksymalnie jeden kiloherc, która służy do rejestrowania prądu elektrody w wybranych punktach czasowych, zwykle 10 razy na sekundę.

Po zrównoważeniu temperatury roztworu inicjowany jest jednocześnie zarówno obwód fosowy, jak i programy elektrod. Aby wykonywać pomiary co 10 sekund, ich wyjścia są rejestrowane synchronicznie w dwóch oddzielnych plikach. Następnie Argonne jest podłączany do portu wlotowego na korku weterynarza.

Gdy Argonne przepływa po powierzchni mieszanego roztworu, stopniowo zastępuje tlen. Powoduje to spadek prądu elektrody i wydłużenie czasu życia fosforu, który jest mierzony za pomocą obwodu fosy. Zwykle tlen jest całkowicie wypierany z roztworu.

Po około dwóch godzinach od rozpoczęcia miareczkowania dane elektrody i czas życia fosforu są importowane do standardowego programu analitycznego, który tworzy wykres odwrotności czasu życia fosforu w funkcji ciśnienia parcjalnego tlenu. Wykres ten jest wyposażony w linię prostą przy użyciu metody najmniejszych kwadratów, aby uzyskać stałą hartowania tlenu jako jej nachylenie. Czas życia fosforyzacji uzyskuje się albo z tego samego pasowania, albo bezpośrednio z pomiaru przy zerowej zawartości tlenu.

Miareczkowanie można powtórzyć przy użyciu roztworu sondy w obecności albuminy, białka obecnego w osoczu krwi, w celu naśladowania warunków panujących we krwi zwierzęcia in vivo. Uzyskane rufowe wykresy Ulmera powinny być identyczne, jeśli ER chroni sondę. No cóż, a grupy kołków izolują sondę od kontaktu z albuminą.

Sugestia tutaj, wybrane etapy syntezy tlenu, a następnie poddane obróbce sondy i ich kalibracja. Podczas wykonywania kalibracji. Ważne jest, aby upewnić się, że warunki są jak najbardziej zbliżone do warunków systemu biologicznego, który jest przedmiotem zainteresowania.

Ważne jest, aby upewnić się, że cząsteczka sondy nie ma wpływu na biomolekuły, takie jak albumina. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w zdobywaniu doświadczenia.