Robotyka i dynamiczna analiza obrazu do badań ekspresji genów w tkankach roślinnych

W tej procedurze dynamika ekspresji genów w tkankach roślinnych jest obrazowana w czasie za pomocą robotyki, najpierw nasiona fasoli są sterylizowane i umieszczane między zwilżonymi ręcznikami papierowymi w pojemniku do hodowli tkankowej w celu kiełkowania. Po czterech dniach koan jest usuwany i bombardowany konstruktem DNA zawierającym promotor połączony z GFP Coan umieszczony na szalkach Petriego jest montowany na dwuwymiarowym, specjalnie zaprojektowanym systemie zbierania obrazów robotycznych. Robot jest zaprogramowany tak, aby rejestrować obrazy każdego fragmentu tkanki co godzinę przez 100 godzin.

Obrazy poddawane są analizie obrazu, w której zbierane są dane ilościowe dotyczące intensywności ekspresji GFP w czasie. Cześć, nazywam się John Finer i jestem dyrektorem Laboratorium Transformacji Roślin na Wydziale Ogrodnictwa i Nauk o Uprawach na Uniwersytecie Stanowym Ohio. Nazywam się Carlos Herandez Garcia i jestem doktorantem w ostatnim laboratorium na Uniwersytecie Stanowym Ohio.

Dzisiaj Carlos pokaże Wam opracowany przez nas protokół analizy ekspresji genów i tkanek roślinnych przy użyciu białka zielonej fluorescencji. Używamy tej procedury, którą opracowaliśmy w laboratorium, do pomiaru odkształcenia aktywności OD. Aby to zrobić, promotor naszej pierwszej korony przed genem GFP, który jest naszym genem reporterowym.

Pokażę Ci, w jaki sposób wprowadzamy kontrolę promotora do vein Cataly i wysyłamy aplikację na nasz niestandardowy system automatycznego przechwytywania obrazu. Zakończę omówieniem naszego protokołu analizy obrazu. Więc chodźmy Aby rozpocząć tę procedurę, sterylizuj nasiona fasoli przy użyciu standardowych procedur.

Umieść wysterylizowane nasiona w siedmiu pojemnikach magenta GA między warstwami wilgotnych i papierowych ręczników i inkubuj je przez cztery dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza. W tym miejscu używamy wektora wyrażenia o wysokiej liczbie kopii, przydatnego do analiz elementów promotora i promotora. Wektor ten zawiera gen GFP, który jest używany do wizualizacji funkcji promotora lub elementu promotora w przekształconych tkankach na około jedną do dwóch godzin przed bombardowaniem.

Akcyza ołowiu CU z fasoli z okrywy nasiennej. Ołowi CU nadający się do bombardowania powinien być od żółtego do jasnozielonego, płaski i wolny od jakichkolwiek uszkodzeń, które mogłyby zakłócać dalszą analizę obrazu, natychmiast po wycięciu umieścić 12 cu ołowiu na szalce Petriego z pożywką hodowlaną OMS zawierającą sole MS, B, pięć witamin, 3% sacharozy i 0,2% szybkość żelowania przy pH 5,7. Następnie wytnij konstrukt DNA na cząstkach wolframu M 10 Po pierwsze, tuż przed użyciem ponownie zamieszaj cząstki w sterylnej wodzie do stężenia 100 miligramów na mililitr.

Następnie do probówki fuge o pojemności 0,6 mililitra dodaj 25 mikrolitrów cząstek, pięć mikrolitrów DNA w ilości jednego mikrograma na mikrolitr, 25 mikrolitrów 2,5 molowego chlorku wapnia i 10 mikrolitrów 100 milimolowych nasieników. Inkubować preparat DNA na lodzie przez pięć minut, a następnie usunąć i wyrzucić 50 mikrolitrów roztworu na cząstki. Ponownie zawiesić cząstki pokryte DNA, które pozostają na dnie probówki, poprzez wirowanie.

I natychmiast po wirowaniu usuń dwulitrową Eloqua. Powtórz ten krok wirowania. Za każdym razem, gdy Eloqua jest usuwana, powleczone cząstki powinny być przechowywane na lodzie i zużyte w ciągu 15 minut.

Teraz, gdy DNA jest pokryte cząsteczkami, umieść dwa mikrolitry cząstek przez górną część filtra strzykawkowego na środku sita filtrującego. Następnie umieść filtr strzykawkowy w jednostce podtrzymującej filtr wewnątrz pistoletu do doprowadzania cząstek stałych lub komory PIG. Umieść współołów z fasoli osiową stroną do góry na przegrodzie, która składa się z sitka stopionego do dna zlewki.

Umieść przegrodę, która służy jako platforma do podtrzymywania tkanek podczas bombardowania, w komorze pistoletu na cząstki. Aby zbombardować tkankę, najpierw otwórz zawór prowadzący do próżni w celu opróżnienia komory. Gdy próżnia osiągnie 760 milimetrów słupa rtęci, aktywuj solenoid i uwolnij hel, aby napędzać cząstki.

Ciśnienie helu używane do przyspieszania cząstek wynosi od 50 do 60 PSI. Po bombardowaniu cząstkami zamknij zawór przewodu podciśnieniowego i uwolnij podciśnienie za pomocą zaworu wydechowego. Po zwolnieniu próżni otwórz drzwi komory, aby pobrać zbombardowaną koołowię i zwróć koolead po stronie dal.

Pożywka hodowlana do OMS do kwantyfikacji i profilowania ekspresji. Bombarduj co najmniej trzy koleadyny na każdy konstrukt DNA. Uwzględniono również kontrolę pozytywną, która daje dobrze zbadany profil ekspresji genów.

Koleadyna jest teraz gotowa do obrazowania. Włącz lampę rtęciową i odczekaj 30 minut, aż lampa się nagrzeje. Włącz źródła zasilania kamery SPOT R-T-C-C-D i sterownika silnika, który napędza ruch specjalnie zaprojektowanej platformy robotycznej, która mieści osiem płyt.

Ustaw zestaw filtrów do wykrywania GFP, wybierając zestaw dwóch filtrów GFP przy wzbudzeniu 480 nanometrów i emisji 510 nanometrów na mikroskopie preparacyjnym MZ L three. Następnie wysterylizuj zagęszczone pokrywki szalek Petriego z poliwęglanu, spryskując je 70% etanolem. Specjalistyczne pokrywki używane do przykrycia podstawy szalki Petriego zapobiegają kondensacji pary wodnej podczas zbierania obrazu.

Umieść płytki zawierające bombardowany materiał na platformie robotyki i dokręć boczną dociskową, aby zamocować je na miejscu. Teraz otwórz niestandardową aplikację, która steruje zarówno platformą robotyki, jak i akwizycją obrazu. Otwórz również programowy przełącznik sterownika światła białego za pomocą oprogramowania, ustaw platformę w pozycji wyjściowej.

Odbywa się to przed wejściem na pozycje. Dla każdego przewodu rozpieszczonego w zakładce silnika wybierz pierwszą płytkę. Platforma umieści środek szalki Petriego pod obiektywem mikroskopu.

Za pomocą przycisków odległości przesuwania precyzyjnie ustaw pierwszy CU LEADIN do zbierania obrazów. Korzystając z funkcji trybu na żywo, przesuń ołowiany przytulankę do odpowiedniego viewobszar Aby po raz pierwszy przytulić ołowiane, użyj ręcznych pokręteł na mikroskopie sekcyjnym, aby ustawić ostrość i ustawić powiększenie na 1.6 x. Po ustawieniu obszaru zainteresowania kliknij przycisk dodaj tę pozycję.

Oprogramowanie doda współrzędne tego regionu do pliku harmonogramu pozycji, a platforma powróci do środka pozycji zestawu płyt dla wszystkich pozostałych współrzędnych na płytach. Korzystając z przycisków odległości przesuwania, użyj trzech ręcznych poziomujących znajdujących się pod każdą płytą na platformie robotyki, aby wyregulować ostrość dla pozostałego coan na tej samej płycie. Po wprowadzeniu wszystkich współrzędnych wszystkich współrzędnych coan zapisz współrzędne harmonogramu pozycji.

Wprowadź parametry zbierania obrazów, takie jak rodzaj światła, które jest niebieskie dla GFP i ustawienie ekspozycji, a także określ, gdzie mają być przechowywane obrazy zgodnie z opisem w dołączonym pisemnym protokole. Przejdź do zakładki Kontrola czasu przechwytywania i ustaw przedział czasu akwizycji obrazu oraz całkowitą liczbę cykli zbierania obrazu. Obrazy są zwykle zbierane co godzinę przez 100 godzin.

Generowanie dobrze zdefiniowanych profili ekspresji genów. Rozpocznij pobieranie obrazu, otwierając kartę harmonogramu pozycji, a następnie klikając przycisk harmonogramu uruchamiania. Odizoluj system zbierania obrazów od zewnętrznego światła po zakończeniu 100-godzinnego zbierania obrazów.

Obrazy o wysokiej rozdzielczości, każdy o wielkości około pięciu megabajtów, są gotowe do analizy obrazu. Użyj obrazu gotowego, aby złożyć 100 sekwencyjnych obrazów z każdego folderu. Zaimportuj wszystkie sekwencyjne obrazy jako klatki i zmień ich rozmiar na 800 na 600 pikseli, aby przyspieszyć przetwarzanie obrazu.

Następnie należy użyć znaczników na nowo wprowadzonej warstwie, która jest widoczna we wszystkich klatkach oraz przy użyciu wybranych punktów GFP w odniesieniu do obrazu. Po zakończeniu wyrównywania należy ręcznie wyrównać każdy obraz, usunąć warstwę użytą jako odniesienie i zapisać plik jako pojedynczy plik PSD. Ponadto wyeksportuj wszystkie klatki jako pojedynczy plik MOV przy użyciu najwyższej rozdzielczości.

Pliki są teraz gotowe do rozpoczęcia kwantyfikacji GFP. Użyj obrazu J, aby otworzyć plik MOV i przyciąć obszar o wymiarach 400 na 300 pikseli. Następnie podziel sekwencyjne obrazy na kanały czerwony, niebieski i zielony za pomocą narzędzia do podziału RGB dla kanałów czerwonego i zielonego.

Odejmij fluorescencję tła za pomocą odejmienia zmierzonego zwrotu z inwestycji dla każdego narzędzia wtyczki slice. Oblicz wyrażenie GFP, dostosowując poziomy progowe i używając wtyczki przeznaczonej do pomiaru średniej wartości skali szarości na piksel i całkowitej liczby pikseli wyrażających GFP. Skopiuj wartości wyjściowe na obrazie J. Na koniec wklej wartości wyjściowe dla kanałów zielonego i czerwonego do pakietu Microsoft Office.

Excel do dalszej manipulacji danymi, aby dać wyobrażenie o wynikach wyrównania obrazu. Ta pierwsza animacja pokazuje niedokładność przestawienia platformy robotycznej podczas 100-godzinnego eksperymentu. Ruch punktowy jest artefaktem wynikającym z niezdolności platformy robotycznej do powrotu do dokładnie tej samej pozycji w każdym punkcie czasowym po ręcznym wyrównaniu obrazu, komórki wyrażające GFP można łatwo zaobserwować, a unikalne cechy tego systemu śledzenia można łatwo zwizualizować.

Jak powtarza się ta animacja, zauważ, że komórki wyrażające GFP są zakreślone, komórka zakreślona na czerwono wykazuje bardzo szybki spadek ekspresji po 18 do 20 godzinach od bombardowania, podczas gdy komórka zakreślona na biało wykazuje opóźniony początek ekspresji GFP. Oprócz animacji, procedura ta umożliwia szybkie określenie ilościowe ekspresji GFP w czasie w tkance docelowej fasoli. Te reprezentatywne wyniki pokazują porównawczą kwantyfikację intensywności promotora przy użyciu promotora CAMV 35 S i czterech różnych promotorów soi.

Właśnie pokazaliśmy, jak wprowadzić DNA do kataliny kiełkującej. Nasiona żyły umieszczają katalinę na robocie, zbierają obrazy do analizy obrazu i analizują te obrazy. Rutynowo stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do walidacji selektorów roślin.

Można wygenerować dużą ilość danych z wprowadzenia różnych promotorów roślinnych. Jednak ta procedura jest skomplikowana z wieloma krokami, które mogą się nie udać podczas wykonywania tej procedury, ważne jest, aby zacząć od świeżych nasion fasoli lub przynajmniej użyć wysokiej jakości nasion, które były odpowiednio przechowywane. Ważne jest również, aby szybko przyciąć pokrywę bombard i ustawić ją na robocie oraz użyć grubej pokrywy do naczyń dla zwierząt, aby zminimalizować problemy z kondensacją.

I na koniec, proszę zauważyć, że GFP, którego używamy, to inna wersja o nazwie SGFP, front Gen HIN Lab na Uniwersytecie Harvarda. Ten GFP nie jest zbyt stabilny i może być lepszy do śledzenia szybkich zmian w ekspresji genów. I to jest itra nas za to, że nas obserwujemy.

I powodzenia w eksperymentach.