Name: Robotyka i dynamiczna analiza obrazu do badań ekspresji genów w tkankach roślinnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Poznaj metodę śledzenia ekspresji GFP w tkankach roślinnych z wykorzystaniem systemu robotycznego do zbierania obrazów. Protokół umożliwia półciągłą rejestrację danych przez 100 godzin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wynagrodzenia i wsparcie badań zostały zapewnione przez United Soybean Board oraz ze środków stanowych i federalnych przydzielonych dla The Ohio State University/Ohio Agricultural Research and Development Center. Badania te były również częściowo wspierane przez stypendium z CONACYT, Meksyk, przyznane dla CMHG. Wzmianka o produktach zastrzeżonych lub markowych nie stanowi gwarancji ani rękojmi produktu przez OSU/OARDC, a także nie oznacza zatwierdzenia z wykluczeniem innych produktów, które również mogą być odpowiednie. Artykuł z czasopisma nr HCS 09-17.

Poniższa metodologia przedstawia protokół analizy obrazu ekspresji genów z wykorzystaniem zautomatyzowanego systemu zbierania obrazów. Dla ułatwienia wyjaśnienia ogólne podejście podzielono na cztery etapy: 1) przygotowanie nasion, 2) wprowadzenie genów za pomocą bombardowania cząstkami, 3) robotyczne zbieranie obrazów oraz 4) analiza obrazu. Choć ta ogólna metodologia może być stosowana w szerokim zakresie innych zastosowań, niniejsze zestawy protokołów opierają się na użyciu genu białka zielonego fluorescencyjnego (gfp), który jest użytecznym genem reporterowym do śledzenia ekspresji genów w tym samym fragmencie żywej tkanki w czasie.
I. Przygotowanie nasion
<ol>
	<li>Nasiona fasoli limskiej (Phaseolus lunatus cv. Henderson-Bush) można zakupić lub, co jest rozwiązaniem idealnym, zebrać z roślin hodowanych w komorze wzrostowej (względna wilgotność 50%, cykl światła i ciemności 16/8 h, temperatura dzień/noc 25/23°C). Jakość nasion po zbiorach można utrzymać, przechowując je w temperaturze -20°C.</li>
	<li>Przygotować pojemniki Magenta GA7 do kiełkowania nasion. Złożyć papier filtracyjny lub ręczniki papierowe tak, aby pasowały do dna pudełek Magenta. Do każdego pojemnika dodać ~25 ml wody dejonizowanej w celu nawilżenia ręczników papierowych, a następnie odlać niepochłoniętą wodę. Pudełka z nawilżonym papierem autoklawować przez 20 min.</li>
	<li>Używając jednorazowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml, wysterylizować nasiona w 10% roztworze komercyjnego wybielacza (20 nasion w 20-40 ml) przez 20 min, wstrząsając na wytrząsarce gyratorowej z prędkością 60 rpm. 
 Uwaga: Wszystkie kolejne kroki należy przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
	<li>Płukać nasiona 4-7 razy sterylną wodą dejonizowaną, delikatnie mieszając przez 30 s podczas każdego płukania.</li>
	<li>Umieścić 5-6 sterylnych nasion pomiędzy warstwami złożonego papieru w każdym sterylnym pudełku Magenta.</li>
	<li>Inkubować nasiona przez 4 dni w następujących warunkach: 25°C, cykl światła i ciemności 16/8 h oraz natężenie światła 40 μEm-2 s-1.</li>
</ol>
II. Wprowadzanie genów za pomocą bombardowania cząsteczkami
<ol>
	<li>Zbuduj konstrukty genowe, używając preferowanego wektora ekspresyjnego z genem reporterowym, który można monitorować w żywych tkankach. Opracowaliśmy wektor ekspresyjny o wysokiej liczbie kopii, użyteczny do analizy promotorów i elementów promotorowych. Wektor ten zawiera gen gfp, który służy do wizualizacji funkcji promotora/elementu promotorowego w transformowanych tkankach.</li>
	<li>Około 1-2 h przed bombardowaniem wyciąć zawiercie fasoli szerokolistnej z kiełkujących siewek i usunąć łupiny nasion. Zawiercie odpowiednie do bombardowania powinny mieć kolor od żółtego do jasnozielonego, być płaskie i wolne od wszelkich uszkodzeń, które mogłyby zakłócić dalszą analizę obrazu.</li>
	<li>Bezpośrednio po wycięciu umieścić zawiercie na pożywce OMS zawierającej sole MS1, witaminy B52, 3% sacharozy i 0,2% Gelrite (pH 5,7).</li>
	<li>Wytrącić konstrukt DNA na cząstkach wolframu M10 (Sylvania, Towanda, PA, USA). Do probówki mikrocentryfużowej o pojemności 0,6 ml dodać 25 μl cząsteczek wolframu (cząsteczki resuspenderowane w sterylnej wodzie, 10 mg ml-1, bezpośrednio przed użyciem), 5 μl DNA (1 μg μl-1), 25 μl 2,5 M chlorku wapnia (Sigma-Aldrich Kat. C381-50G) oraz 10 μl 10 mM spermidyny (Sigma Kat. S-2626). Krótko wymieszać na wortexie, aby dokładnie połączyć wszystkie składniki.</li>
	<li>Inkubować preparat DNA na lodzie przez 5 min. Następnie odpiąć i usunąć 50 μl supernatantu.</li>
	<li>Resuspender pokryte DNA cząsteczki za pomocą wortexa i natychmiast pobrać porcję 2 μl. Powtarzać ten krok wortexowania przy każdym pobraniu porcji z probówki. Pokryte cząsteczki należy przechowywać na lodzie i wykorzystać w ciągu 15 min.</li>
	<li>Przez górną część filtra strzykawkowego nanieść 2 μl pokrytych cząsteczek na środek siatki filtra. Umieścić jednostkę filtrującą z pokrytymi cząsteczkami w uchwycie filtra wewnątrz komory pistoletu do cząsteczek.</li>
	<li>Umieścić zawiercie fasoli szerokolistnej stroną adaksjalną do góry na przegrodzie, a następnie umieścić przegrodę w komorze pistoletu do cząsteczek. Przegroda, składająca się z siatki wtopionej w dno zlewki, służy jako platforma do podtrzymywania tkanek podczas bombardowania.</li>
	<li>Bombardować tkanki za pomocą pistoletu do cząsteczek (w tej metodologii używamy prostego i niedrogiego pistoletu Particle Inflow Gun3, PIG, zaprojektowanego w naszym laboratorium) w następujący sposób: a) otworzyć zawór prowadzący do pompy próżniowej, aby odessać powietrze z komory, b) po osiągnięciu próżni 760 mm (30 in) Hg aktywować solenoid i wypuścić hel, aby napędzić cząsteczki, c) po bombardowaniu cząsteczkami zamknąć zawór linii próżniowej i zwolnić próżnię za pomocą zaworu upustowego. Ciśnienie helu użyte do przyspieszania cząsteczek wynosi 50 PSI.</li>
	<li>Po zwolnieniu próżni otworzyć drzwi komory, aby wyłowić bombardowane zawiercie i przenieść je, stroną adaksjalną do góry, z powrotem na pożywkę OMS. Uwaga: Do celów kwantyfikacji i profilowania ekspresji zazwyczaj bombardujemy minimum trzy zawiercia dla każdego konstruktu DNA. Jako punkt odniesienia dołączana jest kontrola pozytywna, która zazwyczaj jest konstruktem DNA dającym dobrze zbadany profil ekspresji genu.</li>
</ol>
III. Zautomatyzowany pobór obrazów
<ol>
	<li>Włącz lampę rtęciową i odczekaj 30 min aż lampa się rozgrzeje.</li>
	<li>Włącz źródła zasilania dla kamery CCD Spot-RT (Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, MI, USA) oraz sterownika silnika platformy robotycznej, który napędza ruch platformy.</li>
	<li>Ustaw zestaw filtrów do detekcji GFP (zestaw filtrów GFP2; Ex. 480/40 nm, Em. 510 LP) w mikroskopie stereologicznym MZFLIII (Leica, Heerbrugg, Switzerland).</li>
	<li>Sterylizuj pogrubione pokrywki szalek Petriego, spryskując je 70% etanolem. Specjalistyczne pokrywki służące do przykrycia podstawy szalki zapobiegają kondensacji podczas gromadzenia obrazów4.</li>
	<li>Umieść szalki zawierające bombardowane kotyledony na platformie robotycznej (Arrick Robotics, Hurst, TX, USA) zautomatyzowanego systemu gromadzenia obrazów. Platforma robotyczna jest napędzana przez zestaw silników krokowych i składa się ze stołu umożliwiającego zamocowanie 8 szalek Petriego. Platforma jest wykonana z poliwęglanu, polipropylenu i aluminium. Szalki są mocowane w pozycji poprzez dokręcenie bocznej plastikowej śruby ustalającej.</li>
	<li>Otwórz dedykowaną aplikację programową, która steruje zarówno platformą robotyczną, jak i akwizycją obrazu. Otwórz również przełącznik sterownika światła białego w oprogramowaniu.</li>
	<li>W zakładce „motor motion” kliknij „motor on” oraz „motor home”. Po zorientowaniu platformy przez oprogramowanie do pozycji domyślnej, można przystąpić do wprowadzania pozycji dla każdego kotyledonu.</li>
	<li>W zakładce „motor motion” wybierz pierwszą szalkę. Platforma ustawi środek szalki Petriego pod obiektywem mikroskopu. Używając przycisków dystansu ruchu, precyzyjnie ustaw pierwszy kotyledon do gromadzenia obrazu. Przy włączonym sterowniku światła białego obszar docelowy można obserwować na monitorze komputera, uruchamiając funkcję „live mode”.</li>
	<li>Dla pierwszego kotyledonu ustaw ostrość i powiększenie (preferowane powiększenie 1,6x) za pomocą pokręteł manualnych w mikroskopie stereologicznym. Regulację ostrości dla pozostałych kotyledonów na tej samej szalce wykonuje się za pomocą trzech śrub poziomujących znajdujących się pod każdą szalką na platformie robotycznej.</li>
	<li>Po ustawieniu obszaru zainteresowania kliknij przycisk „add this position”. Oprogramowanie doda współrzędne tego obszaru do pliku harmonogramu pozycji, a platforma powróci do centrum szalki.</li>
	<li>Ustaw pozycje i ostrość dla wszystkich pozostałych kotyledonów na szalkach, używając przycisków dystansu ruchu i manualnych śrub poziomujących. Po wprowadzeniu wszystkich współrzędnych wszystkich kotyledonów zapisz współrzędne harmonogramu pozycji.</li>
	<li>Wprowadź parametry gromadzenia obrazów. W zakładce „image setting” wybierz pożądany rodzaj światła: białe lub niebieskie. Do detekcji GFP należy używać wyłącznie światła niebieskiego. Wprowadź również ustawienia czasu ekspozycji. Chociaż czas ekspozycji można modyfikować niezależnie dla kolorów czerwonego, niebieskiego i zielonego, zazwyczaj stosujemy te same ustawienia dla dokumentacji fotograficznej GFP (odpowiednio 20, 14 i 14 s dla kanałów czerwonego, zielonego i niebieskiego), co pozwala na bezpośrednie i spójne porównania różnych konstruktów DNA.</li>
	<li>W tej samej zakładce „image setting” określ pusty folder, w którym będą przechowywane obrazy. Każda seria obrazów zostanie zapisana w tym folderze głównym w niezależnych folderach, numerowanych sekwencyjnie zgodnie z kolejnością wprowadzonych pozycji kotyledonów.</li>
	<li>Przejdź do zakładki „capture time control” i ustaw odstęp czasu akwizycji obrazu oraz całkowitą liczbę cykli gromadzenia obrazów. Obrazy są zazwyczaj gromadzone co godzinę przez 100 h, co pozwala uzyskać dobrze zdefiniowane profile ekspresji genów.</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję obrazu, klikając przycisk „run schedule!” znajdujący się w zakładce „position schedule”.</li>
	<li>Po zakończeniu 10-godzinnego gromadzenia obrazów przenieś wszystkie pliki z komputera sterującego robotem na dowolny dysk twardy o dużej pojemności lub komputer w celu dalszej analizy obrazu. Obrazy o wysokiej rozdzielczości (160 x 120 pikseli) są gromadzone jako pliki TIF o rozmiarze ok. 5 Mb każdy.</li>
</ol>
IV. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Złóż 10 kolejnych obrazów z każdego folderu za pomocą programu Adobe ImageReady.
	<ol>
 	<li>Otwórz ImageReady i zaimportuj wszystkie kolejne obrazy tworzące serię jako klatki.</li>
	<li>Zmień rozmiar oryginalnych obrazów na 80 x 60 pikseli. Zebrane obrazy mają wysoką rozdzielczość, co generuje duże pliki, które mogą spowolnić przetwarzanie obrazu.</li>
	<li>Przejrzyj obrazy i znajdź punkt(y) widoczne na większości z nich.</li>
	<li>Przybliż wybrany punkt(y) do 30%. Wyrównanie obrazów przy większym powiększeniu pozwala na bardziej precyzyjną rejestrację.</li>
	<li>Wstaw warstwę nad wszystkimi obrazami i upewnij się, że jest ona widoczna we wszystkich klatkach. Zaznacz położenie punktu(ów) za pomocą narzędzia „pędzel”.</li>
	<li>Zacznij wyrównywać wszystkie klatki za pomocą narzędzia „przesuń”, przyjmując znaczniki na warstwie jako punkt odniesienia.</li>
	<li>Po zakończeniu wyrównywania usuń warstwę służącą jako odniesienie i zapisz obrazy jako pojedynczy plik „psd”. Wyeksportuj również wszystkie klatki jako pojedynczy plik „mov” w najwyższej rozdzielczości. Ręczne wyrównywanie każdej serii obrazów zajmuje ok. 10 min.</li>
 </ol>
 </li>
	<li>Przeprowadź kwantyfikację ekspresji genów za pomocą programu ImageJ.
 <ol>
 	<li>Uruchom oprogramowanie ImageJ i otwórz plik „mov” zapisany wcześniej w ImageReady.</li>
 	<li>Używając narzędzia zaznaczania, wybierz obszar o wymiarach 40 x 30 pikseli i przytnij obraz. Ten nowy plik należy zapisać jako plik „avi”.</li>
 	<li>Rozdziel kolejne obrazy znajdujące się w nowym pliku „avi” na kanały czerwony, niebieski i zielony, klikając w ImageJ kolejno „image”, „color” i „RGB split”.</li>
 	<li>Odejmij fluorescencję tła od wszystkich obrazów w kanałach zielonym i czerwonym. Korzystając z serii obrazów w kanale zielonym, wybierz obszar 20 x 20 pikseli w regionie z komórkami niewykazującymi ekspresji i zapisz jego położenie w narzędziu „ROI Manager”, aby ten sam obszar został wybrany w obu kanałach. Przy aktywnym kwadracie 20 x 20 pikseli w kanale zielonym przejdź do polecenia „plugins” na pasku zadań programu ImageJ, a następnie kliknij narzędzie wtyczki „subtract measured ROI for each slice”.</li>
 	<li>W ImageJ kliknij „Image”, „adjust”, a następnie „threshold”, aby zdefiniować lub segmentować piksele wykazujące ekspresję GFP. Dostosuj poziomy progu, przesuwając suwak w oknie progu, aby uzyskać średnią wielkość punktu wynoszącą 20-30 pikseli.</li>
 	<li>Określ ekspresję GFP za pomocą wtyczki, którą zaprojektowaliśmy do pomiaru średniej wartości skali szarości na piksel oraz całkowitej liczby pikseli wykazujących ekspresję GFP.</li>
 	<li>Skopiuj uzyskane średnie wartości skali szarości z ImageJ i wklej je do programu Microsoft Office Excel. Oblicz ekspresję GFP dla każdego kanału (czerwonego i zielonego), mnożąc średnią wartość skali szarości na piksel przez całkowitą liczbę pikseli wykazujących ekspresję GFP dla każdego kanału. Suma wartości ekspresji dla obu kanałów daje całkowitą ekspresję GFP. Wartości te mogą służyć do ilustracji profili ekspresji genów i przeprowadzania bezpośrednich porównań. Pliki „mov” lub „avi” mogą być również wykorzystane do generowania animacji time-lapse, zapewniając unikalną i przejrzystą wizualizację profilu ekspresji genów.</li>
</ol>
</li>
</ol>
V. Reprezentatywne wyniki
Opisana tutaj procedura robotycznego gromadzenia i analizy obrazów (Rys. 1) umożliwia pozyskanie dużej ilości danych ilościowych dotyczących ekspresji genów w krótkim czasie. W przypadku charakterystyki promotorów roślinnych z wykorzystaniem genu gfp, metodologia ta jest użyteczna nie tylko do tworzenia profili ekspresji przejściowej (Rys. 2), ale także do szczegółowego śledzenia ekspresji GFP w tkankach roślin poddanych transformacji przejściowej i stabilnej5,6. Krótkie animacje time-lapse, generowane z zebranych sekwencyjnie obrazów, stanowią cenne narzędzie do pogłębionej analizy ekspresji genów w czasie w tkankach roślinnych. Metodologia ta znajduje również szerokie zastosowanie w ocenie czynników bezpośrednio wpływających na ekspresję genów. Na przykład, za pomocą naszego zautomatyzowanego systemu gromadzenia i analizy obrazów pomyślnie zbadano przejściową ekspresję GFP w obecności różnych supresorów wyciszania pochodzenia wirusowego7,8.
<img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig1.jpg" alt="Analiza fluorescencji; dane z programu ImageJ; przebieg eksperymentu; mikroskopia, progowanie obrazu, wyniki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Procedura analizy obrazów składa się z czterech głównych etapów. (A) Pozyskanie serii obrazów za pomocą robotycznego systemu zbierania obrazów, (B) rozdzielenie obrazów na kanały czerwony, niebieski i zielony, (C) segmentacja pikseli wykazujących ekspresję poprzez dostosowanie poziomów progowych oraz (D) uzyskanie wyników końcowych zawierających wartości w skali szarości oraz liczbę ognisk wykazujących ekspresję GFP.
<img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig2.jpg" alt="Wykres ekspresji genów; całkowita ekspresja w funkcji czasu; analiza promotora; dynamiczne wzorce ekspresji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rysunek 2. Wykres przedstawiający różne profile ekspresji przejściowej sterowanej przez promotory roślinne połączone z gfpDane zostały zebrane przy użyciu naszego robotycznego systemu akwizycji obrazów, a następnie przeanalizowane za pomocą oprogramowania ImageReady oraz ImageJ.

<ol><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol Plant. 15, 473-497 (1962).</li>
<li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp Cell Res. 50, 150-158 (1968).</li>
<li>Finer, J. J., Vain, P., Jones, M. W., McMullen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+particle+inflow+gun+for+DNA+delivery+to+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells.</a> Plant Cell Rep. 11, 232-238 (1992).</li>
<li>Finer, J. E., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+reducing+moisture+condensation+on+Petri+dish+lids%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Tiss+Org%22%5BJournal%5D)">A simple method for reducing moisture condensation on Petri dish lids.</a> Plant Cell Tiss Org. 91, 299-304 (2007).</li>
<li>Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+35S+and+Lectin+promoters+in+transgenic+soybean+tissue+using+an+automated+image+acquisition+system+and+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of 35S and Lectin promoters in transgenic soybean tissue using an automated image acquisition system and image analysis.</a> Plant Cell Rep. 25, 290-296 (2006).</li>
<li>Chiera, J. M., Bouchard, R. A., Dorsey, S. L., Park, E. H., Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+two+highly+active+soybean+%28Glycine+max+%28L.%29+Merr.%29+promoters+and+their+characterization+using+a+new+automated+image+collection+and+analysis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Isolation of two highly active soybean (Glycine max (L.) Merr.) promoters and their characterization using a new automated image collection and analysis system.</a> Plant Cell Rep. 26, 1501-1509 (2007).</li>
<li>Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+extension+of+transient+GFP+expression+by+the+co-introduction+of+a+suppressor+of+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification and extension of transient GFP expression by the co-introduction of a suppressor of silencing.</a> Transgenic Res. 17, 1143-1154 (2008).</li>
<li>Dhillon, T., Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+six+different+viral+suppressors+of+silencing+using+image+analysis+of+transient+GFP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of six different viral suppressors of silencing using image analysis of transient GFP expression.</a> Plant Cell Rep. 28, 639-647 (2009).</li>
</ol>

Wykorzystanie robotyki znajduje ogromne zastosowanie w różnych aspektach ludzkiego życia; w szczególności roboty są skutecznie wykorzystywane do wykonywania czynności w niebezpiecznych środowiskach, do automatyzacji żmudnych i złożonych działań oraz do realizacji zadań w bardziej precyzyjny sposób. W biologii molekularnej, a konkretnie w analizach ekspresji genów, roboty mogą pomóc w śledzeniu nie tylko cech genów, ale także wzrostu i rozwoju tkanek w czasie. Wiele zjawisk biologicznych zachodzi dynamicznie, co może być trudne do monitorowania przy użyciu obserwacji w pojedynczym punkcie czasowym.
Wykorzystanie genu gfp w badaniach nad ekspresją niesie ze sobą dodatkowe korzyści w obserwacji odpowiedzi i wzrostu tkanek. W naszych procedurach eksperymentalnych GFP pozwala nam śledzić ekspresję genu w tym samym fragmencie tkanki w czasie, ponieważ detekcja GFP jest metodą niedestrukcyjną. Co więcej, zastosowana przez nas wersja białka GFP jest wystarczająco stabilna, aby umożliwić detekcję, ale wykazuje również pewną rotację w celu zminimalizowania akumulacji w tkankach roślinnych, co pozwala nam śledzić zarówno wzrost, jak i spadek ekspresji genu.
Wykorzystaliśmy już nasz robotyczny system gromadzenia i analizy obrazów w szerokim zakresie zastosowań. Przewidujemy wysoki potencjał dla wielu zastosowań biologicznych, w których pożądane jest dynamiczne zrozumienie danego zjawiska. Na przykład wzrost i rozwój tkanek roślinnych mogą być śledzone za pomocą naszego systemu, co dostarcza cennych informacji na temat tych procesów. Ponadto dynamika transportu białek z wykorzystaniem genów reporterowych, takich jak gfp, może być łatwo wizualizowana za pomocą animacji poklatkowych (time-lapse). Metodologia opisana w niniejszym raporcie jest technicznie złożona, lecz koncepcyjnie prosta. Nasze wyniki są wiarygodne, a stale odkrywane są nowe zastosowania.

<table><tbody><tr><td>ImageJ</td><td>Oprogramowanie</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

robotyka i dynamiczna analiza obrazu w badaniach ekspresji genów w tkankach roślinnych

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Ekspresję genów w tkankach roślin zazwyczaj bada się poprzez destrukcyjną ekstrakcję związków z tkanek roślinnych w celuin vitroanalizy. Przedstawione tutaj metody wykorzystują zielone białko fluorescencyjne (gfp) gen do ciągłego monitorowania ekspresji genów w tych samych fragmentach tkanek w czasie.gfpgen został poddany kontroli regulacyjnej różnych promotorów i wprowadzony do tkanek kotyledonowych fasoli lima za pomocą bombardowania cząsteczkami. Kotyledony zostały następnie umieszczone w zrobotyzowanym systemie zbierania obrazów, który składał się z fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego z kamerą cyfrową oraz dwuwymiarowej platformy robotycznej zaprojektowanej specjalnie w celu zapewnienia bezpiecznego mocowania naczyń hodowlanych. Obrazy tkanek kotyledonowych były gromadzone co godzinę przez 100 godzin w celu wygenerowania profili ekspresji dla każdego promotora. Każda zebrana seria 100 obrazów została najpierw poddana ręcznemu wyrównaniu obrazów za pomocą programu ImageReady, aby upewnić się, że ogniska wykazujące ekspresję GFP były konsekwentnie utrzymywane w wybranych polach analizy. Następnie, do dalszej analizy wybrano konkretne regiony serii o wymiarach 300 x 400 pikseli, aby uzyskać pomiary intensywności GFP przy użyciu oprogramowania ImageJ. Obrazy seryjne zostały rozdzielone na kanały czerwony, zielony i niebieski, a obszary wykazujące ekspresję GFP zidentyfikowano za pomocą funkcji progowania w programie ImageJ. Po odjęciu fluorescencji tła (odjęcie wartości szarości pikseli niewykazujących ekspresji od każdego piksela) w odpowiednich kanałach czerwonym i zielonym, intensywność GFP obliczono poprzez pomnożenie średniej wartości skali szarości na piksel przez całkowitą liczbę pikseli wykazujących ekspresję GFP w każdym kanale, a następnie zsumowanie tych wartości dla kanału czerwonego i zielonego. Wartości intensywności GFP zbierano dla wszystkich 100 punktów czasowych, aby uzyskać profile ekspresji. Zróżnicowanie profili ekspresji GFP wynikało z różnic w czynnikach takich jak siła promotora, obecność supresora wyciszania lub charakter promotora. Oprócz kwantyfikacji intensywności GFP, serie obrazów zostały również wykorzystane do stworzenia animacji time-lapse za pomocą programu ImageReady. Animacje time-lapse wykazały, że zdecydowana większość komórek wykazywała stosunkowo szybki wzrost ekspresji GFP, po którym następował powolny spadek. W niektórych komórkach sporadycznie obserwowano nagłą utratę fluorescencji, co może być związane z szybką śmiercią komórki. Zaobserwowano również pozorny transport GFP przez błonę i ścianę komórkową do sąsiednich komórek. Animacje time-lapse dostarczyły dodatkowych informacji, których nie można było uzyskać za pomocą profili intensywności GFP lub zbierania obrazów w pojedynczych punktach czasowych.

Opisujemy metodę wprowadzania, śledzenia i ilościowej analizy ekspresji GFP w komórkach roślinnych. Metoda ta wykorzystuje specjalnie zaprojektowany system robotyczny do półciągłego zbierania obrazów z dużej liczby próbek w czasie. Demonstrujemy również zastosowanie programów ImageJ i ImageReady do analizy serii obrazów.

Robotyka i dynamiczna analiza obrazu w badaniach ekspresji genów w tkankach roślinnych

Ekspresję genów w tkankach roślin zazwyczaj bada się poprzez destrukcyjną ekstrakcję związków z tkanek roślinnych do analiz in vitro. Metody...

W niniejszej procedurze dynamika ekspresji genów w tkankach roślin jest obrazowana w czasie przy użyciu robotyki; najpierw nasiona fasoli zwyczajnej są sterylizowane i umieszczane między zwilżonymi ręcznikami papierowymi w pojemniku do kultur tkankowych w celu ich kiełkowania. Po czterech dniach usuwa się koleoptilia i poddaje ją bombardowaniu konstruktem DNA zawierającym promotor połączony z GFP. Koleoptilia umieszczone w szalkach Petriego są montowane w dwuwymiarowym, specjalnie zaprojektowanym robotycznym systemie gromadzenia obrazów. Robot jest zaprogramowany tak, aby co godzinę przez 100 godzin rejestrować obrazy każdego fragmentu tkanki.Obrazy poddawane są analizie obrazu, co pozwala uzyskać dane ilościowe dotyczące intensywności ekspresji GFP w czasie. Cześć, jestem John Finer, dyrektor Laboratorium Transformacji Roślin w Departamencie Ogrodnictwa i Nauk o Uprawach na Uniwersytecie Stanowym Ohio. Jestem Carlos Herandez Garcia, doktorant w laboratorium końcowym na Uniwersytecie Stanowym Ohio.Dzisiaj Carlos zaprezentuje protokół opracowany przez nas do analizy ekspresji genów w tkankach roślinnych z wykorzystaniem zielonego białka fluorescencyjnego. Stosujemy tę opracowaną w naszym laboratorium procedurę do pomiaru aktywności promotora OD. W tym celu klonujemy promotor upstream w stosunku do genu GFP, który pełni rolę naszego genu reporterowego.Pokażę Państwu, w jaki sposób wprowadzamy kontrolę promotora do rośliny fasola zwyczajna (Lima bean) oraz jak przesyłamy aplikację za pomocą naszego autorskiego zrobotyzowanego systemu rejestracji obrazów. Na koniec omówię nasz protokół analizy obrazu. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przeprowadzić sterylizację powierzchniową nasion fasoli zwyczajnej zgodnie ze standardowymi procedurami.Umieść wysterylizowane nasiona w siedmiu pojemnikach magenta pomiędzy warstwami wilgotnych ręczników papierowych i inkubuj je przez cztery dni w temperaturze 25 °C. W tym przypadku stosujemy wektor ekspresyjny o wysokiej liczbie kopii, przydatny do analiz promotorów i elementów promotorowych. Wektor ten zawiera gen GFP, który służy do wizualizacji funkcji promotora lub elementu promotorowego w transformowanych tkankach na około jedną do dwóch godzin przed bombardowaniem.Wyciąć kotyledony fasoli lima z łupin nasiennych. Kotyledony odpowiednie do bombardowania powinny mieć kolor od żółtego do jasnozielonego, być płaskie i wolne od wszelkich uszkodzeń, które mogłyby zakłócić późniejszą analizę obrazu; bezpośrednio po wycięciu umieścić 12 kotyledonów w szalce Petri z pożywką kultur OMS zawierającą sole MS, pięć witamin, 3% sacharozy i 0,2% agaru przy pH 5,7. Następnie przeprowadzić precypitację konstruktu DNA na cząsteczkach wolframu M 10. Przed użyciem resuspendować cząsteczki w sterylnej wodzie do stężenia 100 mg/mL.Następnie do probówki wirówkowej o pojemności 0,6 ml dodać 25 µL cząsteczek, 5 µL DNA o stężeniu 1 µg/µL, 25 µL 2,5 M chlorku wapnia oraz 10 µL 100 mM sperminy. Inkubować preparat DNA na lodzie przez 5 minut, a następnie odessać i odrzucić 50 µL roztworu znajdującego się nad cząsteczkami. Ponownie zawiesić pokryte DNA cząsteczki pozostałe na dnie probówki, mieszając na wortexie.Bezpośrednio po wirowaniu w vortexerze pobierz 2 µL Eloqua. Powtórz ten krok wirowania. Po każdym pobraniu Eloqua powlekane cząsteczki należy przechowywać w lodzie i zużyć w ciągu 15 minut.Po naniesieniu DNA na cząsteczki, nanieś 2 µL cząsteczek na górną część filtra strzykawkowego umieszczonego na środku sita filtrującego. Następnie umieść filtr strzykawkowy w uchwycie do filtrów wewnątrz komory wlotowej cząsteczek (tzw. PIG - particle inflow gun). Umieść ziarno fasoli lima w pozycji poziomej, stroną osiową do góry, na przegrodzie składającej się z sita stopionego z dnem zlewki.Umieść przegrodę, która służy jako platforma do podtrzymywania tkanek podczas bombardowania w komorze działa cząsteczkowego. Aby przeprowadzić bombardowanie tkanki, najpierw otwórz zawór prowadzący do próżni, aby odessać powietrze z komory. Gdy próżnia osiągnie 760 millimeters of mercury, aktywuj solenoid i wpuść hel, aby napędzić cząsteczki.Ciśnienie helu wykorzystywane do przyspieszania cząstek wynosi od 50 do 60 PSI. Po bombardowaniu cząstkami zamknij zawór linii próżniowej i zwolnij próżnię za pomocą zaworu upustowego. Po zwolnieniu próżni otwórz drzwi komory, aby wyjąć bombardowany co leadin i zwrócić co leadin na stronę dal.Użyć pożywki hodowlanej OMS do kwantyfikacji i profilowania ekspresji. Przeprowadzić bombardowanie dla co najmniej trzech powtórzeń dla każdego konstruktu DNA. Do badania włączono również kontrolę pozytywną, która daje dobrze poznany profil ekspresji genów.Próbki są teraz gotowe do obrazowania. Włącz lampę rtęciową i odczekaj 30 minut, aż lampa się rozgrzeje. Włącz źródła zasilania dla kamery SPOT R-T-C-C-D oraz sterownika silnika, który napędza ruch specjalnie zaprojektowanej platformy robotycznej przeznaczonej do utrzymywania ośmiu płytek.Ustaw zestaw filtrów do detekcji GFP, wybierając zestaw dwóch filtrów GFP z wzbudzeniem przy 480 nanometrach i emisją przy 510 nanometrach w mikroskopie stereowym MZ L three. Następnie wysterylizuj pogrubione pokrywki z poliwęglanu do szalek Petriego, spryskując je 70% etanolem. Specjalistyczne pokrywki służące do przykrycia podstawy szalki Petriego zapobiegają kondensacji podczas zbierania obrazów.Umieść płytki zawierające napromieniowane cuan na platformie robotycznej i dokręć boczny wkręt mocujący, aby ustabilizować ich pozycję. Następnie otwórz dedykowaną aplikację programową sterującą zarówno platformą robotyczną, jak i akwizycją obrazu. Za pomocą oprogramowania włącz przełącznik kontrolera białego światła i ustaw platformę w pozycji domyślnej.Czynność tę wykonuje się przed wejściem na pozycje. Dla każdego prowadnika coddle w zakładce motor należy wybrać pierwszą płytkę. Platforma ustawi środek szalki Petriego pod obiektywem mikroskopu.Używając przycisków przesuwania, precyzyjnie ustaw pierwszy CU LEADIN do akwizycji obrazów. Korzystając z funkcji trybu na żywo, przesuń cuddle leaden do odpowiedniego obszaru widoczności. W przypadku pierwszego cuddle leaden użyj pokręteł manualnych w mikroskopie dissecting, aby ustawić ostrość oraz ustawić powiększenie na 1.6 x. Po wyznaczeniu obszaru zainteresowania kliknij przycisk add this position.Oprogramowanie doda współrzędne tego obszaru do pliku harmonogramu pozycji, a platforma powróci do centrum ustawionych pozycji płyt dla wszystkich pozostałych coen na płytach. Używając przycisków odległości przemieszczenia, należy wykorzystać trzy ręczne śruby poziomujące znajdujące się pod każdą płytą na platformie robotycznej, aby dostosować ostrość dla pozostałych coan na tej samej płycie. Po wprowadzeniu wszystkich współrzędnych wszystkich coan należy zapisać współrzędne harmonogramu pozycji.Wprowadź parametry zbierania obrazów, takie jak rodzaj światła (dla GFP jest to światło niebieskie) oraz ustawienia ekspozycji, a także określ miejsce zapisywania obrazów zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym. Przejdź do karty kontroli czasu akwizycji i ustaw odstępy czasowe między kolejnymi obrazami oraz całkowitą liczbę cykli zbierania obrazów. Obrazy są zazwyczaj zbierane co godzinę przez 100 h.Generowanie wyraźnie zdefiniowanych profili ekspresji genów. Rozpocznij akwizycję obrazów, otwierając kartę harmonogramu pozycji, a następnie klikając przycisk uruchom harmonogram. Po zakończeniu 100-godzinnej kolekcji obrazów odizoluj system zbierania obrazów od światła zewnętrznego.Obrazy o wysokiej rozdzielczości, o rozmiarze około pięciu megabajtów każdy, są gotowe do analizy obrazu. Użyj programu ImageReady, aby złożyć 100 kolejnych obrazów z każdego folderu. Zaimportuj wszystkie sekwencyjne obrazy jako klatki i zmień ich rozmiar na 800 na 600 pikseli, aby przyspieszyć przetwarzanie obrazów.Następnie nanieś znaczniki na nowej, wprowadzonej warstwie, która jest widoczna we wszystkich klatkach, wykorzystując wybrane punkty GFP w obrazie referencyjnym. Ręcznie wyrównaj każdy obraz, a po zakończeniu wyrównywania usuń warstwę służącą jako referencja i zapisz plik jako pojedynczy plik PSD. Wyeksportuj również wszystkie klatki jako pojedynczy plik MOV, stosując najwyższą rozdzielczość.Pliki są teraz gotowe do rozpoczęcia kwantyfikacji GFP. Użyj programu ImageJ, aby otworzyć plik MOV i przyciąć obszar o wymiarach 400 na 300 pikseli. Następnie rozdziel kolejne obrazy na kanały czerwony, niebieski i zielony, wykorzystując narzędzie RGB split dla kanałów czerwonego i zielonego.Odejmij fluorescencję tła, korzystając z narzędzia wtyczki subtract measured ROI dla każdego przekroju. Oblicz ekspresję GFP poprzez dostosowanie poziomów progu i użycie wtyczki przeznaczonej do pomiaru średniej wartości skali szarości na piksel oraz całkowitej liczby pikseli wykazujących ekspresję GFP. Skopiuj wartości wynikowe w ImageJ. Na koniec wklej wartości wynikowe dla kanałów zielonego i czerwonego do programu Microsoft Office.Program Excel do dalszej manipulacji danymi, aby przybliżyć wyniki wyrównania obrazów. Ta pierwsza animacja pokazuje niedokładność repozycjonowania platformy robotycznej podczas 100-godzinnego eksperymentu. Ruch plam jest artefaktem wynikającym z niemożności powrotu platformy robotycznej do dokładnie tej samej pozycji w każdym punkcie czasowym po ręcznym wyrównaniu obrazu; komórki wykazujące ekspresję GFP są wyraźnie widoczne, a unikalne cechy tego systemu śledzenia można łatwo zwizualizować.Podczas powtórzeń tej animacji należy zwrócić uwagę na zaznaczone komórki wykazujące ekspresję GFP: komórka obwiedziona czerwonym okręgiem wykazuje bardzo szybki spadek ekspresji od 18 do 20 godzin po bombardowaniu, podczas gdy komórka obwiedziona białym okręgiem wykazuje opóźniony początek ekspresji GFP. Poza animacjami, procedura ta umożliwia szybką kwantyfikację ekspresji GFP w czasie w tkance docelowej fasoli zwyczajnej. Te reprezentatywne wyniki przedstawiają porównawczą kwantyfikację intensywności promotora z wykorzystaniem promotora CAMV 35 S oraz czterech różnych promotorów soi.Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak wprowadzić DNA do katalin kiełków. Nasiona fasoli Lima umieszczono na robocie, zebrano obrazy do analizy obrazu, a następnie przeanalizowano te obrazy. W naszym laboratorium rutynowo stosujemy tę procedurę do walidacji klonalnych promotorów roślinnych.Wprowadzenie różnych promotorów roślinnych pozwala na wygenerowanie dużej ilości danych. Procedura ta jest jednak skomplikowana i składa się z wielu etapów, na których mogą wystąpić błędy. Podczas jej przeprowadzania ważne jest, aby rozpocząć od świeżych nasion fasoli lub przynajmniej użyć nasion wysokiej jakości, które były przechowywane w odpowiednich warunkach. Istotne jest również szybkie wycięcie pokrywki do bombardowania i zamocowanie jej na robocie oraz zastosowanie grubej pokrywki naczynia Petri, aby zminimalizować problemy z kondensacją.Na koniec prosimy zauważyć, że używane przez nas GFP to inna wersja o nazwie SGFP, pochodząca z Gen HIN Lab na Uniwersytecie Harvarda. To GFP nie jest zbyt stabilne i może być lepsze do śledzenia gwałtownych zmian w ekspresji genów. To wszystko z naszej strony, dziękujemy za oglądanie.Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

robotics-dynamic-image-analysis-for-studies-gene-expression-plant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Robotyka i dynamiczna analiza obrazów dla badań ekspresji genów w tkankach roślin

Przedstawiono metodę izolacji specyficznych typów komórek z materiału roślinnego. Technika ta wykorzystuje transgeniczne linie markerowe wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w określonych typach komórek, dysocjację komórkową oraz sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Dodatkowo opracowano układ hodowlany, który umożliwia poddanie siewek Arabidopsis thaliana obróbce przed sortowaniem komórek.

Sortowanie komórek protoplastów roślinnych metodą fluorescencyjnej aktywacji (FACS)

Molekularne podstawy przestrzennie specyficznych odpowiedzi fitochromów są badane z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazujących deficyty fitochromów specyficzne dla tkanek i organów. W celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przestrzennie specyficzne odpowiedzi fitochromów stosuje się izolację konkretnych komórek wykazujących indukowane wyczerpanie chromoforu fitochromu za pomocą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie analizy mikromacierzy.

Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana

Opisany tutaj protokół hybrydyzacji in situ umożliwia bezpośrednią lokalizację ekspresji mRNA i małych RNA na poziomie komórkowym z wysoką czułością i swoistością. Procedura została zoptymalizowana dla przekrojów tkanek roślinnych zatopionych w parafinie, ma zastosowanie do szerokiego zakresu roślin i tkanek oraz może zostać ukończona w ciągu dziesięciu dni.

Hybrydyzacja in situ w celu precyzyjnej lokalizacji transkrypty w roślinach

Metoda otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis kompatybilna z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS), umożliwiająca badania specyficznych populacji komórkowych. Metoda ta jest zgodna z każdą linią Arabidopsis wykazującą ekspresję GFP w podzbiorze komórek.

Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Immunoprecypitacja chromatyny to potężna technika identyfikacji miejsc wiązania DNA białek Arabidopsis in vivo. Procedura ta obejmuje sieciowanie i fragmentację chromatyny, immunoprecypitację selektywnymi przeciwciałami przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania oraz analizę qPCR związanego DNA. Opisujemy prosty test ChIP zoptymalizowany dla roślin Arabidopsis.

Test immunoprecypitacji chromatyny do identyfikacji interakcji białko-DNA Arabidopsis in vivo

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak monitorować dynamikę białek znakowanych fluorescencyjnie na powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie, pokazując kropki PATROL1 oznaczonej GFP, białka transportującego błonę, w korze komórkowej kompleksu szparkowego u Arabidopsis thaliana.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie

Obrazowanie konfokalne na żywo dostarcza biologom potężnego narzędzia do badania rozwoju. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół obrazowania konfokalnego na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika.

Obrazowanie konfokalne na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika

Przedstawiamy prostą i wszechstronną metodę wykonywania fluorescencyjnego obrazowania na żywo liści Arabidopsis thaliana przez dłuższy okres czasu. Używamy transgenicznej rośliny Arabidopsis wykazującej ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego pod kontrolą promotora związanego z odpornością jako przykładu uzyskania czasoprzestrzennego zrozumienia odpowiedzi immunologicznych roślin.

Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego

Prezentowany tutaj jest protokół do laserowego mikrodyparowania (LCM) tkanek roślinnych. LCM to mikroskopowa technika izolowania obszarów tkanki w sposób wolny od zanieczyszczeń. Procedura obejmuje utrwalenie tkanek, zatopienie parafiny, cięcie, ekstrakcję LCM i RNA. RNA jest wykorzystywane w dalszej, specyficznej tkankowo, czasowo rozdzielczej analizie transkryptomów.

Sekwencjonowanie RNA z mikrodysekcją laserową do przestrzennej i czasowej analizy ekspresji genów specyficznych dla tkanek u roślin

Przedstawiono metodę taniego obrazowania roślin do pomiaru fenotypów, wraz z najlepszymi praktykami przechwytywania obrazów i potokiem analizy obrazu do ilościowego określania cech roślin. Metody te zastosowano do pomiaru fenotypów kukurydzy (Zea mays) w warunkach upałów, suszy i połączonego stresu abiotycznego.

Obrazowanie i analiza w celu ilościowego określenia fenotypów stresu abiotycznego kukurydzy (Zea mays)

Ten proces wykorzystuje mikroskopi konfokalną w połączeniu z fluorescencyjnie oznaczoną linią jądra i markerem chromatyny w Arabidopsis thaliana, aby jednocześnie rejestrować dynamikę jądra i chromatyny w korzeniach Arabidopsis oraz badać zmiany w tej dynamice w odpowiedzi na wskazówki rozwojowe i środowiskowe.

Ilościowa obrazowanie komórek Arabidopsis thaliana in vivo w czasie rzeczywistym w celu analizy kształtu jądra komórkowego oraz dynamiki chromatyny podczas rozwoju i stresu środowiskowego korzeni

Poznaj metodę śledzenia ekspresji GFP w tkankach roślinnych z wykorzystaniem systemu robotycznego do zbierania obrazów. Protokół umożliwia półciągłą rejestrację danych przez 100 godzin.

Robotyka i dynamiczna analiza obrazu w badaniach ekspresji genów w tkankach roślinnych

Przeglądaj więcej filmów