Name: Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) Część I: Lignina (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-11T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Poznaj metodę analizy zawartości i składu ligniny w biomasie roślinnej przy użyciu spektrofotometrii UV oraz chromatografii gazowej. Protokół ten umożliwia ocenę potencjału biomasy w produkcji biopaliw.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Matthewowi Robertowi Weatherheadowi za doskonałą pomoc techniczną oraz Johnowi Ralphowi z University of Wisconsin za cenne rady, dyskusje i próbkę drewna topoli. Praca ta była finansowana przez US Department of Energy (DOE) Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494) oraz przez Chemical Sciences, Geosciences and Biosciences Division, Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, U.S. Department of Energy (grant nr DE-FG02-91ER20021).

1. Izolacja ściany komórkowej
<ol>
	<li>Zmielić około 60-70mg suszu roślinnego (suszonego powietrzem lub liofilizowanego) za pomocą stalowych kulek o średnicy 5,5 mm w probówce Sarstedt z nakrętką o pojemności 2 ml, używając robota do mielenia i dozowania iWall (30 s). Alternatywna, nierobotyczna procedura o niskiej przepustowości z wykorzystaniem młyna kulowego (retschmill) została przedstawiona w części II2.</li>
	<li>Do odmierzonego zmielonego materiału dodać 1,5 ml 70% wodnego roztworu etanolu i dokładnie wymieszać na wortexie.</li>
	<li>Wirować przy 10 000 rpm przez 10 min w celu osadzenia pozostałości nierozpuszczalnych w alkoholu.</li>
	<li>Odssać lub odlać nadsącz.</li>
	<li>Do osadu dodać 1,5 ml roztworu chloroformu/metanolu (1:1 v/v) i dokładnie wstrząsnąć probówką, aby resuspenderować osad.</li>
	<li>Wirować przy 10 000 rpm przez 10 min, a następnie odessać lub odlać nadsącz.</li>
	<li>Resuspenderować osad w 500 μl acetonu.</li>
	<li>Odparować rozpuszczalnik strumieniem powietrza w temperaturze 35°C do całkowitego wyschnięcia. 
 W razie potrzeby wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszej obróbki.</li>
	<li>Aby rozpocząć usuwanie skrobi z próbki, resuspenderować osad w 1,5 ml 0,1 M buforu octanu sodu o pH 5,0.</li>
	<li>Zakręcić probówki Sarstedt i ogrzewać przez 20 min w temperaturze 80°C w bloku grzejnym.</li>
	<li>Schłodzić zawiesinę na lodzie.</li>
	<li>Do osadu dodać następujące odczynniki: 35 μl 0,01% azotku sodu (NaN3), 35 μl amylazy (50 μg/mL H2O; z gatunków Bacillus, Sigma) oraz 17 μl pullulanazy (17,8 jednostek z Bacillus acidopullulyticus; Sigma). Zakręcić probówkę i dokładnie wymieszać na wortexie.</li>
	<li>Zawiesinę inkubować przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem. Położenie probówek poziomo ułatwia lepsze mieszanie.</li>
	<li>Ogrzać zawiesinę w temperaturze 100°C przez 10 min w bloku grzejnym, aby przerwać proces trawienia.</li>
	<li>Wirować (10 000 rpm, 10 min) i odrzucić nadsącz zawierający rozpuszczoną skrobię.</li>
	<li>Pozostały osad przemyć trzykrotnie, dodając 1,5 ml wody, mieszając na wortexie, wirować i odlewając wodę płuczącą.</li>
	<li>Resuspenderować osad w 500 μl acetonu.</li>
	<li>Odparować rozpuszczalnik strumieniem powietrza w temperaturze 35°C do całkowitego wyschnięcia. W celu lepszego wysuszenia może być konieczne rozbicie materiału w probówce za pomocą szpatułki. Wysuszony materiał stanowi wyizolowaną ścianę komórkową (frakcję lignocelulozową). W razie potrzeby wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszej obróbki.</li>
</ol>
2. Zawartość ligniny
Metoda ta opiera się na opracowanej metodzie Fukushima i Hatfielda 3.
<ol>
	<li>Odważyć 1 – 1,5 mg przygotowanego materiału ścian komórkowych (patrz pkt 1) do kolby miarowej o pojemności 2 ml, pozostawiając jedną probówkę pustą jako próbę jałową.</li>
	<li>Opłukać ścianki probówki 250 μl acetonu, aby zebrać materiał ścian komórkowych na dnie probówki, a następnie bardzo delikatnie odparować aceton w strumieniu powietrza.</li>
	<li>Delikatnie dodać 100 μl świeżo przygotowanego roztworu bromku acetylu (25% v/v bromku acetylu w lodowacym kwasie octowym), wlewając go po ściance probówki, aby zapobiec rozpryskiwaniu.</li>
	<li>Zakręcić kolbę miarową i ogrzewać w temperaturze 50°C przez 2 h.</li>
	<li>Ogrzewać przez dodatkową godzinę, mieszając w wortexie co 15 minut.</li>
	<li>Schłodzić na lodzie do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Dodać 400 μl 2M wodorotlenku sodu oraz 70 μl świeżo przygotowanego 0,5 M chlorku hydroksyloaminy. Wymieszać kolby miarowe w wortexie.</li>
	<li>Dopełnić kolbę miarową dokładnie do kreski 2,0 ml lodowacym kwasem octowym, zakręcić i kilkukrotnie odwrócić w celu wymieszania.</li>
	<li>Pipetować 200 μl roztworu do specjalistycznej płytki 96-dołkowej do UV i odczytać w czytniku ELISA przy 280 nm.</li>
	<li>Wyznaczyć procentową zawartość ligniny rozpuszczalnej w bromku acetylu (%ABSL), stosując odpowiedni współczynnik (Topola = 18,21; Trawy = 17,75; Arabidopsis = 15,69) według następującego wzoru: 
 Obliczanie % ABSL:<img src="/files/ftp_upload/1745/1745eq.jpg" alt="Równanie obliczania współczynnika absorpcji w badaniach spektroskopowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
 Pomnożenie wartości %ABSL przez 10 daje wynik w jednostkach ug/mg ścian komórkowych. 
 W celu uśrednienia absorbancji (abs) zaleca się wykonanie co najmniej 3 odczytów z płytki, ponieważ cząstki stałe mogą powodować niewielkie różnice w wartościach absorbancji. Uwaga: 0,539 cm reprezentuje długość drogi optycznej, jednak w zależności od płytki parametr ten może wymagać wyznaczenia.</li>
</ol>
3. Skład ligniny
Metoda ta została opracowana na podstawie procedury opublikowanej niedawno przez Robinsona i Mansfielda5.
<ol>
 <li>Przenieść około 2 mg materiału ściany komórkowej (patrz pkt 1.) do szklanej probówki z nakrętką do przeprowadzenia tioacidolizy.</li>
	<li>Ostrożnie przygotować roztwór 2,5% trifluorku boru w eterze dietylowym (BF3) i 10% etanotiolu (EtSH). Należy użyć balonu wypełnionego azotem, aby zastąpić utraconą objętość w butelce z dioksanem azotem. Dioksan jest substancją bardzo niebezpieczną, nie należy wyjmować próbek ani sprzętu z dygestorium. Objętości potrzebne do przygotowania roztworu na jedną próbkę: 175 μl dioksanu; 20 μl EtSH; 5 μl BF3.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 200 μl roztworu EtSH, BF3 i dioksanu.</li>
	<li>Przepłukać przestrzeń nad próbką gazem azotowym i natychmiast zakręcić.</li>
	<li>Ogrzewać w temperaturze 100°C przez 4 godziny, delikatnie mieszając co godzinę.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję poprzez chłodzenie na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać 150 μl 0,4M wodorowęglanu sodu i wymieszać w wortexie.</li>
	<li>W celu oczyszczenia dodać 1 ml wody i 0,5 ml octanu etylu, wymieszać w wortexie i odczekać do rozdzielenia się faz (octan etylu na górze, woda na dole).</li>
	<li>Przenieść 150 μl warstwy octanu etylu do probówki Sarstedt o pojemności 2 ml. Należy upewnić się, że nie przeniesiono wody.</li>
	<li>Odparować rozpuszczalnik za pomocą koncentratora z przepływem powietrza.</li>
	<li>Dodać 200 μl acetonu i odparować (powtórzyć łącznie dwa razy, aby usunąć nadmiar wody).</li>
	<li>W celu derywatyzacji TMS do każdej probówki dodać 500 μl octanu etylu, 20 μl pirydyny oraz 100 μl N,O-bis(trimetylosilylo)acetamidu.</li>
	<li>Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 25°C. </li>
	<li>Przenieść 100 μl mieszaniny poreakcyjnej do fiolki GC/MS i dodać 100 μl acetonu.</li>
	<li>Próbki analizować za pomocą GC wyposażonego w kwadrupolowy spektrometr mas lub detektor jonizacji płomieniowej. Zainstalowano kolumnę Agilent HP-5MS (30 mm X 0,25 mm X 0,25 μm grubości filmu). Stosuje się następujący gradient temperatury z 30-minutową zwłoką rozpuszczalnika i szybkością przepływu 1,1 ml/min: temperatura początkowa 130 °C przez 3 min; wzrost o 3 °C/min do 250 °C i utrzymanie tej temperatury przez 1 min; następnie powrót do temperatury początkowej 130 °C.</li>
	<li>Piki identyfikuje się na podstawie względnych czasów retencji przy użyciu tetrakosanu jako standardu wewnętrznego (opcjonalnie) lub na podstawie charakterystycznych jonów widma masowego 299 m/z, 269 m/z i 239 m/z odpowiednio dla monomerów S, G i H (patrz rys. 2). Skład komponentów ligniny określa się ilościowo, przyjmując całkowitą powierzchnię pików za 100%.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Przykład analizy ścian komórkowych przedstawiono na rysunku 2. W tym przypadku łodyga topoli (drewno) została poddana analizie zgodnie z różnymi procedurami opisanymi w sekcji protokołu. Przedstawiono przykładowy chromatogram rozdziału składników ligniny po tioacidolizie i derywatyzacji TMS. Wyraźnie można określić względną zawartość jednostek syringylowych (S), guajacylowych (G) oraz p-hydroksyfenolowych (H). Zawartość ligniny rozpuszczalnej w bromku acetylu jest oczywista; można oczekiwać wartości w przedziale 20-50% suchej masy ścian komórkowych. Należy zauważyć, że bromek acetylu nie rozpuszcza całej ligniny obecnej w ścianie komórkowej, a stopień solubilizacji może się różnić w zależności od materiału. Niemniej jednak metoda ta jest stosunkowo łatwa do przeprowadzenia, szybka i daje doskonałe przybliżenie zawartości ligniny w materiale lignocelulozowym.
<img src="/files/ftp_upload/1745/1745fig1.jpg" alt="Schemat izolacji ściany komórkowej; analiza ligniny i celulozy; proces z użyciem bromku acetylowego i tioacidolizy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1: Przegląd analiz lignocelulozowych. Ściany komórkowe (frakcje lignocelulozowe) są izolowane z surowego, wysuszonego materiału roślinnego. Materiał ścian jest następnie ważony w alikwotach i dzielony na części przeznaczone do różnych analiz. Materiał ścian poddaje się działaniu bromku acetylowego, a rozpuszczoną ligninę oznaczono metodą spektroskopii UV. W celu określenia składu ligniny materiał ścian poddaje się tioacidolizie. Rozpuszczone związki fenolowe podlegają derywatyzacji TMS, a następnie mogą zostać rozdzielone i ilościowo oznaczone za pomocą analizy GC-MS. Protokół określania składu polisacharydów macierzy oraz zawartości celulozy krystalicznej omówiono w Części II2.
<img src="/files/ftp_upload/1745/1745fig2.jpg" alt="Chromatografia gazowa i skład ligniny; wykresy słupkowe przedstawiają zawartość monomerów i ligniny z bromku acetylu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2: Kompleksowa analiza lignocelulozowa drewna topoli. Wióry drewniane z topoli (Populus tremoloides) poddano opisanym protokołom. Skład ligniny; H – jednostki p-hydroksyfenylowe; G – jednostki guaiacylowe; S – jednostki syringylowe.

<ol><li>Carroll, A., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulosic+Biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellulosic Biofuels.</a> Annual Review of Plant Biology. 60, 165-165 (2009).</li>
<li>Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+compositional+analysis+of+Plant+Cell+Walls+%28Lignocellulosic+biomass%29%2C+Part+II%3A+Carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part II: Carbohydrates.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Fukushima, R. S., Hatfield, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+isolation+of+lignin+for+utilization+as+a+standard+to+determine+lignin+concentration+using+the+acetyl+bromide+spectrophotometric+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Extraction and isolation of lignin for utilization as a standard to determine lignin concentration using the acetyl bromide spectrophotometric method.</a> J. Agric. Food Chem. 49 (7), 3133-3133 (2001).</li>
<li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).</li>
<li>Robinson, A. R., Mansfield, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+poplar+lignin+monomer+composition+by+a+streamlined+thioacidolysis+procedure+and+near-infrared+reflectance-based+prediction+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of poplar lignin monomer composition by a streamlined thioacidolysis procedure and near-infrared reflectance-based prediction modeling.</a> Plant J. 58 (4), 706-706 (2009).</li>
<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant-cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward a systems approach to understanding plant-cell walls.</a> Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).</li>
<li>Teeri, T. T., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization+and+applications+of+enzymes+from+the+wood-forming+tissues+of+poplar%3A+Glycosyl+transferases+and+xyloglucan+endo-transglycosylases%5BTitle%5D)+AND+%22Biocatalysis+and+Biotransformation%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endo-transglycosylases.</a> Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).</li>
</ol>

Opisane metody umożliwiają szybką ilościową ocenę zawartości oraz składu ligniny w lignocelulozowej biomasie roślinnej. Przy użyciu robota iWall dziennie można zmielić i rozdzielić około 350 próbek. Przepustowość poszczególnych metod analitycznych na jedną osobę jest zróżnicowana. Stosując opisane tutaj protokoły, dziennie można przetworzyć 30 próbek pod kątem zawartości ligniny oraz 15 pod kątem jej składu. Dzięki ilościowemu charakterowi danych można ocenić optymalne rośliny surowcowe, odmiany lub genotypy pod kątem ich przydatności do produkcji biopaliw.

<table><tbody><tr><td>Wodorochlorek hydroksyloaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255580</td><td></td></tr><tr><td>Bromek acetylu</td><td>Aldrich</td><td>135968</td><td></td></tr><tr><td>Etanotiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3708</td><td></td></tr><tr><td>Dietylowy eter trifluororku boru</td><td>Fluka</td><td>15719</td><td></td></tr><tr><td>N,O-bis(trimetylosilil)acetamid</td><td>Fluka</td><td>15241</td><td></td></tr><tr><td>Dioksan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296309</td><td></td></tr><tr><td>Spectromax Plus 384</td><td>Molecular Devices</td><td>Plus384</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>6890 GC/5975B MSD</td><td>(skład ligniny)</td></tr><tr><td>Stalowe kulki 5.5mm</td><td>Salem Ball Company</td><td>(N/A)</td><td></td></tr><tr><td>Rozpraszacz ciepła do płytek 96-dołkowych</td><td>Biocision</td><td>Coolsink 96F</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzejny</td><td>Techne</td><td>Dri-block DB-3D</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator próbek</td><td>Techne</td><td>FSC400D</td><td></td></tr></tbody></table>

kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) część i: lignina

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

Potrzeba odnawialnych, neutralnych węglowo i zrównoważonych surowców dla przemysłu i społeczeństwa stała się jednym z najpilniejszych problemów XXI wieku. Odnawia to zainteresowanie wykorzystywaniem produktów roślinnych jako surowców przemysłowych do produkcji paliw ciekłych na potrzeby transportu1i inne produkty, takie jak materiały biokompozytowe7. Biomasa roślinna pozostaje jednym z największych niewykorzystanych zasobów na planecie4. Składa się głównie z ścian komórkowych, które zbudowane są z bogatych w energię polimerów, w tym celulozy, różnych hemiceluloz (polisacharydów macierzy) oraz polifenolu zwanego ligniną6i dlatego czasami określa się je mianem lignocelulozy. Jednak ściany komórkowe roślin wyewoluowały tak, by być odpornymi na degradację, ponieważ nadają one wytrzymałość na rozciąganie komórkom i całym roślinom, chronią przed patogenami oraz umożliwiają transport wody przez całą roślinę; u drzew nawet do wysokości ponad 100 m nad poziomem gruntu. Ze względu na różnorodne funkcje ścian komórkowych, występuje ogromna różnorodność strukturalna w obrębie ścian różnych gatunków roślin oraz typów komórek w obrębie pojedynczej rośliny4. Zatem w zależności od tego, który gatunek rośliny uprawnej, odmiana lub tkanka roślinna jest wykorzystywana w biorefinerii, konieczne jest dostosowanie i optymalizacja etapów procesowych związanych z depolimeryzacją za pomocą procesów chemicznych lub enzymatycznych oraz kolejnej fermentacji różnych cukrów do ciekłych biopaliw. Ten fakt podkreśla konieczność dokładnej charakteryzacji surowców pochodzenia roślinnego. Opisujemy kompleksową metodologię analityczną umożliwiającą określenie składu ligninoksylozę i nadającą się do analizy średniej oraz wysokiej przepustowości. W tej pierwszej części skupiamy się na analizie polifenolu ligniny (Rycina 1). Metoda rozpoczyna się od przygotowania materiału ścian komórkowych pozbawionego skrobi. Otrzymane ligninoksylozę poddaje się następnie analizie w celu określenia zawartości ligniny metodą rozpuszczania acetylobromkowego3, a także składu ligniny pod względem jednostek syryngylowych, guajacylowych i p-hydroksyfenylowych5Protokół analizy węglowodanów w biomasy lignocelulozowej, w tym zawartości celulozy i składu polisacharydów macierzy, omówiono w Części II2.

Biomasa roślinna jest głównym neutralnym węglowo zasobem odnawialnym, który może być wykorzystany do produkcji biopaliw. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, które są strukturalnie złożonym materiałem kompozytowym zwanym lignocelulozą. W niniejszej pracy opisujemy protokół kompleksowej analizy zawartości i składu ligniny polifenolowej.

Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) Część I: Lignina

Potrzeba odnawialnych, neutralnych pod względem emisji dwutlenku węgla i zrównoważonych surowców dla przemysłu i społeczeństwa stała się jedną z najbardziej palących kwestii XXI wieku...

Wyznaczanie zawartości i składu ligniny w ścianach komórkowych roślin rozpoczyna się od wysuszonego materiału roślinnego, który poddawany jest różnym ekstrakcjom. Otrzymany materiał składa się wyłącznie ze ścian komórkowych, a następnie jest on rozdzielany w celu określenia zawartości ligniny. Materiał ścian komórkowych poddawany jest hydrolizie za pomocą bromku acetylu, a rozpuszczone monomery są ilościowo oznaczane metodą spektrometrii UV w celu ustalenia składu ligniny.Materiał ścian komórkowych jest hydrolizowany poprzez cytolizę. Rozpuszczone składniki ligniny są następnie przekształcane w ich lotne pochodne trimetylosilanowe, które można rozdzielić i określić ilościowo za pomocą chromatografii gazowej w połączeniu ze spektrometrią mas. Wyznaczenie składu polisacharydowego macierzy oraz zawartości celulozy zostało przedstawione w innym filmie pod tytułem Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part Two Carbohydrates.Witajcie, jestem Marcus Pauley, kierownik laboratorium analizy ścian komórkowych w Great Lakes Bioenergy Research Center na Michigan State University. Jestem Cliff Foster, manager laboratorium analizy ścian komórkowych. Zaprezentujemy Państwu procedurę określania zawartości i składu próbek biomasy roślinnej.Rośliny przekształcają energię świetlną słońca w energię chemiczną, taką jak biomasa. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, złożonej sieci różnorodnych polimerów otaczających wszystkie komórki roślinne. W niniejszej pracy określamy skład materiałów ścian komórkowych roślin, aby ocenić potencjał przekształcania tych lignin Cellose X, które stanowią wysoce dostępny odnawialny zasób, w biopaliwa.Dzisiaj skupimy się na polifenolowej ligninie w kolejnym filmie zatytułowanym Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin, część druga: węglowodany. Skupimy się na analizie polisacharydów. Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać trzy stalowe kulki o średnicy 5,5 mm do probówki z nakrętką o pojemności 2 ml oraz około 60 do 70 mg liofilizowanego materiału roślinnego.Materiał można zmielić na drobny proszek, używając urządzenia eyewall, czyli robota do mielenia i dozowania. Urządzenie eyewall przejmuje probówkę i wstrząsa nią przez 30 s, podczas czego dzięki metalowym kulkom materiał zostaje zmielony na drobny proszek; następnie zmielony, lecz zbity proszek roślinny rozluźnia się za pomocą alternatywnej, nierobotycznej procedury o niskiej przepustowości. Część druga przedstawia ułatwienie procesu ekstrakcji; do zmielonego materiału należy dodać 1,5 M 70% etanolu wodnego, dokładnie wymieszać na wortexie i odwirować w temperaturze pokojowej.Obróbka ta solubilizuje większość białek i organelli komórkowych; odessaj nadsącz i dodaj objętość roztworu chloroformu i metanolu w stosunku jeden do jednego do osadu nierozpuszczalnego w alkoholu. Wstrząśnij dokładnie, aby zawiesić osad, a następnie odwiruj w wirówce. Chloroform i metanol ekstrahują związki hydrofobowe, takie jak lipidy; po wirowaniu odessaj nadsącz i resuspenduj osad w 500 µL acetonu.Aby osuszyć próbkę, odparować rozpuszczalnik strumieniem powietrza w temperaturze 35 °C aż do całkowitego wyschnięcia; wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszego przetwarzania. Aby rozpocząć usuwanie skrobi z osadów próbek, zawiesić pellet w 1,5 ml 0,1 M octanu sodu o pH 5, zamknąć probówki i ogrzewać w bloku grzewczym w celu żelatynizacji skrobi. Po schłodzeniu zawiesiny na lodzie dodać mieszaninę enzymów degradujących skrobię, zamknąć probówkę i dokładnie wymieszać w wstrząsaczu typu vortex, a następnie inkubować zawiesinę przez noc.W wytrząsarce w temperaturze 37 °C wytrząsarka rotacyjna zapewnia odpowiednie mieszanie. Po inkubacji nocnej przerwać trawienie poprzez ogrzewanie w bloku grzejnym w temperaturze 100 °C przez 10 minut. Następnie odwirować i usunąć supernatant, który zawiera rozpuszczoną skrobię.Pozostały osad przemyj trzy razy, używając za każdym razem 1,5 ml wody, poprzez mieszanie w wortexie, wirowanie i odlewanie, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Na koniec resuspenduj osad w 500 µL acetonu i odparuj rozpuszczalnik strumieniem powietrza w temperaturze 35 °C aż do całkowitego wyschnięcia. Wysuszone próbki zawierające wyizolowaną ścianę komórkową lub leg, no celluloses są gotowe do dalszych analiz i mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej.Zacznij od odważenia od 1 do 1,5 mg przygotowanego materiału ścian komórkowych. Materiał można odważyć ręcznie lub w sposób zautomatyzowany przy użyciu ściany oka, tak jak pokazano w części drugiej. Przepłucz ścianki probówki 250 µL acetonu, aby zebrać materiał ścian komórkowych na dnie probówki, a następnie bardzo ostrożnie odparuj aceton w strumieniu powietrza.Po odparowaniu acetonu ostrożnie dodaj 100 µL świeżo przygotowanego 25% obj. acetylobromku w lodowatym kwasie octowym wzdłuż ścianek naczynia. Aby uniknąć rozbryzgów, delikatnie dodawaj odczynnik; bromek rozkłada polimer ligninowy na acetylowane monosacharydy. Następnie zamknij kolbę miarową i podgrzewaj w temperaturze 50 °C przez dwie godziny.Podgrzewaj przez dodatkową godzinę, mieszając co 15 minut, a następnie schłódź na lodzie. Po schłodzeniu kolby w temperaturze pokojowej dodaj 400 µL 2 M wodorotlenku sodu i 70 µL świeżo przygotowanego 0,5 M chlorowodorku hydroksyloaminy, a następnie wymieszaj kolby miarowe w wirówce typu vortex. Następnie zneutralizuj roztwór, dopełniając kolbę miarkową dokładnie do kreski 2 mL octem lodowatym, zakręć i odwróć kilka razy w celu wymieszania. Pipetą przenieś 200 µL roztworu zawierającego zhydrolizowane i rozpuszczone monomery do płytki 96-dołkowej przeznaczonej do analiz UV i odczytaj wartości w czytniku płytek przy 280 nm. Odczytaj płytkę co najmniej trzy razy i wyciągnij średnią z absorbancji, ponieważ cząstki stałe mogą powodować niewielkie różnice w wartościach absorbancji.Wyznacz procentową zawartość ligniny rozpuszczalnej w bromku (BSL), stosując odpowiedni współczynnik roślinny oraz wzór przedstawiony w protokole pisemnym. Lignina jest siecią polifenolową składającą się głównie z trzech podjednostek: p-hydroksyfenylu, guajakolu i syringolu; w celu określenia składu ligniny w materiale roślinnym, należy rozpocząć od przeniesienia około 2 mg materiału ścian komórkowych do szklanej probówki z nakrętką w celu przeprowadzenia cytolizy.Następnie należy przygotować 2,5% BF₃·OEt₂ oraz 10% roztwór etanotiolu w dioksanie. Ze względu na wysoką toksyczność dioksanu, nie należy wyjmować żadnych próbek ani sprzętu z dygestorium. Należy pracować bardzo ostrożnie i użyć balonu wypełnionego azotem, aby zastąpić utraconą objętość w butelce z dioksanem azotem.Przygotuj roztwór, mieszając następujące objętości na próbkę: 175 µL dioksanu, 20 µL ETSH oraz 5 µL BF3. Po wymieszaniu dodaj 200 µL roztworu do każdej próbki. Przepłucz przestrzeń nad próbką w fiolce azotem i zamknij.Przejdź niezwłocznie do podgrzewania próbek w temperaturze 100 °C przez cztery godziny, delikatnie mieszając je na koniec każdej godziny. Przerwij reakcję lizy, chłodząc próbki na lodzie przez pięć minut. Następnie dodaj 150 µL 0,4 M wodorowęglanu sodu w celu neutralizacji i wymieszaj na wortexie.W celu oczyszczenia produktów rozkładu ligniny dodać 1 ml wody oraz 0,5 ml octanu etylu, wymieszać w wstrząsarze typu vortex i poczekać do rozdzielenia się faz. Warstwa octanu etylu znajdzie się na górze, a woda na dole. Przenieść 150 µL górnej warstwy octanu etylu zawierającej składniki ligniny do probówki o pojemności 2 ml, upewniając się, że nie przeniesiono wody.Po przeniesieniu z górnej warstwy octanu etylu odparuj rozpuszczalnik za pomocą koncentratora z przepływem powietrza. Dodaj 200 µL acetonu i odparuj. Powtórz zabieg z użyciem acetonu dwukrotnie, aby usunąć nadmiar wody.Następnie należy przeprowadzić derywatyzację składników ligniny do ich lotnych pochodnych trimetylsylowych. Do każdej probówki należy dodać 500 µL octanu etylu, 20 µL pirydyny oraz 100 µL BSTFA (N,O-bis(trimetylsylo)trifluoroacetamidu). Inkubować przez dwie godziny w temperaturze 25 °C.Po upływie dwóch godzin przenieś 100 µL reakcji do fiolki do GC MS i dodaj 100 µL acetonu. Próbki należy przeanalizować za pomocą GC wyposażonego w kwadrupolowy spektrometr mas lub detektor jonizacji płomieniowej. W celu uzyskania informacji na temat kolumny oraz szczegółów przebiegu analizy należy zapoznać się z towarzyszącym protokołem pisanym.Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy ligniny z wykorzystaniem drewna topoli jako materiału roślinnego. Zgodnie z tą analizą 22% materiału z topoli składa się z ligniny polifenolowej. Skład komponentów ligniny przeanalizowano za pomocą GCMS.Piki są identyfikowane na podstawie względnych czasów retencji przy użyciu wewnętrznego standardu tetrakoanu lub poprzez charakterystyczne jony widma masy 299 m/z, 269 m/z i 239 m/z odpowiednio dla monomerów s, g i h. Skład komponentów ligniny jest ilościowo określany poprzez ustawienie całkowitej powierzchni pików na 100%. Analiza składu wykazuje, że ta konkretna próbka zawiera głównie jednostki s. Jednakże jednostki g są również liczne.Oczywiście ilość i skład jednostek monomerycznych mogą się różnić w zależności od tkanki roślinnej i gatunku. Przedstawiliśmy sposób określania zawartości i składu ligniny w materiale roślinnym na potrzeby analizy polisacharydów. Przejdź do drugiej części.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.

comprehensive-compositional-analysis-plant-cell-walls-lignocellulosic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kompleksowa analiza składowa ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) Część I: lignina

Biomasa roślinna jest głównym, neutralnym pod względem emisji dwutlenku węgla odnawialnym zasobem, który może być wykorzystywany do produkcji biopaliw. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, które są strukturalnie złożonym materiałem kompozytowym zwanym lignocelulozą. W niniejszej pracy opisujemy protokół kompleksowej analizy zawartości i składu węglowodanów pochodzących ze ścian komórkowych.

Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasy lignocelulozowej) Część II: Węglowodany

Przedstawiono metodę opartą na konfokalnej mikroskopii Ramanowskiej, która umożliwia bezznakową wizualizację ligniny w ścianach komórkowych roślin oraz porównanie procesu lignifikacji w różnych tkankach, próbkach lub gatunkach.

Bez znakowania in situ Obrazowanie lignifikacji w ścianach komórkowych roślin

Celem tych badań było stworzenie syntetycznej tkanki ściany komórkowej roślinnej przy użyciu warstwa po warstwie składania włókienek nanocelulozowych i izolowanej ligniny złożonej z rozcieńczonych zawiesin wodnych. Techniki pomiaru powierzchni mikrowagi kryształów kwarcu i mikroskopii sił atomowych zostały wykorzystane do monitorowania tworzenia polimerowo-polimerowego materiału nanokompozytowego.

W kierunku biomimiki drewna: wytwarzane wolnostojące folie z nanocelulozy, ligniny i syntetycznej polikacji

Technika dwuniciowej interferencji RNA (dsRNAi) jest stosowana do obniżania poziomu genu reduktazy cynamoylokoenzymu A (ZmCCR1) w kukurydzy w celu obniżenia zawartości ligniny roślinnej. Regulacja w dół ligniny ze ściany komórkowej jest wizualizowana za pomocą analiz mikroskopowych i określana ilościowo metodą Klasona. Analizowane są zmiany składu hemicelulozy i celulozy krystalicznej.

Regulacja ligniny w dół Zea mays za pomocą dsRNAi i analizy ligniny Klason

Skład ściany komórkowej rośliny różni się w zależności od typu tkanki i może zawierać ligninę, celulozę, hemicelulozy i pektyny. Opracowano różne techniki barwienia w celu wizualizacji różnic na poziomie typu komórki. Niniejszy artykuł jest kompilacją powszechnie stosowanych technik barwienia ścian komórkowych.

Barwienie histochemiczne drugorzędowych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana

Struktura ściany komórkowej roślin i cechy chemiczne są oceniane w celu zidentyfikowania idealnych surowców do produkcji biopaliw i biomateriałów. Standardowe metody mają ograniczenia, gdy są stosowane do dużych zestawów danych. Te wysokoprzepustowe metody obróbki wstępnej, scukrzania enzymatycznego i pirolizy ze spektrometrią mas wiązki molekularnej porównują dużą liczbę próbek biomasy przy skróconym czasie i kosztach eksperymentu.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe zmian oporności biomasy lignocelulozowej: lignina całkowita, monomery ligniny i enzymatyczne uwalnianie cukru

Ten protokół ma na celu przedstawienie ogólnej metody wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianach komórkowych roślin za pomocą obrazowania Ramana i analizy wielowymiarowej.

Połączenie obrazowania ramanowskiego i analizy wielowymiarowej w celu wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianie komórkowej rośliny

BLISS, protokół podwójnego etykietowania do badania dynamiki lignifikacji, został opracowany. Wykorzystując syntetyczne reportery monolignolu i sekwencyjną kombinację bioortogonalnych reakcji klikania SPAAC i CuAAC, metodologia ta toruje drogę do dogłębnej analizy czynników regulujących biogenezę lignin w planta.

Wizualizacja dynamiki zdrewniałości w roślinach za pomocą chemii kliknięć: Podwójne etykietowanie to BŁOGOŚĆ!

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę TGA do szacowania zawartości ligniny w biomasie roślin zielnych. Metoda ta szacuje zawartość ligniny poprzez tworzenie specyficznych wiązań tioeterowych z ligniną i ma przewagę nad metodą Klasona, ponieważ wymaga stosunkowo małej próbki do oszacowania zawartości ligniny.

Oznaczanie zawartości ligniny w biomasie roślinnej przy użyciu kwasu tioglikolowego (TGA)

31P NMR to potężne narzędzie do strukturalnego wyjaśniania polifenoli. Ta szybka, łatwa, precyzyjna, ilościowa i wysoce odtwarzalna procedura analityczna, która pozwala na kwantyfikację i różnicowanie różnych typów grup hydroksylowych, fenolowych i karboksylowych w ligninach i garbnikach, stała się obecnie rutynowym narzędziem analitycznym.

Ilościowa analiza 31P NMR ligniny i garbników

Poznaj metodę analizy zawartości i składu ligniny w biomasie roślinnej przy użyciu spektrofotometrii UV oraz chromatografii gazowej. Protokół ten umożliwia ocenę potencjału biomasy w produkcji biopaliw.

Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) Część I: Lignina

Przeglądaj więcej filmów