Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) Część I: Lignina

Określenie zawartości ligniny i składu ścian komórkowych roślin rozpoczyna się od wysuszonego materiału roślinnego, który poddawany jest różnym ekstrakcjom. Otrzymany materiał składa się tylko ze ścian komórkowych, a następnie jest dzielony w celu określenia zawartości ligniny. Materiał ścianki poddaje się hydrolizie przez bromek acetylu, a rozpuszczone mono aly są oznaczane ilościowo za pomocą spektrometrii UV w celu określenia składu ligniny.

Materiał ściany jest hydrolizowany przez cytolizę. Rozpuszczone składniki ligniny są następnie otrzymywane do ich lotnych pochodnych soli trimetylu, które można oddzielić i określić ilościowo za pomocą chromatografii gazowej w połączeniu ze spektrometrią mas. Oznaczanie składu polisacharydowego matrycy i zawartości celulozy zostało zademonstrowane w innym filmie zatytułowanym Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin, część druga Węglowodany.

Cześć, nazywam się Marcus Pauley i jestem szefem Instytutu Analitycznego Wall w Centrum Badań Bioenergetycznych Wielkich Jezior na Uniwersytecie Stanowym Michigan. Nazywam się Cliff Foster i jestem kierownikiem zakładu analitycznego zajmującego się ścianą komórkową. Pokażemy Ci, jak oznaczyć zawartość i skład próbek biomasy roślinnej.

Rośliny przekształcają energię świetlną ze słońca w energię chemiczną, taką jak biomasa. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, złożonej sieci różnych polimerów, które otaczają wszystkie komórki roślinne. W tym miejscu określamy skład materiałów ścian komórkowych roślin, aby ocenić potencjał przekształcenia tych ligniny Cellose X, które są bardzo obfitym zasobem odnawialnym, w biopaliwa.

Dzisiaj skupimy się na polifenolinie ligninie w innym filmie zatytułowanym Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin, część druga węglowodanów. Skupimy się na analizie polisacharydowej. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj trzy 5,5-milimetrowe kulki ze stali nierdzewnej do dwumililitrowej rurki z nakrętką sared i około 60 do 70 miligramów powietrza lub liofilizowanego materiału roślinnego.

Materiał można zmielić na drobny proszek za pomocą eyewalla, robota do mielenia i dozowania. Ściana oka bierze rurkę i potrząsa nią przez 30 sekund, gdzie dzięki metalowym kulkom materiał jest mielony na drobny proszek, a następnie mielony, ale zwarty proszek roślinny jest poluzowywany w alternatywnej, nierobotycznej procedurze o niskiej przepustowości. Ułatwienie retro przedstawiono w części drugiej, dodaj 1,5 M 70% wodnego etanolu do zmielonego materiału dokładnie wiruj i odwiruj w temperaturze pokojowej.

Zabieg ten rozpuszcza większość białek i organelli komórkowych, odsysa supernatant i dodaje objętość jeden do jednego. Roztwór metanolu chloroformu do nierozpuszczalnego w alkoholu osadu dokładnie wstrząsnąć, aby ponownie odwirować osad i odwirować. Metanol chloroformowy ekstrahuje związki hydrofobowe, takie jak lipidy, po odwirowaniu, odessuje supernatant i ponownie zawiesza osad i 500 mikrolitrów acetonu.

Aby wysuszyć próbkę, odparować rozpuszczalnik strumieniem powietrza o temperaturze 35 stopni Celsjusza do wyschnięcia, wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszego przetwarzania. Aby rozpocząć usuwanie skrobi z próbki reu, zawiesić osad i 1,5 milicala 0,1 molowego octanu sodu o pH pięć zakryć probówki i podgrzać je w bloku grzewczym w celu żelatynizacji skrobi. Po schłodzeniu zawiesiny na lodzie, dodać mieszankę enzymów rozkładających skrobię, zakryć probówkę i dokładnie inkubować zawiesinę przez noc.

W wytrząsarce o temperaturze 37 stopni Celsjusza wytrząsarka rotacyjna zapewnia prawidłowe mieszanie. Po całonocnej inkubacji zakończ trawienie, ogrzewając w bloku grzewczym w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie odwirować i wyrzucić supernatant, który zawiera rozpuszczoną skrobię.

Umyj pozostały granulat trzy razy, za każdym razem używając 1,5 milicala wody, wirując, wirując i dekantując, jak pokazano wcześniej. Na koniec ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach acetonu i odparować rozpuszczalnik strumieniem powietrza o temperaturze 35 stopni Celsjusza do wyschnięcia. Wysuszone próbki zawierające izolowaną ścianę komórkową lub nogę, bez celulozy, są gotowe do dalszej analizy i mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej.

Zacznij od zważenia od jednego do 1,5 miligrama przygotowanego materiału ściany komórkowej. Materiał może być ważony ręcznie lub w sposób zautomatyzowany za pomocą ściany oka, jak pokazano w części drugiej. Przepłucz ścianki probówki 250 mikrolitrami acetonu, aby zebrać materiał ściany komórkowej na dnie probówki i bardzo delikatnie odparować aceton pod wpływem przepływu powietrza.

Po odparowaniu acetonu delikatnie dodać 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego bromku acetylu o objętości 25% objętości w lodowatym kwasie octowym wzdłuż dwóch ścianek. Aby zapobiec rozpryskiwaniu, subtelny bromek rozkłada polimer ligniny na acetylowane monos. Następnie zakryj kolbę miarową i podgrzewaj w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Podgrzej dodatkową godzinę z czterema SMS-ami co 15 minut, a na koniec schłodzić na lodzie W temperaturze pokojowej po schłodzeniu kolby dodać 400 mikrolitrów dwóch molowych wodorotlenków sodu i 70 mikrolitrów świeżo przygotowanego 0,5 molowego wiru chlorowodorku hydroksylolaminy, kolby miarowe. Następnie zneutralizować roztwór, napełniając kolbę miarową dokładnie do oznaczenia dwóch mililitrów lodowatą nasadką z kwasu octowego i kilkakrotnie odwrócić, aby wymieszać pipetą 200 mikrolitrów roztworu zawierającego hydrolizowane i rozpuszczone mono lale z 96-dołkową płytką specyficzną dla promieniowania UV i odczytać płytkę w czytniku płytek dołkowych przy 280 nanometrach. Odczytaj tabliczkę co najmniej trzy razy i uśrednij absorbancję, ponieważ cząstki stałe mogą powodować niewielkie różnice w wartościach absorbancji.

Określić zawartość procentową subtelnej ligniny rozpuszczalnej w bromku lub BSL A, stosując odpowiedni współczynnik roślinny według wzoru przedstawionego w pisemnym protokole. Lignina to sieć polifenolowa, która składa się głównie z trzech podjednostek, hydroksyfenolu P, gua, ACell i jednostek sajgonki, które mają na celu określenie składu ligniny w materiale roślinnym. Zacznij od przeniesienia około dwóch miligramów materiału ściany komórkowej do szklanej rurki z zakręcaną nakrętką w celu cytolizy.

Następnie przygotuj się do przygotowania 2,5% boru trifluorku etylu i 10% roztworu tiolu etanu w dioksanie. Ponieważ dioksan jest bardzo niebezpieczny, nie należy wyjmować żadnych próbek ani sprzętu z okapu. Pamiętaj, aby pracować bardzo ostrożnie i użyć balonu wypełnionego gazowym azotem, aby wyprzeć utraconą objętość w butelce z dioksanem z azotem.

Przygotować roztwór, mieszając następujące objętości na próbkę: 175 mikrolitrów dioksanu, 20 mikrolitrów ETSH, pięć mikrolitrów, BF trzy. Po wymieszaniu dodać 200 mikrolitrów roztworu do każdej próbki. Przepłukać przestrzeń nad fiolką azotem gazowym i nakrętką.

Natychmiast przystąp do podgrzewania próbek w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez cztery godziny, delikatnie mieszając co godzinę pod koniec godziny. Reakcja lizy Theo ace na lodzie przez pięć minut. Następnie dodaj 150 mikrolitrów 0,4-molowego wodorowęglanu sodu, aby zneutralizować i odwirować.

W celu oczyszczenia produktów rozpadu ligniny dodaj jeden milion wody i 0,5 mililitra wiru octanowego i pozwól fazom się rozdzielić. Warstwa octanu etylu będzie na górze, a woda na dole. Przenieś 150 mikrolitrów górnej warstwy octanu Ethel zawierającej składniki ligniny do probówki o grubości dwóch mil, upewniając się, że nie przenosi się wody.

Po przeniesieniu z wierzchniej warstwy octanu Ethel, odparować rozpuszczalnik za pomocą koncentratora z powietrzem. Dodaj 200 mikrolitrów acetonu i odparuj. Powtórz zabieg acetonem dwa razy, aby usunąć nadmiar wody.

Następnie wyprowadza składniki ligniny do ich lotnych trimetylopochodnych Cy Lane. Dodaj 500 mikrolitrów octanu etylu, 20 mikrolitrów puryny i 100 mikrolitrów acetamidu trimetylocytalowego NO biss do każdej probówki. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Pod koniec dwóch godzin przenieść 100 mikrolitrów reakcji do fiolki GC MS i dodać 100 mikrolitrów acetonu. Analizować próbki metodą GC wyposażoną w poczwórny spektrometr masowy lub detektor płomieniowo-jonizacyjny. Aby zapoznać się z kolumną i szczegółami biegu, należy zapoznać się z dołączonym pisemnym protokołem.

Oto kilka reprezentatywnych wyników analizy ligniny z wykorzystaniem drewna topoli jako materiału roślinnego. Zgodnie z tą analizą, 22% materiału topoli składa się z ligniny polifenolowej. Skład składników ligniny analizowano za pomocą GCMS.

Piki są identyfikowane za pomocą względnych czasów retencji przy użyciu wewnętrznego wzorca tetra coane lub za pomocą charakterystycznych ikon widma masowego wynoszących 2 99 MZ, 2 69 MZ i 2 39 MZ odpowiednio dla monomerów sg i h. Skład składników ligniny określa się ilościowo, ustawiając całkowitą powierzchnię piku na 100%Analiza składu pokazuje, że ta konkretna próbka zawiera głównie jednostki struny lub S. Jednak jednostki Goya, aol lub G są również obfite.

Oczywiście ilość i skład jednostek monolialnych może się różnić w zależności od tkanki roślinnej i gatunku. Właśnie pokazaliśmy, jak określić zawartość ligniny i skład materiału roślinnego do analizy polisacharydów. Zamień się w część drugą.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.