Christopher Hughes: Model in vitro do badania angiogenezy (wywiad)

Cześć, nazywam się Dr. Christopher Hughes. Jestem profesorem na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine, a moje laboratorium zajmuje się angiogenezą. Szczególnie interesują nas geny, które regulują proces angiogenezy.

Zoptymalizowaliśmy testy in vitro w oparciu o pracę Nelsona i w tym teście możemy przyjrzeć się wszystkim różnym procesom, które zachodzą podczas angiogenezy, pokrywamy kulki tedex, małe kulki komórkami śródbłonka. Następnie zatapiamy je w żelach fibrynowych. Zapewniamy czynniki wzrostu.

W ciągu kilku dni komórki śródbłonka wyrastają z koralików. Migrują, wyrównują się, rozmnażają, tworzą rurki, rozgałęziają się i tworzą zespolenia. Tak więc po około 10 dniach mamy kompletną kapilarę jak sieć w kulturze.

Cóż, niektóre z problemów z testami envivo i angiogenezy, na przykład te, które są wykonywane na myszach, polegają na tym, że nie jest łatwo manipulować systemem. Trudno to sobie wyobrazić, kiedy to dzieje się wewnątrz zwierzęcia, nie możesz naprawdę zobaczyć angiogenezy. A jeśli chcesz manipulować systemem w naszych hodowlach in vitro, bardzo łatwo jest genetycznie manipulować komórkami śródbłonka, włączać i wyłączać geny, i patrzeć na wpływ tego na kiełkowanie angiogenezy.

A o wiele trudniej jest to zrobić u całego zwierzęcia. Musisz robić nokauty lub pukania. To są dwie główne zalety.

Łatwo jest nim manipulować i łatwo go zwizualizować. Tak więc z biegiem lat opracowano wiele różnych testów agenezji in vitro i wszystkie mają swoje zalety i wady. Szczególnie dobrze znany jest test żelu macierzy, w którym komórki śródbłonka są umieszczane na tej macierzy zewnątrzkomórkowej zwanej matrigelem.

Problem polega na tym, że komórki śródbłonka tworzą struktury przypominające sznur, ale nigdy tak naprawdę nie tworzą prawidłowo aluminiowanych naczyń. Nie widać kiełkowania, nie widać zespolenia. Istnieją modele żelu kolagenowego, które mogą być dobre.

Jest wiele takich, których nie widać proliferacji komórek śródbłonka. Nie ma tendencji do dostrzegania zespoleń. Opracowany przez nas test fibryny w żelu opiera się na modelu Nelsona Kara opublikowanym w połowie lat dziewięćdziesiątych.

A teraz znacznie to poprawiliśmy, dzięki czemu możemy zobaczyć wszystkie etapy angiogenezy. Możemy obserwować początkowe kiełkowanie, migrację. Widzimy proliferację komórek, widzimy tworzenie się światła, rozgałęzianie się i w końcu mamy zespolenie, które tworzy kompletną sieć naczyniową in vitro.

Wierzymy, że ten test jest najlepszym systemem in vitro, jeśli chcesz przyjrzeć się tym wszystkim różnym etapom angiogenezy. Kolejną zaletą, jaką mamy z tym testem in vitro, jest to, że możemy wykonać przechwytywanie laserowe, mikropreparację, możemy obrócić kulturę, aby stała się bardzo płaska, a następnie użyć mikroskopu mikropreparacyjnego do wychwytywania laserowego. W rzeczywistości możemy wyjąć pojedyncze komórki, a w szczególności interesują nas komórki końcówki.

Wycinamy je i możemy przyjrzeć się ekspresji genów, szczególnie w komórkach wierzchołkowych w porównaniu z komórkami tułowia, komórkami, które faktycznie wytwarzają światło. Nasza hipoteza jest taka, że ekspresja genów będzie się różnić między tymi dwiema populacjami komórek. Spójrzmy na to, że byłoby to prawie niemożliwe w systemie in vivo.

Uważamy więc, że jest to kolejna ważna zaleta korzystania z tego testu in vitro. Wczesna praca, która została wykonana w tym, jak wspomniałem przez Nelsona Recona, polegała na wykorzystaniu komórek śródbłonka mikronaczyniowego. Wiele mówi się o komórkach śródbłonka mikronaczyniowego, komórkach, które chciałoby się użyć do takiego testu, ponieważ in vivo, to mikronaczyniowe EC naprawdę tworzy nowe naczynia.

Postanowiliśmy spróbować zrobić to z ve. Są to ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej z kilku powodów. Jednym z nich jest to, że komórki te są bardzo łatwe do zdobycia.

Możesz udać się do szpitala, możesz pobrać pępowinę z sal porodowych i możesz bardzo łatwo odizolować komórki. A także te komórki są wykorzystywane w hodowli od wielu lat. Są bardzo dobrze scharakteryzowane.

Skonfigurowaliśmy więc ten test i zoptymalizowaliśmy go, abyśmy mogli wykorzystać te komórki do tych celów. I co ciekawe, okazuje się, że te duże komórki śródbłonka naczyń wydają się przybierać formę komórek śródbłonka mikronaczyniowego i hodowli. Tracą wiele genów, które normalnie są wyrażane przez duże naczynia c i zaczynają wyrażać geny, które są normalnie związane z komórkami śródbłonka mikronaczyniowego.

I są doskonale zdolne do tworzenia kapilarnych pędów przypominających pędy, wytwarzania światła i sprawiania, że to, co cały świat wygląda jak prawdziwe naczynia włosowate w kulturze. Są więc łatwe w użyciu, są łatwe w użyciu i robią to, czego od nich oczekujemy. Kiełkują i tworzą właściwe naczynia aluminizowane.

Jeśli chcemy określić ilościowo ten test, naprawdę możemy pójść na kilka sposobów. Możemy przyjrzeć się naprawdę ilościowym kryteriom, takim jak liczba kiełków, długość kiełków, średnica pędów, liczba punktów rozgałęzień, liczba zespoleń, ale patrzymy również na kryteria jakościowe. Możemy więc sprawdzić, czy tworzą one lumeny?

I to jest chyba to, co nas najbardziej interesuje. W wielu testach, które wykonujemy, ich prawidłowe tworzenie światła jest prawidłowe. I to jest tak naprawdę bardziej ocena jakościowa, chociaż w miarę jak naczynia stają się większe, można również zmierzyć średnicę tych świateł.

Więc używamy fibroblastów w tych kulturach. Osadzamy kulki w żelu fibrynowym i nakładamy fibroblasty na żel. Fibroblasty są absolutnie niezbędne do prawidłowego kiełkowania i tworzenia światła.

W przypadku braku fibroblastów otrzymujemy pewne kiełkowanie. Jednak komórki śródbłonka mają tendencję do nie pozostawania ze sobą połączonymi. Dzieje się tak, że oddalają się od siebie.

Tak więc każda struktura, którą rozwijasz na tym kiełku, ma tendencję do rozpadania się. A po kilku dniach komórki śródbłonka ulegają apoptozie. Wygląda więc na to, że fibroblasty wytwarzają czynniki, które są niezbędne do angiogenezy, przynajmniej w tym systemie in vitro.

Byliśmy bardzo zainteresowani, aby dowiedzieć się, jakie są te czynniki. Odkryliśmy, że fibroblasty wydzielają coś do pożywki, dzięki czemu możemy pobrać pożywkę kondycyjną z fibroblastów, co będzie wspierać prawidłowe kiełkowanie i tworzenie światła. Zdecydowanie mamy więc do czynienia z czynnikiem rozpuszczalnym.

Oczywiście jesteśmy bardzo zainteresowani tym, co fibroblasty wytwarzają, co jest tak ważne dla angiogenezy w tym układzie. Próbowaliśmy wszystkich zwykłych podejrzanych, VEGF, podstawowe fg F są, są w kulturze, dodanie większej ilości nie zastępuje fibroblastów. Próbowaliśmy również angiopoetyny one, TGF beta, H, GF, et cetera, et cetera.

Do tej pory nie znaleźliśmy istotnego czynnika. To, co teraz robimy, to oczyszczanie fibroblastów z pożywki kondycyjnej. Umieszczamy więc pożywkę warunkową w różnych kolumnach, kationach, wymianie, wykluczeniu rozmiaru i otrzymujemy ułamki tego, które mają aktywność.

A teraz śledzimy tę aktywność i bierzemy te frakcje, znajdujemy, które z nich są aktywne, a następnie możemy uruchomić je na żelach, upewnić się, że mamy tylko stosunkowo niewielką liczbę pasm na żelu, a następnie możemy je wyciąć i zsekwencjonować według specyfikacji masy. A to daje nam wiele ciekawych dni. Mamy teraz sporo genów kandydujących, które testujemy indywidualnie, aby sprawdzić, czy są one rzeczywiście czynnikiem, którego szukamy.

Przetestowaliśmy więc wiele znanych czynników angiogennych i wiemy, że GF wegetatywny i podstawowy FGF są w rzeczywistości niezbędne do prawidłowego kiełkowania w tym teście. Ale to nie wszystko. Istnieją czynniki pochodne, które są ważne, ponieważ, jak wspomniałem, a jednym ze sposobów, w jaki na to spojrzeliśmy, jest to, że pobraliśmy komórki nowotworowe, które są wysoce angiogenne in vivo, generują duże guzy u myszy i są wysoce unaczynione.

Przyjrzeliśmy się tym komórkom nowotworowym i okazało się, że wyrażają one bardzo wysoki poziom vegf i umieściliśmy je w naszych hodowlach. Zastąpiliśmy więc fibroblasty tymi komórkami nowotworowymi i nie wspierają one silnej angiogenezy w tym teście. I to jest bardzo interesujące.

Sugeruje to, i zostało to również zasugerowane przez innych ludzi, że istnieje przesłuch między guzem, zrębem S, który jest fibroblastami i innymi komórkami podporowymi w tkance a komórkami śródbłonka. I może się zdarzyć, że komórki nowotworowe wytwarzają pewne czynniki, które działają bezpośrednio na komórki śródbłonka, ale wytwarzają również inne, które stymulują fibroblasty i inne komórki zrębu do wytwarzania czynników, które następnie wspierają silną angiogenezę.