Christopher Hughes: Model in vitro do badania angiogenezy (wywiad)

Witam, nazywam się dr Christopher Hughes. Jestem profesorem na University of California Irvine, a moje laboratorium zajmuje się angiogenezą. Szczególnie interesują nas geny regulujące proces angiogenezy.

Zoptymalizowaliśmy testy in vitro w oparciu o prace Nelsona. W tym badaniu możemy analizować wszystkie procesy zachodzące podczas angiogenezy; pokrywamy kuleczki Tedex, niewielkie kuleczki, komórkami endotelialnymi. Następnie osadzamy je w żelach fibrynowych i dostarczamy czynniki wzrostu.

W ciągu kilku dni komórki śródbłonka wyrastają z kuleczek. Migrują, ustawiają się, proliferują, tworzą rurki, rozgałęziają się i tworzą anastomozy. Dzięki temu po około 10 dniach otrzymujemy w kulturze pełną sieć przypominającą naczynia włosowate.

Niektóre z problemów związanych z testami angiogenezy in vivo, na przykład tymi wykonywanymi u myszy, polegają na tym, że manipulowanie takim systemem nie jest zbyt łatwe. Trudno jest wizualizować procesy zachodzące wewnątrz organizmu zwierzęcia; nie można w rzeczywistości obserwować przebiegu angiogenezy. Natomiast w przypadku naszych kultur in vitro manipulacja systemem jest znacznie prostsza – można bardzo łatwo modyfikować genetycznie komórki śródbłonka, aktywować lub wyłączać konkretne geny i badać wpływ tych działań na angiogenezę kiełkową.

Znacznie trudniej jest to przeprowadzić w całym organizmie zwierzęcia. Należy wtedy stworzyć linie z nokautem lub nok-inami. To zatem dwie główne zalety.

Jest on łatwy w manipulacji i łatwy do wizualizacji. Dlatego na przestrzeni lat opracowano szereg różnych testów angiogenezy in vitro, z których każdy ma swoje zalety i wady. W szczególności powszechnie znany jest test z użyciem żelu macierzyowego, w którym komórki śródbłonka umieszcza się na powierzchni macierzy pozakomórkowej zwanej Matrigel.

Problem polega na tym, że komórki śródbłonka tworzą struktury przypominające sznury, ale nigdy nie formują właściwych naczyń z lumenem. Nie obserwuje się wypustkowania ani anastomoz. Istnieją modele z żelem kolagenowym, które mogą być przydatne.

W wielu takich przypadkach nie obserwuje się proliferacji komórek śródbłonka. Zazwyczaj nie stwierdza się również anastomozy. Opracowany przez nas test z użyciem żelu fibrynowego opiera się na modelu opracowanym przez Nelsona Kara i opublikowanym w połowie lat dziewięćdziesiątych.

Obecnie znacznie ulepszyliśmy tę metodę, dzięki czemu możemy obserwować wszystkie etapy angiogenezy. Możemy śledzić początkowe kiełkowanie oraz migrację. Obserwujemy proliferację komórek, tworzenie się światła naczynia, rozgałęzianie, a na koniec anastomozę, która prowadzi do powstania kompletnej sieci naczyniowej in vitro.

Wierzymy zatem, że ten test jest obecnie najlepszym systemem in vitro, jeśli chce się badać wszystkie te różne etapy angiogenezy. Inną zaletą tego testu in vitro jest możliwość zastosowania laserowej mikrodyssekcji; możemy odwirować kulturę, aby stała się bardzo płaska, a następnie użyć mikroskopu do laserowej mikrodyssekcji. Możemy w ten sposób wyizolować pojedyncze komórki, a w szczególności interesują nas komórki wierzchołkowe (tip cells).

Zatem wycinamy te fragmenty, co pozwala nam zbadać ekspresję genów, w szczególności w komórkach koniuszka w porównaniu z komórkami trzonu, czyli komórkami, które faktycznie tworzą światło naczynia. Nasza hipoteza zakłada, że między tymi dwiema populacjami komórek wystąpi różnicowa ekspresja genów. Możemy to przeanalizować, podczas gdy w systemie in vivo byłoby to praktycznie niemożliwe.

Uważamy zatem, że jest to kolejna istotna zaleta stosowania tego testu in vitro. W początkowych pracach nad tą metodą, o których wspomniałem, Nelson Recon wykorzystał mikro naczyniowe komórki śródbłonka. Powszechnie uważa się, że mikro naczyniowe komórki śródbłonka są właśnie tymi komórkami, które należy zastosować w takim teście, ponieważ in vivo to właśnie one odpowiadają za tworzenie nowych naczyń.

Zdecydowaliśmy się przeprowadzić to badanie z wykorzystaniem komórek HUVEC. Są to ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej, co wybraliśmy z kilku powodów, z których jednym jest fakt, że komórki te są bardzo łatwo dostępne.

Można udać się do szpitala, pozyskać pępowiny z sal porodowych i bardzo łatwo wyizolować komórki. Ponadto komórki te są wykorzystywane w hodowlach od wielu lat i są bardzo dobrze scharakteryzowane.

W związku z tym przygotowaliśmy ten test i zoptymalizowaliśmy go, aby móc wykorzystać te komórki z wymienionych powodów. Co ciekawe, okazuje się, że te komórki śródbłonka dużych naczyń w hodowli przyjmują postać komórek śródbłonka mikrokrążenia. Tracą one wiele genów normalnie ekspresjonowanych przez EC dużych naczyń i zaczynają ekspresjonować geny zazwyczaj związane z komórkami śródbłonka mikrokrążenia.

Są one w pełni zdolne do tworzenia sproutów przypominających naczynia włosowate, tworzenia lumenów oraz struktur, które w hodowli wyglądają jak prawdziwe kapilary. Są więc łatwe w użyciu, bardzo łatwe w użyciu i robią dokładnie to, czego od nich oczekujemy. Tworzą sprouty oraz prawidłowe naczynia z lumenem.

Przy ilościowym określaniu wyników tego testu możemy zastosować kilka różnych metod. Możemy przeanalizować kryteria ilościowe, takie jak liczba pędów, długość pędów, średnica pędów, liczba punktów rozgałęzień oraz liczba anastomoz, ale bierzemy pod uwagę również kryteria jakościowe. Możemy zatem sprawdzić, czy tworzą się światła naczyń.

I to jest prawdopodobnie to, co interesuje nas najbardziej. W wielu przeprowadzanych przez nas testach kluczowe jest prawidłowe tworzenie się światła naczynia. Jest to w rzeczywistości ocena bardziej jakościowa, choć w miarę jak naczynia stają się większe, można faktycznie mierzyć również średnicę tych świateł.

W tych kulturach wykorzystujemy fibroblasty. Osadzamy kuleczki w żelu fibrynowym, a następnie wysiewamy fibroblasty na powierzchnię żelu. Fibroblasty są absolutnie niezbędne do prawidłowego pączkowania i tworzenia światła naczyń.

W przypadku braku fibroblastów obserwujemy pewne kiełkowanie. Jednak komórki śródbłonka mają tendencję do odrywania się od siebie. W rzeczywistości migrują one od siebie nawzajem.

W związku z tym każda struktura rozwijająca się na tym pędzie ma tendencję do rozpadu. Po kilku dniach komórki śródbłonka ulegają apoptozie. Wygląda więc na to, że fibroblasty wytwarzają czynniki niezbędne do angiogenezy, przynajmniej w tym systemie in vitro.

Byliśmy bardzo zainteresowani ustaleniem, jakie to są czynniki. Odkryliśmy, że fibroblasty wydzielają do medium pewną substancję, zatem możemy pobrać medium warunkowane od fibroblastów, co będzie wspierać prawidłowe kiełkowanie i formowanie światła naczynia. Oznacza to, że mamy zdecydowanie do czynienia z czynnikiem rozpuszczalnym.

Oczywiście jesteśmy bardzo zainteresowani dowiedzeniem się, co dokładnie produkują fibroblasty, co jest tak istotne dla angiogenezy w tym systemie. Przetestowaliśmy wszystkie typowe czynniki: VEGF oraz podstawowy FGF są obecne w hodowli, a dodanie ich większej ilości nie zastępuje obecności fibroblastów. Próbowaliśmy również angiopoetyny 1, TGF beta, HGF i tak dalej.

Jak dotąd nie znaleźliśmy kluczowego czynnika. Dlatego obecnie oczyszczamy czynniki z pożywki kondycjonowanej przez fibroblasty. Przepuszczamy pożywkę kondycjonowaną przez różne kolumny, w tym wymiany kationowej oraz wykluczania wielkości, a następnie wyodrębniamy frakcje wykazujące aktywność.

Obecnie monitorujemy tę aktywność i analizujemy poszczególne frakcje, aby ustalić, które z nich są aktywne. Następnie poddajemy je elektroforezie w żelach, aby upewnić się, że na żelu znajduje się stosunkowo niewielka liczba prążków, po czym wycinamy je i poddajemy sekwencjonowaniu za pomocą spektrometrii mas. Przynosi to wiele interesujących danych. Mamy obecnie kilka genów kandydackich, które testujemy indywidualnie, aby sprawdzić, czy są one faktycznie czynnikiem, którego poszukujemy.

Przetestowaliśmy wiele znanych czynników angiogennych i wiemy, że VEGF oraz podstawowy FGF są w rzeczywistości niezbędne do prawidłowego kiełkowania w tym teście. Jednak nie stanowią one pełnego obrazu. Istnieją czynniki pochodne, które są istotne, o czym wspomniałem, a jednym ze sposobów zbadania tego zagadnienia było wykorzystanie komórek nowotworowych, które wykazują silną angiogenezę in vivo; generują one duże guzy u myszy, które są silnie unaczynione.

Przeanalizowaliśmy te komórki nowotworowe i wykazują one bardzo wysokie poziomy VEGF; wprowadziliśmy je do naszych hodowli. Zastąpiliśmy zatem fibroblasty tymi komórkami nowotworowymi i w tym teście nie wspierają one intensywnej angiogenezy. Jest to niezwykle interesujące.

Sugeruje to, co wskazywali również inni badacze, że zachodzi wzajemne oddziaływanie między guzem, stromą, czyli fibroblastami i innymi komórkami wspierającymi w tkance, a komórkami śródbłonka. Może być tak, że komórki nowotworowe wytwarzają czynniki działające bezpośrednio na komórki śródbłonka, ale produkują one również inne czynniki stymulujące fibroblasty i inne komórki stromy do wytwarzania substancji, które dodatkowo wspierają intensywną angiogenezę.