Name: Ulepszona metoda izolacji RNA z sosny zwyczajnej (P. taeda L.) i innych gatunków drzew iglastych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Poznaj ulepszoną metodę izolacji RNA z sosny zwyczajnej (Pinus taeda) i innych gatunków drzew iglastych. Technika pokonuje problemy związane z wysoką zawartością fenoli i polisacharydów, zapewniając RNA wysokiej jakości do analiz genomowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować następującym osobom, bez których pomocy zebranie tkanek sosny nie byłoby możliwe: dr. Joe Nairnowi, Mattowi Brymanowi, Michaelowi Bordeaux, Ujwalowi Bagalowi, Huizhe Jin i Amandzie Bouffier.

Część 1: Pozyskiwanie drzew
Po wybraniu i ścięciu drzewa ważne jest, aby pracować tak starannie i szybko, jak to możliwe. Każdy pobrany typ tkanki należy niezwłocznie umieścić w oddzielnym naczyniu z ciekłym azotem, aby uniknąć wzajemnego zanieczyszczenia materiału próbkowego. Ten protokół izolacji RNA jest skalowalny.
<ol> 
 <li>Przyciąć kłody na odcinki o długości około 0.5-0.75 m, a następnie za pomocą piły spalinowej naciąć korę w dwóch lub trzech miejscach wzdłuż osi podłużnej kłody.</li>
 <li>Używając dłuta do drewna, opracować krawędź nacięcia, aż kora zacznie oddzielać się od drewna, a następnie kontynuować pracę dłutem, jednocześnie odciągając fragment kory, aż całkowicie oddzieli się ona od pnia.</li>
 <li>Ksylem wtórny pozyskuje się poprzez skrobanie wzdłuż osi podłużnej kłody pozbawionej kory za pomocą jednostronnej żyletki o prostej krawędzi. Należy nosić rękawiczki lateksowe, aby zminimalizować zanieczyszczenie tkanki.</li>
 <li>Floem, znajdujący się po wewnętrznej stronie fragmentów kory, można łatwo pozyskać poprzez ręczne obieranie.</li>
 <li>Drewno reakcyjne pobiera się z dolnej strony konarów po uprzednim oznaczeniu ich farbą w sprayu, aby wskazać ich pierwotną orientację względem podłoża.</li>
 <li>Konary przecina się na kłody o długości 1-2 m i nacinają po przeciwnych stronach wzdłuż osi podłużnej, zgodnie z przybliżonym rozmieszczeniem dwóch typów drewna reakcyjnego: drewna przeciwstawnego (po górnej stronie konara) i drewna kompresyjnego (po dolnej stronie konara). Korę oddziela się od konara w opisany wcześniej sposób, z zastrzeżeniem, że w jednym czasie usuwa się tylko korę pokrywającą dany typ drewna reakcyjnego. Następnie ksylem wtórny lub floem pobiera się w opisany wyżej sposób i umieszcza w ciekłym azocie.</li>
 <li>Inne próbki, takie jak igły, wierzchołki pędów i młode szyszki, można pozyskiwać ręcznie lub przy użyciu sekatora, w zależności od potrzeb.</li>
 <li>Zebrane próbki zamrożone w ciekłym azocie należy umieścić w oznakowanych workach lub odpowiednich pojemnikach i zapakować w suchy lód w celu transportu do laboratorium.</li>
 </ol>
Część 2: Przetwarzanie próbek w młynku kriogenicznym
 <ol>
 <li>Napełnić zbiornik młyna kriogenicznego Spex 6850 ciekłym azotem, umieścić pręt uderzeniowy w jednej z fiolek do mielenia i napełnić ją ciekłym azotem w celu schłodzenia wstępnego. Odlać ciekły azot i dodać próbkę do fiolki.</li>
 <li>Upewnić się, że w komorze mielącej nie pozostał nadmiar ciekłego azotu oraz że nadmiar gazowego azotu został całkowicie odprowadzony przed osadzeniem nasadki zamykającej komorę.</li>
 <li>Włożyć fiolkę do mielenia do uchwytu i zamknąć.</li>
 <li>Mielić próbki zdrewniałe przez dwa cykle po 1 minucie na cykl przy ustawieniu prędkości 14.</li>
 <li>Użyć szpatułki schłodzonej w ciekłym azocie, aby przenieść zmieloną próbkę (mączkę drzewną) do zlewki, która została uprzednio schłodzona i zawiera niewielką ilość ciekłego azotu.</li>
 <li>Przeżyć zawiesinę próbki w ciekłym azocie do pojemnika do przechowywania i umieścić w temperaturze -80° C do czasu użycia.</li>
</ol>
Część 3: Izolacja RNA, dzień 1
 <ol>
 <li> Odmierzyć 20mL buforu do izolacji RNA do zakręcanej probówki Falcon 50mL, dodać 400 μL β-merkaptoetanolu, krótko wymieszać w wirówce typu vortex, a następnie podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 60° C. </li>
 <li> Do każdej probówki dodać 4 g zamrożonej tkanki. Zakręcić i energicznie wstrząsnąć ręcznie, a następnie mieszać w wirówce typu vortex przez 10 sekund.</li>
 <li> Dodać do probówki taką samą objętość chloroformu i delikatnie odwrócić w celu wymieszania. Umieścić probówkę na mielarce i mieszać metodą end-over-end przez 5 minut.</li>
 <li> Przełożyć mieszaninę do probówki Oak Ridge 50 mL i wirować z prędkością 12 000 rpm (17 200 xg) w rotorze stałokątnym SS34 przez 5 minut.</li>
 <li> Przenieść fazę wodną do nowej probówki Oak Ridge i dodać połowę objętości chloroformu. </li>
 <li> Mieszać w wirówce typu vortex przez 1 minutę, a następnie kontynuować mieszanie na mielarce przez 5 minut. Wirować z prędkością 12 000 rpm (17 200 xg) w rotorze stałokątnym SS34 przez 5 minut.</li>
 <li> Przenieść fazę wodną do nowej probówki Oak Ridge i dodać połowę objętości chloroformu. Mieszać w wirówce typu vortex przez 1 minutę. Wirować z prędkością 12 000 rpm (17 200 xg) w rotorze stałokątnym SS34 przez 10 minut.</li>
 <li> Przenieść fazę wodną do wysokoprędkościowej probówki polipropylenowej 50 mL. Wirować z prędkością 10 000 rpm (11 900 xg) w rotorze stałokątnym SS34 przez 20 minut.</li>
 <li> Odlać nadosad do probówki Falcon 50 mL i dodać do nadosadu jedną czwartą objętości roztworu LiCl 10 M. Krótko wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować w temperaturze 4° C przez noc w celu wytrącenia osadu.</li>
</ol>
Część 4: Izolacja RNA, dzień 2
 <ol>
 <li> Przed rozpoczęciem pracy podgrzać bufor SSTE w łaźni wodnej o temperaturze 65° C.</li>
 <li> Przenieść próbkę wytrąconą za pomocą LiCl do probówki z polipropylenu i zpelletować RNA poprzez wirowanie z prędkością 11 000 rpm w rotorze stałokątnym SS34 (14 450 xg) przez 30 minut w temperaturze 4° C.</li>
 <li> Po wirowaniu odlać i usunąć ciecz, a następnie odwrócić probówki na chusteczkach Kimwipes na około 1 minutę. Za pomocą pipety usunąć pozostały naddatek. </li>
 <li> Resuspendować każdy pellet w 800 μL podgrzanego buforu SSTE, używając pipety do dokładnego wymieszania próbek. Przenieść zresuspendowaną próbkę do 2 mL probówek do mikrowirowarki Ambion wolnych od RNaz.</li>
 <li> Podgrzewać próbki w temperaturze 65° C przez 2 minuty, a następnie energicznie wymieszać w wibratorze (vortex), aby zapewnić całkowitą resuspensję.</li>
 <li> Do każdej probówki z próbką dodać równą objętość fenolu z chloroformem, pH 8. Mieszać każdą próbkę w wibratorze przez 30 sekund, a następnie wirować w mikrowirowarce z prędkością 14 000 rpm przez 3 minuty.</li>
 <li> Przenieść fazę wodną do nowych 2 mL probówek do mikrowirowarki Ambion wolnych od RNaz i dodać równą objętość chloroformu. Mieszać każdą próbkę w wibratorze przez 30 sekund i wirować w mikrowirowarce z prędkością 14 000 rpm przez 3 minuty.</li>
 <li> Przenieść fazę wodną do probówek Phase-Lock Gel, które zostały wcześniej przygotowane poprzez wirowanie z prędkością 11 000 rpm przez 2 minuty. Dodać połowę objętości chloroformu i delikatnie wymieszać za pomocą pipety. </li>
 <li> Wirować z prędkością 11 000 rpm przez 5 minut i przenieść fazę wodną do świeżych 2 mL probówek do mikrowirowarki Ambion wolnych od RNaz.</li>
 </ol>
Część 5: Wytrącanie RNA i przemywanie etanolem
 <ol>
 <li> Do fazy wodnej dodać 50 μL 3.0 M octanu sodu, pH 4.8 oraz 1 mL 100% etanolu. Wymieszać w wortexie i wytrącić w temperaturze -80° C przez 30 minut lub przez noc w temperaturze -20° C.</li>
 <li> Próbki wirować w mikrowirowce z prędkością 14,000 rpm przez 30 minut w temperaturze 4° C, a następnie ostrożnie odessać nadsącz. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu.</li>
 <li> Osady RNA przemyć 1 mL 70% (v/v) etanolu w temperaturze -20° C. Wirować w mikrowirowce z prędkością 14,000 rpm przez 1 minutę i odessać etanol.</li>
 <li> Powtórzyć krok 5.3.</li>
 <li> Zdjąć nakrętki z probówek i pozostawić osady do wyschnięcia na powietrzu na blacie przez 3-5 minut.</li>
</ol>
Część 6: Końcowe resuspensowanie i kwantyfikacja
<ol>
	<li> Każdy osad zawiesić w 100 μL wody traktowanej DEPC. Wymieszać za pomocą wortexa i inkubować probówki w temperaturze 65° C przez 2 minuty, a następnie umieścić na lodzie. W razie potrzeby powtórzyć czynność, aby zapewnić pełne zawieszenie próbki.</li>
 <li> W razie potrzeby połączyć podobne próbki i przygotować 50 μL rozcieńczenia 1:10 w 10mM Tris, pH 7.5, do oznaczania ilościowego metodą spektrofotometryczną. Stosunki absorbancji 260/280 oraz 260/230 są zazwyczaj odpowiednio wyższe niż 2.1 i 2.2. Wydajność izolacji RNA wynosi od 60-120μg/g zamrożonej tkanki.</li>
 <li> Próbki przeanalizować, nakładając 1.5-2.5 μg RNA na 1% żel agarozowy w buforze TAE. W przypadku bardziej krytycznych próbek przeanalizować RNA za pomocą Agilent 2100 Bioanalyzer zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
 </ol>
Reprezentatywne wyniki:
Wydajność izolacji RNA z różnych tkanek drzew iglastych wynosi od 60-120 μg/g mrożonej tkanki, przy czym próbki zdrewniałe zazwyczaj dają około 70-80 μg/g mrożonej tkanki. Diagnostyczne stosunki 260/280 oraz 260/230 są zazwyczaj większe niż 2,1 i stanowią dobre wskaźniki tego, że próbka RNA jest odpowiednio wolna od znaczących zanieczyszczeń fenolowych lub węglowodanowych. Próbki analizowane metodą elektroforezy w żelu agarozowym z następującym barwieniem EtBr powinny wykazywać trzy wyraźne prążki dla RNA 25S, 18S i 5S (Rycina 1). Wyznaczanie stechiometrii 28S do 18S na żelach agarozowych jest nieco subiektywne, a czynniki takie jak warunki prowadzenia żelu, barwienie i ilość naniesionej próbki mogą mieć wpływ na wynik. Generalnie stosunek 28S:18S będzie wynosił &gt; 1,5. Jednak niektóre próbki drzew iglastych wykazują niższe stosunki. Na przykład w analizach za pomocą Agilent 2100 zaobserwowaliśmy kilka przypadków próbek drzew iglastych z różnych typów tkanek, w których stechiometria była bliższa 1,2:1. Zatem pozornie niska stechiometria 28S:18S w elektroforezie w żelu agarozowym nie musi wskazywać na niską jakość próbki. W próbkach liści, pędów i szyszek często występują dodatkowe wyraźne prążki ze względu na rybosomalne RNA chloroplastowe. Materiały barwione EtBr, które nie migrują z dołka startowego lub prążki o wysokiej masie cząsteczkowej (&gt;8-10 kb), zazwyczaj wskazują na zanieczyszczenie genomowym DNA (Rycina 2). Smugi o niskiej masie cząsteczkowej w pobliżu lub poniżej prążka 5S oraz osłabione barwienie prążków rybosomalnych lub pozorna stechiometria 18S &gt; 28S są dobrymi wskaźnikami zajścia degradacji RNA (Rycina 3). W analizie elektroferogramu Agilent 2100 linia bazowa powinna być niska i stosunkowo gładka, z głównymi pikami odpowiadającymi rybosomalnemu RNA 18S i 28S, przy czym stosunki 28S:18S wahają się od 1,2 do 2,0. Wartość Agilent RNA Integrity Number (RIN) może być lepszym predyktorem jakości RNA i powinna wynosić co najmniej 7 lub więcej dla RNA, które ma zostać użyte do przygotowania celów do mikromacierzy. Rycina 4 przedstawia typowy elektroferogram Agilent 2100 dla RNA z ksylemu ze stosunkiem 28S:18S równym 1,4 i wartością RIN wynoszącą 8,6, podczas gdy Rycina 5 pokazuje słaby preparat RNA z ksylemu o bardzo wysokiej linii bazowej i wyraźnej degradacji, co ujawnia stosunek 28S:18S równy 0,65 oraz wartość RIN wynosząca 3,4.

<img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig1.jpg" alt="Wyniki elektroforezy, rozdział RNA, prążki żelowe 28S, 18S i 5S, pokazane markery molekularne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Analiza żelu agarozowego wysokiej jakości RNA sosny. Ścieżka 1, standard NEB 1 kb, ścieżka 2 pokazuje typową izolację całkowitego RNA z ksylemu wtórnego sosny loblolly z charakterystycznymi prążkami rybosomalnymi 28S, 18S i 5S oraz wyraźnym stosunkiem 28S:18S &gt;1.
<img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig2.jpg" alt="Wynik elektroforezy w żelu agarozowym; rozdział RNA, prążki 18S, 28S; marker masy cząsteczkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2.Analiza w żelu agarozowym próbki RNA sosny zanieczyszczonej DNA genomowym. Ścieżka 1, standard NEB 1 kb, ścieżka 2, próbka RNA z ksylemu wykazująca zanieczyszczenie DNA genomowym.
<img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig3.jpg" alt="Wynik elektroforezy w żelu; integralność RNA; widoczne prążki 28S, 18S rRNA; marker masy cząsteczkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3.Analiza w żelu agarozowym próbki sosny wykazująca degradację RNA i zanieczyszczenie genomowym DNA. Ścieżka 1, standard NEB 1 kb, ścieżka 2, próbka RNA z ksylemu wykazująca zanieczyszczenie genomowym DNA i silną degradację RNA.
<img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig4.jpg" alt="Wykres dyfrakcji rentgenowskiej przedstawiający piki analizy struktury krystalicznej; metoda wizualizacji danych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4.Elektroforegram Agilent 2100 całkowitego RNA ksylemu wyizolowanego opisaną metodą z ksylemu sosny loblolly. Stosunek 28S:18S wynosi 1,4, wartość RIN wynosi 8,6 
<img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig5.jpg" alt="Wykres wyników chromatografii przedstawiający analizę piku z czasami retencji i danymi o intensywności." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> Rycina 5. Elektroforegram Agilent 2100 całkowitego RNA z wierzchołka apikalnego wykazujący silną degradację i kontaminację genomową. Stosunek 28S:18S wynosi 0,65, wartość RIN wynosi 3,4

<ol><li>Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+for+extracting+RNA+from+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).</li>
<li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+the+Loblolly+Pine+PtGen2+cDNA+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray.</a> Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).</li>
</ol>

Uzyskanie wysokiej jakości RNA z gatunków iglaków może być trudnym zadaniem ze względu na wysoką zawartość związków fenolowych i polisacharydów występujących w tkankach zdrewniałych. Opierając się na protokole opracowanym przez Chang i wsp. (1), stwierdziliśmy, że bardziej rygorystyczne etapy ekstrakcji i oczyszczania prowadzą do spójnej izolacji całkowitego RNA bardzo wysokiej jakości z różnych tkanek zdrewniałych i niezdrewniałych pobranych od szerokiej gamy gatunków iglaków. W tym filmie zaprezentowano nie tylko nasz ...

<table><tbody><tr><td>Bufor do izolacji RNA</td><td></td><td></td><td>2% CTAB (bromek heksadecylotrimetylammonium), 2% PVP (poliwinylo-pirolidon; Mw 30-40 000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L espermidyny</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-4</td><td></td></tr><tr><td>Fenol, Ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>15509-037</td><td></td></tr><tr><td>10M LiCl</td><td></td><td></td><td>Przygotowano z wody traktowanej DEPC</td></tr><tr><td>Bufor SSTE</td><td></td><td></td><td>1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)</td></tr><tr><td>Octan sodu (NaOAc) 3M pH4.8</td><td></td><td></td><td>Przygotowano z wody traktowanej DEPC</td></tr><tr><td>Fenol-chloroform (pH8.0)</td><td></td><td></td><td>120mL fenolu, 160mL chloroformu miareowanego wielokrotnymi zmianami 0.5M Tris-Cl pH 8.0</td></tr><tr><td>Teflonowe probówki do wirowania wysokich prędkości Oak Ridge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#05-562-16B</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowe probówki do wirowania wysokich prędkości 50mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#05-562-10K</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon, sterylne, zakręcane stożkowe probówki jednorazowe 50mL</td><td>VWR international</td><td>#21008-939</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy, 2mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#2302830</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirowarki wolne od RNaz Ambion, 2mL</td><td>Ambion</td><td>#AM12425</td><td></td></tr></tbody></table>

ulepszona metoda izolacji rna z sosny taeda (p. taeda l.) i innych gatunków iglaków

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

Tkanki wyizolowane z gatunków drzew iglastych, w szczególności tych należących do rodziny sosnowatych (Pinaceae), takich jak sosna loblolly (Pinus taeda(L.), zawierają wysokie stężenia związków fenolowych i polisacharydów, które utrudniają oczyszczanie RNA. Izolacja wysokiej jakości RNA z tych gatunków wymaga rygorystycznych procedur pobierania tkanek w terenie oraz zastosowania protokołu izolacji RNA obejmującego wielokrotne etapy ekstrakcji organicznej, aby uzyskać RNA o jakości wystarczającej do analiz mikromacierzy i innych analiz genomicznych. Izolacja wysokiej jakości RNA z próbek sosny loblolly pobranych w terenie może być trudna, jednak kilka modyfikacji standardowych procedur izolacji tkanek i RNA znacznie poprawia wyniki. Stopień ogólnej degradacji RNA wzrasta, jeśli próbki nie są prawidłowo pobierane i transportowane z terenu, szczególnie podczas zbiorów na dużą skalę. Wydajność całkowitego RNA można znacząco zwiększyć poprzez sproszkowanie próbek w młynku kriogenicznym z ciekłym azotem przed izolacją RNA, zwłaszcza gdy próbki pochodzą z tkanek zdrewniałych. Wynika to przede wszystkim z obecności utleniaczy, takich jak związki fenolowe, oraz polisacharydów, które występują w wysokich stężeniach w ekstraktach z tkanek zdrewniałych większości gatunków iglaków. Jeśli nie zostaną usunięte, zanieczyszczenia te mogą przenieść się do produktu końcowego, prowadząc do problemów, takich jak degradacja RNA, co skutkuje niską wydajnością i słabą jakością próbki RNA. Przeniesienie związków fenolowych, a także polisacharydów, może również zmniejszyć lub nawet całkowicie wyeliminować aktywność odwrotnej transkryptazy lub innych polimeraz powszechnie stosowanych do syntezy cDNA. W szczególności RNA przeznaczone do wykorzystania jako matryca do syntezy dwuniciowego cDNA przy tworzeniu bibliotek cDNA, syntezy jednoniciowego cDNA do PCR lub qPCR, lub do syntezy materiałów docelowych do mikromacierzy, musi być najwyższej jakości, jeśli badacze oczekują uzyskania optymalnych wyników. Techniki izolacji RNA powszechnie stosowane dla wielu innych gatunków roślin są często niewystarczające w usuwaniu tych zanieczyszczeń z próbek iglaków i w związku z tym nie pozwalają na uzyskanie próbek całkowitego RNA odpowiednich do dalszych manipulacji. W tym filmie prezentujemy metody pobierania tkanek iglaków w terenie, począwszy od ścięcia czterdziestoletniego drzewa, aż po pobieranie łyka, ksylemu wtórnego i ksylemu drewna reakcyjnego. Prezentujemy również protokół izolacji RNA, który konsekwentnie pozwala na uzyskanie wysokiej jakości RNA do późniejszych manipulacji enzymatycznych.

Wiele tkanek roślinnych, w tym łyko i drewno sosny taeda (Pinus taeda L.), zawiera wysokie stężenia związków fenolowych i polisacharydów, które utrudniają oczyszczanie RNA. Niniejsza prezentacja omawia techniki zbioru tkanek hodowanych w warunkach polowych oraz izolacji RNA o jakości wystarczającej do analiz mikromacierzy i innych analiz genomowych.

Ulepszona metoda izolacji RNA z sosny taeda (P. taeda L.) i innych gatunków iglaków

Tkanki wyizolowane z gatunków drzew iglastych, w szczególności należących do rodziny sosnowatych (Pinaceae), takich jak sosna taeda (Pinus taeda L.), zawierają wysoką...

Poniższy materiał został opracowany przez badaczy z University of Georgia oraz Warnell School of Forestry and Natural Resources. Ten film instruktażowy opisuje proces pozyskiwania tkanki ksylemu i floemu oraz następującą po nim izolację RNA z Pinus taeda, powszechnie znanej jako sosna loblolly, która jest najważniejszym gatunkiem iglaka pod względem produkcji produktów leśnych w Stanach Zjednoczonych. Po ścięciu drzewa, w tym przypadku osobnika w wieku 40 lat, główny pień zostaje pocięty na klocy o długości około 50 cm.Następnie śruba jest nacinana wzdłużnie piłą łańcuchową w kilku miejscach, aby ułatwić usuwanie kory. Za pomocą młotka i dłuta do drewna kora jest podważana, aż do momentu, gdy można ją oddzielić w sekcjach. Następnie tkanka przewodzącą usuwa się ręcznie, zdrapując ją z wewnętrznej strony sekcji kory i natychmiast zanurzając w ciekłym azocie.Po usunięciu kory cienką warstwę ksylemu wtórnego można zebrać, zeskrobując powierzchnię odcinka za pomocą jednostronnej żyletki. Wodnistą tkankę ksylemu natychmiast umieszcza się w ciekłym azocie. Podczas tego zbioru pobrano również próbki drewna reakcyjnego, powszechnie określanego jako drewno ściskane i drewno przeciwstawne, przed odcięciem konarów od głównego pnia.Orientację konarów najpierw zaznacza się farbą w sprayu, aby wyznaczyć obszary zawierające dwa typy tkanki: drewno przeciwstawne na górnej części konara oraz drewno kompresyjne na dolnej. Podczas usuwania kory konary są najpierw nacinane piłą spalinową wzdłuż linii oddzielających drewno kompresyjne od przeciwstawnego, a następnie usuwa się korę w sposób analogiczny do przygotowania odcinków pnia głównego, z zastrzeżeniem, że usuwa się jedynie korę w regionie odpowiadającym danemu typowi reakcji.Pozyskane drewno jest usuwane w dowolnym momencie. Zazwyczaj trudniej jest usunąć duże fragmenty kory z tych mniejszych gałęzi. Próbki drewna reakcyjnego ksylemu wtórnego są pobierane w ten sam sposób co w przypadku normalnego ksylemu wtórnego, poprzez skrobanie żyletką i natychmiastowe zanurzenie w ciekłym azocie.Zwróć uwagę na rdzawobrunatny kolor charakterystyczny dla drewna kompresyjnego. Warto wspomnieć, że pobieranie i przetwarzanie wielu próbek z dużego drzewa wymaga zaangażowania wielu osób, z których każda wykonuje wyznaczone zadanie, tak aby wszystkie typy tkanek były pobierane jednocześnie w celu ograniczenia degradacji RNA; próbki zamrożone w ciekłym azocie są następnie przenoszone do oznakowanych worków do przechowywania i umieszczane na suchym lodzie w celu transportu do laboratorium. Pierwszym krokiem jest sproszkowanie tkanki przy użyciu młyna kriogenicznego Specsmix model 68-50; w porównaniu do rozcierania w moździerzu, ten etap znacznie zwiększa wydajność ekstrakcji RNA z próbek tkanek zdrewniałych, przy jednoczesnym utrzymaniu niskiej temperatury próbek za pomocą ciekłego azotu.Tkankę najpierw rozdrabnia się ręcznie na mniejsze kawałki i umieszcza w komorze próbkowej. Komorę wkłada się do uchwytu i blokuje w miejscu, a następnie próbkę mieli przez dwie minuty. Produkt końcowy ma konsystencję grubego proszku.Protokół ekstrakcji RNA jest procesem dwudniowym. Pierwszego dnia 2,5 g zamrożonej tkanki dodaje się do buforu do ekstrakcji RNA podgrzanego do 65 °C. Próbkę energicznie wstrząsa się w celu wymieszania, następnie dodaje równą objętość chloroformu i ponownie miesza próbkę, delikatnie ją odwracając.Następnie próbkę umieszcza się na obrotowym kole na pięć minut. Próbkę przenosi się potem do wysokobiegowych probówek Teflon Oakridge i wiruje w rotorze SS 34 przy 12, 000 RPM przez pięć minut. Górną frakcję wodną przenosi się do nowej probówki i dodaje połowę objętości chloroformu.Próbkę mieszano w wirówce typu vortex przez jedną minutę, a następnie ponownie umieszczono na rotatorze na pięć minut. Po drugiej centrifugacji frakcję wodną ponownie przeniesiono do 50 ml wysokoprędkościowej probówki polipropylenowej i odwirowano przy 10 000 RPM przez 20 minut. Aby usunąć pozostałe cząstki stałe, próbkę przelano do probówki Falcon 50 ml i dodano do niej jedną czwartą objętości 10 M chlorku litu.Próbkę miesza się poprzez wstrząsanie, a następnie pozostawia w temperaturze 4°C przez noc. Drugiego dnia próbkę z wytrąconym chlorkiem litu wiruje się najpierw przy 11 000 RPM przez 30 minut w temperaturze 4°C.Nadsącz zlewamy i utylizujemy, a następnie probówki odwracamy do góry dnem na chusteczki do zastosowań chemicznych na jedną minutę. Aby usunąć nadmiar cieczy, osad RNA, który powinien być widoczny, resuspendujemy w 800 µL gorącego buforu SSTE uprzednio podgrzanego do 65 °C. Należy pamiętać o kilkukrotnym pipetowaniu w górę i w dół oraz wokół krawędzi osadu, aby upewnić się, że został on całkowicie rozpuszczony.Następnie przenieś resuspensowane RNA do probówki do mikrocentryfugi wolnej od RNaz marki Two Mil and Beyond. Ogrzewaj próbkę przez jedną do dwóch minut w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C, a następnie wymieszaj w wirówce typu vortex, aby upewnić się, że próbka została całkowicie resuspendowana. W razie potrzeby czynność tę można powtórzyć.Następnie należy dodać taką samą objętość buforowanego fenolu z chloroformem. Próbkę należy wymieszać w wirówce typu vortex przez 15 do 20 sekund, a następnie wirować w mikrowirówce z prędkością 14 000 RPM przez trzy minuty. Frakcję wodną przenosi się do nowej probówki do mikrowirówki i dodaje taką samą objętość.Próbkę wymieszano w wortexie i odwirowano w mikrocentryfużce, analogicznie jak w poprzedniej ekstrakcji. W końcowej fazie ekstrakcji organicznej probówki z żelem separacyjnym poddano wirowaniu w mikrocentryfużce z prędkością 11 000 RPM przez dwie minuty.Następnie do żelu do separacji faz dodaje się próbkę RNA z poprzedniej ekstrakcji, a potem połowę objętości chloroformu, po czym obie fazy miesza się, delikatnie pipetując. Następnie próbkę wiruje się przy 11 000 RPM przez pięć minut, a wodną próbkę RNA przenosi się do nowej probówki do mikrocentryfugi Ambion RNA free. Kolejnym krokiem jest proste wytrącanie RNA z próbki poprzez dodanie 1/10 objętości 3 M octanu sodu o pH 4.8 oraz dwóch objętości 100% etanolu.Próbkę mieszamy w wstrząsaczu vortex, umieszczamy na krótko w zamrażarce w temperaturze -80 °C na 30 minut, a następnie wirujemy w mikrowirówce przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Nadpływ ostrożnie odsysamy, a mały biały osad przemywamy 1 mL lodowatego 70% etanolu. Po odessaniu płynu powtarzamy przemywanie etanolem. Pozostały etanol odparowujemy, pozostawiając otwarte probówki na blacie przez pięć minut.Osady RNA resuspenduje się w 100 µL wody z DEPC, mieszając w wstrząsarku typu vortex i podgrzewając do 65 °C. W razie potrzeby czynność tę można powtórzyć. Następnie wyznacza się stężenie próbki.Metodą spektrofotometryczną oblicza się stosunki 260/280 oraz 260/230, aby oszacować stopień zanieczyszczenia próbki białkami i węglowodanami. Elektroforeza w 1% żelu AGROS jest wykorzystywana do jakościowej oceny czystości próbki, zanieczyszczenia genomowym DNA oraz degradacji RNA. Integralność kluczowych próbek jest dodatkowo oceniana przy użyciu bioanalizatora Agilent 2100 w celu wyznaczenia stosunków rybosomalnych 28S/18S oraz wskaźnika integralności RNA (RIN). Dziękujemy za obejrzenie naszego filmu na temat pobierania próbek tkanek i izolacji całkowitego RNA z sosny LOB (lolly pine).Za nagranie i produkcję tego filmu szkoleniowego odpowiedzialne są następujące osoby.

an-improved-method-rna-isolation-from-loblolly-pine-p-taeda-l-other

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Poprawiona metoda izolowania RNA z sosny błonkoskorupowej (P. taeda L.) i innych gatunków iglastych

Mikromacierze cDNA PtGen2 zostały opracowane do badań ekspresji genów u sosny loblolly, P. taeda, oraz innych gatunków iglastych. W niniejszym materiale przedstawiamy techniki przygotowania i obróbki przed oraz po hybrydyzacji, a także metody przemywania, które można zastosować w przypadku tej macierzy w celu uzyskania lepszej powtarzalności, ograniczenia artefaktów i zmniejszenia tła.

Przetwarzanie macierzy cDNA PtGen2 sosny łobasowej

Opisujemy zmodyfikowany protokół hybrydyzacji in situ z użyciem DIG, który jest szybki i możliwy do zastosowania u szerokiego zakresu gatunków roślin, w tym u świerka pospolitego. Dzięki kilku korektom, obejmującym m.in. zmienioną obróbkę RNazą oraz stężenie proteinazy K, protokół ten może być wykorzystywany w badaniach różnych tkanek i gatunków.

Protokół niepromiennej hybrydyzacji in situ stosowalny dla świerka pospolitego i szeregu gatunków roślin

Analiza ekspresji genów w podzbiorze komórek w określonej tkance stanowi duże wyzwanie. W tym artykule opisano, jak wyizolować wysokiej jakości całkowite RNA z określonej populacji komórek, łącząc metodę szybkiego znakowania immunologicznego z mikrodysekcją wychwytu laserowego.

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Udało nam się ustalić metodę izolacji RNA z nasion roślin zawierających duże ilości olejów, białek i polifenoli, które mają działanie hamujące izolację RNA o wysokiej czystości. Nasza metoda jest odpowiednia do monitorowania ekspresji genów z transkryptami niskiego poziomu w nasionach.

Skuteczna metoda izolacji wysoce oczyszczonego RNA z nasion do zastosowania w ilościowej analizie transkryptomu

Tutaj prezentujemy protokół śledzenia zanieczyszczenia genomowym DNA (gDNA) w próbkach RNA. W prezentowanej metodzie wykorzystuje się startery specyficzne dla wewnętrznego transkrybowanego regionu dystansowego (ITS) genów rybosomalnego DNA (rDNA). Metoda ta nadaje się do niezawodnego i czułego wykrywania zanieczyszczenia DNA u większości eukariontów i prokariontów.

Ocena zanieczyszczenia DNA w próbkach RNA na podstawie rybosomalnego DNA

Ten protokół zawiera przegląd procedur izolacji RNA do transkryptomicznego profilowania tkanek węzłów chłonnych od dużych zwierząt, w tym etapy identyfikacji i wycinania węzłów chłonnych od zwierząt gospodarskich i dzikich, podejścia do pobierania próbek w celu zapewnienia spójności wśród wielu zwierząt, oraz rozważania oraz reprezentatywne wyniki dotyczące konserwacji i przetwarzania po pobraniu do analizy RNA.

Pobieranie i przetwarzanie węzłów chłonnych od dużych zwierząt do analizy RNA: przygotowanie do badań transkryptomicznych węzłów chłonnych dużych gatunków zwierząt

Tutaj prezentujemy podejście bioinformatyczne i analizy mające na celu zidentyfikowanie ekspresji LINE-1 na poziomie specyficznym dla locus.

Sekwencjonowanie RNA nowej generacji i proces bioinformatyczny w celu identyfikacji ekspresji LINE-1 na poziomie specyficznym dla locus

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Ten protokół ma na celu wyizolowanie specyficznych dla typu komórki translujących rybosomalnych mRNA za pomocą mysiego modelu NuTRAP.

Izolowanie RNA specyficznych dla typu komórki z zatrzaskowo mrożonych próbek tkanek heterogenicznych bez sortowania komórek

Opisujemy prostą, ale wysoce powtarzalną metodę izolowania zewnątrzkomórkowego RNA z powierzchni liści i apoplastu roślin Arabidopsis.

Przewodnik krok po kroku dotyczący izolacji i analizy powierzchni liści i apoplastycznego RNA przy użyciu rozet Arabidopsis

Poznaj ulepszoną metodę izolacji RNA z sosny zwyczajnej (Pinus taeda) i innych gatunków drzew iglastych. Technika pokonuje problemy związane z wysoką zawartością fenoli i polisacharydów, zapewniając RNA wysokiej jakości do analiz genomowych.

Ulepszona metoda izolacji RNA z sosny taeda (P. taeda L.) i innych gatunków iglaków

Przeglądaj więcej filmów