Ulepszona metoda izolacji RNA z sosny taeda (P. taeda L.) i innych gatunków iglaków

Poniższy materiał został opracowany przez badaczy z University of Georgia oraz Warnell School of Forestry and Natural Resources. Ten film instruktażowy opisuje proces pozyskiwania tkanki ksylemu i floemu oraz następującą po nim izolację RNA z Pinus taeda, powszechnie znanej jako sosna loblolly, która jest najważniejszym gatunkiem iglaka pod względem produkcji produktów leśnych w Stanach Zjednoczonych. Po ścięciu drzewa, w tym przypadku osobnika w wieku 40 lat, główny pień zostaje pocięty na klocy o długości około 50 cm.

Następnie śruba jest nacinana wzdłużnie piłą łańcuchową w kilku miejscach, aby ułatwić usuwanie kory. Za pomocą młotka i dłuta do drewna kora jest podważana, aż do momentu, gdy można ją oddzielić w sekcjach. Następnie tkanka przewodzącą usuwa się ręcznie, zdrapując ją z wewnętrznej strony sekcji kory i natychmiast zanurzając w ciekłym azocie.

Po usunięciu kory cienką warstwę ksylemu wtórnego można zebrać, zeskrobując powierzchnię odcinka za pomocą jednostronnej żyletki. Wodnistą tkankę ksylemu natychmiast umieszcza się w ciekłym azocie. Podczas tego zbioru pobrano również próbki drewna reakcyjnego, powszechnie określanego jako drewno ściskane i drewno przeciwstawne, przed odcięciem konarów od głównego pnia.

Orientację konarów najpierw zaznacza się farbą w sprayu, aby wyznaczyć obszary zawierające dwa typy tkanki: drewno przeciwstawne na górnej części konara oraz drewno kompresyjne na dolnej. Podczas usuwania kory konary są najpierw nacinane piłą spalinową wzdłuż linii oddzielających drewno kompresyjne od przeciwstawnego, a następnie usuwa się korę w sposób analogiczny do przygotowania odcinków pnia głównego, z zastrzeżeniem, że usuwa się jedynie korę w regionie odpowiadającym danemu typowi reakcji.

Pozyskane drewno jest usuwane w dowolnym momencie. Zazwyczaj trudniej jest usunąć duże fragmenty kory z tych mniejszych gałęzi. Próbki drewna reakcyjnego ksylemu wtórnego są pobierane w ten sam sposób co w przypadku normalnego ksylemu wtórnego, poprzez skrobanie żyletką i natychmiastowe zanurzenie w ciekłym azocie.

Zwróć uwagę na rdzawobrunatny kolor charakterystyczny dla drewna kompresyjnego. Warto wspomnieć, że pobieranie i przetwarzanie wielu próbek z dużego drzewa wymaga zaangażowania wielu osób, z których każda wykonuje wyznaczone zadanie, tak aby wszystkie typy tkanek były pobierane jednocześnie w celu ograniczenia degradacji RNA; próbki zamrożone w ciekłym azocie są następnie przenoszone do oznakowanych worków do przechowywania i umieszczane na suchym lodzie w celu transportu do laboratorium. Pierwszym krokiem jest sproszkowanie tkanki przy użyciu młyna kriogenicznego Specsmix model 68-50; w porównaniu do rozcierania w moździerzu, ten etap znacznie zwiększa wydajność ekstrakcji RNA z próbek tkanek zdrewniałych, przy jednoczesnym utrzymaniu niskiej temperatury próbek za pomocą ciekłego azotu.

Tkankę najpierw rozdrabnia się ręcznie na mniejsze kawałki i umieszcza w komorze próbkowej. Komorę wkłada się do uchwytu i blokuje w miejscu, a następnie próbkę mieli przez dwie minuty. Produkt końcowy ma konsystencję grubego proszku.

Protokół ekstrakcji RNA jest procesem dwudniowym. Pierwszego dnia 2,5 g zamrożonej tkanki dodaje się do buforu do ekstrakcji RNA podgrzanego do 65 °C. Próbkę energicznie wstrząsa się w celu wymieszania, następnie dodaje równą objętość chloroformu i ponownie miesza próbkę, delikatnie ją odwracając.

Następnie próbkę umieszcza się na obrotowym kole na pięć minut. Próbkę przenosi się potem do wysokobiegowych probówek Teflon Oakridge i wiruje w rotorze SS 34 przy 12, 000 RPM przez pięć minut. Górną frakcję wodną przenosi się do nowej probówki i dodaje połowę objętości chloroformu.

Próbkę mieszano w wirówce typu vortex przez jedną minutę, a następnie ponownie umieszczono na rotatorze na pięć minut. Po drugiej centrifugacji frakcję wodną ponownie przeniesiono do 50 ml wysokoprędkościowej probówki polipropylenowej i odwirowano przy 10 000 RPM przez 20 minut. Aby usunąć pozostałe cząstki stałe, próbkę przelano do probówki Falcon 50 ml i dodano do niej jedną czwartą objętości 10 M chlorku litu.

Próbkę miesza się poprzez wstrząsanie, a następnie pozostawia w temperaturze 4°C przez noc. Drugiego dnia próbkę z wytrąconym chlorkiem litu wiruje się najpierw przy 11 000 RPM przez 30 minut w temperaturze 4°C.

Nadsącz zlewamy i utylizujemy, a następnie probówki odwracamy do góry dnem na chusteczki do zastosowań chemicznych na jedną minutę. Aby usunąć nadmiar cieczy, osad RNA, który powinien być widoczny, resuspendujemy w 800 µL gorącego buforu SSTE uprzednio podgrzanego do 65 °C. Należy pamiętać o kilkukrotnym pipetowaniu w górę i w dół oraz wokół krawędzi osadu, aby upewnić się, że został on całkowicie rozpuszczony.

Następnie przenieś resuspensowane RNA do probówki do mikrocentryfugi wolnej od RNaz marki Two Mil and Beyond. Ogrzewaj próbkę przez jedną do dwóch minut w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C, a następnie wymieszaj w wirówce typu vortex, aby upewnić się, że próbka została całkowicie resuspendowana. W razie potrzeby czynność tę można powtórzyć.

Następnie należy dodać taką samą objętość buforowanego fenolu z chloroformem. Próbkę należy wymieszać w wirówce typu vortex przez 15 do 20 sekund, a następnie wirować w mikrowirówce z prędkością 14 000 RPM przez trzy minuty. Frakcję wodną przenosi się do nowej probówki do mikrowirówki i dodaje taką samą objętość.

Próbkę wymieszano w wortexie i odwirowano w mikrocentryfużce, analogicznie jak w poprzedniej ekstrakcji. W końcowej fazie ekstrakcji organicznej probówki z żelem separacyjnym poddano wirowaniu w mikrocentryfużce z prędkością 11 000 RPM przez dwie minuty.

Następnie do żelu do separacji faz dodaje się próbkę RNA z poprzedniej ekstrakcji, a potem połowę objętości chloroformu, po czym obie fazy miesza się, delikatnie pipetując. Następnie próbkę wiruje się przy 11 000 RPM przez pięć minut, a wodną próbkę RNA przenosi się do nowej probówki do mikrocentryfugi Ambion RNA free. Kolejnym krokiem jest proste wytrącanie RNA z próbki poprzez dodanie 1/10 objętości 3 M octanu sodu o pH 4.8 oraz dwóch objętości 100% etanolu.

Próbkę mieszamy w wstrząsaczu vortex, umieszczamy na krótko w zamrażarce w temperaturze -80 °C na 30 minut, a następnie wirujemy w mikrowirówce przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Nadpływ ostrożnie odsysamy, a mały biały osad przemywamy 1 mL lodowatego 70% etanolu. Po odessaniu płynu powtarzamy przemywanie etanolem. Pozostały etanol odparowujemy, pozostawiając otwarte probówki na blacie przez pięć minut.

Osady RNA resuspenduje się w 100 µL wody z DEPC, mieszając w wstrząsarku typu vortex i podgrzewając do 65 °C. W razie potrzeby czynność tę można powtórzyć. Następnie wyznacza się stężenie próbki.

Metodą spektrofotometryczną oblicza się stosunki 260/280 oraz 260/230, aby oszacować stopień zanieczyszczenia próbki białkami i węglowodanami. Elektroforeza w 1% żelu AGROS jest wykorzystywana do jakościowej oceny czystości próbki, zanieczyszczenia genomowym DNA oraz degradacji RNA. Integralność kluczowych próbek jest dodatkowo oceniana przy użyciu bioanalizatora Agilent 2100 w celu wyznaczenia stosunków rybosomalnych 28S/18S oraz wskaźnika integralności RNA (RIN). Dziękujemy za obejrzenie naszego filmu na temat pobierania próbek tkanek i izolacji całkowitego RNA z sosny LOB (lolly pine).

Za nagranie i produkcję tego filmu szkoleniowego odpowiedzialne są następujące osoby.