Name: Oznaczanie reaktywności i miana surowicy za pomocą testu hemaglutynacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Poznaj test hemaglutynacji do oznaczania reaktywności i miana przeciwciał w surowicy. Metoda wykorzystuje płytki U-bottom i rozcieńczenia szeregowe do szybkiej oceny wyników immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor pragnie podziękować pani Lora Matthews za wykonanie techniki oraz panu Paulowi Shepherdowi za kinematografię. Projekt ten był finansowany przez program Laboratory Medicine Uniwersytetu Południowej Australii.

Przygotowanie 5x soli fizjologicznej z buforem weronalowym (VBS)
<ol>
 <li>W celu przygotowania soli fizjologicznej buforowanej weronalem (VBS) należy przygotować trzy oddzielne roztwory.</li>
 <li>Roztwór 1 przygotowujemy poprzez rozpuszczenie 21.25gm NaCl i 0.94gm barbitonianu sodu w 350ml wody destylowanej. Końcowe stężenia NaCl i barbitonianu sodu wynoszą odpowiednio 1.02M oraz 13mM.</li>
 <li>Roztwór 2 przygotowujemy poprzez rozpuszczenie 1.44gm barbitonianu w 125ml gorącej wody destylowanej. Końcowe stężenie barbitonianu wynosi 62.5mM.</li>
 <li>Roztwór 3 przygotowujemy poprzez rozpuszczenie 20.33gm MgCl2 i 4.41gm CaCl2 w 100ml wody destylowanej. Końcowe stężenia MgCl2 i CaCl2 wynoszą odpowiednio 2.18M oraz 440mM.</li>
 <li>Wymieszać roztwory 1 i 2, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej.</li>
 <li>Po ochłodzeniu połączonego roztworu dodać 1.25 ml roztworu 3 i dostosować pH do wartości 7.3-7.5 za pomocą 1M HCl.</li>
 <li>Dopełnić objętość końcową wody destylowaną do 500ml, aby przygotować 5-krotny roztwór zapasowy.</li>
 <li>Aby przygotować 1-krotny roztwór roboczy, należy rozcieńczyć roztwór zapasowy w stosunku 1:5 wodą destylowaną.</li>
</ol>
Rozcieńczanie Revercells
<ol>
 <li>Delikatnie resuspenduj roztwór stokowy Revercells poprzez odwracanie probówki, a następnie pobierz 1ml komórek i wiruj przez 5 min przy 600g w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Po wirowaniu ostrożnie usuń nadsącz i resuspenduj komórki w 3ml 1x Veronal Buffered Saline.</li>
 <li>Komórki można teraz przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia.</li>
</ol>
Procedura
<ol>
 <li>Przenieś 50ml 1x VBS do dołków A1-A12 płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U.</li>
 <li>Do dołka A1 dodaj 50μl surowicy anty-A i wymieszaj dokładnie za pomocą pipety.</li>
 <li>Używając nowej końcówki do pipety, pobierz 50μl cieczy z dołka A1 i przenieś ją do dołka A2. Wymieszaj dokładnie i powtarzaj ten proces, aż dojdziesz do dołka A11, a następnie odrzuć ostatnie 50μl z tego dołka.</li>
 <li>Próbka surowicy została w ten sposób rozcieńczona seryjnie 2-krotnie, od 1:2 do 1:2048. Do dołka A12 nie dodaje się surowicy, ponieważ służy on jako ujemna kontrola VBS.</li>
 <li>Jeśli do oceny przeznaczono więcej niż jedną próbkę surowicy, powtórz kroki 4.1-4.4 dla rzędu B itd.</li>
 <li>Po przygotowaniu wszystkich rozcieńczeń dodaj 50μl 1% Revercells do wszystkich dołków. Uwaga: Revercells z czasem osiadają i powinny zostać delikatnie zawieszone przed dozowaniem do dołków.</li>
 <li>Wymieszaj próbki, delikatnie stukując w bok płytki mikrotitracyjnej, przykryj i pozostaw reakcję hemaglutynacji na 1h w temperaturze 37°C. Można użyć inkubatora lub odpowiednio ogrzanego pomieszczenia.</li>
 <li>Po inkubacji ostrożnie wyjmij płytkę z inkubatora i sprawdź obecność hemaglutynacji. Pierwszym sprawdzanym dołkiem powinien być dołek kontrolny VBS. Jeśli reakcja jest ujemna, wyniki są prawidłowe. Jeśli próbka VBS wykazuje pozytywny wynik hemaglutynacji, wyniki nie mogą zostać wykorzystane i należy powtórzyć cały proces. Pozytywna reakcja hemaglutynacji objawia się jako szeroka warstwa na dnie dołka, natomiast reakcja ujemna jako mały, skoncentrowany osad komórek w centrum dołka. Wynik pośredni będzie charakteryzował się obecnością pierścienia komórek pozytywnych z centralnym rdzeniem osadzonych komórek. Wynik ten występuje, gdy surowica zawiera pewną ilość Ab zdolnych do reakcji, ale jest ich zbyt mało, aby wywołać pełną reakcję.</li>
 <li>Sekcja wyników reprezentatywnych zawiera dwa schematyczne przedstawienia oczekiwanych wyników. Podano przykład nieprawidłowego oraz prawidłowego zestawu wyników. Wyznaczone zostanie również miano dla antysurowicy.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Film zawiera przykład reprezentatywnych wyników. Poniżej (Ryc. 1 i Ryc. 2) przedstawiono dwa przykłady w formie schematycznej. Pierwszy przykład przedstawia reakcję, której nie można zinterpretować, ponieważ kontrola VBS jest dodatnia, natomiast drugi jest prawidłowym testem, który pozwala na oznaczenie miana.
<img src="/files/ftp_upload/1752/1752fig1.jpg" alt="Schemat rozcieńczeń seryjnych wyników testu wykrywania przeciwciał, kroki zmniejszania stężenia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Przykład hemaglutynacji, w której wynik dodatni jest błędny. Na powyższej reprezentacji schematycznej reakcja hemaglutynacji nie może zostać zaakceptowana. Negatywna kontrola surowicy VBS wykazuje dodatnią reakcję hemaglutynacji, o czym świadczy powstanie warstwy (sheet formation) u podstawy dołka. Wskazuje to na wystąpienie błędu i brak możliwości zaakceptowania wyników. W takim przypadku proces należy powtórzyć.
<img src="/files/ftp_upload/1752/1752fig2.jpg" alt="Schemat serii rozcieńczeń dla analizy miana przeciwciał; pokazane czynniki rozcieńczenia z wynikami pozytywnymi i negatywnymi." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Przykład hemaglutynacji, w której wynik pozytywny został uzyskany prawidłowo. W przedstawieniu schematycznym reakcja hemaglutynacji jest prawidłowa. Kontrola negatywna VBS wykazuje negatywną reakcję hemaglutynacji, o czym świadczy osad utworzony na dnie dołka. Ostatnim pozytywnym dołkiem jest rząd 7, co wskazuje, że miano dla tej próbki surowicy wynosi 128 (tj. odwrotność 1/128). Jest to przykład przeciwciała występującego w surowicy w umiarkowanej ilości.

Test aglutynacji jest bardzo prostą techniką, która pozwala na ocenę licznej grupy próbek surowicy w krótkim czasie. Zaletą tej metody jest możliwość odczytu bez użycia specjalistycznego sprzętu, gdyż wystarczający jest wzrok obserwatora. Technikę tę można również zmodyfikować w celu wykrywania hormonu gonadotropiny kosmórki ludzkiej w moczu, jako element testu inhibicji aglutynacji. W odniesieniu do standardowego testu aglutynacji istnieje kilka obszarów, w których należy zachować ostrożność, aby badanie zostało przepro...

<table><tbody><tr><td>Revercells</td><td>CSL</td><td>02490201</td><td>Stosować w stężeniu końcowym 1%</td></tr><tr><td>Surowica przeciwciała anty-A</td><td>CSL</td><td>02611305</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa z dnem w kształcie litery U</td><td>TRP</td><td>92097</td><td>Musi być z dnem w kształcie litery U</td></tr><tr><td>Bufor solny Veronal</td><td></td><td></td><td>Stosować w stężeniu końcowym 1x</td></tr><tr><td>Pomieszczenie/inkubator 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rękawiczki jednorazowe</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie reaktywności i miana surowicy za pomocą testu hemaglutynacji

Determining the Reactivity and Titre of Serum using a Haemagglutination Assay

Hemaglutynacja jest specyficzną formą aglutynacji, stosowaną w przypadku wiązania przeciwciał z erytrocytami, które pełnią rolę antygenu cząsteczkowego. Erytrocyty są szczególnie użytecznymi celami, ponieważ są łatwo dostępne, a aglutynację można zaobserwować gołym okiem. Technika ta jest powszechnie wykorzystywana do określania miana przeciwciał (Ab), w określaniu grup krwi oraz w miareczkowaniu wirusów. W niniejszym filmie zaprezentowano etapy przygotowania i przeprowadzenia testu hemaglutynacji z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla antygenów grupy krwi A dodanych do erytrocytów (Revercells). Antyserum poddaje się rozcieńczeniom seryjnym w 96-dołkowej mikro płytce titracyjnej z wypukłym dnem (U-bottom), do której dodawana jest zawiesina Revercells. Próbki są mieszane, a następnie inkubowane w temperaturze 37°C przez 60 minut. Po tym czasie próbki można łatwo ocenić pod kątem reakcji hemaglutynacji ujemnych (-ve), dodatnich (+ve) oraz pośrednich (-/+). Podejście to pozwala na ocenę reaktywności i miana próbki surowicy przy użyciu szybkiej i prostej techniki. Film obejmuje teorię stojącą za testem, sposób odczytu i interpretacji wyników, metodę wyznaczania miana, możliwości modyfikacji testu oraz problemy związane z zastosowaniem tej techniki.

Hemaglutynacja jest rodzajem aglutynacji, w której przeciwciała wiążą się z erytrocytami. Erytrocyty są łatwo dostępne, a wyniki można łatwo zaobserwować gołym okiem. Ten film prezentuje etapy przeprowadzania testu hemaglutynacji, interpretację wyników oraz wyznaczanie miana.

Oznaczanie reaktywności i miana surowicy za pomocą testu hemaglutynacji

Hemaglutynacja jest specyficzną formą aglutynacji i jest stosowana w sytuacjach, gdy przeciwciała wiążą się z erytrocytami, które pełnią rolę antygenu cząsteczkowego. Krwinki czerwone...

Oznaczanie reaktywności i miana surowicy za pomocą testu hemaglutynacji. Hemaglutynacja to reakcja zachodząca pomiędzy rozpuszczalnymi przeciwciałami a antygenami cząsteczkowymi. Mogą to być komórki lub cząsteczki nośnikowe.Epitopy na powierzchni nośnika umożliwiają przeciwciałom wiązanie i sieciowanie nośników, co prowadzi do powstania złożonej sieci zwanej kompleksem antygen-przeciwciało. Hemaglutynacja jest specyficzną formą aglutynacji, w której przeciwciała wiążą się z erytrocytami, które pełnią rolę antygenu cząsteczkowego. Erytrocyty są użytecznymi celami, ponieważ są łatwo dostępne, a wyniki można bez trudu zaobserwować gołym okiem.Próbki surowicy poddaje się rozcieńczaniu seryjnem, a następnie przenosi do płytki UBO z 96 dołkami. Następnie dodaje się zawiesinę erytrocytów. Gdy przeciwciała występują w wysokim stężeniu, dochodzi do ich wiązania z erytrocytami, co prowadzi do powstania rozbudowanej sieci.W miarę jak sieć ta osiada pod wpływem grawitacji, przyjmuje kształt płytki ubo. Patrząc z góry, widoczna jest szeroka warstwa erytrocytów. Jest to dodatnia reakcja hemaglutynacyjna.Gdy poziomy przeciwciał są niskie, sieć nie może się utworzyć, a erytrocyty przyjmują kształt płytki UBO i koncentrują się u podstawy, tworząc mały osad. Jest to ujemna reakcja hemaglutynacji. Ten schemat przedstawia reakcję dodatnią.Komórki, osiadając, tworzą sieć, dostosowując się do kształtu płytki z dnem w kształcie litery U. Po lewej i prawej stronie widoczny jest widok z góry, na którym widać szeroką warstwę erytrocytów. W przypadku obecności umiarkowanej ilości przeciwciał, zaobserwowana zostanie formacja przypominająca litery.Aglutynacja hemoglobiny pozwala również na badanie reaktywności różnych próbek surowicy względem znanego antygenu. Można również wyznaczyć miano próbki surowicy. Miano to ostatnie rozcieńczenie, przy którym zaobserwowano reakcję dodatnią.Zazwyczaj im wyższe stężenie przeciwciał w próbce surowicy, tym wyższy miano. Ten schemat przedstawia ujemną reakcję hemaglutynacji. Obecność przeciwciał jest niewystarczająca do sieciowania erytrocytów.W miarę jak komórki osiadają pod wpływem grawitacji, przesuwają się wzdłuż ścianki dołka, tworząc na dnie zwarty pellet. Schemat po prawej stronie przedstawia erytrocyty widziane z góry. Do tego eksperymentu będzie potrzebna jedna płytka 96-dołkowa z dnem w kształcie litery U.Niezbędne jest użycie płytek z dnem w kształcie litery U, ponieważ płytki z płaskim dnem nie pozwolą na sedymentację komórek w pellet, co uniemożliwi interpretację wyników. Pipetą należy nanieść 50 µL surowicy testowej, 1% zawiesiny komórek Riva oraz roztwór buforu soli PBS do każdej studzienki w rzędzie. Do studzienek od 1 do 12 należy nanieść 50 µL buforu soli PBS.Służy on jako rozcieńczalnik. Teraz należy nanieść 50 µL surowicy do dołka A1. Jest to pierwsze rozcieńczenie dwukrotne.Używając mieszadła, należy upewnić się, że próbka surowicy jest dokładnie wymieszana. Po wymieszaniu odpipuj 50 µL z dołka A1 i przenieś do dołka A2. Jest to drugie rozcieńczenie 1:2, co daje końcowe rozcieńczenie czterokrotne.Kontynuuj tę serię rozcieńczeń, korzystając z dołków od trzeciego do jedenastego. Do dołka 12 nie dodawaj żadnego surowicy, ponieważ służy on jako ujemna kontrola z roztworem soli fizjologicznej. Następnie pobierz 50 µL dokładnie wymieszanej 1% zawiesiny komórek Riva i przenieś do dołków od A1 do A12.Po dodaniu komórek przykryć płytkę i delikatnie nią stuknąć, aby zapewnić wymieszanie próbek i komórek. Następnie inkubować w temperaturze 37°C przez 60 minut. Odpowiedni będzie inkubator z nawilżaniem.Podczas 60 minutowego okresu inkubacji będą zachodzić oddziaływania antygen-przeciwciało, a komórki zaczną osiadać. Wyświetlany materiał wideo to film poklatkowy z całego 60 minutowego okresu. Jest to zbliżenie na dołki od piątego do dziesiątego.Zbadaliśmy już studni środkową 12, która w tym doświadczeniu służyła jako kontrola VBS. Komórki utworzyły zwarty osad, co wskazuje na prawidłowe działanie testu. Studnie pięć i sześć są przykładami pozytywnej hemaglutynacji.Studnia numer siedem stanowi przykład pośredniego wyniku aglutynacji, natomiast studnie osiem, dziewięć i 10 są ujemne pod kątem hemaglutynacji. Na podstawie tego wyniku miano zostanie określone na podstawie rozcieńczenia dla studni numer siedem, ponieważ była to ostatnia studnia, w której zaobserwowano reakcję dodatnią.

determining-reactivity-titre-serum-using-haemagglutination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Oznaczanie reaktywności i tytru surowicy za pomocą testu oznaczania aglutynacji krwinek czerwonych

Opracowano prostą metodę slot blot do ilościowego oznaczania hemaglutyniny i neuraminidazy wirusa grypy przy użyciu uniwersalnych przeciwciał skierowanych przeciwko ich najbardziej konserwatywnym sekwencjom, zidentyfikowanym za pomocą analiz bioinformatycznych. To innowacyjne podejście może stanowić przydatną alternatywę dla ilościowego określania wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusowych.

Analizy ilościowe wszystkich hemaglutynin i neuraminidaz wirusa grypy typu A z wykorzystaniem uniwersalnych przeciwciał w prostych testach slot blot

Film demonstruje test hamowania hemaglutynacji do wykrywania przeciwciał surowicy przeciwko określonym antygenom. Potwierdzenie zahamowania hemaglutynacji w studzience testowej i hemaglutynacji w studzience kontrolnej uzyskuje się za pomocą wyraźnych wzorców wizualnych. Test ten odgrywa kluczową rolę w ocenie odpowiedzi immunologicznej, skuteczności szczepionki i badaniu infekcji wirusowych w wirusologii i immunologii.

Test zahamowania hemaglutynacji w celu wykrycia przeciwciał w surowicy przeciwko antygenowi docelowemu

Ten film demonstruje testy mikroneutralizacji do pomiaru przeciwciał neutralizujących za pomocą komórek nerki Madin-Darby Canine nadekspresji kwasu sjalowego związanego z α2,6 w surowicy ludzkiej. Ten test jest często stosowany w badaniach serologicznych grypy u...

Test mikroneutralizacji do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących w surowicy ludzkiej

Ten film pokazuje test mierzący miano przeciwciał influenza neuraminidazy (NA) w próbce surowicy. Próbkę surowicy zawierającą przeciwciała przeciwko NA dodaje się do płytki mikrodołkowej pokrytej fetuiną. Po dodaniu wirusa przeciwciała zapobiegają rozszczepianiu przez wirusa NA fetuiny i odsłanianiu jej ugrupowania galaktozy. Następnie dodaje się lektynę sprzężoną z peroksydazą, która wiąże się z odsłoniętą galaktozą. Miano przeciwciał hamujących NA określa się za pomocą testu...

Test do pomiaru miana przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy

Opisujemy test lektyny sprzężony z enzymem (ELLA) do pomiaru miana przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy (NA) w surowicach. Test wykorzystuje aglutyninę z orzeszków ziemnych do ilościowego określenia reszt galaktozy, które stają się dostępne, gdy NA usuwa kwas sjalowy z 96-dołkowych płytek pokrytych fetuiną.

Pomiar mian przeciwciał hamujących neuraminidazę grypy za pomocą testu lektyny sprzężonej z enzymem

Przedstawione protokoły opisują, jak przeprowadzić test hamowania hemaglutynacji w celu ilościowego określenia miana przeciwciał specyficznych dla grypy z próbek surowicy biorców szczepionki przeciw grypie. Pierwszy test określa optymalne stężenia antygenu wirusowego za pomocą hemaglutynacji. Drugi test określa ilościowo miana przeciwciał swoistych dla grypy poprzez hamowanie hemaglutynacji.

Zoptymalizowany test hamowania hemaglutynacji (HI) do ilościowego określania mian przeciwciał specyficznych dla grypy

Opisujemy metodę pomiaru aktywacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc przez przeciwciała skierowane przeciwko hemaglutyniny wirusa grypy. Test ten można również dostosować do oceny zdolności przeciwciał monoklonalnych lub surowic poliklonalnych ukierunkowanych na inne glikoproteiny powierzchniowe wirusa do indukowania odporności zależnej od Fc.

Metoda oceny funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc indukowanych przez przeciwciała specyficzne dla hemaglutyniny grypy

Przeciwciała neutralizujące grypę korelują z ochroną przed infekcjami grypowymi. Testy mikroneutralizacji mierzą przeciwciała neutralizujące w surowicach ludzkich i są często stosowane w serologii grypy u ludzi. Opisujemy test mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1 do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących wobec współczesnych wirusów 3C.2a i 3C.3a A(H3N2) po szczepieniu lub zakażeniu grypą.

Pomiar odpowiedzi przeciwciał neutralizujących grypę na wirusy A(H3N2) w surowicach ludzkich za pomocą testów mikroneutralizacji z wykorzystaniem komórek MDCK-SIAT1

Ten artykuł przedstawia uproszczoną metodę przygotowania 4 jednostek hemagglutynacji antygenu do testów serologicznych wirusa rzekomego pomoru drobiu. Dzięki dokładnemu określeniu miana hemaglutynacji antygenu, w połączeniu z bardziej rygorystyczną metodą miareczkowania wstecznego i dobrze zdefiniowanym procesem regulacji, zwiększa wydajność testu, zmniejsza liczbę wyników fałszywie dodatnich i poprawia nadzór nad chorobami u drobiu.

Optymalizacja preparatu antygenowego do oznaczania hamowania hemaglutynacji wirusa rzekomego pomoru drobiu

Droga klasyczna jest aktywowana przez przeciwciała i kończy się lizą komórki docelowej. Test CH50 pozwala na pomiar aktywności dopełniacza w próbce surowicy. Niniejsze wideo przedstawia etapy wyznaczania wartości CH50 w próbce surowicy, sposób obliczeń oraz interpretację wyników.

Pomiar 50% aktywności hemolitycznej dopełniacza (CH50) w surowicy

Poznaj test hemaglutynacji do oznaczania reaktywności i miana przeciwciał w surowicy. Metoda wykorzystuje płytki U-bottom i rozcieńczenia szeregowe do szybkiej oceny wyników immunologicznych.

Oznaczanie reaktywności i miana surowicy za pomocą testu hemaglutynacji

Przeglądaj więcej filmów