Name: Preparacja i hodowla neuronów spoidła z embrionalnego rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-25T17:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Naucz się izolować i hodować neurony spoidła z E13 rdzenia kręgowego szczura. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów wzrostu i prowadzenia aksonów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została wsparta grantami z Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Peter Lougheed Medical Research Foundation, McGill Program in Neuroengineering, Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) oraz Canada Foundation for Innovation (CFI). Sébastien D. Langlois otrzymał wsparcie w ramach Master's Training Award z Fonds de la recherché en santé du Québec (FRSQ) oraz Frederick Banting and Charles Best Canada Graduate Scholarships Master's Award z Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Dziękujemy Jessica M.T. Pham za pomoc w przygotowaniu rycin.

<ol><li>Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. , 113-1111 (2003).</li>
<li>Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+ipsilateral+retinal+ganglion+cell+axons+at+the+optic+chiasm+requires+the+Shh+Receptor+Boc%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc.</a> Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).</li>
<li>Helms, A. W., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitors+of+dorsal+commissural+interneurons+are+defined+by+MATH1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression.</a> Development. 125, 919-928 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boc+is+a+receptor+for+sonic+hedgehog+in+the+guidance+of+commissural+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons.</a> Nature. 444, 369-373 (2006).</li>
<li>Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+guides+axons+through+a+noncanonical%2C+Src-family-kinase-dependent+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway.</a> Neuron. 62, 349-362 (2009).</li>
</ol>

Opisaliśmy metodę wyizolowania i hodowli neuronów komisuralnych z embrionalnego rdzenia kręgowego szczura. Procedura ta jest rutynowo stosowana w naszym laboratorium do niezawodnego przygotowywania neuronów w celu badania komórkowych i molekularnych mechanizmów prowadzenia aksonów. W przypadku eksperymentów z zakresu biologii komórki i immunochemii, preparaty z jednego miotu dostarczają wystarczającej liczby neuronów. Gdy wymagana jest większa liczba komórek, na przykład w wielu eksperymentach biochemicznych, konieczne m...

<table><tbody><tr><td>pożywka Neurobasal, płyn</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>Zobacz przepisy i komentarze</td></tr><tr><td>suplement B27 50X</td><td>Invitrogen</td><td>17504</td><td>Zobacz przepisy i uwagi</td></tr><tr><td>0,01% roztwór poli-L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>pożywka L-15, proszek</td><td>Invitrogen</td><td>41300-070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 2,5% (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I, 25000 U/mL</td><td>Worthington Biochemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-wolny</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM, roztwór</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>Zobacz przepisy i uwagi</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Disekcja grzbietowej części rdzenia kręgowego embrionalnego szczura (patrz również Tabela I)&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;szczur w 13. dniu ciąży (E13)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Etanol 70%&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Nożyczki chirurgiczne, Fine Science Tools&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Pinceta, Dumont #5, Fine Science Tools&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Szalki Petriego&lt;/li&gt;&lt;li&gt;pożywka L-15&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Mikroskop stereoskopowy, Leica&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Plastikowe pipety transferowe&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Mikronożyczki, Fine Science Tools&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Igły wolframowe i uchwyty do pinów (jedna igła w kształcie haczyka, jedna igła w kształcie litery L, jedna igła prosta), Fine Science Tools&lt;/li&gt;&lt;li&gt;surowica konia inaktywowana termicznie (HiHS)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;plastikowe probówki 15 ml&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Kultura neuronów komisuralnych (patrz również Tabela I)&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Inkubatory do hodowli tkankowych (37&amp;#x00B0;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, z kontrolowaną wilgotnością)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;szklane laminki German Desag i/lub plastikowe szalki do hodowli tkankowych&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Poly-L-lizyna, Sigma&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Sterylna woda Milli-Q&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Neurobasal, Invitrogen&lt;/li&gt;&lt;li&gt;inaktywowana ciepłem płodowa surowica bydlęca (HiFBS)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;L-glutamina&lt;/li&gt;&lt;li&gt;B27, Invitrogen&lt;/li&gt;&lt;li&gt;antybiotyki penicylina/streptomycyna&lt;/li&gt;&lt;li&gt;37&amp;#x00B0;łaźnia wodna C&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Sterylne pipety Pasteura&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Palnik Bunsena&lt;/li&gt;&lt;li&gt;HBSS, Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-free, Invitrogen&lt;/li&gt;&lt;li&gt;DNaza, Worthington&lt;/li&gt;&lt;li&gt;MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Wirówka&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Hemacytometr&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Roztwór błękitu trypanu&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

disekcja i hodowla neuronów komisuralnych z embrionalnego rdzenia kręgowego

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Neurony komisuralne są szeroko wykorzystywane do badania mechanizmów leżących u podstaw prowadzenia aksonów podczas embrionalnego rozwoju rdzenia kręgowego. Ciała komórkowe tych neuronów znajdują się w grzbietowej części rdzenia kręgowego, a ich aksony podążają stereotypowymi trajektoriami w trakcie rozwoju embrionalnego. Aksony komisuralne początkowo kierują się brzusznie w stronę płyty dna. Po przekroczeniu linii środkowej aksony te skręcają przednio i kierują się w stronę mózgu. Każdy z tych etapów jest regulowany przez działanie kilku sygnałów prowadzących. Kultury silnie wzbogacone w neurony komisuralne są idealnie dostosowane do wielu eksperymentów dotyczących mechanizmów wyznaczania drogi przez aksony, w tym testów skrętu, immunochemii i biochemii. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji i hodowli neuronów komisuralnych z grzbietowej części rdzenia kręgowego szczura w 13. dniu embrionalnym (E13). Najpierw izoluje się rdzeń kręgowy i wycina paski tkanki grzbietowej. Następnie tkankę grzbietową dysocjuje się do postaci zawiesiny komórkowej poprzez trypsynizację i rozbicie mechaniczne. Neurony wysiewa się na szkiełka podstawowe lub naczynia hodowlane pokryte poli-L-lizyną. Po 30 godzinachin vitro, większość neuronów wytworzyła akson. Czystość hodowli (Yamet al.2009), zazwyczaj powyżej 90%, można ocenić za pomocą immunoznakowania markerami neuronów komisuralnych DCC, LH2 oraz TAG1 (Helms i Johnson, 1998). Ta preparatka neuronalna stanowi użyteczne narzędzie doin vitrobadania nad komórkowymi i molekularnymi mechanizmami wzrostu i prowadzenia aksonów komisuralnych podczas rozwoju rdzenia kręgowego.

W tym filmie zaprezentowano metodę preparowania i hodowli neuronów komisuralnych z grzbietowej części rdzenia kręgowego szczura w 13. dniu embrionalnym (E13). Dysocjowane neurony komisuralne są użyteczne w badaniu komórkowych i molekularnych mechanizmów wzrostu i prowadzenia aksonów.

Disekcja i hodowla neuronów komisuralnych z embrionalnego rdzenia kręgowego

Neurony komisuralne są szeroko wykorzystywane do badania mechanizmów leżących u podstaw prowadzenia aksonów podczas embrionalnego rozwoju rdzenia kręgowego. Ciała komórkowe ...

W tym filmie zaprezentowano metodę wyizolowania i hodowli neuronów choralnych z zarodkowego rdzenia kręgowego. Procedura rozpoczyna się od pobrania embrionów szczura w 13. dniu rozwoju (E 13), a następnie wycięcia rdzeni kręgowych. Podczas sekcji rdzenie kręgowe są otwierane wzdłuż płytki dachowej i przygotowywane w konfiguracji rozwartej książki.Paski tkanki grzbietowej są wycinane i zbierane do probówki. Tkankę grzbietową dysocjuje się do postaci zawiesiny pojedynczych komórek za pomocą trypsyny oraz rozdrabniania mechanicznego. Neurony komisuralne są następnie hodowane na szkiełkach nakrywkowych lub naczyniach hodowlanych pokrytych polilizyną.Można je następnie wykorzystać do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów wzrostu i prowadzenia aksonów. Cześć, jestem Sebastian z Laboratorium Biologii Molekularnej Rozwoju Neuronalnego w Instytucie Badań Klinicznych w Montrealu. Cześć, jestem Steve Moen, również z Laboratorium Biologii Molekularnej Rozwoju Neuronalnego.Dzisiaj przedstawimy procedurę wyizolowania i hodowli neuronów komisuralnych z embrionalnego rdzenia kręgowego. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów prowadzenia aksonów. Zatem zacznijmy.Dzisiaj rdzenie kręgowe zostaną wypreparowane z nowo pobranych embrionów szczura w 13. dniu rozwoju (E 13), które podczas całej procedury będą umieszczone w naczyniu z pożywką L 15. Ważne jest, aby embriony i roztwory przechowywać w lodzie. Należy pamiętać, że na wszystkich etapach preparowania kluczowe jest, aby nie rozciągać rdzenia kręgowego, ponieważ może to utrudnić wyizolowanie w pełni nienaruszonego rdzenia.Pod mikroskopem stereoskopowym oddziel zarodek od wszystkich tkanek pozazarodkowych i błon zarodkowych. Następnie umieść jeden zarodek w naczyniu do sekcji. Używając mikronožyczek, odetnij głowę oraz tylne części pod kątami pokazanymi tutaj.Pozwoli to na stworzenie płaskiej powierzchni, która pomoże w odpowiednim ułożeniu zarodka, zapewniając łatwy dostęp do rdzenia kręgowego. Umieść zarodek stroną brzuszną do dołu, tak aby koniec przedni był skierowany od badacza. Użyj pęsety, aby mocno przytwierdzić zarodek do podłoża z jednej strony.Nie ściskaj ani nie puszczaj pęsety, w przeciwnym razie tkanka zostanie rozerwana przez drugą parę pęset. Chwyć skórę z boku rdzenia kręgowego. Rozsuń końcówki pęsety trzymającej.Odsłoń skórę pokrywającą grzbiet zarodka, aby odsłonić rdzeń kręgowy otoczony oponami, i częściowo oddziel tkankę znajdującą się po prawej stronie rdzenia kręgowego. Używając zamkniętej pęsety, nakłuwaj tkankę, zaczynając od poziomu pęsety mocującej. Staraj się dotrzeć jak najbliżej rdzenia kręgowego, nie dotykając go.Powtórz tę czynność kilkakrotnie wzdłuż rdzenia kręgowego. Pozwoli to na przytwierdzenie niektórych zwojów korzeni grzbietowych i uszkodzenie organów brzusznych. Pozostaw nieco tkanki przy końcach przednim i tylnym, zaczynając od końca przedniego.Używając wolframowej igły w kształcie haka, przetnij oponu i otwórz rdzeń kręgowy wzdłuż płytki dachowej. Obróć embrion o 180 stopni i usuń tkankę z pozostałej strony, stosując tę samą metodę.Następnie całkowicie oddziel tkankę po lewej stronie rdzenia kręgowego – po tej stronie, która została wcześniej naruszona, pierwotnie po prawej. Połóż rdzeń kręgowy na boku i za pomocą pęsety usuń większość pozostałej tkanki mezenchymalnej oraz zwoje korzeni grzbietowych. Użyj pęsety, aby odwarstwić krótki płat opon mózgowo-rdzeniowych. Na tym etapie opony i rdzeń kręgowy tworzą dwie warstwy tkanki ułożone warstwowo.Za pomocą pęsety przytrzymaj większą część rdzenia kręgowego na końcu przednim. Chwyć dwa oddzielone segmenty pęsetą i odwarstw opony mózgowo-rdzeniowe. Czynność tę należy wykonywać płynnym, jednostajnym ruchem, ponieważ nierównomierne odwarstwianie może doprowadzić do przerwania warstwy opon lub uszkodzenia rdzenia kręgowego.Jeśli warstwa opon podczas wyciągania ulegnie przerwaniu, część rdzenia kręgowego pozostająca przytwierdzona do opon jest zazwyczaj nie do odzyskania, choć czasami jest to możliwe. Przed przystąpieniem do obróbki kolejnych embrionów, należy za pomocą plastikowej pipety ostrożnie przenieść wyizolowany rdzeń kręgowy do naczynia z pożywką L 15 z 10% inaktywowaną ciepłem surowicą konia, umieszczonego w lodzie.Należy pamiętać o wymianie medium w naczyniu do sekcji na schłodzony L 15, aby utrzymać niską temperaturę embrionu i pomóc zachować integralność tkanki. Przed przystąpieniem do sekcji grzbietowej części rdzenia kręgowego należy pobrać rdzenie kręgowe ze wszystkich embrionów. Aby rozpocząć sekcję grzbietową, umieść jeden świeżo wyizolowany rdzeń kręgowy w szalce Petri zawierającej L 15 z 10% inaktywowaną termicznie surowicą konia.Odetnij szerszą część przednią, która obejmuje fragment mózgu tylnego. Następnie rozłóż rdzeń kręgowy na płasko, rozwierając go jak otwartą książkę. Tkanka grzbietowa znajduje się w najbardziej bocznych częściach rozwartego rdzenia. Unieruchamiając rdzeń prostą igłą wolframową, użyj L-kształtnej igły wolframowej, aby wyciąć pasek o szerokości wynoszącej około jednej piątej szerokości połowy rdzenia kręgowego; wycięcie szerszych pasków zwiększy wydajność, ale zmniejszy czystość hodowli.Przenieś kilka pasków grzbietowych do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej pożywkę L 15 z 10% surowicą końską i umieść probówkę w lodzie. Pozostała część procedury będzie odbywać się w pobliżu lub wewnątrz komory do hodowli tkanek. W przypadku tych hodowli ważne jest wcześniejsze przygotowanie roztworów i sprzętu, zazwyczaj przed sekcją.Krok tacji wykorzystuje wypalane w ogniu pipety z pasty w dwóch rozmiarach: jedną o średnicy stanowiącej połowę rozmiaru pierwotnego oraz drugą o nieco mniejszej średnicy. Przed rozpoczęciem należy pokryć obie wypalane pipety pożywką zawierającą surowicę, odsysając pożywkę do wnętrza pipet i pozostawiając ją na 30 sekund. Pozwoli to zmniejszyć liczbę komórek przylegających do szkła podczas tacji.Zacznij od sprawdzenia, czy paski grzbietowe opadły na dno probówki. W komorze z laminarnym przepływem powietrza usuń większość nadosadu SUP za pomocą pipety automatycznej. Szybko przemyj próbkę trzema mililitrami zimnego HBSS pozbawionego magnezu i wapnia.Pozostaw pasek grzbietowy rurki neuralnej na dwie minuty, aby osiadł. Następnie usuń HBSS za pomocą pipety. Uzupełnij objętość do 4,7 milliliters.Do ciepłego roztworu HBSS dodać 0,3 ml 2,5% trypsyny, aby uzyskać stężenie końcowe 0,15% trypsyny, delikatnie wymieszać i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez siedem minut. W połowie czasu inkubacji delikatnie wymieszać zawiesinę raz. Po zakończeniu inkubacji dodać DNazę do stężenia końcowego 150 jednostek/ml oraz siarczan magnezu do stężenia końcowego 0,15% i krótko wymieszać.Przekroje grzbietowej części cewy nerwowej powinny być teraz pofragmentowane. Wirować fragmenty tkanki przy 200 G przez cztery minuty. Usunąć nadsącz za pomocą pipety, pozostawiając około 50 do 100 µL płynu na dnie probówki.Delikatnie stuknij probówkę, aby rozluźnić pellet. Następnie wypłucz komórki, dodając pięć mililitrów ciepłego HBSS. Pozostaw komórki do osiadania w temperaturze pokojowej przez dwie minuty.Odwirować i ponownie wypłukać komórki. Tym razem resuspender je w dwóch mililitrach ciepłego HBSS. Używając pipety ogniowo polerowanej o połowie średnicy, utrzeć komórki, powoli pipetując w górę i w dół od czterech do sześciu razy, kierując strumień cieczy w stronę ścianki probówki, aby rozbić większe skupiska i ograniczyć obumieranie komórek.Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza i nie doprowadzić do nadmiernego napowietrzenia. Aby dalej dysocjować komórki, należy użyć najmniejszej końcówki z polerowanego szkła i powoli pipetować zawiesinę w górę i w dół trzy do czterech razy w ten sam sposób. Nie ma potrzeby dysocjowania wszystkich skupisk komórek, ponieważ martwe komórki i detrytus mają tendencję do tworzenia agregatów.Pozostaw fragmenty tkanki na jedną minutę, aby osiadły. Następnie pobierz 20 µL nadsączu SUP, które powinno zawierać zawieszone komórki do zliczenia w analizatorze HemoSoter; neurony powinny wykazywać co najmniej 95% żywotności w teście z błękitem trypanu. Neurony w medium Neurobasal do wysiewania powinny znajdować się w stężeniu odpowiednim dla danej aplikacji.Po 16–18 godzinach wymienić pożywkę na pożywkę wzrostową neural basal growth media, aby uniknąć oderwania komórek. Pożywkę z neuronami należy usuwać delikatnie za pomocą pipety, zamiast odsysać ją pompą próżniową. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki dla izolowanych neuronów komisuralnych wysianych na szkiełka podstawowe pokryte PLL; cztery godziny po wysianiu neurony przylegają do powierzchni, a obraz pochodzi z 30 godzin po wysianiu.Większość neuronów posiada wydłużone aksony z widocznym stożkiem wzrostu. Neurony te mogą być łatwo wykorzystane w eksperymentach z immunofluorescencją. W tym przykładzie mikrotubule są znakowane kolorem zielonym, aktyna kolorem czerwonym, a NA kolorem niebieskim.Właśnie zaprezentowaliśmy sposób wyizolowania i hodowli neuronów komisuralnych z embrionalnych rdzeni kręgowych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że czystość neuronów komisuralnych zależy od grubości wyciętego paska grzbietowego. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

dissection-culture-commissural-neurons-from-embryonic-spinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Sekcja i hodowla neuronów komisuralnych z zarodkowego rdzenia kręgowego

Niniejszy test ocenia zdolność cząsteczki sygnałowej, w tym przypadku białka morfogenetycznego kostnego 7 (BMP7), do zmiany kierunku wzrostu aksonów komisuralnych. Eksplant embrionalnego grzbietowego rdzenia kręgowego jest hodowany obok agregatu komórek COS wydzielających badane czynniki wzrostu. Zmiana kierunku wzrostu aksonów komisuralnych w obrębie eksplantu jest wizualizowana za pomocą immunohistochemii.

Ocena zdolności rozpuszczalnych cząsteczek sygnałowych do zmiany orientacji embrionalnych aksonów komisuralnych rdzenia kręgowego

Demonstrujemy sposób wycinania i hodowli eksplantów zwoju statoakustycznego w dniu E4 oraz rdzenia kręgowego w dniu E6 zarodka kurczaka. Eksplanty są hodowane w warunkach bezsurowiczych w trójwymiarowych żelach kolagenowych przez 24 godziny. Reaktywność neurytów jest badana przy użyciu pożywki uzupełnionej o czynniki wzrostu oraz koralików pokrytych białkiem.

Disekcja i hodowla eksplantów zrazustatoakustycznego i rdzenia kręgowego kurczaka w żelach kolagenowych do testów wzrostu neurytów

Film pokazuje izolację neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych od transgenicznego zarodka myszy. Zarodek wykazuje ekspresję neuronów ruchowych znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w celu łatwej wizualizacji i identyfikacji. Neurony ruchowe są chirurgicznie izolowane pod mikroskopem fluorescencyjnym i utrzymywane w pożywce hodowlanej.

Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych z zarodka myszy

Kultury Slice ułatwiają manipulowanie rozwojem zarodka za pomocą zaburzeń genowych i farmakologicznych. Jednakże warunki hodowli muszą zapewniać, że normalny rozwój może przebiegać w ograniczonym środowisku wycinka. Ilustrujemy protokół, który ułatwia prawidłowy rozwój rdzenia kręgowego, aby przebiegał przez co najmniej 24 godziny.

Protokół hodowli plastrów rdzenia kręgowego zarodków kurczaka

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Płyta podłogowa jest kluczową strukturą rozwijającego się rdzenia kręgowego, dostarczającą dyfuzyjnych sygnałów do progenitorów i różnicujących neurony. Opisujemy metodę wytwarzania pożywki kondycjonowanej płytką podłogową, stosowania jej do świeżej tkanki rdzenia kręgowego oraz oceny wpływu na białka będące przedmiotem zainteresowania przez biochemię.

Hodowla izolowanej tkanki płytki podłogowej i produkcja kondycjonowanej pożywki w celu oceny właściwości funkcjonalnych sygnałów uwalnianych przez płytkę podłogową

Minogi odzyskują lokomocję po całkowitym urazie rdzenia kręgowego. Jednak niektóre neurony projekcji rdzeniowej są dobrymi regeneratorami, a inne nie. W artykule przedstawiono techniki przetrzymywania larw minoga morskiego (i niedawno przekształconych osobników dorosłych), wytwarzania kompletnych przekrojów rdzenia kręgowego oraz przygotowania całych mózgów i rdzeni kręgowych do hybrydyzacji in situ.

Kompletny protokół uszkodzenia rdzenia kręgowego i rozwarstwienia mózgu w celu późniejszej hybrydyzacji in situ u larw minoga morskiego

Modele hodowli komórkowych zapewniają szczegółową kontrolę nad warunkami środowiskowymi, a tym samym stanowią potężną platformę do wyjaśnienia wielu aspektów biologii komórek neuronalnych. Opisujemy szybką, niedrogą i niezawodną metodę izolacji, dysocjacji i hodowli neuronów czuciowych z zarodków piskląt. Podano również szczegółowe informacje na temat przygotowania podłoża i immunocytochemii.

Izolacja i hodowla zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodków piskląt

Tutaj prezentujemy protokół, który opiera się na wycinkach rdzenia kręgowego hodowanych na układach wieloelektrodowych w celu zbadania funkcjonalnej regeneracji połączeń propriordzeniowych in vitro.

Badanie regeneracji funkcjonalnej w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na matrycach wieloelektrodowych

To badanie przedstawia technikę izolacji neuronów od noworodków myszy WT. Wymaga starannego wypreparowania rdzenia kręgowego od noworodka myszy, a następnie oddzielenia neuronów od tkanki rdzenia kręgowego poprzez mechaniczne i enzymatyczne rozszczepienie.

Izolacja i hodowla neuronów rdzenia kręgowego od nowonarodzonych myszy

Ta praca przedstawia protokół do uzyskania jednorodnych kultur komórkowych pierwotnych neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych. Kultury te można wykorzystać do analiz porównawczych cech morfologicznych, komórkowych, molekularnych i elektrofizjologicznych neuronów ruchowych oka i rdzenia.

Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych myszy transgenicznych z grupy prenatalnej mn:GFP

Naucz się izolować i hodować neurony spoidła z E13 rdzenia kręgowego szczura. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów wzrostu i prowadzenia aksonów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

Disekcja i hodowla neuronów komisuralnych z embrionalnego rdzenia kręgowego

Przeglądaj więcej filmów