Disekcja i hodowla neuronów komisuralnych z embrionalnego rdzenia kręgowego

W tym filmie zaprezentowano metodę wyizolowania i hodowli neuronów choralnych z zarodkowego rdzenia kręgowego. Procedura rozpoczyna się od pobrania embrionów szczura w 13. dniu rozwoju (E 13), a następnie wycięcia rdzeni kręgowych. Podczas sekcji rdzenie kręgowe są otwierane wzdłuż płytki dachowej i przygotowywane w konfiguracji rozwartej książki.

Paski tkanki grzbietowej są wycinane i zbierane do probówki. Tkankę grzbietową dysocjuje się do postaci zawiesiny pojedynczych komórek za pomocą trypsyny oraz rozdrabniania mechanicznego. Neurony komisuralne są następnie hodowane na szkiełkach nakrywkowych lub naczyniach hodowlanych pokrytych polilizyną.

Można je następnie wykorzystać do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów wzrostu i prowadzenia aksonów. Cześć, jestem Sebastian z Laboratorium Biologii Molekularnej Rozwoju Neuronalnego w Instytucie Badań Klinicznych w Montrealu. Cześć, jestem Steve Moen, również z Laboratorium Biologii Molekularnej Rozwoju Neuronalnego.

Dzisiaj przedstawimy procedurę wyizolowania i hodowli neuronów komisuralnych z embrionalnego rdzenia kręgowego. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów prowadzenia aksonów. Zatem zacznijmy.

Dzisiaj rdzenie kręgowe zostaną wypreparowane z nowo pobranych embrionów szczura w 13. dniu rozwoju (E 13), które podczas całej procedury będą umieszczone w naczyniu z pożywką L 15. Ważne jest, aby embriony i roztwory przechowywać w lodzie. Należy pamiętać, że na wszystkich etapach preparowania kluczowe jest, aby nie rozciągać rdzenia kręgowego, ponieważ może to utrudnić wyizolowanie w pełni nienaruszonego rdzenia.

Pod mikroskopem stereoskopowym oddziel zarodek od wszystkich tkanek pozazarodkowych i błon zarodkowych. Następnie umieść jeden zarodek w naczyniu do sekcji. Używając mikronožyczek, odetnij głowę oraz tylne części pod kątami pokazanymi tutaj.

Pozwoli to na stworzenie płaskiej powierzchni, która pomoże w odpowiednim ułożeniu zarodka, zapewniając łatwy dostęp do rdzenia kręgowego. Umieść zarodek stroną brzuszną do dołu, tak aby koniec przedni był skierowany od badacza. Użyj pęsety, aby mocno przytwierdzić zarodek do podłoża z jednej strony.

Nie ściskaj ani nie puszczaj pęsety, w przeciwnym razie tkanka zostanie rozerwana przez drugą parę pęset. Chwyć skórę z boku rdzenia kręgowego. Rozsuń końcówki pęsety trzymającej.

Odsłoń skórę pokrywającą grzbiet zarodka, aby odsłonić rdzeń kręgowy otoczony oponami, i częściowo oddziel tkankę znajdującą się po prawej stronie rdzenia kręgowego. Używając zamkniętej pęsety, nakłuwaj tkankę, zaczynając od poziomu pęsety mocującej. Staraj się dotrzeć jak najbliżej rdzenia kręgowego, nie dotykając go.

Powtórz tę czynność kilkakrotnie wzdłuż rdzenia kręgowego. Pozwoli to na przytwierdzenie niektórych zwojów korzeni grzbietowych i uszkodzenie organów brzusznych. Pozostaw nieco tkanki przy końcach przednim i tylnym, zaczynając od końca przedniego.

Używając wolframowej igły w kształcie haka, przetnij oponu i otwórz rdzeń kręgowy wzdłuż płytki dachowej. Obróć embrion o 180 stopni i usuń tkankę z pozostałej strony, stosując tę samą metodę.

Następnie całkowicie oddziel tkankę po lewej stronie rdzenia kręgowego – po tej stronie, która została wcześniej naruszona, pierwotnie po prawej. Połóż rdzeń kręgowy na boku i za pomocą pęsety usuń większość pozostałej tkanki mezenchymalnej oraz zwoje korzeni grzbietowych. Użyj pęsety, aby odwarstwić krótki płat opon mózgowo-rdzeniowych. Na tym etapie opony i rdzeń kręgowy tworzą dwie warstwy tkanki ułożone warstwowo.

Za pomocą pęsety przytrzymaj większą część rdzenia kręgowego na końcu przednim. Chwyć dwa oddzielone segmenty pęsetą i odwarstw opony mózgowo-rdzeniowe. Czynność tę należy wykonywać płynnym, jednostajnym ruchem, ponieważ nierównomierne odwarstwianie może doprowadzić do przerwania warstwy opon lub uszkodzenia rdzenia kręgowego.

Jeśli warstwa opon podczas wyciągania ulegnie przerwaniu, część rdzenia kręgowego pozostająca przytwierdzona do opon jest zazwyczaj nie do odzyskania, choć czasami jest to możliwe. Przed przystąpieniem do obróbki kolejnych embrionów, należy za pomocą plastikowej pipety ostrożnie przenieść wyizolowany rdzeń kręgowy do naczynia z pożywką L 15 z 10% inaktywowaną ciepłem surowicą konia, umieszczonego w lodzie.

Należy pamiętać o wymianie medium w naczyniu do sekcji na schłodzony L 15, aby utrzymać niską temperaturę embrionu i pomóc zachować integralność tkanki. Przed przystąpieniem do sekcji grzbietowej części rdzenia kręgowego należy pobrać rdzenie kręgowe ze wszystkich embrionów. Aby rozpocząć sekcję grzbietową, umieść jeden świeżo wyizolowany rdzeń kręgowy w szalce Petri zawierającej L 15 z 10% inaktywowaną termicznie surowicą konia.

Odetnij szerszą część przednią, która obejmuje fragment mózgu tylnego. Następnie rozłóż rdzeń kręgowy na płasko, rozwierając go jak otwartą książkę. Tkanka grzbietowa znajduje się w najbardziej bocznych częściach rozwartego rdzenia. Unieruchamiając rdzeń prostą igłą wolframową, użyj L-kształtnej igły wolframowej, aby wyciąć pasek o szerokości wynoszącej około jednej piątej szerokości połowy rdzenia kręgowego; wycięcie szerszych pasków zwiększy wydajność, ale zmniejszy czystość hodowli.

Przenieś kilka pasków grzbietowych do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej pożywkę L 15 z 10% surowicą końską i umieść probówkę w lodzie. Pozostała część procedury będzie odbywać się w pobliżu lub wewnątrz komory do hodowli tkanek. W przypadku tych hodowli ważne jest wcześniejsze przygotowanie roztworów i sprzętu, zazwyczaj przed sekcją.

Krok tacji wykorzystuje wypalane w ogniu pipety z pasty w dwóch rozmiarach: jedną o średnicy stanowiącej połowę rozmiaru pierwotnego oraz drugą o nieco mniejszej średnicy. Przed rozpoczęciem należy pokryć obie wypalane pipety pożywką zawierającą surowicę, odsysając pożywkę do wnętrza pipet i pozostawiając ją na 30 sekund. Pozwoli to zmniejszyć liczbę komórek przylegających do szkła podczas tacji.

Zacznij od sprawdzenia, czy paski grzbietowe opadły na dno probówki. W komorze z laminarnym przepływem powietrza usuń większość nadosadu SUP za pomocą pipety automatycznej. Szybko przemyj próbkę trzema mililitrami zimnego HBSS pozbawionego magnezu i wapnia.

Pozostaw pasek grzbietowy rurki neuralnej na dwie minuty, aby osiadł. Następnie usuń HBSS za pomocą pipety. Uzupełnij objętość do 4,7 milliliters.

Do ciepłego roztworu HBSS dodać 0,3 ml 2,5% trypsyny, aby uzyskać stężenie końcowe 0,15% trypsyny, delikatnie wymieszać i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez siedem minut. W połowie czasu inkubacji delikatnie wymieszać zawiesinę raz. Po zakończeniu inkubacji dodać DNazę do stężenia końcowego 150 jednostek/ml oraz siarczan magnezu do stężenia końcowego 0,15% i krótko wymieszać.

Przekroje grzbietowej części cewy nerwowej powinny być teraz pofragmentowane. Wirować fragmenty tkanki przy 200 G przez cztery minuty. Usunąć nadsącz za pomocą pipety, pozostawiając około 50 do 100 µL płynu na dnie probówki.

Delikatnie stuknij probówkę, aby rozluźnić pellet. Następnie wypłucz komórki, dodając pięć mililitrów ciepłego HBSS. Pozostaw komórki do osiadania w temperaturze pokojowej przez dwie minuty.

Odwirować i ponownie wypłukać komórki. Tym razem resuspender je w dwóch mililitrach ciepłego HBSS. Używając pipety ogniowo polerowanej o połowie średnicy, utrzeć komórki, powoli pipetując w górę i w dół od czterech do sześciu razy, kierując strumień cieczy w stronę ścianki probówki, aby rozbić większe skupiska i ograniczyć obumieranie komórek.

Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza i nie doprowadzić do nadmiernego napowietrzenia. Aby dalej dysocjować komórki, należy użyć najmniejszej końcówki z polerowanego szkła i powoli pipetować zawiesinę w górę i w dół trzy do czterech razy w ten sam sposób. Nie ma potrzeby dysocjowania wszystkich skupisk komórek, ponieważ martwe komórki i detrytus mają tendencję do tworzenia agregatów.

Pozostaw fragmenty tkanki na jedną minutę, aby osiadły. Następnie pobierz 20 µL nadsączu SUP, które powinno zawierać zawieszone komórki do zliczenia w analizatorze HemoSoter; neurony powinny wykazywać co najmniej 95% żywotności w teście z błękitem trypanu. Neurony w medium Neurobasal do wysiewania powinny znajdować się w stężeniu odpowiednim dla danej aplikacji.

Po 16–18 godzinach wymienić pożywkę na pożywkę wzrostową neural basal growth media, aby uniknąć oderwania komórek. Pożywkę z neuronami należy usuwać delikatnie za pomocą pipety, zamiast odsysać ją pompą próżniową. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki dla izolowanych neuronów komisuralnych wysianych na szkiełka podstawowe pokryte PLL; cztery godziny po wysianiu neurony przylegają do powierzchni, a obraz pochodzi z 30 godzin po wysianiu.

Większość neuronów posiada wydłużone aksony z widocznym stożkiem wzrostu. Neurony te mogą być łatwo wykorzystane w eksperymentach z immunofluorescencją. W tym przykładzie mikrotubule są znakowane kolorem zielonym, aktyna kolorem czerwonym, a NA kolorem niebieskim.

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób wyizolowania i hodowli neuronów komisuralnych z embrionalnych rdzeni kręgowych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że czystość neuronów komisuralnych zależy od grubości wyciętego paska grzbietowego. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.