Pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli wyhodowane z eksplantatów

W tym artykule opisujemy protokół wzrostu i ekspansji ludzkich komórek nabłonka oskrzeli ze świeżo wyizolowanych ludzkich segmentów oskrzeli. Protokół ten składa się z pięciu sekcji, kodowania i drapania, stumilimetrowych płytek hodowlanych, naprawy tkanki oskrzeli, explan przeszczepów tkanki oskrzelowej, pasażu ludzkich komórek nabłonka oskrzeli rosnących w orzęskach, ludzkich komórek nabłonka oskrzeli na transwellach. Zanim zaczniesz, pamiętaj, że wszystkie kroki są wykonywane w szafie bezpieczeństwa biologicznego.

O ile nie zaznaczono inaczej, prosimy o zapoznanie się z sekcją dotyczącą materiałów, odczynników i przygotowania oraz upewnienie się, że są one odpowiednio przygotowane. Następujące kodowanie, kultura roztworu podstawowego, roztwory dysocjacyjne podłoża, powlekanie i drapanie. Stumilimetrowe płytki hodowlane należy wykonać w bst.

Utrzymuj wszystko w sterylności. Umieść sterylne stumilimetrowe płytki hodowlane i roztwór powlekający. W pipecie BST dwa młynki z roztworem powlekającym i stumilimetrowa płytka wirują, aby pokryć podstawę płytki.

Upewnij się, że roztwór powłokowy równomiernie pokrywa podstawę płytki. Odpipetować pozostały roztwór i użyć go do pokrycia drugiej stumilimetrowej płytki. Powtórz tę czynność dla tylu talerzy, ile potrzeba.

Liczba potrzebnych płytek różni się w zależności od liczby eksplantatów tkanek. Upewnij się, że roztwór powłokowy równomiernie pokrywa podstawę płyt. Jak wykazano.

Przykryj talerze Ich okładkami. Pozostawić płytki do wyschnięcia w inkubatorze na jedną do dwóch godzin, a przed użyciem odessać roztwór dostępowy Do oczyszczania tkanki oskrzelowej. Nieużywane powlekane płytki hodowlane można umieścić w sterylnej torbie i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza na później.

Użyj czystych, małych, ostrych nożyczek w sprayu, skalpela i kleszczyków z 70% etanolem i wprowadź do płytek pokrytych zarysowaniem BSC, mocno dociskając skalpelem, aby utworzyć głębokie małe XS co najmniej cztery na płytkę. Jeśli rysa nie jest wystarczająco głęboka, kawałki tkanki nie osiądą w strzykawkach i będą unosić się na zewnątrz BSC umieść tkankę w naczyniu P trzy. Dokładnie wypłukać izolowaną ludzką tkankę oskrzelową w Bss na zewnątrz.

Otwórz oskrzela. Przenieś tkankę do BS i przenieś do sterylnej stumilimetrowej płytki do hodowli tkankowej o nazwie DM EM ham F 12 plus 1% antybiotyk przeciwgrzybiczy. Użyj ostrych małych nożyczek, aby pokroić tkankę na dwa do trzech milimetrowych kawałków sześciennych.

Umieść jeden kawałek przeciętej tkanki na środku każdego X za pomocą kleszczy i dociśnij. Delikatnie pozwól kawałkom tkanki lub eksplantatom X przylegać do płytki przez kilka sekund. A następnie delikatnie dodaj 10 milicali kompletnego podłoża Jeśli tkanka unosi się na wodzie Po dodaniu pożywki użyj kleszczy, aby wepchnąć tkankę w grzbiety X lub wykonaj nowy X.It może być konieczne wykonanie nowych X, jeśli grzbiety nie są wystarczająco głębokie.

Umieść płytki w inkubatorze i zmieniaj pożywkę co trzy do czterech dni, tkanki są gotowe do przeszczepu. Gdy wokół tkanek wyrośnie wystarczająca ilość komórek nabłonkowych, aby pokryć obszar od jednego do dwóch centymetrów, trwa to około czterech tygodni. Użyj stumilimetrowych pokrytych i porysowanych płytek.

Ponieważ niektóre explan tkanek może się nie powieść. Liczba płytek zależy od liczby przeszczepianych kawałków tkanki. Jeśli używasz płytek, które zostały wcześniej pokryte i przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przed użyciem doprowadź do temperatury pokojowej Za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś tkankę z oryginalnej płytki i umieść na środku osi w nowej płytce i delikatnie dociśnij Tkanki bez wyrostka należy wyrzucić.

Niech tkanka przylega do płytki. Przez kilka sekund dodawaj pożywkę i inkubuj. Dodaj opisany wcześniej dla X explan.

Tak więc dwa miliony wycieczek i roztwór podstawowy EDTA na każde sto milimetrów płytki do hodowli tkankowej. Rozcieńczyć bulion sześcioma mililitrami sterylu 0,01 molowego PBS i dwoma mililitrami roztworu podstawowego do sześciu mililitrów PBS w celu uzyskania końcowego stężenia trypsyny w dwóch dawkach 50 mikrogramów na promil i w przypadku EDTA w sto mikrogramów na promil. Po przeniesieniu eksplantatów na nową płytkę, odessaj pożywkę z płytek z pierścieniami komórki o długości od jednego do dwóch centymetrów.

Dodaj osiem mililitrów ciepłych, rozcieńczonych kroplówek i nałóż roztwór na każdą stumilimetrową płytkę. I umieść inkubator w temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy do 15 minut. Sprawdzaj często.

Pozostawienie trypsyny zbyt długo włączonej spowoduje uszkodzenie komórek. Sprawdź płytki pod mikroskopem, aby upewnić się, że większość komórek została podniesiona, komórki zaokrąglą się w górę i oderwą, jak pokazano przy ośmiu milach ciepła. 10% FBS w mediach na płytkę, aby dezaktywować roztwór w EDT.

Połącz objętości wszystkich płytek w jedną probówkę lub oddzielne probówki z różnymi tkankami. Policz komórki za pomocą wirówki cytometru Hema przy stu G przez pięć minut. U podstawy rurki utworzy się osad komórkowy, który zawiesi osad komórkowy w kompletnym podłożu do pożądanego stężenia komórek.

Umieścić od dwóch do 3 milionów komórek w kolbie T 75 i dodać całe podłoże zgodnie z wymaganiami. Inkubacja i zmiana podłoża. Co trzy do czterech tygodni komórki rosną do subkonfluencji w kolbach D 75.

Po około czterech tygodniach komórki powinny zostać podniesione i rozszerzone lub użyte w momencie zbiegu, aby zapobiec sene. Zacznij od przygotowania przepuszczalnych membran transwells. Użyj wkładek o średnicy 6,5 milimetra, które pasują do 24-dołkowych płytek wielodołkowych.

Dodaj pożywkę po obu stronach membrany. Punkt sześć mil na dole i 0,1 milia na górze. Inkubować przez godzinę w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Ostrożnie usuń pożywkę z obu stron membrany. Ostrożne rozpoczęcie od objętości podstawowej oznacza, że membranę można łatwo uszkodzić. Odpipetuj więc pożywkę z boku wkładki hodowlanej, użyj zalecanej objętości.

Niezastosowanie się do tego spowoduje wyciek pożywki do innych studni do komórek nasiennych. Po wstępnej inkubacji przepuszczalnego podłoża ostrożnie odpipetuj zawiesinę komórkową do epickiej strony membrany dla 6,5 milimetrowych dołków przy 0,1 milimetra zawiesiny komórkowej do epickiej strony membrany. Pipeta 0,6 M, podłoże po podstawowej stronie membrany.

Karm komórki od strony epickiej i podstawowej przez 10 dni. Aby ustanowić dobrze zróżnicowaną wymianę kultur, medium dwa razy w tygodniu. Korzystając z zademonstrowanej metody, usuń objętość podstawową.

Najpierw wymień objętość epicką, dodaj 0,6 milicala pożywki do podstawowej strony membrany. Ta metoda sprzyja przyczepianiu się komórek do błony i zapobiega wystawieniu komórek na działanie powietrza przez długi czas. Szybko wymień pożywkę i umieść z powrotem w inkubatorze.

Utwórz interfejs powietrzno-cieczowy w 10 dniu, usuwając pożywkę AAL i zastępując 0,6 mililitra pożywki po podstawowej stronie membrany. Utrzymuj komórki w granicy między powietrzem a cieczą przez sześć tygodni, zmieniaj media dwa razy w tygodniu. Komórki rzęskowe zaczną pojawiać się cztery tygodnie po utworzeniu ucha.

Interfejs cieczy. Komórki osiągną równomierne różnicowanie w komórki rzęskowe. Sześć tygodni po stworzeniu interfejsu płynu do ucha.

Ludzkie segmenty oskrzeli ze zdrowymi komórkami nabłonkowymi z explan i przeszczepów. W naszym badaniu udane posiewy z eksplanu tkanki oskrzelowej wystąpiły w ośmiu z dziewięciu tkanek. Gdy jedna z kultur explan została zainfekowana, pierścienie komórek nabłonka osiągnęły promień od jednego do dwóch centymetrów w ciągu trzech do czterech tygodni.

Udany X explan został ponownie wyhodowany do sześciu razy. Wszystkie udane hodowle wykazują dowody migracji komórek w ciągu 48 godzin od rozpoczęcia przeszczepów, lub X explan, jak pokazano w komórkach B, mają brukowany wygląd, który jest wyraźny dla tych komórek nabłonkowych, jak pokazano w B. A na kolejnych rycinach barwienie immunologiczne preparatów cytozyny komórek z explan i komórek wysianych na szkiełkach nakrywkowych ujawniło, że wszystkie komórki były dodatnie dla cytokeratyny specyficznej dla nabłonka, Pokazano tutaj ludzkie subkultury komórek oskrzeli wyhodowanych do sub konfluencji i kolb T 75. Zwróć uwagę na wygląd kostki brukowej.

Ludzkie subkultury komórek oskrzelowych wykazywały jednolite dodatnie barwienie immunologiczne dla keryny i E. Barwienie immunologiczne swoistymi przeciwciałami przeciwko innym typom komórek nie wykazało żadnych oznak zanieczyszczenia kultur przez fibroblasty, komórki mezenchymalne lub śródbłonka. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z rysunkiem piątym i jego legendą w tekście komórki hodowane na przepuszczalnych membranach poliestrowych lub transwellach z lub płynnym interfejsem zróżnicowanym w nabłonek rzęskowy, jak pokazano tutaj, odrzuć komórki i ich lub przeszczepy, jeśli komórki o innej morfologii, jak pokazano tutaj, zaczynają się pojawiać. W tym protokole przedstawiliśmy szczegółowe metody hodowli i ekspansji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli.

Badania na komórkach ludzkich są potrzebne do określenia ważnych szlaków mechanizmów chorób płuc u ludzi oraz do badań przesiewowych toksyczności i farmakologicznych nowego leku. Mamy nadzieję, że opisane tutaj metody zachęcą Pana/Panią do hodowli ludzkich komórek nabłonka oskrzeli z eksplantatów i do wykorzystania tych komórek w swoich systemach badawczych. Dziękuję i życzę powodzenia.