Name: Pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli wyhodowane z eksplantatów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-26T17:10:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: Poznaj metodę hodowli pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli z eksplantatów tkanki oskrzelowej. Protokół obejmuje izolację, ekspansję i różnicowanie na interfejsie powietrze-ciecz, co umożliwia badanie mechanizmów chorób płuc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są bardzo wdzięczni dr. Richardowi Inculetowi za udostępnienie tkanek oskrzeli. Zgody Komisji Etyki Badań uzyskano z St. Joseph's Healthcare Hamilton oraz University of Western Ontario/London Health Sciences Centre (dr David McCormack), Tissue and Archives Committee, Department of Pathology. Dziękujemy również Ernie'mu Spitzerowi (Electron Microscopy, McMaster University) za wykonanie zdjęć TEM naszych kultur ALI oraz Danieli Farkas za dostarczenie niektórych materiałów niezbędnych do immunobarwienia. Praca ta była finansowana z grantu blokowego Ontario Thoracic Society; dr Asma Yaghi otrzymała wsparcie z programu stypendialnego FSORC, St. Joseph's Healthcare, Hamilton, Ontario, Kanada.

<ol><li>Phillips, J. Growing Cells on Transwell Inserts - Tips and Techniques [Internet]. Corning Life Sciences, Technical Resources, Online Training. , (2008).</li>
<li>Turi, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+activates+anion+exchange+protein+2+and+AP-1+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 283, L791-L798 (2002).</li>
<li>Lechner, J. F., Haugen, A., McClendon, I. A., Pettis, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+growth+of+normal+adult+human+bronchial+epithelial+cells+in+a+serum-free+medium%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Clonal growth of normal adult human bronchial epithelial cells in a serum-free medium.</a> In Vitro. 18, 633-642 (1982).</li>
<li>Yoshisue, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ciliated+bronchial+epithelium+1%2C+a+ciliated+cell-associated+gene+induced+during+mucociliary+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of ciliated bronchial epithelium 1, a ciliated cell-associated gene induced during mucociliary differentiation.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 491-500 (2004).</li>
<li>Wetering, S. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+secretory+leukocyte+proteinase+inhibitor+%28SLPI%29+production+by+human+bronchial+epithelial+cells%3A+increase+of+cell-associated+SLPI+by+neutrophil+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Investig.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase.</a> J. Investig. Med. 48, 359-366 (2000).</li>
<li>Tristram, D. A., Hicks, W., Hard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+and+human+bronchial+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Otolaryngol.+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus and human bronchial epithelium.</a> Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124, 777-783 (1998).</li>
<li>Mattinger, C., Nyugen, T., Schafer, D., Hormann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+serum-free+culture+conditions+for+primary+human+nasal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Hyg.+Environ.+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of serum-free culture conditions for primary human nasal epithelial cells.</a> Int. J. Hyg. Environ. Health. 205, 235-238 (2002).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+epithelial+cells%22">Culture of epithelial cells</a>. Freshney, R. I. , Wiley-Liss, Inc. New York. 1-23 (1992).</li>
<li>Freshney, R. I. Normal human bronchial epithelial cell cultures in Culture of specialized cells series. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+epithelial+cells%22">Culture of epithelial cells</a>. Freshney, R. I. , Wiley-Liss, Inc. New York. 181-196 (1992).</li>
</ol>

W niniejszym badaniu przedstawiliśmy szczegółowe metody hodowli i namnażania pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli. Wykazaliśmy, że eksplantaty i przeszczepy tkanki oskrzelowej, hodowane w pożywkach sprzyjających wzrostowi komórek nabłonka, mogą zapewnić ciągłe źródło ludzkich komórek nabłonka dróg oddechowych do badań nad modelami komórkowymi niedróżnicowanymi (zanurzonymi) i zróżnicowanymi (hodowanymi na granicy powietrze-ciecz). Komórki te mogą być wykorzystywane w systemach testowania leków, które w większym...

<table><tbody><tr><td>Albumina z surowicy bydlęcej, proszek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4919</td><td>Do użycia jako roztwór do powlekania</td></tr><tr><td>Roztwór kolagenu typu I 0,1%, filtrowany sterylnie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8919</td><td>Stosować jako roztwór do powlekania</td></tr><tr><td>Fibonektyna z ludzkiej osocza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td>Do użycia jako roztwór do powlekania</td></tr><tr><td>Earle&amp;rsquo;zrównoważony roztwór soli (EBSS, sterylny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28888</td><td>Stosować do płukania tkanki oraz do roztworu powlekającego</td></tr><tr><td>DMEM/Ham F-12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>płytki plodowa cielęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1015</td><td>Unieczynnić, następnie podzielić na alykwoty i zamrozić (-20°C)&amp;#x00B0;C); w razie potrzeby użyć świeżych</td></tr><tr><td>Stabilizowana mieszanina antybiotyków i leków przeciwgrzybiczych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>Przenieś do probówek o objętości 2 ml i zamroź (-20°C)&amp;#x00B0;C); w razie potrzeby użyć świeżego</td></tr><tr><td>Roztwór albuminy z surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Ekstrakt z przysadki bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1476</td><td>BPE (Byte Pair Encoding)</td></tr><tr><td>Epidermalny czynnik wzrostu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>EGF</td></tr><tr><td>(&amp;#177;)-Epinefryna </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1635</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Transferryna ludzka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Trijodotyronina (T3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9935</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>PBS</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td>Stosować do dezynfekcji i czyszczenia</td></tr><tr><td>wpływy Transwell 24-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowej (T75) CLLBND od firmy Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-104</td><td>Kolby te posiadają powłokę Cell Bind, która wspomaga adhezję i wzrost komórek.</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty-cytokeratyna, pan-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3418</td><td>Permeabilizacja: 0,2% TRITON X-100/PBS; stosować w rozcieńczeniu 1:250</td></tr><tr><td>Przeciwciało: E-kadheryna (H108)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-7870</td><td>&lt;silny&gt;Nie permeabilizować;&lt;/strong&gt; Należy zastosować rozcieńczenie 1:250 oraz przeciwciało wtórne A21207 (Invitrogen)</td></tr><tr><td>przeciwciało osiołkowe anty-królicze IgG znakowane Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A21207</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:400</td></tr><tr><td>Przeciwciało: mysie monoklonalne anty- &amp;alpha;-aktyna mięśni gładkich-Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td>Permeabilizacja: 0,2% TRITON X-100/PBS; zastosować rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało: Vimentyna (RV202)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-32322</td><td>Permeabilizacja: 0,2% TRITON X-100/PBS; zastosować rozcieńczenie 1:100 oraz T2402 (Sigma-Aldrich) jako przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>przeciwciało królicze anty-mysie TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2402</td><td>Stosować rozcieńczenie 1:400</td></tr><tr><td>Przeciwciało: CD31 lub PECAM-1 (M-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-1506</td><td>&lt;silny&gt;Nie permeabilizować;&lt;/strong&gt; Należy zastosować rozcieńczenie 1:200 oraz przeciwciało wtórne: Donkey anti-goat IgG-FITC</td></tr><tr><td>przeciwciało osiołkowe przeciwko IgG kozie znakowane FITC</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td></td><td>Stosować rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Medium montażowe Vectashield z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Przechowywać w lodówce w ciemności; barwi jądra komórkowe i zachowuje fluorescencję podczas długotrwałego przechowywania</td></tr><tr><td>Medium montażowe Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Przechowywać w lodówce, w ciemności; zapobiega to utracie fluorescencji podczas długotrwałego przechowywania</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;roztwór barwiący CST</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6024</td><td>Barwi jądra komórkowe; należy zastosować rozcieńczenie 1:10 oraz Vectashield H-1000</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Inne wymagania:&lt;/strong&gt; inkubator, komora z laminarnym przepływem powietrza (BSC), wirówka, płytki hodowlane 100 mm, probówki sterylne (15 ml, 50 ml i 2 ml), sterylne końcówki do pipet, uchwyt i ostrza skalpela, małe ostre nożyczki, fartuchy laboratoryjne i rękawiczki. Przedmioty te można nabyć u preferowanych dostawców.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli hodowane z eksplantatów

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Ludzkie komórki nabłonka oskrzelowego są niezbędne do tworzenia modeli komórkowych chorób oraz do badania wpływu substancji pomocniczych i środków farmakologicznych na funkcję i strukturę ludzkich komórek nabłonkowych. W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisujemy metodę hodowli komórek nabłonka oskrzelowego z tkanki dróg oddechowych oskrzeli, pobranej przez chirurga podczas operacji płuc (np. w przypadku raka płuca lub operacji redukcji objętości płuc). Po uzyskaniu zgody komisji etycznej oraz świadomej zgody pacjenta, chirurg pobiera materiał niezbędny do badań patomorfologicznych i przekazuje nam fragment oskrzela oddalony od obszarów objętych chorobą. Tkanka ta służy następnie jako źródło eksplantów, które można wykorzystać do hodowli pierwotnych komórek nabłonka oskrzelowego. Segmenty oskrzeli o długości około 0,5-1 cm i średnicy ≤1 cm płucze się zimnym EBSS, a następnie usuwa nadmiar tkanki miąższowej. Segmenty są rozcinane i siekane na kawałki o wielkości 2-3 mm3fragmenty tkanki. Fragmenty te służą jako źródło pierwotnych komórek. Po pokryciu płytek hodowlanych 100 mm przez 1-2 h kombinacją kolagenu (30 μg/ml), fibronektyny (10 μg/ml) i BSA (10 μg/ml), na płytkach wykonuje się zadrapania w 4-5 obszarach, w których umieszcza się fragmenty tkanki, a następnie dodaje pożywkę hodowlaną (DMEM/Ham F-12 z dodatkami) odpowiednią do wzrostu komórek nabłonkowych i umieszcza płytki w inkubatorze w temperaturze 37°C w 5% CO22nawilżone powietrze. Pożywkę hodowlaną wymienia się co 3-4 dni. Komórki nabłonkowe wyrastają z fragmentów tkanek, tworząc pierścienie o średnicy około 1,5 cm w ciągu 3-4 tygodni. Eksplanty można wykorzystać do 6 razy, przenosząc je do nowych, uprzednio powlekanych płytek. Komórki są odrywane za pomocą trypsyny/EDTA, łączone, liczone i ponownie wysiewane do kolb T75 Cell Bind w celu zwiększenia ich liczebności. Kolby T75 zasiane 2-3 milionami komórek osiągają 80% konfluencji w ciągu 4 tygodni. Namnożone pierwotne ludzkie komórki nabłonkowe mogą być hodowane i poddawane różnicowaniu na granicy faz powietrze-ciecz. Opisane tutaj metody zapewniają obfite źródło ludzkich komórek nabłonka oskrzelowego z tkanek świeżo wyizolowanych i umożliwiają badanie tych komórek jako modeli chorób oraz w badaniach farmakologicznych i toksykologicznych.

W niniejszej pracy opisujemy szczegółową metodę hodowli pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli z eksplantów tkanki dróg oddechowych człowieka, w tym ich różnicowania na granicy faz powietrze-ciecz. Metoda ta zapewnia obfite źródło pierwotnych komórek do badania roli nabłonka dróg oddechowych w zdrowiu i chorobach ludzkich płuc.

Pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli hodowane z eksplantatów

Komórki nabłonka oskrzeli człowieka są niezbędne do tworzenia komórkowych modeli chorób oraz do badania wpływu substancji pomocniczych i środków farmakologicznych na...

W niniejszym artykule opisujemy protokół hodowli i ekspansji ludzkich komórek nabłonka oskrzeli z bezpośrednio wyizolowanych segmentów oskrzeli ludzkich. Protokół ten składa się z pięciu sekcji: kodowania i nacinania, płyt hodowlanych o średnicy stu milimetrów, przygotowania tkanki oskrzelowej, transplantacji eksplantów tkanki oskrzelowej, pasażowania ludzkich komórek nabłonka oskrzeli z rozwojem rzęsek oraz hodowli ludzkich komórek nabłonka oskrzeli na wkładkach transwell. Przed rozpoczęciem należy pamiętać, że wszystkie etapy są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza.Jeśli nie zaznaczono inaczej, należy zapoznać się z sekcją materiałów, odczynników i przygotowań, aby upewnić się, że wszystkie niezbędne elementy zostały przygotowane. Następujące etapy: kodowanie, hodowla roztworów zapasowych, medium, roztwory do dysocjacji, powlekanie i drapanie, powinny być wykonywane w płytkach hodowlanych o średnicy 100 mm w optymalnych warunkach.Zachować pełną sterylność. Przygotować sterylne płytki hodowlane o średnicy 100 mm oraz roztwór powlekający. Za pomocą pipety BST nanieść 2 ml roztworu powlekającego na płytkę 100 mm, a następnie delikatnie nią potrząsać, aby równomiernie pokryć dno płytki.Należy upewnić się, że roztwór powlekający równomiernie pokrywa dno płytki. Pozostały roztwór należy odpipetować i wykorzystać do powleczenia drugiej płytki o średnicy 100 mm. Czynność tę należy powtórzyć dla tylu płytek, ile jest wymagane.Liczba potrzebnych płytek zależy od liczby eksplantów tkankowych. Należy upewnić się, że roztwór powlekający równomiernie pokrywa dno płytek, zgodnie z demonstracją.Przykryj płytki ich pokrywkami. Pozostaw płytki do wyschnięcia w inkubatorze na jedną do dwóch godzin i odessaj nadmiar roztworu przed wykorzystaniem do eksplantacji tkanki oskrzeli. Niewykorzystane powlekane płytki hodowlane można umieścić w sterylnym worku i przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.Użyj sprayu do czyszczenia, małych ostrych nożyczek, skalpela i pęsety odkawezionych 70% ethanol, a następnie wprowadź do BSC płytki z naniesionymi nacięciami, dociskając mocno skalpel, aby utworzyć głębokie, małe nacięcia w kształcie XS, co najmniej cztery na płytkę. Jeśli nacięcia nie będą wystarczająco głębokie, fragmenty tkanki nie osadzą się w strzykawkach i będą dryfować. Poza obszarem BSC umieść tkankę w naczyniu typu P3. Dokładnie wypłucz wyizolowaną ludzką tkankę oskrzelową w Bss.Otwórz fragmenty oskrzeli. Przenieś tkankę do BS, a następnie przełóż ją do sterylnej 100 mm płytki hodowlanej z chłodnym medium DMEM/F-12 z dodatkiem 1% antybiotyku i przeciwgrzybiczego.Za pomocą pincety umieść jeden fragment wyciętej tkanki w centrum każdego nacięcia X i dociśnij. Pozostaw fragmenty tkanki lub eksplanty X na kilka sekund, aby przylgnęły do płytki. Następnie delikatnie dodaj 10 ml pełnej pożywki. Jeśli po dodaniu pożywki tkanka wypływa, użyj pincety, aby wcisnąć ją w rowki nacięcia X lub wykonaj nowe nacięcie X. Konieczne może być wykonanie nowych nacięć X, jeśli rowki nie są wystarczająco głębokie.Umieść płytki w inkubatorze i wymieniaj pożywkę co trzy do czterech dni, aż tkanki będą gotowe do transplantacji. Proces ten trwa około czterech tygodni, do momentu gdy wokół tkanek urośnie wystarczająca liczba komórek nabłonkowych, pokrywając obszary o wielkości od jednego do dwóch centymetrów. Użyj powlekanych i porysowanych płytek o średnicy stu milimetrów.Ponieważ niektóre eksplanty tkankowe mogą nie przetrwać, liczba płytek zależy od liczby przenoszonych fragmentów tkanki. W przypadku stosowania płytek, które zostały wcześniej pokryte i przechowywane w temperaturze 4°C, należy doprowadzić je do temperatury pokojowej przed użyciem. Za pomocą pęsety ostrożnie pobrać tkankę z pierwotnej płytki, umieścić ją w centrum osi na nowej płytce i delikatnie docisnąć. Tkanki bez widocznego przerostu należy odrzucić.Pozostaw tkankę do przyprzylgnięcia do płytki. Po kilku sekundach dodaj pożywkę i inkubuj. Dodaj opisane wcześniej dla X explan.Do każdej 100 mm płytki do hodowli tkankowej należy dodać 2 ml roztworu zapasowego trypsyny i EDTA. Rozcieńczyć roztwór zapasowy w 6 ml sterylnego 0,01 M PBS, tak aby 2 ml roztworu zapasowego przypadało na 6 ml PBS, co zapewni końcowe stężenie trypsyny wynoszące 250 µg/ml oraz EDTA wynoszące 100 µg/ml. Po przeniesieniu eksplantów na nową płytkę, odessać medium z płytek zawierających pierścienie komórek o szerokości 1-2 cm.Do każdej płytki o średnicy 100 mm dodaj 8 ml ciepłych, rozcieńczonych kropel i roztworu edt. Następnie umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 3 do 15 minut. Sprawdzaj często.Zbyt długie działanie trypsyny uszkodzi komórki. Sprawdź płytki pod mikroskopem, aby upewnić się, że większość komórek została odklejona; komórki przyjmą okrągły kształt i oddzielą się, jak pokazano w powiększeniu 8x. Dodaj 10% FBS w pożywce na płytkę, aby dezaktywować roztwór EDTA.Połączyć objętości ze wszystkich płytek w jednej probówce lub w osobnych probówkach dla różnych tkanek. Policzyć komórki, używając komory licznikowej Hema Cytometer; wirować z prędkością 100 g przez pięć minut. Na dnie probówki utworzy się granulat komórkowy; resuspender granulat komórkowy w pełnym medium do pożądanej koncentracji komórek.Przenieść od 2 do 3 milionów komórek do każdej kolby T 75 i dodać odpowiednią ilość pełnej pożywki. Inkubować i wymieniać pożywkę. Co trzy do czterech tygodni komórki w kolbach D 75 osiągają stan subkonfluencji.Po około czterech tygodniach komórki należy zdjąć i namnożyć lub wykorzystać przy subkonfluencji, aby zapobiec starzeniu. Rozpocznij od przygotowania przepuszczalnych membran transwelli. Użyj wkładów o średnicy 6,5 mm, które pasują do wieloodrywnych płytek 24-dołkowych.Dodać pożywkę po obu stronach membrany. 600 µm od spodu oraz 100 µm od góry. Inkubować przez jedną godzinę w inkubatorze do hodowli komórkowych.Ostrożnie usuń pożywkę z obu stron membrany. Zacznij od objętości bazalnej, ponieważ membrana może zostać łatwo uszkodzona. Pożywkę należy pipetować po ściance insertu hodowlanego, stosując zalecaną objętość.Zaniechanie tego kroku spowoduje wyciek medium do innych studzienek z wysianymi komórkami. Po preinkubacji wspornika przepuszczalnego ostrożnie pipetuj zawiesinę komórkową na stronę apikalną membrany w studzienkach o średnicy 6,5 mm, nakładając 0,1 ml zawiesiny komórkowej na stronę apikalną membrany. Pipetuj 0,6 ml medium na stronę bazalną membrany.Dokarmić komórki od strony apikalnej i bazalnej przez 10 dni. Aby uzyskać dobrze zróżnicowaną hodowlę, wymieniać medium dwa razy w tygodniu. Stosując zademonstrowaną metodę, usunąć objętość bazalną.Najpierw, aby uzupełnić objętość nadstrefową, dodaj 0,6 ml pożywki po stronie podstawnej membrany. Metoda ta sprzyja adhezji komórek do membrany i zapobiega ich długotrwałej ekspozycji na powietrze. Szybko wymień pożywkę i umieść próbkę z powrotem w inkubatorze.W 10. dniu utwórz granicę powietrze-ciecz (air liquid interface), usuwając medium AAL i wymieniając 0,6 ml medium po stronie podstawnej membrany. Utrzymuj komórki w warunkach granicy powietrze-ciecz przez sześć tygodni, zmieniając media dwa razy w tygodniu. Komórki rzęsiste zaczną pojawiać się cztery tygodnie po utworzeniu granicy.Interfejs ciecz-powietrze. Komórki osiągną jednorodną różnicowanie w komórki rzęskowe. Sześć tygodni po utworzeniu interfejsu ciecz-powietrze dla ucha.Ludzkie segmenty oskrzelowe ze zdrowymi komórkami nabłonkowymi z preparatów i przeszczepów. W naszym badaniu pomyślne hodowle z preparatów tkanki oskrzelowej uzyskano w ośmiu z dziewięciu przypadków. Ponieważ jedna z hodowli z preparatów uległa zakażeniu, pierścienie komórek nabłonkowych osiągnęły promień od jednego do dwóch centymetrów w ciągu trzech do czterech tygodni.Udane eksplanty X hodowano ponownie do sześciu razy. Wszystkie udane hodowle wykazywały oznaki migracji komórek w ciągu 48 godzin od rozpoczęcia transplantacji, lub eksplanty X, jak pokazano w B, miały wygląd brukowany, który jest charakterystyczny dla tych komórek nabłonkowych, jak pokazano w B. W kolejnych rysunkach immunobarwienie preparatów cytologicznych komórek z eksplantu oraz komórek wysianych na szkiełka nakrywki wykazało, że wszystkie komórki były pozytywne w kierunku specyficznej dla nabłonka cytokeratyny; tutaj przedstawiono ludzkie subkultury komórek oskrzelowych hodowanych do stanu subkonfluencji w kolbach T 75. Należy zwrócić uwagę na wygląd brukowany.Ludzkie subkultury komórek oskrzelowych wykazywały jednolite dodatnie barwienie immunocytochemiczne dla keratyny i E.Cad. Barwienie immunocytochemiczne ze swoistymi przeciwciałami przeciwko innym typom komórek nie wykazało żadnych oznak kontaminacji kultur fibroblastami, komórkami mezenchymalnymi lub śródbłonkowymi. Więcej szczegółów znajduje się na rysunku 5 oraz w jego opisie w tekście. Komórki hodowane na przepuszczalnych membranach poliestrowych lub transwellach z interfejsem ciecz-powietrze różnicowały się w nabłonek rzęskowy, co zostało tutaj zademonstrowane; należy zutylizować komórki i ich pasaże, jeśli zaczną pojawiać się komórki o innej morfologii niż przedstawiona tutaj. W niniejszym protokole przedstawiliśmy szczegółowe metody hodowli i ekspansji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzelowego.Badania oparte na ludzkich komórkach są niezbędne do określenia istotnych szlaków mechanizmów chorób płuc u ludzi oraz do badań toksykologicznych i farmakologicznych nowych leków. Mamy nadzieję, że opisane tutaj metody zachęcą Państwa do hodowli ludzkich komórek nabłonka oskrzeli z eksplantów i wykorzystania tych komórek w systemach badawczych. Dziękujemy i życzymy powodzenia.

primary-human-bronchial-epithelial-cells-grown-from-explants

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Komórki nabłonkowe ludzkich oskrzeli pierwotnych wyhodowane z eksplantatów

Komórki nabłonka nosa, uzyskane poprzez powierzchowną biopsję zeskrobaną ludzkich ochotników, są rozszerzane i przenoszone do wkładek do hodowli tkankowych. Po osiągnięciu konfluencji komórki są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz, dając kultury komórek rzęskowych i nierzęskowych. Zróżnicowane hodowle komórek nabłonka nosa dostarczają realnych modeli eksperymentalnych do badania błony śluzowej układu oddechowego.

Hodowla ludzkich komórek nabłonka nosa na granicy faz powietrza i cieczy

Ta publikacja demonstruje metody skutecznego pobierania próbek i hodowli błony śluzowej nabłonka nosa od dzieci oraz przeprogramowania tych komórek na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC).

Hoduj pierwotne komórki nabłonka nosa od dzieci i przeprogramuj je w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli są trudne do transdukcji. Protokół ten opisuje produkcję lentiwirusów i ich koncentrację, a także optymalne warunki hodowli niezbędne do osiągnięcia wysoce wydajnych transdukcji w tych komórkach poprzez różnicowanie do pseudostratyfikowanego nabłonka.

Optymalna produkcja lentiwirusa i warunki hodowli komórkowej niezbędne do skutecznej transdukcji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię metod dysocjacji tkanek i frakcjonowania komórkowego, umożliwiając wzbogacenie żywotnych komórek nabłonkowych z bliższych i dalszych obszarów ludzkiego płuca. W tym przypadku podejścia te są stosowane do analizy funkcjonalnej komórek progenitorowych nabłonka płuc poprzez wykorzystanie modeli hodowli organoidów 3D.

Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów

Tutaj opisujemy izolację, amplifikację i różnicowanie pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka nosa (HNE) na granicy powietrze-ciecz oraz protokół biobankowania pozwalający na skuteczne zamrażanie, a następnie rozmrażanie amplifikowanego HNE. W protokole analizowane są właściwości elektrofizjologiczne zróżnicowanych komórek HNE i korekcja wydzielania chlorków związanych z CFTR po różnych zabiegach modulatorowych.

Pierwotne ludzkie komórki nabłonka nosa: biobankowanie w kontekście medycyny precyzyjnej

Protokół przedstawia metodę pozyskiwania ludzkich organoidów płucnych z pierwotnych tkanek płuc, rozszerzania organoidów płuc i wywoływania różnicowania proksymalnego w celu wygenerowania organoidów dróg oddechowych 3D i 2D, które wiernie kopiują nabłonek ludzkich dróg oddechowych.

Ustalanie ludzkich organoidów płuc i różnicowanie proksymalne w celu wytworzenia dojrzałych organoidów dróg oddechowych

Obecny protokół opisuje ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki nabłonkowe typu 2 z pęcherzyków płucnych typu 2 (iAT2). Komórki te mogą być hodowane jako samoodnawiające się kulki w hodowli 3D lub przystosowane do hodowli na granicy faz powietrze-ciecz (ALI).

Generowanie sfer 3D i kultur 2D granicy faz powietrze-ciecz indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Ostatnie postępy w protokołach różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pozwalają na stopniowe wyprowadzanie typów komórek specyficznych dla narządów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe kroki dotyczące utrzymania i ekspansji komórek podstawnych dróg oddechowych pochodzących z iPSC oraz ich różnicowania w nabłonek śluzowo-rzęskowy w kulturach na granicy faz powietrze-ciecz.

Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przedstawiona tutaj jest powtarzalna, przystępna cenowo i solidna metoda izolacji i ekspansji pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do długoterminowego biobankowania i generowania zróżnicowanych komórek nabłonkowych przez hodowlę na granicy powietrze-ciecz.

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

Kultura interfejsu powietrze-ciecz jest powszechnie stosowana do tworzenia pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych poprzez różnicowanie pierwotnych normalnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli, które naśladują wierzchołkową stronę drogi oddechowej płuc. W tym miejscu opisujemy prosty protokół określania jego jakości poprzez monitorowanie jego właściwości biofizycznych, takich jak funkcja rzęsek i integralność błony.

Określanie funkcji rzęsek i nieprzepuszczalności błony pseudostratyfikowanego nabłonka dróg oddechowych płuc

Poznaj metodę hodowli pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli z eksplantatów tkanki oskrzelowej. Protokół obejmuje izolację, ekspansję i różnicowanie na interfejsie powietrze-ciecz, co umożliwia badanie mechanizmów chorób płuc.

Pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli hodowane z eksplantatów

Przeglądaj więcej filmów