Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) Część II: Węglowodany

Określenie składu polisacharydowego matrycy i zawartości celulozy krystalicznej w ścianach komórkowych roślin rozpoczyna się od wysuszonego materiału roślinnego, który poddaje się różnym ekstrakcjom. Otrzymany materiał składa się tylko ze ścian komórkowych, a następnie jest dzielony w celu określenia składu polisacharydów matrycy. Materiał ściany jest traktowany słabym kwasem w celu hydrolizy, niekrystalicznych polisacharydów, które są głównie hemocelulozami w ich monosacharydach.

Monosacharydy są następnie wyprowadzane do odpowiadających im lotnych octanów aldolowych, które są następnie analizowane i oznaczane ilościowo za pomocą chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrem masowym w celu oznaczenia celulozy krystalicznej. Ścianki zawartości są traktowane odczynnikiem grafowym, mieszaniną kwasów, które usuwają niekrystaliczne składniki ścian. Pozostała celuloza krystaliczna jest rozkładana do monomeru glukozy, który można oznaczyć metrycznie.

Oznaczanie zawartości i składu ligniny zostało zademonstrowane w innej publikacji wideo J zatytułowanej Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin, część pierwsza Lignina. Cześć, nazywam się Marcus Pauley i jestem szefem ośrodka analitycznego Wall w Centrum Badań Bioenergetycznych Wielkich Jezior na Uniwersytecie Stanowym Michigan. Nazywam się Cliff Foster i jestem kierownikiem placówki analitycznej Cell Wall.

Dzisiaj pokażemy Ci, jak określić skład polisacharydów obecnych w materiale ściany komórkowej rośliny, czyli celulozie w różnych Homo celulozach. W Centrum Badań Bioenergetycznych Wielkich Jezior opracowujemy technologię przekształcania tych cukrów w biopaliwa. Aby zidentyfikować optymalny surowiec roślinny, musimy najpierw ocenić rodzaj i obfitość cukrów obecnych w tej biomasie.

W innym filmie zatytułowanym Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin, część pierwsza lignina, skupimy się na analizie polifenoli. Więc zacznijmy. Rozpocznij tę procedurę od wyizolowania ścian komórkowych.

Zmiel około 60 do 70 miligramów suszonego materiału roślinnego za pomocą 5.5-milimetrowych kulek ze stali nierdzewnej w dwumilimetrowej tubie z nakrętką SAR TED. Korzystając z młyna REM jako alternatywy o wysokiej przepustowości, użyj robota do mielenia i dozowania zwanego ścianą oczną, jak opisano w części pierwszej. Po zakończeniu mielenia usuń stalowe kulki.

Kontynuuj izolowanie ścian komórkowych i usuwanie resztek skrobi, jak pokazano w części pierwszej i opisano w dołączonym pisemnym protokole. Odważyć dwa miligramy materiału ściany komórkowej skrobi DS do probówki z dwoma młynkami. Wysokowydajnym sposobem wykonywania tego zadania jest robot do ścian ocznych.

Robot pobiera rurkę zawierającą zmielony materiał roślinny i robi dziurę w dnie rurki. Przebitą rurkę umieszcza się następnie na podajniku VI. Pustą rurkę umieszcza się na wadze i przesuwa pod podajnikiem VI poprzez wibracje, materiał przenika przez otwór w załadowanej górnej rurze do pustej dolnej rury, aż do zgromadzenia się żądanej ilości materiału.

Dodać 100 mikrogramów acetolu jako wzorzec wewnętrzny. Przepłucz ścianki rurki acetonem, aby zebrać materiał ściany komórkowej na dnie probówki i bardzo delikatnie odparować aceton pod przepływem powietrza. Następnie wykonaj hydrolizę słabego kwasu.

Ostrożnie dodaj 250 mikrolitrów dwóch molowych kwasów trichlorooctowych lub TFA do każdej próbki, upewniając się, że żaden materiał nie rozpryskuje się na ściankach probówki. Szczelnie zamknij probówki i inkubuj w temperaturze 121 stopni Celsjusza w bloku grzewczym przez 90 minut. Następnie schłodzić bloki grzewcze i próbki na lodzie i odwirować probówki z prędkością 10 000 obr./min przez 10 minut.

Przenieść 100 mikrolitrów kwaśnego supernatantu zawierającego rozpuszczone cukry polisacharydu matrycy do fiolek z nakrętką, uważając, aby nie naruszyć materiału osadu. Osad może być używany do oznaczania celulozy krystalicznej. Odparować TFA w szklanej probówce pod delikatnym strumieniem powietrza w urządzeniu do odparowywania.

Dodaj 300 mikrolitrów dwóch propanoli w celu usunięcia nadmiaru wiru kwasu i odparowania w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Powtórz w sumie trzy razy. W celu umożliwienia identyfikacji cukrów prostych za pomocą chromatografii gazowej należy przeprowadzić pochodną octanu aldolowego.

Najpierw zredukuj cukrów prostych do odpowiadających im aldoli z otwartym pierścieniem, które są następnie acetylowane. Zapoznaj się z dołączonym pisemnym protokołem, aby uzyskać szczegółowe instrukcje. Każdy etap procedury przebiega zgodnie z wcześniej przedstawionym protokołem, dodanie odczynnika, inkubacja, odparowanie pod strumieniem powietrza, a następnie usunięcie nadmiaru odczynnika za pomocą różnych etapów mycia.

W końcowych etapach ekstrahuje się octany aldolowe. Najpierw dodaj 500 mikrolitrów octanu etylu i lekko zamieszaj. Następnie dodać dwa mililitry wody, zakryć probówki i wirować, odwirować probówki z prędkością 2000 obr./min przez pięć minut, aby uzyskać klarowne, oddzielne warstwy z octanem etylu na górze zawierającym octany Al Dettol i wodą na dole pipetę 50 mikrolitrów warstwy octanu etylu do fiolek GCMS z wkładkami rozcieńczonymi przez dodanie 100 mikrolitrów acetonu do fiolki GC, a fiolka GC może być przechowywana w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Jeśli analiza GCMS nie zostanie natychmiast przeprowadzona, wstrzyknij próbki do urządzenia do fotografowania chrominancji gazu, które jest wyposażone w poczwórny spektrometr masowy. Aby zapoznać się z kolumną i szczegółami biegu, należy zapoznać się z dołączonym pisemnym protokołem. Materiałem wyjściowym do oznaczania zawartości celulozy krystalicznej może być wyizolowany materiał ściany komórkowej lub materiał ścianki już poddany działaniu słabego kwasowego TFA, albo bezpośrednio po obróbce kwasem, albo w postaci suchej, nadającej się do przechowywania.

Po usunięciu nadmiaru TFA za pomocą iso propanolu, jak pokazano wcześniej, dodaj do osadu TFA w dwóch M sars do probówki jeden M odczynnika degra składającego się z kwasu octowego, kwasu azotowego i wody, dodaj stosunek objętości do objętości osiem do jednego do dwóch. Szczelnie zakręć rurkę, wiruj i podgrzewaj na bloku grzewczym w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 30 minut. W wyniku tej obróbki w granulce pozostaje tylko krystaliczna celuloza.

Wszystkie inne polisacharydy są hydrolizowanymi chłodnymi próbkami w bloku na lodzie do temperatury pokojowej lub chłodniejszej. Następnie odwirować próbki z prędkością 10 000 obr./min przez 15 minut po odwirowaniu, wyrzucić supernatant, upewniając się, że osad nie został naruszony i nie usunięto żadnego materiału z osadu. W tym celu należy pozostawić w probówce około 150 mikrolitrów supernatantu, kilkakrotnie przemyć osad wodą.

Następnie wykonaj to samo i hydrolizę stężonym kwasem siarkowym, aby całkowicie zhydrolizować kryształ i osad celulozy do glukozy. Zacznij od dodania 175 mikrolitrów 72% kwasu siarkowego do probówki sarta i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po wstępnej inkubacji należy zawirować próbkę i inkubować przez kolejne 15 minut.

Następnie dodaj 825 mikrolitrów wody i wiruj próbki z prędkością 10 000 obr./min przez pięć minut. W probówce może pozostać trochę brązowego i rozpuszczalnego materiału, głównie ligniny, podczas gdy glukoza znajduje się w supernatancie. Zawartość glukozy w supernatantze jest oznaczana przy użyciu testu Colormetric anthone.

Test ten przeprowadza się w 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania polistyrenu. Napraw krzywą wzorcową glukozy w dwóch egzemplarzach, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym pisemnym protokole. Przygotować próbki, łącząc 10 mikrolitrów każdej próbki, supernatu i 90 mikrolitrów wody do oddzielnych studzienek na tej samej płytce do mikromiareczkowania, co standardowe wykończenie, dodając 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego i wrzuconego odczynnika.

Następnie podgrzewaj talerz przez 30 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza w piekarniku z aluminiowym rozpraszaczem ciepła. Obserwuj, że próbki zawierające glukozę zmieniają kolor z żółtego na niebiesko-zielony po zakończeniu ogrzewania. Pozwól talerzowi ostygnąć do temperatury pokojowej i dokładnie wstrząśnij.

Odczytaj absorpcję przy 625 nanometrach za pomocą czytnika płytek mikromiareczkowych. Zawartość glukozy, składnika budulcowego celulozy, oblicza się na podstawie absorbancji w porównaniu z krzywą wzorcową ustaloną na tej samej płytce. Oto kilka reprezentatywnych wyników analizy polisacharydowej kawałka drewna topolowego.

Piki chromatogramu gazowego są identyfikowane za pomocą profili masowych i/lub czasów retencji wzorców. Monosacharydy są oznaczane ilościowo na podstawie krzywych standardowych. Analiza zawartości cukrów w polisacharydach matrycy wykazuje dużą obfitość ksylozy reprezentującej hemi celulozę xam, ale obecne są również inne cukry.

Z analizy wynika, że 40% materiału topoli składa się z kryształu i celulozy. Należy pamiętać, że te treści i kompozycje mogą się różnić w zależności od rośliny lub od różnych anatomii roślin. Właśnie pokazaliśmy, jak określić zawartość polisacharydów i analizę składu biomasy lignanocelulozowej do analizy ligniny polifenolowej.

Włącz część pierwszą. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.