Name: Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) Część II: Węglowodany (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Poznaj metodę analizy węglowodanów ścian komórkowych roślin z wykorzystaniem chromatografii gazowej i spektrometrii mas. Protokół umożliwia ilościowe oznaczanie polisacharydów macierzystych oraz krystalicznej celulozy w biomasie lignocelulozowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Matthew Robert Weatherhead za doskonałą pomoc techniczną oraz John Ralphowi z University of Wisconsin za cenne porady, dyskusje i próbkę drewna topoli. Praca ta była finansowana przez Chemical Sciences, Geosciences and Biosciences Division, Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, U.S. Department of Energy (grant nr DE-FG02-91ER20021) oraz przez US Department of Energy (DOE) Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494).

1. Izolacja ściany komórkowej
<ol>
	<li>rozmieć około 60-70mg materiału roślinnego suszonego powietrzem lub liofilizowanego za pomocą kulek ze stali nierdzewnej o średnicy 5.5 mm w probówce Sarstedt z nakrętką o pojemności 2ml, używając młyna Retsch (1 min, 25 Hz). Alternatywnie, zastosowanie wysokoprzepustowego robota do rozdrabniania i dozowania o nazwie iWall opisano w Części I3.</li>
<li>usuń stalowe kulki przed kontynuowaniem procedury izolacji ścian komórkowych 
Szczegółowy protokół przygotowania materiału ścian komórkowych przedstawiono w Części I3. Dla pełności obrazu poniżej zamieszczono opisane kroki protokołu.</li>
<li>dodaj 1.5 ml 70% wodnego etanolu i dokładnie wymieszaj w wortexie</li>
<li>wiruj przy 10,000 rpm przez 10 min, aby wytrącić osad pozostałości nierozpuszczalnych w alkoholu</li>
<li>odessij lub odlej nadsącz</li>
<li>dodaj do osadu 1.5 ml roztworu chloroformu/metanolu (1:1 v/v) i dokładnie potrząśnij probówką, aby resuspendować osad</li>
<li>wiruj przy 10,000 rpm przez 10 min, a następnie odessij lub odlej nadsącz</li>
<li>resuspenduj osad w 500 ul acetonu</li>
<li>odparuj rozpuszczalnik strumieniem powietrza w temperaturze 35°C aż do całkowitego wysuszenia 
 W razie potrzeby wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszego przetwarzania.</li>
<li>Aby rozpocząć usuwanie skrobi z próbki, resuspenduj osad w 1.5 ml 0.1 M buforu octanu sodu o pH 5.0.</li>
<li>zamknij probówki Sarstedt i podgrzewaj przez 20 min w temperaturze 80°C w bloku grzewczym.</li>
<li>schłodź zawiesinę na lodzie</li>
<li>dodaj do osadu następujące odczynniki: 35 μl 0.01% azydku sodu (NaN3), 35 μl amylazy (50 μg/1mL H2O; z gatunków Bacillus, SIGMA); 17 μl pullulanazy (18.7 jednostek z Bacillus acidopullulyticus; SIGMA). Zamknij probówkę i dokładnie wymieszaj w wortexie.</li>
<li>Zawiesinę inkubuje się przez noc w temperaturze 37°C w wytrząsarce. Położenie probówek poziomo ułatwia lepsze mieszanie.</li>
<li>podgrzej zawiesinę w temperaturze 100°C przez 10 min w bloku grzewczym, aby zakończyć trawienie.</li>
<li>wiruj (10,000 rpm, 10 min) i odrzuć nadsącz zawierający rozpuszczoną skrobię</li>
<li>przemyj pozostały osad trzykrotnie, dodając 1.5 ml wody, mieszając w wortexie, wirując i odlewając wodę płuczącą.</li>
<li>resuspenduj osad w 500 ul acetonu</li>
<li>odparuj rozpuszczalnik strumieniem powietrza w temperaturze 35°C aż do całkowitego wysuszenia. Może być konieczne rozbicie materiału w probówce za pomocą szpatułki w celu lepszego wysuszenia. 
 Wysuszony materiał stanowi izolowane ściany komórkowe (lignocelulozę). W razie potrzeby wysuszone próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu dalszego przetwarzania.</li>
</ol>
2. Skład polisacharydowy macierzy
Metoda ta stanowi w istocie modyfikację metody opublikowanej przez Albersheima 1.
<ol>
 <li>Aby określić skład monosacharydowy materiału ścian komórkowych, odważyć 2 mg materiału do probówek Starstedt o pojemności 2 ml, ręcznie lub w sposób wysokoprzepustowy przy użyciu iWall, zrobotyzowanego urządzenia do mielenia i ważenia.</li>
	<li>Dodać 20 uL roztworu inozytolu (5 mg/ml) jako wzorca wewnętrznego. Dla próbki 2 mg ścian komórkowych zaleca się dodanie 100 ug.</li>
	<li>Przepłukać ścianki probówki 250 ul acetonu, aby zebrać materiał ścian komórkowych na dnie probówki, a następnie bardzo delikatnie odparować aceton w strumieniu powietrza.</li>
	<li>W celu przeprowadzenia hydrolizy słabym kwasem dodać 250 ul 2M kwasu trifluorooctowego (TFA) do każdej próbki. TFA należy dodawać ostrożnie, aby uniknąć rozpryskania materiału na ścianki probówki.</li>
	<li>Szczelnie zakapslować i inkubować przez 90 min w temperaturze 121°C w bloku grzejnym.</li>
	<li>Schłodzić bloki grzejne i próbki na lodzie.</li>
	<li>Wirować probówki z prędkością 10 000 rpm przez 10 min.</li>
	<li>Przenieść 100 ul kwaśnego supernatantu zawierającego monosacharydy pochodzące z polisacharydów macierzy do szklanych fiolek z nakrętką, dbając o to, aby nie naruszyć osadu. Osad można wykorzystać do poniższej analizy celulozy krystalicznej (patrz pkt 3.).</li>
	<li>Odparować TFA w szklanej probówce pod delikatnym strumieniem powietrza w urządzeniu do odparowywania.</li>
	<li>Dodać 300 μl 2-propanolu, wymieszać w wortexie i odparować w temperaturze 25°C (powtórzyć łącznie trzy razy).</li>
	<li>Pierwszym etapem procedury derywatyzacji do octanów alditoli jest redukcja monosacharydów do odpowiadających im alditoli. W tym celu do każdej wysuszonej próbki dodać 200 μl roztworu borowodorku sodu. Za każdym razem należy przygotować świeży roztwór, stosując 10 mg borowodorku sodu na 1 ml 1M wodorotlenku amonu.</li>
	<li>Pozostawić szklane fiolki w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny.</li>
	<li>Zneutralizować roztwór, dodając 150 ul lodowatego kwasu octowego.</li>
	<li>Wymieszać w wortexie i odparować w temperaturze 25°C.</li>
	<li>Dodać 250 μl mieszaniny kwas octowy/metanol (1:9, v/v), wymieszać w wortexie i odparować w temperaturze 25°C.</li>
	<li>Dodać 250 μl metanolu i odparować w strumieniu powietrza (powtórzyć łącznie trzy razy).</li>
	<li>W celu acetylacji alditoli dodać 50 μl bezwodnika octowego i 50 μl pirydyny, wymieszać w wortexie i inkubować przez 20 min w temperaturze 121°C w bloku grzejnym.</li>
	<li>Schłodzić próbki w bloku za pomocą lodu, czekając, aż temperatura spadnie do poziomu zbliżonego do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Odparować odczynniki pod delikatnym strumieniem powietrza w temperaturze pokojowej. Uwaga: octany alditoli są bardzo lotne.</li>
	<li>Dodać 200 μl toluenu i odparować w strumieniu powietrza (x3).</li>
	<li>W końcowych etapach przeprowadza się ekstrakcję octanów alditoli. Najpierw dodać 500 ul octanu etylu i delikatnie zamieszać ruchem okrężnym.</li>
	<li>Dodać 2 ml wody, zakapslować probówki i wymieszać w wortexie.</li>
	<li>Wirować probówki z prędkością 2 000 RPM przez 5 min, aby uzyskać wyraźnie rozdzielone warstwy (octan etylu na górze, woda na dole).</li>
	<li>Nabrać pipetą 50 ul warstwy octanu etylu do fiolek GC/MS z wkładkami.</li>
	<li>Rozcieńczyć, dodając 100 ul acetonu do fiolki GC, i zakapslować. Objętość próbki i objętość rozcieńczenia można dostosować, aby uniknąć przeciążenia GC/MS, jeśli stężenie próbki jest zbyt wysokie. Fiolkę GC można przechowywać w temperaturze 4°C, jeśli analiza GC/MS nie zostanie przeprowadzona natychmiast.</li>
	<li>Próbki wstrzykuje się do chromatografu gazowego (GC) wyposażonego w kwadrupolowy detektor MS, choć odpowiedni jest również detektor izo-jonizacyjny (FID). Stosowana jest kolumna Supelco SP-2380 (30 mm x 0,25 mm x 0,25 μm grubości warstwy) z 4-minutowym opóźnieniem rozpuszczalnika i szybkością przepływu 1,5 ml/min. Wstrzyknięte próbki poddawane są następującemu programowi temperaturowemu: początkowe utrzymanie w 160°C przez 2 min; wzrost temperatury z prędkością 20°C/min do 200°C i utrzymanie przez 5 min; wzrost z prędkością 20°C/min do 245°C i utrzymanie przez 12 min; gwałtowny wzrost do 270°C i utrzymanie przez 5 min przed schłodzeniem do temperatury początkowej 160°C. Piki są identyfikowane na podstawie profili masowych i/lub czasów retencji wzorców. Monosacharydy są ilościowo oznaczane na podstawie krzywych wzorcowych.</li>
</ol>
3. Zawartość celulozy krystalicznej
Metoda ta została w zasadzie opisana przez Updegrafa8. Do tej procedury można wykorzystać kilka rodzajów materiałów wyjściowych: wyizolowany materiał ściany komórkowej (patrz 1) lub materiał ściany poddany już działaniu 2M TFA (patrz 2.8) – albo osad pozostały bezpośrednio po obróbce kwasem (patrz 2.8), albo osad TFA, który został przemyty 2-propanolem i wysuszony.
<ol>
 <li>Do osadu TFA w szklanej probówce z nakrętką dodać 1 ml odczynnika Updegraffa (kwas octowy: kwas azotowy: woda, 8:1:2 v/v). </li>
	<li>Szczelnie zakręcić probówkę, wymieszać w wstrząsarku typu vortex i ogrzewać w bloku grzejnym w temperaturze 100°C przez 30 min. W wyniku tej obróbki w osadzie pozostaje nierozpuszczalna jedynie celuloza krystaliczna.</li>
	<li>Schłodzić próbki w bloku na lodzie do temperatury pokojowej lub niższej.</li>
 <li>Wirować próbki przy 10 000 rpm przez 15 min.</li>
 <li>Odlać nadsącz, dbając o to, aby nie naruszyć osadu i nie usunąć żadnego materiału z osadu. W tym celu pozostawić w probówce ok. 150 µl nadsączu. </li>
	<li>Dodać 1,5 ml wody, wymieszać, wirować i odlać nadsącz w sposób opisany powyżej.</li>
	<li>Powtórzyć procedurę płukania jeszcze 3 razy, używając 1,5 ml acetonu. </li>
	<li>Bardzo delikatnie wysuszyć osad strumieniem powietrza lub pozostawić do wyschnięcia na blacie przez noc.</li>
	<li>Osad (celuloza krystaliczna) jest teraz całkowicie hydrolizowany do glukozy poprzez tzw. hydrolizę Saemana. W tym celu do probówki Sarstedt dodać 175 μl 72% kwasu siarkowego.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min, wymieszać w wstrząsarku typu vortex i inkubować przez kolejne 15 min.</li>
	<li>Dodać 825 μl wody i wymieszać w wstrząsarku typu vortex.</li>
	<li>Wirować próbki przy 10 000 rpm przez 5 min. W probówce może pozostać brązowy nierozpuszczalny materiał, czyli lignina. </li>
	<li>Zawartość glukozy w nadsączu oznaczono za pomocą kolorymetrycznego testu antronowego. Oznaczanie to wykonuje się na polistyrenowej płytce mikrotitracyjnej z 96 dołkami.</li>
	<li>Do krzywej wzorcowej należy użyć roztworu stokowego glukozy o stężeniu 1 mg/ml (przechowywanego w 0°C) i przygotować dublety standardów 0, 2, 4, 6, 8 i 10 µg poprzez pipetowanie 0, 2, 4, 6, 8 i 10 µl do oddzielnych, odpowiednich dołków. Każdy dołek należy uzupełnić wodą do objętości 100 µl.</li>
	<li>Do oddzielnych dołków na tej samej płytce mikrotitracyjnej co standardy dodać 10 μl nadsączu z każdej próbki oraz 90 ml wody. </li>
	<li>Dodać 200 μl świeżo przygotowanego odczynnika antronowego (antron rozpuszczony w stężonym kwasie siarkowym, 2 mg antronu/ml kwasu siarkowego).</li>
	<li>Ogrzewać płytkę przez 30 min w temperaturze 80°C w piecu (używając aluminiowego rozpraszacza ciepła). Próbki zawierające glukozę zmieniają kolor z żółtego na niebiesko-zielony.</li>
	<li>Pozostawić płytkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej i dokładnie wstrząsnąć. </li>
	<li>Odczytać absorbancję płytki przy 625 nm za pomocą czytnika płytek mikrotitracyjnych.</li>
	<li>Ilość glukozy (a tym samym zawartość celulozy krystalicznej) oblicza się na podstawie absorbancji w odniesieniu do krzywej wzorcowej wyznaczonej na tej samej płytce.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Przykład analizy ścian komórkowych przedstawiono na rysunku 2. W tym przypadku łodyga topoli (drewno) została poddana analizie zgodnie z różnymi procedurami opisanymi w sekcji protokołu. Skład polisacharydowy macierzy został zilustrowany przykładowym chromatogramem identyfikującym typowe cukry obecne w ścianach komórkowych roślin: fukozę, ramnozę, ksylozę, arabinozę, galaktozę, mannozę i glukozę (oraz standard wewnętrzny inozytol). Głównym komponentem hemicelulozowym topoli jest ksylan, co potwierdza wysoka zawartość ksylozy. Należy jednak pamiętać, że zawartość tych cukrów będzie się różnić w zależności od zastosowanego surowca4. Glukoza w tej analizie pochodzi z hemicelulozy ksyloglukanu oraz celulozy amorficznej. Dzięki przeprowadzonej analizie dane mogą być przedstawione jako mol% lub ug/ mg materiału ścian komórkowych (lub masy suchej). Zawartość celulozy krystalicznej jest oczywista; można oczekiwać wartości od 20-50% suchej masy ścian komórkowych. Na podstawie wyników przedstawionych tutaj oraz w części I3, skład lignocelulozowy drewna topoli wynosi 21% ligniny, 30% hemiceluloz i 41% celulozy krystalicznej. Pozostała część to popiół.
<img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig1.jpg" alt="Schemat procesu izolacji ścian komórkowych; analiza ligniny i polisacharydów poprzez hydrolizę, GC/MS oraz testy analityczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1: Przegląd analizy lignocelulozowej. Ściany komórkowe (frakcje lignocelulozowe) są izolowane z surowego, wysuszonego materiału roślinnego. Następnie materiał ścian komórkowych jest ważony w aliquoty i dzielony na części do poszczególnych testów analitycznych. Skład polisacharydów macierzy ustala się po potraktowaniu materiału ścian słabym kwasem (2M TFA), przeprowadzeniu derywatyzacji otrzymanych rozpuszczonych monosacharydów do postaci octanów alditoli oraz analizie metodą GC-MS. Osad po obróbce słabym kwasem jest przemywany tzw. odczynnikiem Updegraffa, w wyniku czego pozostaje jedynie nierozpuszczalna celuloza krystaliczna. Celuloza jest solubilizowana kwasem siarkowym i oznaczana ilościowo za pomocą testu kolorymetrycznego określającego zawartość glukozy. Równolegle można oznaczyć zawartość i skład ligniny zgodnie z opisem w Części I3.
<img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig2.jpg" alt="Chromatografia gazowa z wykresami słupkowymi składu monosacharydowego; analiza zawartości polisacharydów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2: Kompleksowa analiza lignocelulozowa drewna topoli. Wióry drewna topoli (Populus tremoloides) poddano opisanemu protokołowi. Góra po lewej: Skład polisacharydów macierzy; Fuc fukoza; Rha ramnoza; Ara arabinoza; Xyl ksyloza; Man mannoza; Gal galaktoza; Glc glukoza; inositol standard wewnętrzny.

<ol><li>Albersheim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+analysis+of+sugars+in+plant+cell+wall+polysaccharides+by+gas-liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">A method for the analysis of sugars in plant cell wall polysaccharides by gas-liquid chromatography.</a> Carbohydr. Res. 5, 340-340 (1967).</li>
<li>Carroll, A., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulosic+Biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellulosic Biofuels.</a> Annu Rev Plant Biol. 60, 165-165 (2009).</li>
<li>Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+compositional+analysis+of+Plant+Cell+Walls+%28Lignocellulosic+biomass%29%2C+Part+I%3A+Lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part I: Lignin.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li>
<li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).</li>
<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant-cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward a systems approach to understanding plant-cell walls.</a> Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).</li>
<li>Teeri, T. T., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterisation+and+applications+of+enzymes+from+the+wood-forming+tissues+of+poplar%3A+Glycosyl+transferases+and+xyloglucan+endotransglycosylases%5BTitle%5D)+AND+%22Biocatalysis+and+Biotransformation%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterisation and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endotransglycosylases.</a> Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).</li>
<li>UPDEGRAF, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEMIMICRO+DETERMINATION+OF+CELLULOSE+IN+BIOLOGICAL+MATERIALS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">SEMIMICRO DETERMINATION OF CELLULOSE IN BIOLOGICAL MATERIALS.</a> Anal. Biochem. 32 (3), 420-420 (1969).</li>
</ol>

Opisane metody umożliwiają szybką ilościową ocenę składu lignocelulozowej biomasy roślinnej. Metoda ta pozwala na określenie składu takich materiałów, w tym składu cukrowego polisacharydów macierzy, mianowicie hemiceluloz, oraz zawartości celulozy krystalicznej. Przepustowość poszczególnych metod analitycznych w przeliczeniu na jedną osobę jest zróżnicowana. Zastosowanie opisanych tutaj protokołów pozwala na przetworzenie 20 próbek w celu analizy składu polisacharydów macierzy oraz 30 próbek w celu oznaczenia zawartości celulozy krystalicznej. Dzięki ilościowemu charakterowi danych możliwe jest ocenienie optymalnych roślin surowcowych, odmian lub genotypów pod kątem ich przydatności do produkcji biopaliw.

<table><tbody><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>myo-Inozytol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>Borewodorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>Pirydyna</td><td>JT Baker</td><td>3348-01</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Spectromax Plus 384</td><td>Molecular Devices</td><td>Plus384</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>7890A GC/5975C MSD</td><td></td></tr><tr><td>Stalowe kulki 5.5mm</td><td>Salem Ball Company</td><td>(N/A)</td><td></td></tr><tr><td>Radiator do płytek 96-dołkowych</td><td>Biocision</td><td>Coolsink 96F</td><td></td></tr><tr><td>Młyn Retsch</td><td>Qiagen</td><td>TissueLyser II</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzejny</td><td>Techne</td><td>Dri-block DB-3D</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator próbek</td><td>Techne</td><td>FSC400D</td><td></td></tr></tbody></table>

kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasy lignocelulozowej) część ii: węglowodany

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

Potrzeba odnawialnych, neutralnych pod względem emisji dwutlenku węgla i zrównoważonych surowców dla przemysłu i społeczeństwa stała się jedną z najpilniejszych kwestii XXI wieku. Przyczyniło się to do odnowienia zainteresowania wykorzystaniem produktów roślinnych jako surowców przemysłowych do produkcji paliw płynnych do transportu2i inne produkty, takie jak materiały biokompozytowe6Biomasa roślinna pozostaje jednym z największych niewykorzystanych zasobów na planecie4Składa się ona głównie ze ścian komórkowych zbudowanych z bogatych w energię polimerów, w tym celulozy, różnych hemiceluloz oraz polifenolowej ligniny5i stąd bywają one nazywane materiałami lignocelulozowymi. Jednakże ściany komórkowe roślin ewoluowały tak, aby były oporne na degradację, ponieważ w znacznym stopniu przyczyniają się do wytrzymałości i integralności strukturalnej całej rośliny. Pomimo niezbędnej sztywności, ściana komórkowa jest wysoce dynamiczną jednostką, która jest metabolicznie aktywna i odgrywa kluczową rolę w licznych procesach komórkowych, takich jak wzrost i różnicowanie roślin5Ze względu na różnorodne funkcje ścian komórkowych, w ścianach różnych gatunków roślin oraz w różnych typach komórek w obrębie jednej rośliny występuje ogromna różnorodność strukturalna.4Zatem w zależności od tego, jaki gatunek uprawy, odmiana lub tkanka roślinna jest wykorzystywana w biorafinerii, etapy przetwarzania w celu depolimeryzacji za pomocą procesów chemicznych/enzymatycznych oraz następująca po nich fermentacja różnych cukrów do płynnych biopaliw muszą zostać dostosowane i zoptymalizowane. Fakt ten uzasadnia potrzebę dokładnej charakterystyki surowców z biomasy roślinnej. Przedstawiamy tutaj kompleksową metodologię analityczną, która umożliwia określenie składu materiałów lignocelulozowych i nadaje się do analiz o średniej i wysokiej przepustowości (Rycina 1). Metoda rozpoczyna się od przygotowania materiału ścian komórkowych pozbawionego skrobi. Otrzymane materiały lignocelulozowe są następnie dzielone w celu określenia składu monosacharydowego hemiceluloz i innych polisacharydów macierzy1 oraz zawartości celulozy krystalicznej7Protokół analizy składników ligniny w biomasie lignocelulozowej został omówiony w Części I3(Empty source HTML provided)

Biomasa roślinna jest głównym, neutralnym pod względem emisji dwutlenku węgla odnawialnym zasobem, który może być wykorzystywany do produkcji biopaliw. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, które są strukturalnie złożonym materiałem kompozytowym zwanym lignocelulozą. W niniejszej pracy opisujemy protokół kompleksowej analizy zawartości i składu węglowodanów pochodzących ze ścian komórkowych.

Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasy lignocelulozowej) Część II: Węglowodany

Konieczność pozyskania odnawialnych, neutralnych pod względem emisji dwutlenku węgla i zrównoważonych surowców dla przemysłu i społeczeństwa stała się jedną z najpilniejszych kwestii XXI wieku...

Wyznaczanie składu polisacharydów macierzy oraz zawartości krystalicznej celulozy w ścianach komórkowych roślin rozpoczyna się od wysuszonego materiału roślinnego, który poddawany jest różnym ekstrakcjom. Uzyskany materiał składa się wyłącznie ze ścian komórkowych, a następnie jest dzielony w celu określenia składu polisacharydów macierzy. Materiał ścian komórkowych traktuje się słabym kwasem, aby zhydrolizować niekrystaliczne polisacharydy, głównie hemicelulozy, do ich monosacharydów.Monosacharydy są następnie przekształcane w odpowiadające im lotne octany aldolowe, które następnie poddawane są analizie i kwantyfikacji za pomocą chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrem mas w celu oznaczenia celulozy krystalicznej. Ściany komórkowe traktuje się odczynnikiem graficznym, będącym mieszaniną kwasów, które usuwają niekrystaliczne komponenty ścian. Pozostała celuloza krystaliczna jest degradowana do monomeru glukozy, który może być oznaczany kolorymetrycznie.Wyznaczanie zawartości i składu ligniny zostało zaprezentowane w innej publikacji wideo JoVE zatytułowanej Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin, część pierwsza Lignina. Witajcie, jestem Marcus Pauley, kierownik laboratorium analitycznego ścian komórkowych w Great Lakes Bioenergy Research Center na Michigan State University. Jestem Cliff Foster, menedżer laboratorium analitycznego ścian komórkowych.Dzisiaj pokażemy Państwu, jak określić skład polisacharydów obecnych w materiale ścian komórkowych roślin, czyli celulozie w różnych rodzajach celuloz Homo. Tutaj, w Great Lakes Bioenergy Research Center, opracowujemy technologię przetwarzania tych cukrów na biopaliwa. Aby zidentyfikować optymalny surowiec roślinny, musimy najpierw ocenić rodzaj i zawartość cukrów obecnych w tej biomasie.W innym filmie pod tytułem Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin, część pierwsza: Lignina, skupimy się na analizie polifenoli. Zacznijmy zatem. Procedurę tę należy rozpocząć od izolacji ścian komórkowych.Rozetrzeć około 60 do 70 miligramów wysuszonego materiału roślinnego za pomocą kulek ze stali nierdzewnej o średnicy 5,5 milimetra w probówce z nakrętką SAR TED o pojemności dwóch ml. Jako wysokoprzepływową alternatywę dla młyna REM należy wykorzystać robota do mielenia i dozowania o nazwie eyewall, zgodnie z opisem w części pierwszej. Po zakończeniu mielenia należy usunąć stalowe kulki.Kontynuuj izolację ścian komórkowych i usuwanie pozostałości skrobi zgodnie z procedurą przedstawioną w pierwszej części oraz opisaną w towarzyszącym protokole pisemnym. Odważ dwa miligramy materiału ścian komórkowych skrobi DS do probówki typu 2 ml. Wysokoprzepustowym sposobem wykonania tego zadania jest użycie robota eyewall.Robot pobiera probówkę zawierającą zmielony materiał roślinny i wykonuje otwór w dnie probówki. Przebita probówka jest następnie umieszczana w podajniku VI. Pusta probówka zostaje umieszczona na wadze i przesunięta pod podajnik VI; za pomocą wibracji materiał przesiąka przez otwór w napełnionej górnej probówce do pustej dolnej probówki, aż do momentu zgromadzenia pożądanej ilości materiału.Dodaj 100 µg acetolu jako standard wewnętrzny. Przepłucz ścianki probówki acetonem, aby zebrać materiał ścian komórkowych na dnie probówki, a następnie bardzo delikatnie odparuj aceton pod strumieniem powietrza. Następnie przeprowadź hydrolizę słabym kwasem.Ostrożnie dodaj 250 µL 2 M kwasu trichlorooctowego lub TFA do każdej próbki, dbając o to, aby materiał nie rozprysnął się na ścianki probówek. Szczelnie zakręć probówki i inkubuj w bloku grzewczym w temperaturze 121 °C przez 90 minut. Następnie schłodź bloki grzewcze i próbki na lodzie, a potem wiruj probówki przy 10 000 RPM przez 10 minut.Przenieś 100 µL kwaśnego supernatantu zawierającego rozpuszczone cukry polisacharydu macierzy do fiolek z nakrętką, uważając, aby nie naruszyć osadu. Osad można wykorzystać do oznaczenia celulozy krystalicznej. Odparuj TFA w szklanej probówce pod łagodnym strumieniem powietrza w urządzeniu do odparowywania.Dodaj 300 µL propan-2-olu, aby usunąć nadmiar kwasu, wymieszaj w wortexie i odparuj w temperaturze 25 °C. Powtórz czynność łącznie trzy razy. W celu umożliwienia identyfikacji monosacharydów za pomocą chromatografii gazowej przeprowadź derywatyzację do octanu aldolu.W pierwszej kolejności należy zredukować monosacharydy do odpowiadających im otwartych pierścieni aldoli, które następnie poddaje się acetylacji. Szczegółowe instrukcje znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym. Każdy etap procedury przebiega zgodnie z wcześniej przedstawionym protokołem: dodanie odczynnika, inkubacja, odparowanie strumieniem powietrza, a następnie usunięcie nadmiaru odczynnika poprzez kolejne etapy przemywania.W końcowych etapach przeprowadza się ekstrakcję octanów aldolowych. Najpierw należy dodać 500 µL octanu etylu i lekko zamieszać. Następnie dodać 2 mL wody, zamknąć probówki i wymieszać w wstrząsarce typu vortex. Probówki należy odwirować przy 2000 RPM przez pięć minut, aby uzyskać wyraźnie oddzielone warstwy, z octanem etylu na górze, zawierającym octany aldolowe, oraz wodą na dole. Następnie należy pipetować 50 µL warstwy octanu etylu do fiolek GC-MS z wkładkami. Próbkę rozcieńcza się, dodając 100 µL acetonu do fiolki GC; tak przygotowane fiolki można przechowywać w temperaturze 4 °C.Jeśli analiza GCMS nie zostanie przeprowadzona niezwłocznie, należy wstrzyknąć próbki do chromatografu gazowego wyposażonego w kwadrupolowy spektrometr mas. W celu uzyskania informacji na temat kolumny oraz szczegółów przebiegu analizy prosimy o zapoznanie się z towarzyszącym protokołem pisemnym. Materiałem wyjściowym do oznaczania zawartości celulozy krystalicznej może być wyizolowany materiał ścian komórkowych lub materiał ścian poddany uprzednio działaniu słabego kwasu TFA, albo bezpośrednio po obróbce kwasowej, albo w formie wysuszonej przeznaczonej do przechowywania.Po usunięciu nadmiaru TFA izopropanolem, zgodnie z wcześniej opisananą procedurą, do osadu TFA w probówkach dodaj 1 M odczynnika do degradacji, składającego się z kwasu octowego, kwasu azotowego i wody, w stosunku objętościowym od 8:1 do 2:1. Szczelnie zamknij probówkę, wymieszaj w wstrząsarzu Vortex i inkubuj na bloku grzejnym w temperaturze 100 °C przez 30 minut. W wyniku tej obróbki w osadzie pozostaje jedynie celuloza krystaliczna.Wszystkie pozostałe polisacharydy poddaje się hydrolizie. Próbki schładza się w bloku na lodzie do temperatury pokojowej lub niższej. Następnie próbki wiruje się z prędkością 10 000 RPM przez 15 minut. Po wirowaniu odrzuca się nadsącz, dbając o to, aby nie naruszyć osadu i nie usunąć żadnego materiału z niego pochodzącego. W tym celu w probówce pozostawia się około 150 µL nadsączu, a następnie kilkukrotnie przemywa osad wodą.Następnie przeprowadź hydrolizę kwasową przy użyciu stężonego kwasu siarkowego, aby całkowicie zhydrolizować kryształy i pelet celulozy do glukozy. Rozpocznij od dodania 175 µL 72% kwasu siarkowego do probówki typu sarta i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po wstępnej inkubacji wymieszaj próbkę w wortexie i inkubuj przez kolejne 15 minut.Następnie należy dodać 825 µL wody, wymieszać na wirówce typu vortex, a następnie odwirować próbki przy 10 000 RPM przez pięć minut. W probówce może pozostać pewna ilość brązowego, rozpuszczalnego materiału, głównie ligniny, podczas gdy glukoza znajduje się w nadfiltracie. Zawartość glukozy w nadfiltracie oznacza się za pomocą kolorymetrycznego testu antonowego.Analizę tę przeprowadza się w 96-dołkowej polistyrenowej płytce mikrotytrującej. Należy przygotować krzywą wzorcową dla glukozy w dwóch powtórzeniach, zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym protokole pisemnym. Próbki przygotowuje się, łącząc 10 µL każdej próbki (nadpłynu) z 90 µL wody w osobnych dołkach tej samej płytki mikrotytrującej, co wzorce, a następnie dodając 200 µL świeżo przygotowanego odczynnika.Następnie podgrzewaj płytkę przez 30 minut w temperaturze 80 °C w piekarniku z aluminiowym rozpraszaczem ciepła. Zauważ, że próbki zawierające glukozę zmieniają kolor z żółtego na niebiesko-zielony po zakończeniu podgrzewania. Pozostaw płytkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej i dokładnie wstrząśnij.Odczytaj absorbancję przy 625 nanometrach za pomocą czytnika płytek mikrotytrowych. Zawartość glukozy, będącej jednostką budulcową celulozy, oblicza się na podstawie absorbancji w odniesieniu do krzywej wzorcowej wyznaczonej na tej samej płytce. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy polisacharydów fragmentu drewna topoli.Piki na chromatogramie gazowym są identyfikowane na podstawie profilu masy i/lub czasów retencji standardów. Monosacharydy są ilościowo określane na podstawie krzywych wzorcowych. Analiza cukrów polisacharydów matrycy wykazuje wysoką zawartość ksylozy, reprezentującej hemicelulozę xam, choć obecne są również inne cukry.Z analizy wynika, że 40% materiału topolnego składa się z kryształów i celulozy. Należy pamiętać, że zawartość i skład tych komponentów mogą się różnić w zależności od rośliny lub pomiędzy różnymi strukturami anatomicznymi rośliny. Przedstawiliśmy sposób wyznaczania zawartości polisacharydów oraz analizy składu biomasy lignocelulozowej w celu analizy ligniny polifenolowej.Zapraszamy do obejrzenia pierwszej części. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w eksperymentach.

comprehensive-compositional-analysis-plant-cell-walls-lignocellulosic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wszechstronna analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) Część II: Węglowodany

Biomasa roślinna jest głównym neutralnym węglowo zasobem odnawialnym, który może być wykorzystany do produkcji biopaliw. Biomasa roślinna składa się głównie ze ścian komórkowych, które są strukturalnie złożonym materiałem kompozytowym zwanym lignocelulozą. W niniejszej pracy opisujemy protokół kompleksowej analizy zawartości i składu ligniny polifenolowej.

Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasa lignocelulozowa) Część I: Lignina

Opisano szybką metodę pozwalającą na poznanie struktury polisacharydów w macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje specyficzność glikozylohydrolaz oraz czułość spektrometrii mas, co umożliwia analizę niewielkich ilości materiału. Technikę tę można dostosować do bezpośredniego zastosowania w tkance.

Profilowanie masy oligosacharydów (OLIMP) wielocukrów zewnątrzkomórkowych

Przedstawiono metodę opartą na konfokalnej mikroskopii Ramanowskiej, która umożliwia bezznakową wizualizację ligniny w ścianach komórkowych roślin oraz porównanie procesu lignifikacji w różnych tkankach, próbkach lub gatunkach.

Bez znakowania in situ Obrazowanie lignifikacji w ścianach komórkowych roślin

Opisano technikę o nazwie Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP), służącą do charakterystyki glikanów ścian komórkowych roślin. Metoda ta łączy specyficzność przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko określonym epitopom glikanów z miniaturową analityczną platformą mikromacierzy, która umożliwia przesiewowe badanie występowania glikanów w szerokim zakresie kontekstów biologicznych.

Profilowanie glikanów polimerów ściany komórkowej roślin z wykorzystaniem mikromacierzy

Celem tych badań było stworzenie syntetycznej tkanki ściany komórkowej roślinnej przy użyciu warstwa po warstwie składania włókienek nanocelulozowych i izolowanej ligniny złożonej z rozcieńczonych zawiesin wodnych. Techniki pomiaru powierzchni mikrowagi kryształów kwarcu i mikroskopii sił atomowych zostały wykorzystane do monitorowania tworzenia polimerowo-polimerowego materiału nanokompozytowego.

W kierunku biomimiki drewna: wytwarzane wolnostojące folie z nanocelulozy, ligniny i syntetycznej polikacji

Technika dwuniciowej interferencji RNA (dsRNAi) jest stosowana do obniżania poziomu genu reduktazy cynamoylokoenzymu A (ZmCCR1) w kukurydzy w celu obniżenia zawartości ligniny roślinnej. Regulacja w dół ligniny ze ściany komórkowej jest wizualizowana za pomocą analiz mikroskopowych i określana ilościowo metodą Klasona. Analizowane są zmiany składu hemicelulozy i celulozy krystalicznej.

Regulacja ligniny w dół Zea mays za pomocą dsRNAi i analizy ligniny Klason

Struktura ściany komórkowej roślin i cechy chemiczne są oceniane w celu zidentyfikowania idealnych surowców do produkcji biopaliw i biomateriałów. Standardowe metody mają ograniczenia, gdy są stosowane do dużych zestawów danych. Te wysokoprzepustowe metody obróbki wstępnej, scukrzania enzymatycznego i pirolizy ze spektrometrią mas wiązki molekularnej porównują dużą liczbę próbek biomasy przy skróconym czasie i kosztach eksperymentu.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe zmian oporności biomasy lignocelulozowej: lignina całkowita, monomery ligniny i enzymatyczne uwalnianie cukru

Ten protokół ma na celu przedstawienie ogólnej metody wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianach komórkowych roślin za pomocą obrazowania Ramana i analizy wielowymiarowej.

Połączenie obrazowania ramanowskiego i analizy wielowymiarowej w celu wizualizacji ligniny, celulozy i hemicelulozy w ścianie komórkowej rośliny

Opisano protokół analizy strukturalnej polisacharydów metodą elektroforezy żelowej (PACE), na przykładzie mannanu.

Charakterystyka strukturalna polisacharydów ściany komórkowej Mannanów w roślinach przy użyciu PACE

Przedstawiono protokół przygotowania 13 C,15znakowanych N próbek grzybów i roślin do wielowymiarowej spektroskopii NMR w ciele stałym i badań dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP).

Przygotowanie materiałów grzybowych i roślinnych do wyjaśnienia strukturalnego za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej w stanie stałym NMR

Metoda Updegraff jest najczęściej używaną metodą szacowania celulozy. Głównym celem tej demonstracji jest dostarczenie szczegółowego protokołu Updegraff do szacowania zawartości celulozy w próbkach biomasy roślinnej.

Oznaczanie zawartości celulozy krystalicznej w biomasie roślinnej metodą Updegraff

Poznaj metodę analizy węglowodanów ścian komórkowych roślin z wykorzystaniem chromatografii gazowej i spektrometrii mas. Protokół umożliwia ilościowe oznaczanie polisacharydów macierzystych oraz krystalicznej celulozy w biomasie lignocelulozowej.

Kompleksowa analiza składu ścian komórkowych roślin (biomasy lignocelulozowej) Część II: Węglowodany

Przeglądaj więcej filmów