Name: Oczyszczanie szczepu M. magneticum AMB-1 Białko związane z magnetosomami MamAΔ41 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-25T16:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Poznaj protokół oczyszczania białka MamAΔ41 z magnetosomami M. magneticum AMB-1 przy użyciu chromatografii afinitowej, jonowymiennej i rozmiarowej. Metoda ta umożliwia badanie struktury i funkcji białek związanych z magnetosomami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować dr. Amirowi Aharoniemu za wsparcie oraz Geuli Davidov, Noamowi Grimbergowi i Chen Guttmanowi za ich rady i uwagi.

1. Klonowanie i ekspresja genu mamA w E. coli
Zmutowany gen mamAΔ41 został namnożony metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z DNA genomowego Magnetospirillum magneticum AMB-1, z wykorzystaniem starterów: 5'-GCATTACGCATGGACGACATCCGCCAGGTG-3' oraz 5'-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3'. W amplifikowanych fragmentach DNA wprowadzono miejsce rozpoznawane przez enzym NcoI w kodonie startowym ATG, a kodon stop zastąpiono miejscem rozpoznawanym przez enzym SacI. Fragmenty poddano trawieniu enzymami NcoI i SacI, a następnie sklonowano w odpowiednie miejsca wektora pET52b(+), otrzymując pET52bMamAΔ41-AMB1. W tej konstrukcji mamAΔ41 gen został połączony w ramce odczytu z etykietą 10-His na końcu C. Plazmid wprowadzono do szczepu E. coli BL21 za pomocą elektroporacji. Szczep E. coli BL21 zawierający pET52bMamAΔ41 hodowano w warunkach autoindukcji (15) podłoże zawierające ampicylinę (50 mg/ml) 310°K przez 3 godziny. Następnie zmieniono temperaturę hodowli z 310° Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do przetłumaczenia. 300°K i utrzymywano przez dodatkowe 48 h w 300°KKomórki zebrano poprzez wirowanie przy 5465g przez 10 min w temperaturze 277°K8 litrów hodowli pozwoliło uzyskać 60 gramów mokrego osadu komórkowego.
2. Obliczenia bioinformatyczne
Obliczenia masy cząsteczkowej (MW), zgodnie z sekwencją aminokwasów oraz przewidywaną absorbancją 1mg/1ml białka przy 280nm, wykonano przy użyciu serwera ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html). Dla 10His-Tag-MamAΔ41 MW wynosi 2529 Da (240 aminokwasów), a dla MamAΔ41 (z pozostałymi 9 aminokwasami po usunięciu His-tagu przez trombinę) MW wynosi 20596.5Da (187 aminokwasów). Przewidywana absorbancja 1mg/1ml białka przy 280nm dla 10His-Tag-MamAΔ41 wynosi 0,595, a dla MamAΔ41 0,579. Dodatkowo sekwencja aminokwasowa nie zawiera żadnych reszt cysteiny. W związku z tym podczas procesu oczyszczania nie są wymagane środki redukujące.
3. Oczyszczanie MamAΔ41
<ol>
 <li>W celu przygotowania roztworów stokowych odważić i przygotować (po 20 ml każdego z nich) w następujących stężeniach: roztwór imidazolu (MW 228,2 g/mol) 4M, roztwór NaCl (Mw 58,4 g/mol) 5M, roztwór Tris-HCl (Mw 121,3 g/mol) 1M, dostosowując pH=8. Dodać wodę dwukrotnie destylowaną (DDW) i mieszać za pomocą vortexa do momentu, aż roztwór stanie się klarowny. Przefiltrować roztwory przez filtr 0,2μm i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przygotować i przefiltrować 6 świeżych buforów z roztworów stokowych (Tabela 1).</li>
 <li>Rozcieńczyć i zawiesić komórki w buforze A w stosunku 1:2 (gramy komórek do objętości buforu w ml).</li>
 <li>Dodać DNazę I (1 mg/ml) w ilości 10μl na każde 10g bakterii, aby rozbić fragmenty DNA w próbce. Dodać koktajl inhibitorów proteaz bez EDTA w ilości 1ml na każde 20g bakterii. Inkubować przez 20 min na lodzie.</li>
 <li>Zdestabilizować komórki poprzez dwa cykle w prasie francuskiej (French press) przy 25 0 psi. W przeciwieństwie do sonikacji, prasa francuska służy do ekstruzji dużych objętości komórek (&gt;10ml) poprzez wymuszanie ich przejścia pod wysokim ciśnieniem przez wąski otwór. Tłok należy chłodzić na lodzie przez dziesięć minut przed użyciem i montażem ze względu na wzrost temperatury.</li>
 <li>Przenieść lizowane komórki do probótek do ultracentryfugi o pojemności 25ml i precyzyjnie zrównoważyć je (50mg) buforem A, aż próbka osiągnie linię szyjki probówki.</li>
 <li>Oddzielić szczątki komórkowe poprzez ultracentryfugację przy 270 0g przez 1 godzinę w temperaturze 27°K.</li>
 <li>Przygotować kolumnę Ni NTA do chromatografii grawitacyjnej (średnica 2,5cm), dodając do kolumny 4 ml żywicy Ni NTA, przechowywanej w 20% etanolu. Poczekać, aż ciecz całkowicie spłynie, a następnie przemyć 40 ml DDW i ponownie poczekać na całkowite spłynięcie cieczy. Przeekwilibrować żywicę w kolumnie 40 ml buforu A.</li>
 <li>Nałożyć frakcję rozpuszczalną z probótek po ultracentryfugacji na kolumnę Ni NTA. Poczekać, aż ciecz spłynie, zebrać przepłuczynę (białka niezwiązane) i przechowywać w temperaturze 27K.</li>
 <li>Zebrać próbkę osadu z probótek po ultracentryfugacji, zeskrobując osad za pomocą małego końcówki. Wymieszać końcówkę w 50μl 5% β-merkaptoetanolu w buforze do próbek 2X SDS-PAGE.</li>
 <li>Przemyć kolumnę 100 ml buforu B. Poczekać, aż ciecz spłynie, zebrać przepłuczynę i przechowywać w temperaturze 27K.</li>
 <li>Przygotować 15 oznakowanych probótek eppendorfowskich (1,5ml).</li>
 <li>Elucja – zamknąć zawór kolumny, a następnie nałożyć na kolumnę 1ml buforu C; inkubować przez 3 min, po czym otworzyć zawór i zebrać przepłuczynę. Powtórzyć ten krok trzykrotnie.</li>
 <li>Eluować resztę zawiesiny w przyrostach 1 ml buforu C i zamknąć zawór.</li>
 <li>Zmierzyć OD przy 280nm dla frakcji i ocenić położenie piku białkowego; jeśli OD nadal wynosi &gt;0,3, konieczne jest pobranie dodatkowych próbek.</li>
 <li>Analiza SDS-PAGE zebranych frakcji. Taką analizę należy przeprowadzić również dla następujących próbek: przepłuczyn z białkami niezwiązanymi, przepłuczyn z przemywania oraz próbki osadu po ultracentryfugacji. Wymieszać 10μl każdej próbki z 10μl 5% β-merkaptoetanolu w buforze do próbek 2X SDS-PAGE. Nałożyć próbki na żel 15% SDS-PAGE i prowadzić elektroforezę przez 45 min przy 180 V.</li>
 <li>Barwić żel w 15 ml roztworu InstantBlue, wstrząsając przez 1 godzinę. Upewnić się, że plastikowe pudełko jest przykryte i chronione przed światłem.</li>
 <li>Ocenić żel; jeśli ekspresja białka jest wysoka i specyficzna zgodnie ze wskaźnikowymi prążkami, połączyć wybrane frakcje elucyjne.</li>
 <li>W celu usunięcia 10-His-tag dodać do połączonej próbki trombinę bydlęcą (10 jednostek/μl), w proporcji 10μl trombiny na 1 mg białka, zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
 <li>Dializę stosuje się do usunięcia nadmiaru imidazolu i obniżenia stężeń NaCl do poziomów wymaganych podczas wiązania w wymianie jonowej. Do dializy odciąć pożądany odcinek tubingu dializacyjnego o progu odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 7 kD. Przemyć DDW i zawiązać węzeł na jednym końcu (lub zabezpieczyć klipsami). Przenieść połączony roztwór białka do worka, pozostawiając nieco miejsca na górze i zacisnąć.</li>
 <li>Zanurzyć tubing dializacyjny w 4 litrach schłodzonego buforu do dializy (Bufor D). Mieszać roztwór powoli przez noc w temperaturze 27°K.</li>
 <li>Wyjąć tubing dializacyjny z zlewki, wykonać małe nacięcie i przenieść białko do probówki 50ml.</li>
 <li>Chromatografia wymiany jonowej: zamontować przygotowaną kolumnę MonoQ 4.6/10 PE w systemie szybkiej chromatografii cieczowej (FPLC). Przemyć kolumnę 5 objętościami kolumny (CV) filtrowanej wody DDW. Przeekwilibrować kolumnę 5 CV buforu D.</li>
 <li>Przemyć pętlę wtryskową DDW (dwukrotna objętość pętli), a następnie powtórzyć czynność z buforem D. Nałożyć białko do pętli wtryskowej.</li>
 <li>Wtrysnąć próbkę białka (przepływ 1 ml/min) i rozpocząć zbieranie frakcji do detekcji białek niezwiązanych metodą SDS-PAGE.</li>
 <li>Jeśli początkowa objętość białka (krok 3.23) jest większa niż objętość pętli wtryskowej, powtarzać kroki 3.25-3.26, bez przemywania pętli, aż cała próbka zostanie nałożona na kolumnę.</li>
 <li>Przemyć kolumnę 3 CV buforu C w celu usunięcia białek niezwiązanych.</li>
 <li>Eluować białko za pomocą 60-minutowego gradientu liniowego od 40 do 200mM NaCl pomiędzy buforem D a E (gdzie 10% buforu E stanowi koniec gradientu), przy przepływie 1 ml/min (można zastosować wyższe przepływy kosztem większych objętości, ale mniej skoncentrowanych pików białkowych). Zbierać piki białkowe w momencie ich pojawienia się na chromatogramie przy 280nm.</li>
 <li>Oczyścić kolumnę zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
 <li>Analiza SDS-PAGE zebranych frakcji. Analizę tę należy przeprowadzić dla następujących próbek: przepłuczyn z białkami niezwiązanymi oraz przepłuczyn z pikami białkowymi. Przeprowadzić SDS-PAGE i barwienie zgodnie z instrukcjami w krokach 3.17-3.18.</li>
 <li>Ocenić żel pod kątem obecności prążków białkowych przy przewidywanej masie cząsteczkowej (Mw) zgodnie z markerem białkowym wstępnie barwionym. Połączyć wybrane frakcje elucyjne zawierające odpowiednie białko.</li>
 <li>Przeprowadzić dializę połączonych próbek w celu obniżenia stężenia NaCl wymaganego do chromatografii wykluczania sterycznego. Dializę przeprowadzić zgodnie z krokami 3.21-3.23 przeciwko buforowi F.</li>
 <li>Skoncentrować próbkę białka za pomocą Vivaspin-15 10 00 MWCO do stężenia 8 mg/ml w wirówce stołowej, 40 rpm. Zweryfikować pożądane stężenie, mierząc OD przy 280nm w kuwecie kwarcowej. Jeśli białko jest zbyt skoncentrowane, rozcieńczyć je buforem F i zmierzyć ponownie.</li>
 <li>Zamontować przygotowaną kolumnę do wykluczania sterycznego, HiLoad 26/60 Superdex 20, w systemie FPLC; przemyć kolumnę 3 CV filtrowanej wody DDW. Przeekwilibrować kolumnę 3 CV buforu F.</li>
 <li>Przemyć pętlę wtryskową 5ml DDW (dwukrotna objętość pętli), a następnie taką samą objętością buforu F. Nałożyć nie więcej niż 4 ml próbki białka do pętli wtryskowej.</li>
 <li>Wtrysnąć próbkę białka (przepływ 3,5 ml/min) i rozpocząć zbieranie frakcji piku białkowego w momencie ich pojawienia się na chromatogramie przy 280nm. Pozostawić przepływ buforu do momentu osiągnięcia objętości kolumny.</li>
 <li>Jeśli początkowa objętość białka (krok 3.23) jest większa niż objętość pętli wtryskowej, powtarzać kroki 3.25-3.26, bez przemywania pętli, aż cała próbka zostanie nałożona na kolumnę.</li>
 <li>Oczyścić kolumnę zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
 <li>Analiza SDS-PAGE zebranych frakcji. Analizę tę należy przeprowadzić dla próbek z pików białkowych. Przeprowadzić SDS-PAGE i barwienie zgodnie z instrukcjami w krokach 3.17-3.18.</li>
 <li>Ocenić żel: jeśli piki białkowe są specyficzne, mają prawidłową przewidywaną Mw zgodnie z markerem białkowym wstępnie barwionym i widoczny jest tylko jeden prążek, połączyć wybrane frakcje elucyjne odpowiedniego białka.</li>
 <li>Skoncentrować próbkę białka za pomocą Vivaspin-15 10 0 MWCO do stężenia &gt;20 mg/ml w wirówce stołowej, 40 rpm. Zweryfikować pożądane stężenie, mierząc OD przy 280nm. Oczyszczony MamAΔ41 został następnie skoncentrowany do 26,5 mg/ml w celu krystalizacji.</li>
 <li>Potwierdzić czystość próbki i tożsamość białka za pomocą desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej macierzą (MALDI-TOF).</li>
 <li>Jeśli białko zostało oczyszczone zgodnie z wynikami spektrometru mas i SDS-PAGE, podzielić skoncentrowany MamAΔ41 do wcześniej oznakowanych probótek eppendorfowskich; po 25-50μl białka do każdej.</li>
 <li>Szybko zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze 193°K.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Przy prawidłowym przeprowadzeniu tego protokołu powinny zostać otrzymane wysokiej czystości, jednorodne pod względem rozmiaru i skoncentrowane próbki białka. Próbki te są następnie gotowe do prób krystalizacji oraz badań biochemicznych, takich jak kinetyka enzymatyczna, powinowactwo wiązania i inne. Opisano tutaj reprezentatywne wyniki głównych etapów protokołu oczyszczania. Analiza SDS-PAGE profilu elucji z kolumny powinowactwa Ni-NTA powinna wykazać silną nadekspresję białka w frakcji rozpuszczalnej przy odpowiedniej masie cząsteczkowej ok. 22kDa (Rycina 1). Analiza SDS-PAGE powinna również wykazać minimalną ilość białka, lub jego całkowity brak, w części przepływowej białek niewiązanych, w części przepływowej płukania oraz w osadzie po ultrawirowaniu. Jeśli w tych próbkach pojawią się wyraźne prążki odpowiedniego białka, należy rozważyć błędne przygotowanie buforu, problemy z rozbiciem komórek lub problemy z warunkami autoindukcji i wzrostem kultury.
Chromatografię wymiany jonowej przeprowadza się w celu oddzielenia pożądanego białka od pozostałych białek E.coli, które związały się z żywicą niklową (na skutek oddziaływań elektrostatycznych lub obecności pętli białkowych bogatych w histydynę/aminokwasy kwasowe) oraz od nieprzeciętego białka z His-Tagiem. Kolumna ta rozdziela białka w zależności od ich powinowactwa do dodatnio naładowanej żywicy przy rosnącym stężeniu NaCl. Białka o silnym ładunku ujemnym będą eluować przy wyższych stężeniach NaCl w porównaniu do białek o umiarkowanym ładunku ujemnym. Zaletami tej kolumny są wysoka szybkość przepływu oraz pojemność wiązania. Chromatogram wymiany jonowej (Rysunek 2) wykazuje dobrą separację trzech populacji białek przy rosnącym stężeniu NaCl. Niezbędna jest analiza SDS-PAGE w celu określenia masy cząsteczkowej (MW) każdej populacji, wyizolowania tej pożądanej oraz oceny, czy konieczne są dalsze etapy oczyszczania. Pierwsza populacja to MamAΔ41 (~20 kDa), druga to MamAΔ41+His Tag (~2kDa), który nie został przecięty przez trombinę bydlęcą, a trzecia populacja jest niewykrywalna w SDS-PAGE ze względu na niskie stężenie. Jeśli piki białek nie są wyraźnie oddzielone, należy rozważyć błąd w przygotowaniu buforu lub zmianę nachylenia gradientu NaCl.
Chromatografię wykluczania rozmiarów przeprowadza się w celu oddzielenia pożądanego białka od pozostałych białek komórek E.coli, które związały się z żywicą Ni-NTA i nie zostały usunięte podczas chromatografii wymiany jonowej. Kolumna ta rozdziela białka w zależności od ich wielkości. Białka duże będą eluować w mniejszych objętościach elucji w przeciwieństwie do białek małych, które zostaną eluowane w większych objętościach. Chromatogram kolumny (Rysunek 3) wykazuje dobrą separację pożądanego białka jako jednej głównej populacji. Populacja ta wydaje się eluować w odpowiedniej wielkości monomeru o MW ~20 kDa. Obecność prążka ~80 kDa (typowego białka E.coli wiążącego żywicę Ni-NTA) jest wykrywana w SDS-PAGE przed nałożeniem na kolumnę i znika w trakcie tego etapu. Ponieważ stężenie tego białka ~80 kDa jest początkowo niskie, jego populacja nie pojawia się na chromatogramie ze względu na rozcieńczenie, dlatego analiza SDS-PAGE jest niezbędna do określenia wydajności oczyszczania. Zalecamy nałożenie na SDS-PAGE rozcieńczonej i skoncentrowanej próbki głównego piku, aby z pewnością określić obecność czystego białka o odpowiednim MW. Na tym etapie białko jest oczyszczone, a jego homogeniczność należy ocenić za pomocą MALDI-TOF. Analiza ta wykazała białko o MW 20347 Da oraz inne o Mw 10176 Da (Rysunek 4). Białko ~10 kDa jest dwukrotnie naładowaną formą białka ~20 kDa. Przewidywane MW dla MamAΔ41 z pozostałymi 9 aminokwasami po usunięciu His-Tag wynosiło 20596,5 Da. Porównując je z uzyskanym MW z MALDI-TOF, stwierdzono różnicę wynoszącą 248 Da. Ta rozbieżność może wynikać z błędów pomiarowych MALDI-TOF i/lub z powszechnej degradacji pierwszej metioniny i drugiej glicyny. Podsumowując, białko jest wysoko oczyszczone i może być wykorzystane w dalszych eksperymentach.
<img src="/files/ftp_upload/1844/1844table.jpg" alt="Tabela przygotowania buforu, stężenia odczynników: Tris-HCl, NaCl, imidazol; zmierzone objętości." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> Tabela 1. Składy buforów.
<img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig1.jpg" alt="żel SDS-PAGE, rozdział białek, wyniki elektroforezy, markery masy cząsteczkowej" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rycina 1. Reprezentatywna analiza SDS-PAGE oczyszczania na kolumnie Ni-NTA. Od prawej do lewej; P – osad z ultrawirowania (krok 3.1 protokołu), W – przemycie (krok 3.12 protokołu), U – białka nieprzypisane (krok 3.10 protokołu), E – pięć ścieżek próbek elucji (krok 3.14 protokołu), M – marker białkowy (liczby wskazują MW). Strzałka wskazuje MamAΔ41.
<img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig2.jpg" alt="Chromatografia i żel SDS-PAGE; analiza białek; rozdział według wielkości i wyznaczanie masy cząsteczkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rysunek 2. Analiza etapu chromatografii wymiany jonowej (a) Chromatogram wymiany jonowej (kolumna MonoQ); kolor niebieski – absorbancja 280 nm, reprezentująca stężenie białka, kolor zielony – stężenie NaCl, kolor czerwony – wskazanie zebranych frakcji. (b) Reprezentacyjna analiza SDS-PAGE etapu oczyszczania metodą wymiany jonowej. Od lewej do prawej: M – marker białkowy (liczby oznaczają masę cząsteczkową Mw), A6 – frakcja pierwszego piku, A8 – frakcja drugiego piku.
<img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig3.jpg" alt="Oczyszczanie białek; chromatogram i żel SDS-PAGE do porównania wyników analizy białek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rycina 3. Analiza metodą chromatografii wykluczania molekularnego (a) Chromatogram z chromatografii wykluczania cząsteczkowego (kolumna Superdex 20); kolor niebieski – absorbancja przy 280 nm, reprezentująca stężenie białka, kolor czerwony – wskazanie zebranych frakcji. (b) Reprezentatywna analiza SDS-PAGE etapu oczyszczania metodą wykluczania cząsteczkowego. Od lewej do prawej; M – marker białek (liczby wskazują masę cząsteczkową MW), PreI – próbka przed wtryskiem, A4-6 – połączone frakcje zebrane z pierwszego piku, A4-6D – rozcieńczona frakcja zebrana z piku. 
<img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig4.jpg" alt="Wykres spektrometrii mas przedstawiający piki intensywności jonów; analiza widma; dane dotyczące stosunku masy do ładunku." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> Rycina 4. Widmo masowe z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą macierzą (MALDI-TOF) oczyszczonego białka MamAΔ41. Matrycą jest kwas sinapowy (SA). Widoczny jest MamAΔ41 o masie 20347 Da, a także dwukrotnie naładowany gatunek MamAΔ41 o masie 10176 Da.

<ol><li>Faivre, D., Schuler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetotactic+Bacteria+and+Magnetosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Magnetotactic Bacteria and Magnetosomes.</a> Chem Rev. 108, 4875-4898 (2008).</li>
<li>D'Andrea, L. D., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPR+proteins%3A+the+versatile+helix%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">TPR proteins: the versatile helix.</a> Trends Biochem Sci. 28, 655-662 (2003).</li>
<li>Young, J. C., Barral, J. M., Hartl, U. lrich, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+folding%3A+localized+functions+of+cytosolic+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">More than folding: localized functions of cytosolic chaperones.</a> Trends Biochem Sci. 28, 541-547 (2003).</li>
<li>Brocard, C., Hartig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+targeting+signal+1%3A+is+it+really+a+simple+tripeptide%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Peroxisome targeting signal 1: is it really a simple tripeptide?</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 1565-1573 (2006).</li>
<li>Fransen, M., Amery, L., Hartig, A., Brees, C., Rabijns, A., Mannaerts, G. P., Van Veldhoven, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+PTS1-+and+Rab8b-binding+properties+of+Pex5p+and+Pex5Rp%2FTRIP8b%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of the PTS1- and Rab8b-binding properties of Pex5p and Pex5Rp/TRIP8b.</a> Biochim Biophys Acta. 1783, 864-873 (2008).</li>
<li>Baker, M. J., Frazier, A. E., Gulbis, J. M., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein-import+machinery%3A+correlating+structure+with+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein-import machinery: correlating structure with function.</a> Trends Cell Biol. 17, 456-464 (2007).</li>
<li>Mirus, O., Bionda, T., von Haeseler, A., Schleiff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+evolved+discriminators+in+the+3-TPR+domain+of+the+Toc64+family+involved+in+protein+translocation+at+the+outer+membrane+of+chloroplasts+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Model%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily evolved discriminators in the 3-TPR domain of the Toc64 family involved in protein translocation at the outer membrane of chloroplasts and mitochondria.</a> J Mol Model. 15, 971-982 (2009).</li>
<li>Gatsos, X., Perry, A. J., Anwari, K., Dolezal, P., Wolynec, P. P., Likic, V. A., Purcell, A. W., Buchanan, S. K., Lithgow, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+and+outer+membrane+assembly+in+Alphaproteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein secretion and outer membrane assembly in Alphaproteobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 32, 995-1009 (2008).</li>
<li>Tiwari, D., Singh, R. K., Goswami, K., Verma, S. K., Prakash, B., Nandicoori, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+residues+in+Mycobacterium+tuberculosis+protein+kinase+G+play+a+role+in+regulating+kinase+activity+and+survival+in+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Key residues in Mycobacterium tuberculosis protein kinase G play a role in regulating kinase activity and survival in the host.</a> J Biol Chem. 284, 27467-27479 (2009).</li>
<li>Edqvist, P. J., Broms, J. E., Betts, H. J., Forsberg, A., Pallen, M. J., Francis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetratricopeptide+repeats+in+the+type+III+secretion+chaperone%2C+LcrH%3A+their+role+in+substrate+binding+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tetratricopeptide repeats in the type III secretion chaperone, LcrH: their role in substrate binding and secretion.</a> Mol Microbiol. 59, 31-44 (2006).</li>
<li>Grunberg, K., Muller, E. C., Otto, A., Reszka, R., Linder, D., Kube, M., Reinhardt, R., Schuler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+proteomic+analysis+of+the+magnetosome+membrane+in+Magnetospirillum+gryphiswaldense%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and proteomic analysis of the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1040-1050 (2004).</li>
<li>Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosome+vesicles+are+present+before+magnetite+formation%2C+and+MamA+is+required+for+their+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 3839-3843 (2004).</li>
<li>Okuda, Y., Fukumori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+a+magnetosome-associated+protein%2C+TPR-containing+MAM22%2C+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of a magnetosome-associated protein, TPR-containing MAM22, in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 491, 169-173 (2001).</li>
<li>Taoka, A., Asada, R., Sasaki, H., Anzawa, K., Wu, L. F., Fukumori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+localizations+of+Mam22+and+Mam12+in+the+magnetosomes+of+Magnetospirillum+magnetotacticum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spatial localizations of Mam22 and Mam12 in the magnetosomes of Magnetospirillum magnetotacticum.</a> J Bacteriol. 188, 3805-3812 (2006).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li>
</ol>

Oczyszczanie białek jest kluczowym etapem w każdych badaniach biochemicznych lub strukturalnych białek. Ponieważ każde białko jest unikalne i charakteryzuje się odrębnymi właściwościami, konieczne jest zdefiniowanie jego cech i odpowiednie dostosowanie procesu oczyszczania. W pierwszym kroku prowadzącym do oczyszczania białko docelowe należy przeanalizować za pomocą narzędzi bioinformatycznych. Służą one do obliczenia punktu izoelektrycznego białka docelowego oraz oceny zapotrzebowania na środowisko redukujące/utleniając...

<table><tbody><tr><td>Prasa francuska (French Press)</td><td>Sprzęt</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-078A</td><td></td></tr><tr><td>Komora ciśnieniowa</td><td>Sprzęt</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Sprzęt</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>Discovery 90SE</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Sprzęt</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Ti60</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówki; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml</td><td>Sprzęt</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>BC-355618</td><td></td></tr><tr><td>Szklane kolumny chromatograficzne Econo-Column o średnicy 2.5cm</td><td>Sprzęt</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2521</td><td></td></tr><tr><td>Żywica Ni-NTA His Bind</td><td>Sprzęt</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>M0063428</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Sprzęt</td><td>Amersham</td><td>Ultraspec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta kwarcowa</td><td>Sprzęt</td><td>Hellma</td><td>104-QS</td><td></td></tr><tr><td>Szybka chromatografia cieczowa (FPLC) – AKTA purifier 10</td><td>Sprzęt</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna wymiany jonowej &amp;#8211; MonoQ 4.6/100 PE</td><td>Sprzęt</td><td>GE Healthcare</td><td>10025543</td><td></td></tr><tr><td>Napełniona kolumna do chromatografii wykluczania molekularnego – HiLoad 26/60 Superdex 200</td><td>Sprzęt</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1071-01</td><td></td></tr><tr><td>Centricon – Vivaspin15 &amp;#8211; 10,000 MWCO</td><td>Sprzęt</td><td>Sartorius AG</td><td>VS1501</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Sprzęt</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>IEC CL30R</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Sprzęt</td><td>Bruker Corporation</td><td>Reflex IV</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (hydroksymetylaminometan)</td><td>Odczynnik</td><td>BioLab</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Odczynnik</td><td>FRUTROM</td><td>235553470</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Odczynnik</td><td>Alfa Aesar</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteaz bez EDTA</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8849</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I (Deoksiribonukleaza I)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>Trombina wołowa</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP25432</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Odczynnik</td><td>BioLab</td><td>07132391</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Odczynnik</td><td>BioLab</td><td>19822391</td><td></td></tr><tr><td>Beta-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Odczynnik</td><td>Expedeon</td><td>1SB01L</td><td></td></tr><tr><td>Marker białkowy PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>Odczynnik</td><td>Fermentas</td><td>SM0671</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie białka mamaΔ41 związanego z magnetosomami szczepu amb-1 m. magneticum

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Bakterie magnetotaktyczne stanowią zróżnicowaną grupę mikroorganizmów wodnych, które potrafią orientować się wzdłuż pól geomagnetycznych. Uważa się, że zachowanie to ułatwia im poszukiwanie odpowiednich środowisk.(1)Zdolność ta jest zapewniana przez magnetosom, organellum subkomórkowe składające się z liniowego łańcucha pęcherzyków lipidowych, z których każdy jest w stanie biomineralizować i zamykać wewnątrz kryształ magnetytu lub greigitu o rozmiarze ~50-nm. Głównym składnikiem magnetosomu, którego wykazano, że jest niezbędny do tworzenia funkcjonalnych pęcherzyków, jest MamA. MamA to białko stowarzyszone z magnetosomem występujące w dużych ilościach, będące jednym z najlepiej scharakteryzowanych białek związanych z tym organellum.in vivo (2-6)Niniejszy artykuł koncentruje się na oczyszczaniu białka MamA, które pomimo bycia badanymin vivo, nie zidentyfikowano dla niego żadnych jasnych szczegółów funkcjonalnych ani strukturalnych. Analiza bioinformatyczna zasugerowała, że MamA jest białkiem zawierającym powtórzenia tetra-tripeptydowe (TPR). TPR to motyw strukturalny występujący samodzielnie lub jako część większej fałdy w szerokim zakresie białek; służy on jako matryca dla oddziaływań białko-białko i pośredniczy w tworzeniu wielobiałkowych kompleksów(7)Białka TPR biorą udział w wielu kluczowych zadaniach związanych z procesami w organellach komórek eukariotycznych oraz w wielu szlakach bakteryjnych(8-14).Aby zrozumieć białko MamA, unikalne białko zawierające powtórzenia TPR, w pierwszym kroku wymagane jest otrzymanie wysoko oczyszczonego białka. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół oczyszczania stabilnego mutanta z delecją MamA (MamAΔ41) zM. magneticum AMB-1.

MamA jest unikalnym białkiem powiązanym z magnetosomami, o którym wykazano, że bierze udział w ich aktywacji. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół oczyszczania mutanta z delecją MamA (MamAΔ41) z M. magneticum AMB-1.

Oczyszczanie białka MamAΔ41 związanego z magnetosomami szczepu AMB-1 M. magneticum

Bakterie magnetotaktyczne stanowią zróżnicowaną grupę mikroorganizmów wodnych, które są zdolne do orientowania się wzdłuż pól geomagnetycznych. Zachowanie to jest ...

Proces oczyszczania rozpoczyna się od pelletów komórkowych wykazujących ekspresję rekombinowanego białka Mame. Delta 41. Po rozbiciu błon komórkowych następuje oddzielenie frakcji rozpuszczalnej od nierozpuszczalnej. W celu wyekstrahowania rozpuszczalnego białka rekombinowanego wykorzystuje się chromatografię powinowactwa, która pozwala oddzielić białko rekombinowane z przyłączoną znacznikową sekwencją od pozostałych białek komórkowych.Chromatografia wymiany jonowej oddziela mamma Delta 41 od pozostałych białek komórkowych, które pozostały po chromatografii powinowactwa i wykluczaniu wielkościowym. Dalsza chromatografia pozwala na dodatkowe oczyszczenie mamma Delta 41 i ujawnia jej stan oligomeryczny. Na koniec analizowana jest czystość oraz homogeniczność białka rekombinowanego.Cześć, jestem Raza, kierownik Laboratorium XVA w Katedrze Nauk o Życiu na Uniwersytecie Benon of the Negative. Jestem Natalie, również z Laboratorium Z. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę oczyszczania białka rekombinowanego.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania białek związanych z magnetyzmem. Zacznijmy zatem. Na początku tego protokołu białko MAME Delta 41 jest ekspresowane jako białko fuzyjne z 10-His.Komórki e coli szczepu BL 21 hoduje się w pożywce do autoindukcji zawierającej Epi Brazilin w temperaturze 310 K przez trzy godziny. Następnie należy zmienić temperaturę hodowli na 300 K i inkubować komórki przez 48 godzin. Po inkubacji komórki należy zebrać poprzez wirowanie, zlać nadsącz i zważyć otrzymany osad komórkowy.Osiem litrów hodowli powinno przynieść około 60 g mokrego osadu komórkowego. Przed oczyszczaniem białek należy przygotować roztwory stokowe o objętości 200 ml: 4 M imidazole, 5 M NaCl oraz 1 M Tris-HCl pH 8.Używając wody dwukrotnie destylowanej (DDW), mieszaj roztwory w wirówce wortex aż do uzyskania klarowności, a następnie przefiltruj je przez filtr 0,22 µm. Przefiltruj roztwory zapasowe oraz świeżo przygotowane bufory od A do F zgodnie z opisem w protokole pisemnym dołączonym do tego filmu. Aby rozpocząć oczyszczanie białka, resuspendu komórki w buforze A w stosunku masy komórek do objętości buforu wynoszącym jeden do dwóch.Na każde 10 gramów bakterii dodaj 10 mikrolitrów dna, one, aby strawić wszelkie fragmenty DNA w próbce. Następnie dodaj jeden mililitr E dt, gotowej mieszanki inhibitorów proteaz. Na każde 20 gramów bakterii inkubuj roztwór przez 20 minut w lodzie.Po inkubacji poddaj komórki lizie za pomocą dwóch cykli praski francuskiej przy ciśnieniu 25 000 PSI. Ze względu na wzrost temperatury, tłok należy schładzać na lodzie przez 10 minut przed użyciem. Przenieś zlizowane komórki do probówek do ultrawirówki o pojemności 25 ml.Napełnij probówki buforem A do linii szyjki i precyzyjnie je zrównoważ. Następnie oddziel debris komórkowy za pomocą ultrawirowania. W międzyczasie przygotuj kolumnę grawitacyjną z niklem NTA, wsypując cztery mililitry żywicy nikiel NTA do szklanej kolumny o średnicy 2,5 centymetra.Przygotować żywicę do oczyszczania białek zgodnie z instrukcjami producenta i S. Po odwirowaniu próbek przelać frakcję rozpuszczalną z probówek do ultrawirowania na kolumnę z niklową NTA. Zebrać białka niezwiązane w frakcji przepływowej.Kontynuuj płukanie kolumny 100 mililitrami buforu B i zbieraj przelew. Przechowuj frakcje przelewu w temperaturze 277 K. Eluuj białko do 15 ponumerowanych probówek typu einor o pojemności 1,5 mililitra. Zamknij zawór kolumny i nałóż na nią jeden mililitr buforu C.Po trzech minutach inkubacji otwórz zawór i zbierz eluat. Powtórz ten krok trzykrotnie. Kontynuuj elucję białka w przyrostach 1 mL buforu, pomijając trzyminuotową inkubację.Używając spektrofotometru UV, zlokalizuj peak białka w frakcjach, mierząc gęstość optyczną przy 280 nanometrach. Na koniec przeprowadź analizę frakcji za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. Nie związany protein przepływa przez etap płukania, przepływ oraz próbkę osadu z ultrawirowania z żelu.Ustal, które wyeluowane frakcje zawierają wysoką zawartość białka, a następnie połącz wybrane frakcje. Aby usunąć znacznik 10 hiss tag, dodaj do połączonej próbki 10 µL trombiny bydlęcej na każdy 1 mg białka. Następnie poddaj próbkę dializie przeciwko buforowi D w celu usunięcia nadmiaru imydolu i obniżenia stężenia chlorku sodu.W ramach przygotowania do chromatografii wymiany jonowej odetnij odpowiedni odcinek tubingu do dializy o granicy odcięcia masy cząsteczkowej 7 kDa. Przepłucz tubing wodą DDW i przygotuj worek, zawiązując węzeł na jednym z końców. Przenieś roztwór białka poddanego trawieniu trombiną do worka, pozostawiając nieco wolnej przestrzeni u góry. Zamknij tubing do dializy za pomocą zacisku.Zanurz tubę dializacyjną w czterech litrach schłodzonego buforu D. Mieszaj roztwór powoli przez noc w temperaturze 277 K. Po całonocnej dializie wyjmij tubę z zlewki. Wykonaj niewielkie nacięcie i przenieś białko do probówki Falcon o pojemności 50 ml. Do dalszego oczyszczania białka memay Delta 41 stosuje się chromatografię wymiany jonowej. Podłącz gotową kolumnę mono Q4 0.6 100 PE do systemu oczyszczania FPLC ACTA.Przepłucz kolumnę pięciokrotną objętością kolumny (CV) filtrowanej wody DDW, a następnie wyrównaj kolumnę pięcioma CV buforu D. Przepłucz pętlę wtryskową dwukrotną objętością pętli wody DDW, a następnie dwukrotną objętością pętli buforu D. Wprowadź białko do pętli wtryskowej. Wtryśnij próbkę białka przy szybkości przepływu 1 ml/min i rozpocznij zbieranie frakcji. Zostaną one wykorzystane do detekcji białek nie związanych za pomocą elektroforezy SDS-PAGE.Kontynuuj nakładanie i wstrzykiwanie białka, aż cała próbka zostanie zaaplikowana na kolumnę. Przemyj kolumnę trzykrotną objętością kolumny (cv) buforu D. Aby usunąć wszystkie niezwiązane białka, eluuj białko przez 60 minut z przepływem 1 ml/min, stosując liniowy gradient chlorku sodu od 40 mM do 2 M. Zbieraj piki białkowe pojawiające się na chromatogramie przy 280 nm po osiągnięciu 100% buforu E.Oczyść kolumnę preparatywną zgodnie z zaleceniami producenta. Przeprowadź analizę frakcji zebranych z FPLC, w tym niezwiązanego białka oraz przepływu szczytu białkowego, za pomocą elektroforezy SDS-PAGE z użyciem markerów wstępnie barwionych. Oceń prążki białkowe w celu zidentyfikowania frakcji zawierających białko o przewidywanej masie cząsteczkowej Mame.W kroku Delta 41 połączone zostają wybrane frakcje w ramach przygotowania do chromatografii wykluczania cząsteczkowego. Stężenie chlorku sodu w połączonych próbkach zostaje obniżone poprzez dializę przeciwko buforowi f, zgodnie z wcześniejszym opisem. Po dializie nocnej.Użyj wirówki laboratoryjnej, aby zagęścić próbkę białka za pomocą koncentratora odśrodkowego z progiem odcięcia 10 000 Da. Zagęść białko do stężenia 8 mg/mL przy 4 000 RPM. Potwierdź uzyskanie pożądanego stężenia, mierząc OD przy 280 nm w kuwecie kwarcowej.Zamontuj kolumnę do chromatografii wykluczania o wysokiej wydajności 26 60 superdeck 200 w systemie oczyszczania FPLC ACTO. Przemyj kolumnę trzema objętościami kolumny (cv) filtrowanej wody i zrównoważ ją trzema cv buforu F. Przemyj pętlę wtryskową dwiema objętościami pętli DDW, a następnie taką samą objętością buforu F. Po przemyciu i zrównoważeniu systemu FPLC wprowadź próbkę białka do pętli wtryskowej. Wstrzyknij próbkę białka i rozpocznij zbieranie frakcji piku białkowego w miarę ich pojawiania się na chromatogramie dla 280 nanometrów.Pozwól buforowi przepływać do momentu osiągnięcia objętości martwej kolumny. Oczyść kolumnę prefabrykowaną zgodnie z zaleceniem producenta. Przeprowadź analizę frakcji w technice SDS-PAGE i oceń żel.Białko powinno pojawić się przy prawidłowej przewidywanej masie cząsteczkowej zgodnie z markerem białek i widoczny powinien być tylko jeden prążek. Połącz frakcje czystego białka i zagęść próbkę białka do stężenia powyżej 20 mg/mL, używając koncentratora odśrodkowego z granicą odcięcia 10 000 Da oraz wirówki stołowej. Potwierdź pożądane stężenie, mierząc OD przy 280 nm.Potwierdź czystość i tożsamość próbki MAME delta 41, wykorzystując matryksową desorpcyjną jonizację laserową z analizą czasu przelotu (MALDI-TOF). Na koniec podziel skoncentrowane, oczyszczone białko MAME delta 41 do wcześniej oznakowanych probówek typu Eppendorf, rozdzielając je na objętości od 25 do 50 µL każda. Próbkę można błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze 193 K. Niniejszy protokół powinien pozwolić na uzyskanie wysoce czystej, homogenicznej pod względem wielkości, skoncentrowanej próbki białka MAME Delta 41. Analiza SDS-PAGE profilu elucji z niklowego NTA wykazuje wysokie poziomy białka MAME delta 41 10-his w frakcjach elucyjnych przy masie około 22 kDa.Analiza w żelu SDS-PAGE pozwoli również wykryć obecność białka memay delta 41 w niezwiązanym przepływie białek, w próbkach po płukaniu, w przepływie przejściowym oraz w osadzie po ultrawirowaniu. Jeśli w tych próbkach pojawią się wyraźne prążki w okolicach 22 kilodaltonów, konieczne jest przeprowadzenie procedury rozwiązywania problemów. Chromatografię wymiany jonowej stosuje się w celu oddzielenia białka MAME Delta 41 od innych białek w próbce poprzez wymianę jonową.Przy rosnących stężeniach chlorku sodu chromatogram wymiany jonowej wykazuje dobrą separację dwóch populacji białek. Analiza stężeń próbek za pomocą elektroforezy SDS-PAGE pozwala określić masę cząsteczkową każdej z populacji. Pierwszy pik to MAME delta 41, natomiast drugi pik to białko MAME delta 41 10 hiss, które nie zostało rozcięte przez trombinę wołową.Jeśli chromatografia wymiany jonowej nie doprowadzi do pełnej rozdzielczości pików białkowych, należy zweryfikować przygotowanie buforu oraz nachylenie gradientu chlorku sodu. Ostatnim etapem oczyszczania MAME delta 41 jest chromatografia wykluczania molekularnego. Chromatogram wykazuje pojedynczy pik eluujący przy 20 kilodaltons.W celu weryfikacji oczyszczonego białka MAME delta 41 przeprowadzono analizę MALDI w celu określenia odpowiedniej wielkości monomeru białka MAME Delta 41. Analiza ta wykazała obecność dwóch form: jednej reprezentującej pojedynczo naładowane białko o masie 20 347 Daltonów oraz drugiej reprezentującej podwójnie naładowane białko o masie 10 176 Daltonów. Przewidywana masa cząsteczkowa rekombinowanego białka MAME delta 41 po usunięciu znacznika His jest równa 20 597 Daltonów.Niewielka różnica wynosząca 250 Dalton może wynikać z powszechnej degradacji pierwszej metioniny w drugą glicynę. Wyniki wskazują na wysoką czystość białka MAME delta 41. Może ono zostać wykorzystane w dalszych eksperymentach.Właśnie pokazaliśmy, jak oczyścić rekombinowane białko syllable. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby dostosować bufory do specyfiki używanego białka oraz przeprowadzić te doświadczenia tak szybko, jak to możliwe. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

purification-m-magneticum-strain-amb-1-magnetosome-associated-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oczyszczanie białka magnetosomu związanego z szczepem M. magneticum AMB-1 MamAΔ41

Film wyjaśnia sposób oczyszczania limfocytów B poprzez celowanie immunomagnetyczne i separację od zawiesiny komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Metoda ta polega na znakowaniu niepożądanych typów komórek specyficznymi przeciwciałami lub ligandami (połączonymi z cząstkami magnetycznymi) skierowanymi przeciwko określonym białkom powierzchniowym komórki, które mają zostać usunięte z heterogenicznej zawiesiny komórkowej przez separację magnetyczną.

Negatywna selekcja immunomagnetyczna: metoda oczyszczania limfocytów B z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

W tym filmie demonstrujemy procedurę izolowania egzosomów od docelowych płynów biologicznych za pomocą mikrokulek magnetycznych. Procedura umożliwia szybkie wychwytywanie egzosomów, które można wykorzystać do dalszej analizy.

Ekstrakcja egzosomów na bazie kulek magnetycznych: technika izolowania określonych egzosomów z biopłynów

W tym filmie opisujemy protokół izolacji komórek CD11b, w tym mikrogleju, z mózgów młodych myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie. Tkanki mózgowe są homogenizowane w celu uzyskania zawiesin pojedynczych komórek, które są inkubowane z mikrokulkami pokrytymi przeciwciałem anty-CD11b, a następnie rozdzielane na podstawie kolumny magnetycznej w celu oczyszczenia populacji komórek CD11b +.

Izolacja magnetyczna mikrogleju z mózgów młodych myszy

Demonstrujemy metodę zbierania bakterii magnetotaktycznych (MTB), które można zastosować do naturalnych wód.  MTB można wyizolować i wzbogacić z próbek osadu przy użyciu stosunkowo prostej konfiguracji, która wykorzystuje naturalny magnetyzm bakterii.  Wyizolowany MTB można następnie szczegółowo zbadać zarówno za pomocą mikroskopii świetlnej, jak i elektronowej.

Zbieranie, izolacja i wzbogacanie naturalnie występujących bakterii magnetotaktycznych ze środowiska

Ta procedura ilustruje, jak wyizolować z mózgu dorosłej myszy błony ER związane z mitochondriami lub MAM oraz frakcje mikrodomen wzbogacone glikosfingolipidami z MAM i preparatów mitochondrialnych.

Błony ER związane z mitochondriami (MAM) i mikrodomeny wzbogacone w glikosfingolipidy (GEM): izolacja od mózgu myszy

Egzosomy to mikropęcherzykowe struktury znajdujące się w biopłynach, które potencjalnie przenoszą ważne biomarkery dyskryminujące choroby. W tym przypadku zastosowano nowatorską metodę do specyficznej ekstrakcji egzosomów i szybkiego przetestowania ładunku egzosomalnego dla obu celów RNA/białka po rozerwaniu egzosomów za pomocą niejednorodnych elektrycznych cyklicznych fal prostokątnych.

Wykrywanie biomarkera egzosomalnego za pomocą uwalniania i pomiaru wywołanego polem elektrycznym (EFIRM)

Przedstawiono protokół syntezy i kationizacji magnetoferytyny domieszkowanej kobaltem, a także metodę szybkiego magnesowania komórek macierzystych za pomocą kationizowanej magnetoferytyny.

Synteza kationizowanej magnetoferytyny do ultraszybkiego namagnesowania komórek

Ten manuskrypt opisuje efektywne, niewirusowe dostarczanie miR do komórek śródbłonka przez wektor PEI/MNP i ich namagnesowanie. Tak więc, oprócz modyfikacji genetycznej, podejście to pozwala na magnetyczne prowadzenie komórek i wykrywalność MRI. Technika ta może być stosowana w celu poprawy właściwości terapeutycznych produktów komórkowych.

Przygotowanie i charakterystyka in vitro namagnesowanych komórek śródbłonka zmodyfikowanych miR

Opisana tutaj metoda to nowy protokół izolacji pęcherzyków, który pozwala na oczyszczanie przedziałów komórkowych, w których egzogenne antygeny są przetwarzane przez degradację związaną z retikulum endoplazmatycznym w prezentacji krzyżowej.

Oczyszczanie przedziału błony w celu degradacji antygenów egzogennych związanych z retikulum endoplazmatycznym w prezentacji krzyżowej

Tutaj opisujemy metodę szybkiej homogenizacji wspomaganą separacją magnetyczną do produkcji na dużą skalę nanopęcherzyków pochodzących z endosomów jako nowy typ egzosomów naśladujących (EM), które mają to samo pochodzenie biologiczne i podobną strukturę, morfologię i skład białkowy natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).

Metoda szybkiej homogenizacji wspomagana separacją magnetyczną do produkcji pęcherzyków pochodzących z endosomów na dużą skalę

Ten protokół opisuje metodę sortowania opartą na magnesowych kulkach z wykorzystaniem przeciwciał cytometrii przepływowej oznaczonych fykoerytryną (PE) i przeciwciał anty-PE w celu izolacji określonych subpopulacji komórek macierzystych mezenchymalnych o wysokiej dodatniości markera posortowania i zachowanej proliferacji/aktywności metabolicznej opartej na CCK-8 w badanych warunkach, bez konieczności stosowania drogich sorterów komórkowych lub specyficznych dla celu niestandardowych kulek.

Izolacja i Walidacja Podpopulacji Komórek Macierzystych Mezenchymalnych Pozytywnych na Podoplaniny za Pomocą Pośredniej Strategii Używającej Magnesycznych Cząstek

Poznaj protokół oczyszczania białka MamAΔ41 z magnetosomami M. magneticum AMB-1 przy użyciu chromatografii afinitowej, jonowymiennej i rozmiarowej. Metoda ta umożliwia badanie struktury i funkcji białek związanych z magnetosomami.

Oczyszczanie białka MamAΔ41 związanego z magnetosomami szczepu AMB-1 M. magneticum

Przeglądaj więcej filmów